UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO

CENTRO TECNOLÓGICO - DEPTO DE ENGENHARIA AMBIENTAL

DISCIPLINA: LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA E ECOTOXICOLOGIA

ISOLAMENTO DE FUNGOS A PARTIR DE AMOSTRAS AMBIENTAIS

LAÍS MONTEIRO

LOUISE CADE JORGE

VITÓRIA/ES

2015

1. INTRODUÇÃO

Os fungos são microrganismos popularmente conhecidos por bolores, mofos,

fermentos, cogumelos, etc. Eles são encontrados no ar atmosférico, solo, na água,

nos vegetais, em animais, no homem e em detritos em geral. O isolamento de

fungos é obtido em cultura pura a partir de tecidos doentes do hospedeiro, quando

obtido um organismo em cultura pura não significa que ele seja o agente causal da

doença. Vários meios são utilizados, porém o mais usado é o Batata-Dextrose-

Ágar (BDA) e Extrato de Malte-Ágar (EMA).    

Os métodos utilizados na pratica foram de isolamento direto e indireto. O

isolamento direto é a transferência com auxílio de um estilete, de estruturas do

patógenos (hifas, esporos, rizomorfos, escleródios) direto do órgão infectado. Já o

isolamento indireto é a transferência para meio de cultura, de porções infectadas

de tecido do hospedeiro em que o patógeno está no interior do tecidos da planta

porem sem produzir frutificações na superfície do órgão lesionado.

2. OBJETIVOS

Isolar fungos a partir de uma amostra de terriço utilizando o método de diluição em

placas, e a partir de tecidos vegetais necrosados utilizando os métodos de

isolamento direto e indireto. Além disso, analisar o desenvolvimento das colônias

fúngicas obtidas pelos métodos acima.

2

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

O experimento foi dividido em três partes. Inicialmente foi utilizado o método de

diluição em placas para isolar fungos a partir de uma amostra de terriço. Na

segunda parte houve o isolamento de fungos presentes em tecidos vegetais

necrosados pelo método do isolamento direto. E por fim, foi feito o isolamento

indireto de fungos a partir do tecido vegetal lesionado de três espécies de plantas.

3.1ISOLAMENTO A PARTIR DE AMOSTRA DE TERRIÇO

.

Realizando um estudo macroscópico do isolamento da amostra de terriço, o

resultado foi a formação de uma colônia fúngica de superfície lisa e textura velutina

e uma colônia bacteriana de forma circular e aspecto brilhoso. Ou seja, sem a

presença de antibiótico bacteriano, pode ser visto que não houve o isolamento

somente dos fungos que estavam presentes, mas também de bactérias contidas na

amostra de solo.

3

Figura 1. Amostra de terriço após 7 dias de incubação.

O número de colônias fungicas foi abaixo de esperado, uma vez que segundo

Kuravov, dentre os microrganismos de solo, a biomassa fúngica é predominante e

nela se encontram várias espécies com potencial antagônico e de promoção de

crescimento. A presença de microrganismos em um determinado solo é função das

condições ambientais relacionadas. As características biológicas de fungos são

influenciadas quando as amostragens são feitas em camadas superficiais do solo;

onde as condições climáticas e de umidade sofrem variações. São nestas camadas

que ocorrem maior atividade microbiana devido ao constante depósito de material

orgânico sobre o solo (MOREIRA, 2006). A pequena quantidade de colônias

fungicas e microbianas obtidas no experimento pode ter sido motivada por erro na

metodologia ao semear incorretamente a amostra de terriço na placa de Petri.

3.2. ISOLAMENTO DE FUNGOS A PARTIR DE TECIDOS VEGETAIS

NECROSADOS

3.2.1ISOLAMENTO DIRETO

Após

a inoculação, a placa foi devidamente vedada com papel filme e incubada a 28ºC

durante 7 dias. O resultado após a incubação se encontra na figura 3.

4

Figura 2. Alimentos selecionados para a prática de isolamento direto de

fungos: ¹beringela, ²maracujá, ³laranja, 4caule de banana, 5abobrinha.

Pela observação macroscópica, ficou evidenciado que o crescimento se deu de

dentro para fora dos círculos desenhados na placa. O que obteve maior

crescimento foi o fungo isolado a partir de esporos no maracujá, que está no

círculo nº2, de coloração amarelada. O mesmo pode ser identificado como um

fungo filamentoso, que tem como característica o crescimento radial formando

anéis concêntricos.

