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EFEITOS DE DIFERENTES TEMPOS DE DESMINERALIZAÇÃO COM ÁCIDO FOSFÓRICO
SOBRE A MICROESTRUTURA E PROPRIEDADES ÓPTICAS DO ESMALTE
DENTAL
Projeto de pesquisa de iniciação científica a ser submetido para concessão de bolsa pelo programa PIC/UFABC.
Aluna: Jemima Barbosa Pereira
Orientadora: Profa. Dra. Patricia A. da Ana
Curso: Engenharia Biomédica
Centro: Centro de Engenharia, Modelagem e Ciências Sociais Aplicadas - CECS
SANTO ANDRÉ
22
2011
CONTEÚDO
1. RESUMO...................................................................................................................3
2. INTRODUÇÃO.........................................................................................................4
3. OBJETIVO.................................................................................................................8
4. MATERIAL E MÉTODO..........................................................................................9
4.1. Delineamento experimental..................................................................................................................9
4.2. Obtenção e preparo das amostras...................................................................................................10
4.3. Análise por microscopia de fluorescência...................................................................................11
4.4. ANÁLISE MORFOLÓGICA.....................................................................................................................11
4.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA.........................................................................................................................12
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES...........................................................................13
6. CONCLUSÃO.........................................................................................................22
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................14
PALAVRAS-CHAVE
Fluorescência, esmalte, desmineralização, morfologia.
22
1. RESUMO
O estudo da fluorescência tem se tornado uma ferramenta promissora
de diagnóstico das pequenas modificações químicas promovidas pelas
desmineralizações dos tecidos duros dentais, dentre as quais se enquadram a
cárie, erosão, condicionamento ácido, dentre outros. Contudo, ainda há a
necessidade de se desenvolver métodos eficazes e acessíveis para aplicação
clínica. O presente projeto avaliou os efeitos de diferentes tempos de aplicação
de ácido fosfórico a 37% sobre a microestrutura e morfologia do esmalte
dental, comparando-se os dados com os resultados obtidos por meio da
detecção de fluorescência por imagem hiperespectral.
Para a execução deste projeto, foram preparadas 60 amostras de esmalte
dental. Estas amostras foram submetidas à avaliação inicial por FTIR
(Espectroscopia de absorção no infravermelho por transformada de fourier); em
seguida, as amostras foram desmineralizadas por ácido fosfórico a 37% sob
diferentes tempos de tratamento. Em seguida, as amostras foram novamente
avaliadas por FTIR. Após as análises de fluorescência, as amostras foram
submetidas à avaliação morfológica por FTIR. Os dados obtidos por FTIR
foram comparados com os dados já previamente obtidos pelo sistema de
imagens hiperespectrais, buscando-se encontrar uma correlação e, com isso,
identificar se o sistema por imagens hipersespectrais pode ser considerado
como um instrumento promissor para identificação da fluorescência em
pequenas desmineralizações do tecido duro dental.
22
2. INTRODUÇÃO
A aparência do sorriso tem grande impacto na vida dos indivíduos,
afetando desde o convívio social até relações profissionais. Assim, a
Odontologia Estética, com o passar do tempo, tem evoluído em busca de
materiais e técnicas restauradoras que mimetizem o aspecto natural dos
elementos dentários. Para tal, tornou-se comum o uso de resinas compostas
fotopolimerizáveis e cerâmicas estéticas, as quais se utilizam de
condicionamento ácido prévio para possibilitar o embricamento nos tecidos
duros dentais.
Atualmente, o uso de ácido fosfórico a 37% tem se tornado rotina para a
execução da maioria dos procedimentos odontológicos, incluindo a confecção
de restaurações de resina composta, a instalação de aparelhos ortodônticos
estéticos, a cimentação de facetas ou próteses em porcelana, dentre outros.
Trata-se de um procedimento que visa o condicionamento prévio da superfície
do tecido dental exposto, seja esmalte ou dentina, o qual possibilita o maior
embricamento químico-mecânico dos materiais restauradores, principalmente
por intermédio de diferentes sistemas adesivos1,2.
