rekombinacija molekula dnk - bio.bg.ac.rs · i mejoza • mejoza (dve sukcesivne deobe, redukciona...

REKOMBINACIJA

MOLEKULA DNK

Fenomeni odgovorni za

održavanje i ekspresiju genoma

Svaki molekul DNK je

rekombinovani molekul DNK

• Pojam rekombinacije

• Tridesete godine prošlog veka

• Mejoza (poslednja istraživanja i u mitozi)

• I kod prokatiota i kod eukariota

• Tehnologija rekombinovane DNK

Vrste rekombinacije DNK

Homologna rekombinacija molekula DNK

Rekombinacija DNK specifična za mesto

Rekombinacija DNK transpozicijom

Ilegitimna (nepravilna) rekombinacija

Rekombinacija DNK kod prokariota

• Horizontalni transfer

• Bakteriofagna infekcija

• Reparacija molekula DNK

Rekombinacije DNK kod eukariota

• Održanje integriteta genoma (tokom mejoze, npr.)

• Razmena genetičkih informacija – genetički diverzitet

• Zaštita gen. informacija– omogućava reparaciju DSB u DNK

• Učestvuje i u procesima regulacije ekspresije nekih gena

• Obezbeđuje nesmetano odvijanje replikacije – pomaže da “zarobljena” replikaciona viljuška “ponovo krene”

HOMOLOGNA

REKOMBINACIJA

Generalna, opšta

Homologna

RecA zavisna (kod prokariota)

Fizička razmena istih ili

homolognih sekvenci

DNK između dva različita

molekula DNK

Homologna rekombinacija

• Fizička bliskost dva molekula DNK

• Homologija najmanje u 100 bp dugom regionu DNK

• Prekidi u jednom ili oba lanca molekula DNK

• Formiranje i kretanje Holidejeve strukture

• Razrešenje (rezolucija) Holidejeve strukture

• de novo sinteza molekula DNK

Pola veka istraživanja homologne rekombinacije

1964. godine otkriva je Robin Holliday (1932-2014)

Holidejev model

homologne rekombinacije DNK

• Pojava jednolančanih prekida u lancima iste polarnosti u

dva blisko postavljena molekula DNK predstavlja

početak homologne rekombinacije

Holidejev model


• Slobodni krajevi mogu razmeniti svoje homologne partnere

procesom koji se definiše kao INVAZIJA LANACA

• Invazija lanaca za posledicu ima formiranje mosta ili sinapse

• Ova strukuta se stabilizuje „zatvaranjem“ jednolančanih

prekida delovanjem enzima DNK ligaze

Holidejev model


• Dobijena hibridna struktura naziva se Holidejev

rekombinovani intermedijer (Holidejeva struktura)

• Hibridna struktura je stabilna ali ne i statična –

MIGRACIJA GRANA

Holidejeva

veza

Holidejev model

homologne rekombinacije DNK • Migracija grana stvara kraće ili duže regione koji su u

hemijskom smislu heterodupleksi a u genetičkom

smislu heterozigoti

Holidejev model

homologne

rekombinacije DNK

• Razrešenje

Holidejeve strukture

• Uvođenjem dva

jednolančana prekida

Produkti homologne

rekombinacije molekula DNK

Dva različita

Startna genotipa

“Patch”

Produkti sa

umetkom

“Splice”

Splajsovani

produkti

Delovanje

endonukleaze

MODEL REPARACIJE DVOLANČANIH PREKIDA

HOMOLOGNOM REKOMBINACIJOM DNK

https://www.youtube.com/watch?v=9PEdqBuDMHM

Dvolančani prekidi DNK i njihova

reparacija homolognom

rekombinacijom

• Dvolančani prekidu u DNK molekulu česti događaji

• I jedan dvolančani prekid može biti letalan za E.coli

• Dejstvom jonizujućeg zračenja i citotoksičnih agenasa

• Na „mestu“ dvolančanog prekida dolazi do enzimske

degradacije molekula DNK i formiranja regiona

jednolančanih repova DNK ili invazivni lanci koji se

završavaju slobodnom 3’OH grupom.

• Jedan jednolančani DNK rep svojim 3’ krajem napada

homologni molekul dvolančane DNK

• Izmeštanje jednog lanca homolognog molekula DNK

• Kontakt oba jednolančana repa prekinutog molekula

DNK sa homolognim delovima neprekinutog molekula

DNK.