O fungo presente no circulo de nº3, retirado da laranja, também apresenta fios

característicos de fungos filamentosos. Já nos círculos de nº4 e nº5 os fungos

isolados estão entre fungos filamentosos e leveduras. Pode ser visto que, como o

meio não é seletivo, permite o crescimento de vários microrganismos presentes em

uma mesma lesão.

Não foi claro um crescimento no círculo nº1, isolado a partir da berinjela. Isso pode

ter ocorrido devido ao maior crescimento do nº2 que impediu a visualização, ou por

erro de metodologia, por ter sido transferido um esporo fungico incorretamente.

5

Figura 3. Isolamento direto de fungos: ¹beringela,

²maracujá, ³laranja, 4caule de banana, 5abobrinha.

Após 7 dias de incubação.

3.2.2 ISOLAMENTO INDIRETO

Os resultados após 7 dias de incubação a 28ºC se encontram na Figura 5.

6

Figura 5. Isolamento indireto de fungos: ¹ fragmento de folha de mangueira, ² fragmento de folha de mangueira, ³ fragmento de folha de cajueiro, 4 fragmento de folha de cajueiro, 5 fragmento de folha de oiti.

Figura 4. Amostras de tecidos vegetais para a pratica de

isolamento indireto de fungos: ¹folha de mangueira, ²folha de

cajueiro, ³folha de oiti.

Realizando a análise macroscópica, percebeu-se que houve um crescimento dos

fungos dentro das delimitações feitas ao redor das amostras. Foi possível observar

o crescimento de fungos filamentosos no meio de cultura nas amostras de número

2, 3 e 4. Evidenciados pela textura de algodão e crescimento radial. Não ficou

evidenciado crescimento no círculo nº1, de fragmento de folha de mangueira,

provavelmente por erro na metodologia.

7

4. QUESTÕES

1)Qual a finalidade e como se classificam os meios de cultura utilizados para o

cultivo de fungos em laboratório?

Os meios de cultura têm por finalidade proporcionar o isolamento e

desenvolvimento dos microrganismos para facilitar o estudo e identificação por

meio da observação das características das colônias formadas.

Os meios de cultura para crescimento de fungos em laboratório podem ser

classificados em: Meio definido, no qual toda a composição é quimicamente

conhecida; Meio complexo, onde toda ou parte da composição não é quimicamente

conhecida; Meio seletivo, que favorece o crescimento de fungos impedindo o

crescimento de outros microrganismos, ou de um determinado fungo de interesse,

impedindo o crescimento de outros fungos; Meio diferencial, facilita a diferenciação

das colônias de um determinado fungo desejado em relação a outras colônias

crescendo na mesma placa; Meio de enriquecimento, favorece o desenvolvimento

de uma população fúngica, que estaria em desvantagem entre as populações.

2) O que é uma cultura pura de um fungo e qual a sua importância?

Cultura pura é um meio de cultivo que apresenta apenas o organismo de interesse

presente, ou seja, uma cultura isenta de todos os demais tipos de organismos,

onde todas as células na população sejam idênticas (originárias de uma mesma

célula parental). A obtenção de culturas puras de fungos é essencial para o

crescimento dos microrganismos de interesse e assim, ser possível a

caracterização, identificação e utilização desses microrganismos em inúmeras

atividades científicas e tecnológicas.

3) O que são condições assépticas de trabalho na manipulação de fungos em

laboratório? Cite exemplos de como proceder neste sentido e a importância destes

procedimentos.

São condições de trabalho essenciais para evitar contaminações provenientes dos

meios de cultura e materiais utilizados na manipulação dessas culturas e do meio

8

ambiente. Ou seja, não permitir que microrganismos existentes no laboratório

contaminem as amostras e não permitir que as culturas em estudo contaminem o

laboratório.

Essas técnicas são indispensáveis para o isolamento, cultivo e identificação de

microrganismos, pois evitam contaminações do meio de cultura e material utilizado.

Alguns procedimentos são: esterilizar o material a ser utilizado, desinfectar a área

de trabalho, trabalhar na área de segurança da lamparina ou bico de Bunsen.

4)Qual o papel dos fungos no saneamento ambiental, com ênfase em processos de

biorremediação ao nível do solo? Cite exemplos.

A biorremediação é um processo espontâneo ou manipulado no qual os

contaminantes, por meio de procedimentos microbiológicos, são transformados

e/ou degradados até a obtenção de estruturas químicas menos tóxicas e/ou

inofensivas, podendo chegar até a mineralização; diminuindo, dessa forma, o

impacto ambiental (CETEM/MCT, 2008)

Os fungos apresentam um papel muito importante no saneamento ambiental, pois

estes microrganismos são bons biodegradadores. O processo de biorremediação

do solo utilizando os fungos pode ser utilizado em recuperação de solos

contaminados por agrotóxicos, petróleo e seus derivados, e em solos

contaminados por organoclorados.