Para esta ação, o agente condicionador promove a dissolução dos
cristais de hidroxiapatita, removendo uma camada micrométrica da superfície
do esmalte e da dentina, expondo uma estrutura porosa de prismas de esmalte
e da rede de colágeno da dentina. Este fenômeno aumenta a rugosidade
superficial do tecido, permitindo que os sistemas adesivos e selantes penetrem
por capilaridade, formando projeções resinosas (tags) e estabelecendo-se,
assim, uma retenção micromecânica com o material restaurador resinoso3,4.
22
Para possibilitar tais aplicações, empregam-se tempos de
condicionamento ácido distintos, os quais podem gerar diferentes efeitos
morfológicos e microestruturais na estrutura dental5. Sabe-se que, para
execução de uma restauração padrão de resina composta, o condicionamento
com ácido fosfórico a 37% deverá respeitar o tempo preconizado de 15
segundos para esmalte e 10 segundos para dentina. Contudo, na literatura,
existem controvérsias a respeito do tempo ideal que deve ser utilizado nos
dentes, o qual pode variar de 15 segundos até 4 minutos, dependendo do
material restaurador e da técnica aplicada6.
Relatos demonstram que, quanto maior o tempo de exposição da
superfície ao condicionamento ácido, maiores são as modificações químico-
estruturais proporcionadas tanto em esmalte quanto em dentina, o que
depende também da região a ser desmineralizada, na qual pode variar a
orientação dos prismas (no caso do esmalte) ou mesmo a composição da
matriz orgânica (no caso de dentina exposta a um longo processo de cárie, por
exemplo)7. Assim, embora o condicionamento prévio dos tecidos duros seja um
passo essencial para possibilitar o correto embricamento do material resinoso a
ser aplicado, a exposição exacerbada ao ácido pode proporcionar danos
químicos nas superfícies, promovendo a degradação da rede de colágeno da
dentina e, com isso, comprometendo a longevidade das restaurações8.
O condicionamento dos tecidos duros dentais com ácido fosfórico
também modifica as propriedades ópticas destes tecidos. Conhecendo estas
modificações, seria possível desenvolver um equipamento ou técnica que
podesse ser sensível para detectar estas mudanças.
22
Desta maneira, o estudo da fluorescência tem se tornado uma
ferramenta promissora de diagnóstico das pequenas modificações químicas
promovidas pelas desmineralizações dos tecidos duros dentais, dentre as quais
se enquadram a cárie, erosão, condicionamento ácido, dentre outros. Em
termos físicos, a fluorescência é um fenômeno óptico onde uma substância é
excitada energeticamente por exposição a certos tipos de luz, acarretando a
elevação dos elétrons da camada mais externa dessa substância e, com isso,
ocupem órbitas de maior conteúdo energético. Quando a substância volta a
seu estado fundamental, o elétron retorna à sua órbita normal, liberando fótons
de energia na forma de luz. Na fluorescência, a emissão de luz pelo corpo
excitado ocorre somente durante a exposição do corpo à fonte de energia
excitatória. Se permanecesse emitindo luz por mais tempo, o fenômeno se
chamaria fosforescência9.
A fluorescência da estrutura dental é determinada principalmente pela
dentina, pois apresenta um número maior de pigmentos orgânicos
fotossensíveis, resultando em cerca de três vezes mais fluorescência que o
esmalte10. Para sua detecção, equipamentos como o DiagnoDent e o QLF
(Quantitative light fluorescence) já se encontram disponíveis para utilização
clínica pelos cirurgiões-dentistas. A detecção das mudanças na fluorescência
de esmalte dental submetidos a vários tempos de condicionamento ácido foi
proposta empregando-se o QLF11 e o LIF12 (laser induced luorescence),
obtendo-se resultados promissores; contudo, fatores como alto custo e baixa
disponibilidade no mercado limitam as aplicações destas técnicas.