• Formiranje karakteristične strukture neprekinutog

molekula DNK koja se naziva D petlja

Reparaciona sinteza DNK

• Elongacija 3’-krajeva jednočanačnih DNK repova.

• Matrica za DNK sintezu su homologni segmenti lanaca

neprekinutog molekula DNK.

• DNK ligaze

Rekombinovani DNK

intermedijer sa dve Holidejeve

strukture • Migracija grana je posledica raskidanja vodoničnih veza

u originalnim molekulima DNK i istovremeno formiranje

novih vodoničnih veza u rekombinovanom intermedijeru

između lanaca dva homologna molekula DNK.

• Migracija grana za posledicu ima povećanje dužine

segmenata DNK koji bivaju razmenjeni između

homologih molekula DNK

Razrešenje rekombinovanog intermedijera

sa dve Holidejeve strukture

• Odvija se uvođenjem dva jednolančana prekida

• Za posledicu ima stvaranje dva rekombinovana molekula

DNK

• (dve veze sa dva mesta)



Ako se na isti način

seku obe

Holidejeve veze

rezultat

homologne rekombinacije

su produkti sa umetkom



Ako se korišćenjem

različitih mesta seku

dve Holidejeve veze rezultat

homologne rekombinacije

su produkti sa krosingoverom –

splajsovani produkti

• Kombinacija dve

pojedinačne Holidejeve strukture

• Patch + patch = patch

• Splice + splice = patch

• Splice + patch = splice

Proteinska mašinerija reparacije dvolančanih

prekida molekula DNK kod E.coli

• Specijalizovani proteini:

• Proteinski kompleks RecBCD – promoter

rekombinacije (obrada dvolančanog prekida i formiranje

invazivnog lanca)

• Protein RecA – centralni protein homologne

rekombinacije (proces invazije i razmene lanaca)

• Proteinski kompleks RuvAB – odgovoran za

prepoznavanje Holidejeve veze i za proces migracije

grana

• Protein RuvC – učestvuje u razrešenju Holidejevih veza

Proteinska mašinerija reparacije dvolančanih

prekida molekula DNK kod E.coli

• Pored specijalizovanih proteina u procesu homologne

rekombinacije učestvuju i:

• DNK polimeraza

• DNK ligaza

• Topoizomeraza

• Proteini koji se vezuju za jednolančane molekule DNK

(eng. single-strand binding protein, SSB) – SSB proteini

Proteinski kompleks RecBCD –

promoter homologne rekombinacije

• Tri subjedinice – proteinski produkti tri gena

• Prepoznaje dvolančani prekid u molekulu DNK odnosno

njegove ravne krajeve

• Poseduje helikazno/nuleaznu aktivnost zavisnu od ATP

• Rezultat ove aktivnosti je formiranje invazivnog lanca

Protein RecB

• Dva funkcionalna

domena

• Domen na N-kraju ima

helikaznu aktivnost u

smeru 3’-5’

• Multifunkcionalan domen

na C-kraju poseduje

nukleaznu aktivnosti

• Domen na C-kraju

uspostavlja interakcije sa

proteinom RecA

Protein RecD

• Poseduje helikaznu aktivnost u smeru 5’-3’

Protein Rec C

• U svojoj strukturi poseduje izraženu petlju u vidu čiode

• Širi dva lanca molekula DNK i usmerava lance ka

helikaznim „motorima” druge dve subjedinice kompleksa

• Prepoznaje chi mesta



• Lanci DNK različitim

kanalima stižu do

nukleaznog centra

kompleksa.

• Kanal kojim u nukleazni

centar dospeva lanac sa

3’-5’ polarnošću je tako

pozicioniran da je

nukleazna aktivnost

efikasnija na ovom lancu.



• Aktivnost kompleksa RecBCD regulisanaje specifičnim

sekvencama u molekulu DNK ('5-GCTGGTGG-3') koje

se nazivaju chi (eng. crossover hotspot instigator, chi) ili

χ mesta.

• Prelaskom preko chi mesta dolazi do konformacione

promene subjedinice RecC.

• Fleksibilna petlja RecC proteina zatvara kanal kojim se

kreće lanac sa polarnošću 3’-5’.

• Usled toga, nukleazni centar počinje efikasnije da

degradira lanac sa polarnošću 5’-3’.

