Methee Sriprapun, PhD

Faculty of Medical Technology Huachiew Chalermprakiet University

1

Objectives

• เขา้ใจความส าคญัของการควบคุมการแสดงออกของยนี • อธิบายกระบวนการควบคุมการแสดงออกของยนีได ้• อธิบาย ยกตวัอยา่ง เปรียบเทียบ วเิคราะห์ กลไกควบคุมการแสดงออกของยนีได ้

- lac operon - trp operon

2

Central dogma of molecular biology

DNA RNA Protein

Replication

Transcription Translation

Reverse Transcription

3

Gene expression

• กระบวนการน าขอ้มูลสารพนัธุธรรมในยนีไปสร้างเป็นผลผลิตของยนีไดแ้ก่ mRNA หรือโปรตีน

• Transcription and translation processes • Prokaryotes : transcription และ translation เกิดใน cytoplasm • Eukaryotes : transcription เกิดใน nucleus translation เกิดใน cytoplasm

4

Gene Expression

5 http://barleyworld.org/sites/default/files/figure-08-01_0.jpg

3 types of gene expression

6

- Constitutive gene expression essential genes for living cells housekeeping genes - Inducible gene expression enzymes in catabolic pathways - Repressible gene expression enzymes in anabolic pathways

Gene expression

(Simmons MJ and Snustad DP, 2010)

Inducible gene expression - lactose: inducer - -galactosidase

Repressible gene expression - Tryptophan: co-repressor - tryptophan synthesis

7

Regulation of gene expression • เพื่อใหส่ิ้งมีชีวิตสามารถด ารงชีวิตอยูไ่ดใ้นสภาวะแวดลอ้มท่ีเปล่ียนไป • เป็นการควบคุมการสร้างหรือยบัย ั้ง gene product เช่น RNA หรือโปรตีน

ในสภาวะต่างๆ ของส่ิงมีชีวิตเพื่อตอบสนองต่อส่ิงแวดลอ้ม - Positive regulation: ควบคุมใหมี้การแสดงออกของยนี

* activator RNA polymerase - Negative regulation: ควบคุมไม่ใหมี้การแสดงออกของยนี

* active repressor transcription * inducer + repressor transcription

8

Gene regulation found in all steps of gene expression in prokaryotes

9 (Simmons MJ and Snustad DP, 2010)

What is “Operon” ?

• Bacterial gene organization • Cluster of genes under the control of the same promoter

and operator • Promoter, operator & structural gene(s)

• In E.coli 25 operons controlling 250 genes • Inducible & Repressible operons • Lac operon and Trp operon

10

http://www.nature.com/scitable/resource?action=showFullImageForTopic&imgSrc=/scitable/content/33138/pierce_16_3_FULL.jpg 11

Inducible & repressible operons • Defined by the response of operon to metabolite (small molecule)

Adapted from :http://www.bx.psu.edu/~ross/workmg/PosNegCntrlCh15.htm 12

Type of operon Presence of metabolite

Effect on operon

Example

Inducible Lactose ON Lac operon Repressible Tryptophan OFF Trp operon

Inducible operon

13 (Simmons MJ and Snustad DP, 2010)

Repressible operon

14 (Simmons MJ and Snustad DP, 2010)

Terminology

• Promoter: ต าแหน่ง sequence บน DNA ท่ีให ้RNA polymerase เขา้มาจบัเพื่อการถอดรหสั

15 http://connorfowlerdotcom.wordpress.com/tag/biology/

Terminology (II)

• Operator: เป็นต าแหน่ง DNA sequence ท่ีให ้ regulatory protein เขา้มาจบั • Inducer : โมเลกลุของสารท่ีเหน่ียวน าใหเ้กิดการ แสดงออกของยนี • Repressor: โปรตีนท่ีเขา้จบักบัส่วน operator แลว้ยบัย ั้ง กระบวนการ transcription

16

Lac operon

• F. Jacop and J. Monod (1961) • Inducible operon (inducer: allolactose) • Enzyme synthesis for lactose metabolism

(-galactosidase)

17 http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/library/micro229/terry/229sp00/lectures/regulation.html

Components of lac operon

• Regulatory gene (I or lac I gene)

• Promoter gene (P or lac P gene)

• Operator gene (O or lac O gene)

18

Components of lac operon (II)

• Structural genes

- lac Z gene: ควบคุมการสร้างเอนไซม ์-galactosidase - lac Y gene: ควบคุมการสร้างเอนไซม ์permease เพื่อช่วย ในการ pump lactose เขา้เซลล ์- lac A gene ควบคุมการสร้างเอนไซม ์transacetylase

19

Components of lac operon

20 http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-23/23_02.jpg

Gene regulation in lac operon

• Negative regulation

- repressor protein • Positive regulation

- presence or absence of glucose - การท างานของโปรตีนควบคุม CAP (Catabolic Activator Protein) - Active form: CAP-cAMP

21

Negative regulation of lac operon

• Absence of lactose but presence of glucose Lac I สร้าง repressor protein ไปจบับริเวณ operator