Desta maneira, busca-se desenvolver um método que possibilite a
detecção de pequenas mudanças no conteúdo mineral e orgânico dos tecidos
22
duros dentais, o qual apresente sensibilidade e especificidade, além dos
requisitos de baixo custo e disponibilidade. Assim, o uso do sistema de análise
hiperespectral, uma combinação da técnica de espectroscopia com a formação
de imagens digitais, permite a análise das propriedades ópticas dos tecidos,
com resolução espacial e espectral ao mesmo tempo, mostrando-se uma
técnica promissora para tal fim. Nesta técnica, emprega-se um espectrômetro,
uma lente objetiva, uma câmera CCD, um sistema de iluminação e um
scanner13.
Este projeto trata-se de uma continuação do projeto de PDPD proposto
anteriormente para a mesma discente, em que foi possível monitorar as
mudanças ocorridas em esmalte dental bovino exposto a diferentes tempos de
condicionamento ácido por imagem hiperespectral. Ainda assim, para validar-
se tal método, são necessárias análises do tecido dental por meio de outras
técnicas.
A espectroscopia de absorção no infravermelho (IR) é uma técnica que
pode ser utilizada como sonda óptica de análise molecular com a finalidade de
diagnosticar tecidos doentes14. A espectroscopia FTIR é uma variação da
espectroscopia IR, a qual propicia algumas vantagens, tais como maior
rapidez, alta reprodutibilidade e alta razão de sinal/ruído. Desta maneira, pode
constituir-se em uma análise não destrutiva, refletindo características químicas
e bioquímicas da substância analisada15,16.
Sendo assim, o FTIR será utilizado buscando-se estabelecer uma
comparação com o método desenvolvido, analisando as diferenças promovidas
pelos diferentes tempos de aplicação de ácido fosfórico, o que motivou a
proposição do presente projeto de Iniciação científica.
22
3. OBJETIVO
O objetivo principal deste projeto é avaliar os efeitos de diferentes
tempos de aplicação de ácido fosfórico a 37% sobre a microestrutura e
morfologia do esmalte dental, comparando-se os dados com os resultados
obtidos por meio da detecção de fluorescência por imagem hiperespectral.
22
4. MATERIAL E MÉTODO
O presente projeto foi executado em parceria com o Prof. Dr. Emery
Cleiton C. Lins, do CECS-UFABC. Previamente à execução dos experimentos,
o presente projeto foi submetido à avaliação pela Comissão de Ética em Uso
de Animais da UFABC (CEUS-UFABC), cujos experimentos foram iniciados
apenas após aprovação desta comissão.
4.1. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Para a execução deste projeto, foram empregados 60 dentes incisivos
inferiores bovinos, dos quais foram preparados 6 grupos, cada um com 10
amostras de esmalte dental. Estas amostras foram submetidas à avaliação
inicial por FTIR; em seguida, as amostras foram desmineralizadas por ácido
fosfórico a 37% sob diferentes tempos de tratamento. Em seguida, as amostras
foram novamente avaliadas por FTIR. Após as análises de fluorescência, as
amostras foram desidratadas, recobertas com ouro e submetidas à avaliação
morfológica por microscopia eletrônica de varredura. Os dados obtidos por
FTIR foram comparados com os dados já previamente obtidos pelo sistema de
imagens hiperespectrais, buscando-se encontrar uma correlação e, com isso,
identificar se o sistema por imagens hipersespectrais pode ser considerado
como um instrumento promissor para identificação da fluorescência em
pequenas desmineralizações do tecido duro dental.
22
4.2. OBTENÇÃO E PREPARO DAS AMOSTRAS
Para a realização deste projeto, foram empregados 60 dentes incisivos
bovinos. Os dentes foram cedidos por frigoríficos após aprovação pela CEUA-
UFABC. Após cessão, os dentes foram limpos por meio de lavagem com água
e detergente e profilaxia com pedra-pomes e água. Em seguida, os dentes
foram verificados em lupa esterescópica (10X) para visualização de eventuais
trincas, manchamentos ou desmineralizações. Os que continham tais
características foram descartados. Para evitar desidratação, os dentes foram
mantidos em ambiente úmido sob refrigeração até o início dos experimentos.