• Na taj način dolazi do formiranja jednolančanog DNK

repa – invazivnog lanca.

c mesto

• Genoma E. coli poseduje 1009 c mesta

• Zaštita bakterijske od dejstva fagne DNK ili segmenata bakterijskih DNK koje ne poseduju chi mesta a koje dospevaju u bakterijsku ćeliju raznim vidovima horizontalnog transfera gena.

• 10x povećava frekvencu rekombinacije.



• Zahvaljujući subjedinici RecB, kompleks RecBCD

pomaže vezivanje proteina RecA za invazivni lanac.

Protein RecA

• Protein RecA je centralni protein homologne

rekombinacije kod E. coli.

• Pripada proteinskoj familiji proteina za razmenu

lanaca (eng. strandexchange proteins).

• Mutacija u proteinu RecA smanjuje učestalost

rekombinacije za 100.000 puta.

• Poseduje ATP–aznu i proteaznu aktivnost.

• Proteni RecA vezuju se za invazivni lanac (jednolančani

DNK rep) i omogućava proces invazije.

Filament RecA

• Za invazivni lanac, proteini RecA vezuju se kooperativno

i na taj način formiraju filament RecA.

• Filament RecA sastoji se od oko 100 molekula proteina

RecA koji se vezuju za 300 nukleotida dugu sekvencu

DNK invazivnog lanca.

Filament RecA

• Štiti jednolančanu DNK od dejstva nukleaza i omogućava proces invazije lanaca.

• Vrši „napad“ na dvolančani homologni molekul DNK.

• Struktura koja se sastoji od filamenta RecA i segmenta dvolančanog molekula DNK naziva se spojeni (eng. joint) molekul.

Filament RecA

• Filament RecA poseduje dva vezujuća mesta za

molekule DNK.

• U okviru jednog nalazi se invazivni lanac i ono se naziva

primarno mesto.

• Drugo mesto za vezivanje molekula DNK naziva se

sekundarno mesto i za njega se vezuje homologni

dvolančani molekul DNK.

Filament RecA

• Zahvaljujući postojanju ovih mesta u okviru filamenta

RecA, tokom invazije lanaca jednolančani DNK repovi

(invazivni lanci) „pretražuju i pronalaze“ homologne

regione u dvolančanom molekulu DNK.

Filament RecA

• Vezivanje dvolančanog molekula DNK za sekundarno mesto filamenta RecA je brzo, slabo, prolazno i nezavisno od sekvence.

• Mehanizam kojim filament RecA pretražuje dvolančani molekul DNK kako bi pronašao homologne sekvence sa sekvencom invazivnog lanca nije sasvim poznat.

• Pretpostavka je da se baze invazivnog lanca i baze dvolančane DNK spajaju vodoničnim vezama.

• Energiju potrebnu za raskidanje vodoničnih veza u dvolančanom molekulu DNK obezbeđuju molekuli RecA svojom ATP-aznom aktivnošću.

• Raskidanjem vodoničnih veza segment dvolančanog molekula DNK privremeno se otvara i omogućava svojim bazama da formiraju vodonične veze sa bazama u jednolančanom molekulu DNK (invazivnom lancu).

Ispravno sparivanje 15 baza signal da je

pronađena homologna sekvenca

Reparaciona sinteza DNK

• Nakon invazije lanaca i pronalaženja homologije između

molekula DNK, proteini RecA disosuju, a spojeni molekul

postaje mesto aktivnosti DNK polimeraza i DNK ligaza.

• Aktivnošću DNK polimeraze i DNK ligaze formiraju se

Holidejeve veze.

Migracija Holidejevih veza omogućena

je proteinskim kompleksom RuvAB

• Protein RuvA vezuje se za Holidejevu strukturu u formi

tetramera i regrutuje dva molekula RuvB – heksamerni

protein sa ATP-aznom aktivnošću koji omogućava

migraciju grana

U razrešenju Holidejeve strukture

učestvuje protein RuvC

• Holidejevu strukturu

prepoznaje zahvaljujući

protein-protein interakciji

sa kompleksomRuvAB.

• Dva molekula proteina

RuvC vezuju se za

kompleks RuvAB.

Protein RuvC

• Protein RuvC je

endonukleaza koja uvodi

jednolančane prekide u

lancima DNK iste polarnosti.

• Jednolančane prekide uvodi

posle drugog timina u sekvenci

5'-A/T-T-T-C/G -3'.