Inhibit transcription and translation of lac ZYA

-galactosidase

22

Negative regulation of lac operon • Presence of lactose but absence of glucose Inducer binds with repressor protein & inhibit repressor

binding with lac O

Transcription of lac ZYA -galactosidase

Lactose analog เช่น IPTG

(isopropyl thiogalactoside) Inducer

23

http://bio1151.nicerweb.com/Locked/media/ch18/lac_operon.html 24

Lactose & Allolactose

25

-1, 6-glycosidic linkage

-1, 4-glycosidic linkage

Positive regulation of lac operon

• Presence of both glucose and lactose

-galactosidase จนกวา่ glucose จะถูกใชไ้ป หมดก่อน “catabolite repression” • การท างานของ RNA polymerase อาศยั CAP-cAMP

complex positive regulator ของ lac operon

26

Glucose = cAMP = -galactosidase

Glucose = cAMP = -galactosidase

CAP-cAMP

• CAP: cyclic AMP receptor protein or catabolite activator protein : promoter

• cAMP: effector molecule adenosine-3’, 5’–phosphate

• CAP only cannot bind with lac operon • Active form: CAP-cAMP enhance RNA polymerase

activity 27 http://www.ufrgs.br/depbiot/blaber/section3/section3.htm

28 http://cnx.org/content/m44535/latest/

29 (Alberts et al., 2007) = cAMP

Summary of lac operon Glucose cAMP Lactose Expression of lac operon

+ - No mRNA + + Slow mRNA synthesis - - No mRNA - + Rapid mRNA synthesis

30 Adapted from : http://biocadmin.otago.ac.nz/fmi/xsl/bioc2/learnbitsdetail.xsl?-db=BIOC2web.fp7&-lay=AllFieldsLayout&-max=100&RecID=158&-find

• Negative regulation: lac repressor • Positive regulation: CAP-cAMP • glucose cAMP

Trp operon

• Charles Yanofsky and his colleaque(1981) • Repressible operon • Enzyme for tryptophan synthesis (anabolic pathway)

• Chorismic acid tryptophan • Controlled by operator and attenuation mechanism • Repressor protein & corepressor (tryptophan)

31

Components of Trp operon

• Promoter, operator, attenuator (leader region) • Structural genes

- trp E antranilate synthetase component I - trp D antranilate synthetase component II - trp C N-(5’phosphoribosyl)-anthranilate isomerase Indole-3-glycerol phosphate synthase

- trp B tryptophan synthase (-subunit) - trp A tryptophan synthase (-subunit)

32

(Russell PJ, 2010) 33

Regulation of trp operon Presence of tryptophan

34

Tryptophan binds with inactivate (aporepressor) repressor protein

Active repressor protein binds with operator

Inhibit function of RNA polymerase

No tryptophan synthesis in bacterial cell

Regulation of trp operon Absence of tryptophan

35

No tryptophan binds with inactivate repressor protein

No active repressor protein binds with operator

No inhibition of RNA polymerase

Tryptophan synthesis in bacterial cell

(Alberts et al., 2007) 36

Attenuation mechanism

• Mechanism for controlling tryptophan synthesis • Attenuator sequence: leader region near trpL sequences ,

162 bp (5’UTR) 4 domains • Leader peptide: 2 trp molecules pos. 10&11 control

attenuator • Other amino acids: histidine, phenylalanine and threonine.

37

Possibility of mRNA folding

38

Leader peptide: 14 aa (2 tryptophan molecules)

http://www.nature.com/scitable/resource?action=showFullImageForTopic&imgSrc=/scitable/content/19425/pierce_16_16_FULL.gif 39

40

http://www.csun.edu/~hcbio027/biotechnology/lec4a/trp.html

Summary of trp operon

41

Summary of lac and trp operons Lac operon Trp operon

Type of operon Inducible Repressible

Metabolism Catabolism Anabolism

Purpose of synthesis -galactosidase Tryptophan

Regulation mechanism Lac repressor &

CAP-cAMP Tryptophan &

attenuation

Metabolites Allolactose (inducer) Tryptophan

(co-repressor) 42

Gene regulation in Eukaryotes • Absence of operon • Regulation in each level of expression

43 (Alberts et al., 2008)

44

http://www.mun.ca/biology/ desmid/brian/BIOL2060/ BIOL2060-23/23_10.jpg

References • เอกสารประกอบการสอน MT4021 เทคโนโลยชีีวภาพ เร่ือง การควบคุมการแสดงออก

ของยนี คณะเทคนิคการแพทย ์มหาวทิยาลยัหวัเฉียวเฉลิมพระเกียรติ 2556. • สิทธิศกัด์ิ หรรษาเวก. การควบคุมการแสดงออกของยนี. ใน: เซลลชี์ววทิยาทางการแพทย ์

1. กรุงเทพฯ: ภาควิชาชีวเคมี คณะแพทยศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวทิยาลยั. • Snustad DP, Simmons MJ. Regulation of gene expression in prokaryotes and their

viruses. In: Principles of genetics. 5th ed. Asia: John Wiley & Sons; 2010. • Fitzgerald-Hayes M, Reichsman F. DNA and Biotechnology. 3rd ed. China: Academic

Press (Elsevier); 2010. • ตรีทิพย ์รัตนวรชยั. การควบคุมการแสดงออกของยนี. ใน: อณูพนัธุศาสตร์เบ้ืองตน้

มหศัจรรยข์องดีเอน็เอ. พิมพค์ร้ังท่ี 1. กรุงเทพฯ: โรงพิมพแ์ห่งจุฬาลงกรณ์มหาวทิยาลยั; 2552.

• Russell PJ. Regulation of gene expression in bacteria and bacteriophage. In: iGenetics a molecular approach. 3rd ed. San Francisco, CA: Pearson Education; 2010.

45