Em seguida, os dentes foram seccionados, no sentido ocluso-cervical,
com cortes paralelos à face vestibular do dente, por meio de disco diamantado
sob refrigeração. Os cortes foram realizados de forma que sejam obtidas fatias
de esmalte de 4 x 4 x 1 mm. As fatias finalizadas foram submetidas ao
polimento usando-se lixas de granulação 1200, feltro e pasta diamantada de 1
µm. Ao final, as amostras foram submetidas ao banho ultrassônico com
detergente aniônico.
Após preparo, as amostras foram aleatoriamente distribuídas em 6
grupos experimentais (n = 10), a saber:
- Grupo 1: amostras desmineralizadas por 15 s;
- Grupo 2: amostras desmineralizadas por 30 s;
- Grupo 3: amostras desmineralizadas por 45 s;
- Grupo 4: amostras desmineralizadas por 60 s;
- Grupo 5: amostras desmineralizadas por 2 minutos;
- Grupo 6: amostras desmineralizadas por 3 minutos.
22
As desmineralizações foram feitas aplicando-se ácido fosfórico 37%
(ScotchBond, 3M ESPE, Brasil) em toda a superfície do esmalte, pelos tempos
determinados em cada grupo experimental. Decorrido este tempo, as amostras
foram lavadas com água destilada e secas com leve jato de ar.
4.3. ANÁLISE POR FTIR(ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NO INFRAVERMELHO POR TRANSFORMADA DE FOURIER)
O FTIR foi utilizado para a tomada de espectros de autofluorescência do
conteúdo orgânico e mineral das amostras submetidas aos diferentes tempos
de demineralização. As análises foram feitas no FTIR, disponível na Central
Multiusuário da UFABC.
Em cada amostra, foram feitas duas análises: anteriormente à
desmineralização e imediatamente à desmineralização. Desta maneira, foi
possível comparar as mudanças na fluorescência de cada amostra
individualmente.
4.4. ANÁLISE MORFOLÓGICA
Após as análises de fluorescência, a morfologia das amostras foi
verificada por meio de microscopia eletrônica de varredura. Para tal, as
amostras de dentina foram desidratadas e recobertas com ouro.
Assim, as amostras foram fixadas em solução de Glutaraldeído 2%
durante 2 horas e lavadas com solução Tampão Fosfato 0,1 M (3 lavagens de
5 minutos cada). Posteriormente, as amostras foram deixadas em Tampão
Ósmio por 20 minutos, lavadas em seguida com Tampão Fosfato 0,1 M (3
lavagens de 5 minutos cada) e desidratadas em soluções de concentrações
22
crescentes de álcool (30%, 50%, 70%, 90%, 96% e 100%), com duas lavagens
de 5 minutos em cada solução.
Após a desidratação, as amostras foram fixadas em HMDS
(Hexamethyldisilazane) por 20 minutos e secas em capela por 2 horas. Então,
as amostras foram coladas em suportes metálicos apropriados (stubs) com
auxílio de cola prata condutora, onde foi depositado um filme fino de ouro (de
espessura aproximada de 10 µm) sobre as mesmas por 120 segundos com o
equipamento Sputter Coater, TEC SCD050, Bal Tec, Zurich, Ge, pertencente
ao IPEN/CNEN-SP. As amostras mantidas em dessecador até o momento das
análises. As amostras foram examinadas no FTIR, pertencente à Universidade
Federal do ABC.
4.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados de alterações na fluorescência do esmalte obtidos por meio do
FTIR foram comparados com os dados obtidos por sistema de imagens
hiperespectrais, buscando-se encontrar uma correlação.
A análise estatística dos dados provenientes de cada metodologia de
análise foi realizada de acordo com a homogeneidade e normalidade que os
dados apresentarem, considerando o nível de significância de 5%.