• Ova sekvenca se u molekulu

DNK E. coli nalazi na svakih

64 nukleotida.

DNK ligaza “još jednom”

• DNK krajevi nastali dejstvom proteina RuvC imaju

slobodnu 5’ fosfatnu grupu i 3’OH grupu koje se direktno

spajaju dejstvom DNK ligaze.

• Rekombinovani molekuli DNK međusobno se razdvajaju

i time je homologna rekombinacija završena.

Homologna rekombinacija

i mejoza

• Mejoza (dve sukcesivne deobe,

redukciona i ekvaciona deoba).

• Homologna rekombinacija odvija

se u pahitenu profaze I.

• Mejotička rekombinacija:

- omogućava pravilno razdvajanje

hormozoma (održavanje

genoma)

- putem krosingovera predstavlja

izvor genetičke varijabilnosti

(ekspresija genoma).

Nondisjunction

• Odsustvo mejotičke

rekombinacije za posledicu

ima nepravilno razdvajanje

hromozoma.

• Rezultat: Povećan broj

gameta bez kompletnog

broja hromozma što je

uzrok smanjenog fertiliteta.

Protein Spo11

• Protein Spo11 programirano uvodi dvolančani prekid u molekul DNK tokom inicijacije mejotičke rekombinacije.

• Topoizomerazama sličan protein koga poseduju svi eukarioti od kvasca do čoveka.

• Značaj proteina Spo11 za odvijanje homologne rekombinacije i mejoze pokazan je u eksperimentima na C.elegans.

Protein Spo11

• U formi dimera, protein Spo11 “napada” molekul DNK (svaki monomer napada po jedan lanac).

• OH grupa tirozina raskida fosfodiestarsku vezu.

• Generiše se kovalentna veza fosfatne grupe molekula DNK i proteina Spo11.

• Energija kovalentne veze može se osloboditi raskidanjem iste i iskoristiti za repariranje dvolančanog prekida u uslovima kada ćelija dobije signal za zaustavljanje procesa mejoze.

Protein Spo11

• “Seče” molekul DNK na mnogim mestima sa malom selektivnošću za sekvencu.

• Mesta delovanja proteina SPO11 nisu nasumično raspoređena po molekulu DNK – češća u regionima koji nisu čvrsto pakovani sa histonima – vruća mesta (eng. hot spots) za rekombinaciju.

• Vremenski strogo kontrolisana aktivnost.

Proteinski kompleks MRX

• Funkcija slična funkciji kompleksa

RecBCD kod E.coli.

• Sastoji se od tri subjedinice:

Mre11, Rad 50 i Nbs1/Xrs 2.

• Kompleks ispoljava nukleaznu

aktivnost

• Rezultat aktivnosti ovog

kompleksa je stvaranje invazivnog

lanca od najmanje 1kb.

Dmc1 i Rad51

• Eukariotski analozi proteina RecA

• Dmc1 se u ćeliji eksprimira

isključivo tokom mejoze

• Rad51 i tokom mitoze i tokom

mejoze

• Mejotička rekombinacija dešava se između 4 kompletna dvolančana lanca DNK (svaki u po jednoj hromatidi homologih hromozoma)

• Dcm1 zavisna rekombinacija češće se odigrava između nesestrinskih hromatida homolognih hromozoma

• Mehanizam kojom protein Dcm1 promoviše rekombinaciju između nesestrinskih hromatida je nepoznat.

• JASNA BIOLOŠKA ULOGA

Protein Dcm1

• Brojni drugi proteini uključeni su u proces mejotičke rekombinacije.

• Rad52 stimuliše vezivanja proteina Rad51 za jednolančane DNK repove.

• Rad54 eukariotski analog RuvB (?)

• Veliki protein-DNK kompleksi nazivaju se rekombinacione fabrike.

Rekombinacione fabrike

• Protein Mus81 je visoko konzerviran protein eukariota.

• Kompleks Mus81-Eme1 ima ulogu endonukleaze

(resolvaze) u razrešenju Holidejevih struktura.

Rekombinacione fabrike

• Protein BRCA2 interaguje sa proteinom Rad51 i reguliše proces mejotičke rekombinacije.

• Poslednja istraživanja pokazuju da BRCA2 protein interaguje i sa proteinom Dmc1.

• Ovo otkriće, BRCA2 protein promoviše u univerzalnog regulatora rekombinacionog

događaja.