Dentre os fungos que degradam hidrocarbonetos de petróleo é importante

distinguir os filamentosos, degradadores de lignina, tais como Phanaerochaete

chrysosporium, e os não degradadores de lignina como Cunninghamella elegans

(CAMERON et al., 2000).

5)Qual o papel dos fungos na produção e no armazenamento de produtos

agrícolas e quais as conseqüências ambientais decorrentes? Cite exemplos.

Os fungos são tão prejudiciais como benéficos à agricultura. Por um lado,

prejudicam a colheita ocasionando perdas por causa das enfermidades que

produzem nas plantações.  Também podem ocasionar vários problemas aos

produtos armazenados. Além disso, os fungos podem produzir toxinas em produtos

9

como: amendoim, arroz e muitos outros. Eles também ajudam a abrir caminho para

outros agentes de deterioração como as leveduras e as bactérias, bem como aos

insetos.

Em contraste aumentam a fertilidade do solo. Um exemplo é a interação entre

fungos e raízes, denominada associação micorrízica, constitui importante fator de

sobrevivência e crescimento das plantas. Também são utilizados no controle

biológico de pragas, como: o Metarrhizium para eliminação de gorgulhos, o

Coniothyrium minitans para controle de fungos que destroem culturas de soja e

feijão e o Paecilomyces fumosoroseus para controle de cupins.

5. CONCLUSÃO

Através da pratica realizada, foi possível observar que o meio de cultura utilizado

possibilitou realmente o crescimento dos microrganismos que foram isolados, e

induziu a formação de

estruturas reprodutivas da maioria dos fungos

testados.

Também ficou evidente a importância do conhecimento adquirido. Pudemos

aprender a realizar esse isolamento e tornar viável a repicagem e o estudo da

cultura pura do fungo a ser estudado. Além disso, foi possível perceber a

diversidade de fungos presentes no meio ambiente e algumas de suas diferencias

macroscópicas.

10

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

CAMERON M. D.; TIMOFEEVSKI S.; AUST S. D. Enzymology of Phanerochaete

chrysosporium with respect to the degradation of recalcitrant compounds

and xenobiotics. Applied Microbiology and Biotechnology. December 2000.

CASSINI, Servio Tulio.; KELLER, Regina; RODRIGUES, Celson; WAGNNER,

Paulo. Apostila de Aulas Práticas. UFES, Departamento de Engenharia

Ambiental, Laboratório de Análises Físico-Químicas.

KURAKOV, A. V.; NECHITAILO, T. Yu.; GOLYSHIN, P. N.; ZVYAGINTSEV, D.G.

Pinotti, Santos, Klauberg Filho, Michelleti & Castro. Diversity of facultatively

anaerobic microscopic Mycelial Fungi in Soils. Microbiology. Rev. Bras. de

Agroecologia vol. 77, Nº1, pp 90-98. 2008

LINHARES, Sérgio; GEWANDSZNAJDER, Fernando. Biologia. Editora Ática,

volume único, 1ª edição, 2007.

LEMOS, J. L. S.; BARROS, C. A.; OLIVEIRA, S. D.; REICHE, A. P.. Fungos

filamentosos: agentes de degradação de petróleo e de hidrocarbonetos

aromáticos policíclicos (HAPs). Série Tecnologia Ambiental, CETEM/MCT, 2008.

Disponível em < http://mineralis.cetem.gov.br/handle/cetem/323>. Acessado em 6

de setembro de 2015

MOREIRA, F. M. S.; SIQUEIRA, J.O.. Microbiologia e Bioquímica do solo. 2ªed,

Lavras MG: Ed UFLA, 2006, v.7, p.98.il.

PINOTTI, Maria Margareth Zamboni; SANTOS, Júlio César Pires; KLAUBERG

FILHO, Osmar; MICHELLUTI, David José; CASTRO, David Ricardo Lima.

Isolamento de Fungos de Solo Associados a culturas de Amora, Framboesa e

Mirtilo no sul do Brasil. Rev. Bras. de Agroecologia. 6(1): 67- 80.2011. Disponível

11

em <http://orgprints.org/24151/1/Pinotti_Isolamento.pdf>.Acessado em 26 de

setembro de 2015.

TORTORA, Gerard J.; CASE, Christine L.; FUNKE, Berdell R. Microbiologia. 10.

ed. Porto Alegre: Artmed, 2012. xviii, 934 p.

12