Genska konverzija

• Genska konverzija je vrsta homologne rekombinacije bez

krosingovera i formiranja Holidejeve veze.

• Zbog odsustva krosingovera naziva se i nerecipročna

rekombinacija.

• Mehanizam kojim se odvija nerecipročna rekombinacija

naziva se i sparivanje lanaca zavisno od sinteze (eng.

synthesis-dependent strand annealing, SDSA).

Pivski kvasac

Lokus MAT – otključana kaseta

(mating – type locus)

• Mating – type geni kodiraju regulatorne proteine koji

regulišu ekspresiju gena čiji proteinski produkti definišu tip

ćelije.

• Kopije ovih gena prisutne su u svim tipovima ćelija ali se

sve ne eksprimiraju.

• Nalaze se u okviru lokusa koji se naziva lokus MAT ili

otključana kaseta.

Lokus MAT – otključana kaseta

(mating – type locus)

• U a ćelijama u lokusu MAT prisutan gen a1.

• U a ćelijama u lokusu MAT prisutni geni a 1 i a 2.

• U diploidnim ćelijama sva tri mating-type control gena

prisutna su u dva lokusa MAT.

Lokusi HMR i HML – Utišane kasete

skladište genetičkih informacija

• Svaka ćelija sadrži dodatne kopije kako gena a1, tako i

gena a1 i a2.

• Ove kopije se ne eksprimiraju i nalaze se u lokusima

označenim kao HML i HMR (“zaključane kasete”).

• Lokusi HMR i HML “čuvaju” genetičku informaciju

neophodnu da ćelija promeni svoj tip.

Nerecipročna rekombinacija

• Lokus HML kodira utišane kompije gena a

• Lokus HMR kodira utišanu kopiju gena a

• Rekombinacija između lokusa MAT i lokusa HML, a

ćelija “prelazi u” a ćeliju.

• Rekombinacija između lokusa MAT i lokusa HMR, a

ćelija “prelazi u” a ćeliju.

Sparivanje lanaca zavisno od

sinteze - SDSA

• Nerecipročna rekombinacija otpočinje uvođenjem

dvolančanog prekida u okviru lokusa MAT.

• HO sekvencno-specifična endonukleaza.

• HO endonukleaza jedino prepoznaje i seče lokus MAT

(nikada lokus HMR ili HML jer hromatinska struktura to

ne dozvoljava).


sinteze - SDSA

• Razgradnja molekula DNK u smeru 5’–3’ na mestu

delovanja HO endonukleaze odvija se istim

mehanizmom kao kod mejotičke rekombinacije dejstvom

proteinskog kompleksa MRX.


sinteze - SDSA

• Formirani jednolančani DNK rep iz lokusa MAT povezuje

se sa proteinima Rad51 i Rad52 i “napada” zaključanu

kasetu (dvolančanu DNK).


sinteze - SDSA

• Ako je u lokusu MAT sekvenca gena a1 invazijom se

napada lokus HML koji kodira utišane kopije a gena

• Ako je u lokusu MAT sekvenca a1 i a2 gena invazijom se

napada lokus HMR koji kodira utišanu kopiju a gena


sinteze - SDSA

• Nakon invazije, slobodni 3’-kraj jednolančanog DNK

repa služi kao prajmer za iniciranje sinteze DNK.

• Matrica za ovu sintezu DNK je sekvenca zaključane

kasete.


sinteze - SDSA

• Suprotno mehanizmu replikacije molekula DNK,

novosintetisani lanci komplementarni zaključanoj kaseti

napuštaju matricu i povezuju se sa sekvenacma koje

okružuju lokus MAT.

• Pre ove ligacije, preostali lanac DNK iz lokusa MAT biva

isečen.


sinteze - SDSA

• Nakon rekombinacije genetička informacija koja je u

lokusu HMR nalazi se i u lokusu MAT.

• Informacija u lokusu MAT je zamenjena, dok je

informacija u lokusu HMR ostala ista.


sinteze - SDSA • Mating-type swiching je unidirekcioni - informacija iz

lokusa HML ili HMR može biti “premeštena” u lokus MAT, ali ne i obruto

• Lokus MAT je uvek recipijentni partner rekombinacije.


sinteze – SDSA

Sledi.... Rekombinacija DNK

specifična za mesto

rekombinacija molekula dnk - bio.bg.ac.rs · i mejoza • mejoza (dve sukcesivne deobe, redukciona...

Documents