22
6. RESULTADOS E DISCUSSÕES
A figura 1 ilustra um espectro representativo de esmalte sadio obtido por
ATR-FTIR, onde podem ser observadas as principais bandas vibracionais na
região do infravermelho para os componentes deste tecido.
Figura 1: Espectro representativo de amostra de esmalte bovino sadio obtidos por equipamento ATR-FTIR, onde são evidenciadas as principais bandas de absorção consideradas para o presente estudo
A tabela 1 mostra as bandas vibracionais do esmalte sadio, de acordo
com dados da literatura.
3 fo
sfat
o
1 fo
sfat
o
H2O
, O-
H
C-Ham
ida
Iam
ida
II 3
car
bona
to +
am
ida
II 3
carb
onat
o
2
carb
onat
o
22
Tabela 1: Bandas de absorção presentes em esmalte17.
Vibração Frequência de vibração aproximada (cm-1)
Estiramento assimétrico do fosfato (3) 1028; 1008Vibração do fosfato (1) 950Deformação angular assimétrica do carbonato (2)
880
Estiramento assimétrico do carbonato (3) 1415Amida III (vibração C-N) 1236Amida II (vibração C-N ou N-H) 1443Amida I (ligação C=O) 1650
Pela Tabela 1 e pela Figura 1, pode-se observar que o esmalte dental
apresenta significativamente maior conteúdo de fosfato, o que está relacionado
com a estrutura cristalina do esmalte, composto de aproximadamente 95% de
mineral, 2% material orgânico e 3% de água em peso35F35F18,36F36F19. Este
conteúdo mineral constitui-se principalmente de cristais de apatita firmemente
unidos, separados de seus vizinhos por finos espaços intercristalinos, os quais,
assim, são preenchidos com água e material orgânico, basicamente composto
por proteínas e lipídeos37F37F20. Por sua composição, observa-se que o
esmalte possui pequena quantidade de água e material orgânico (composta por
proteínas – amidas I, II e III), cujas bandas de absorção encontram-se de
pequena intensidade nos espectros de FTIR.
Os radicais fosfato detectados nos espectros de FTIR encontram-se na
hidroxiapatita mineral [Ca10(PO4)6(OH)2] presente nos cristais de hidroxiapatita.
Porém, inclusões de carbonato, sódio, flúor, magnésio, potássio, cobre, cloro,
ferro, manganês, enxofre, chumbo e outros íons fazem da apatita biológica
uma forma impura do mineral, sendo que 80% a 90% destes correspondem à
22
hidroxiapatita carbonatada40F40F21. Desta forma, a presença de carbonato
pode ser visivelmente detectada nos espectros de FTIR.
A hidroxiapatita carbonatada poderia ser representada quimicamente
pela fórmula: (Ca,Mg,Na,X)10(PO4,HPO4,CO3)6(OH,Cl)2 22
102H102H, onde X
representa inclusões de outros íons. Estes componentes menores
correspondem a 3% da composição total do esmalte, dos quais o carbonato e o
sódio correspondem a 9/10103H103H. Como componentes principais, os
cristais de apatita possuem cerca de 37% de cálcio, 52% de fosfato (sendo
18% de fósforo), 3% de hidroxila e razão molar de cálcio e fósforo (Ca/P) de
1,6441F41F23.
Os cristais de hidroxiapatita têm, em média, 50 nm de largura em corte
transversal e mais de 100 nm de comprimento4H104H 6. Cada cristal é
circundado por uma camada de água firmemente ligada, a qual é evidenciada
na região compreendida entre 1630 a 3570 cm-1. Contudo, esta água adsorvida
pode ser removida apenas quando o esmalte é aquecido a 600o C105H105H24;
isto porque a assimetria e a grande área superficial dos cristais de
hidroxiapatita confere um campo elétrico forte que atrai íons e moléculas
eletricamente carregados, dentre eles a água42F42F25.
A Figura 2 mostra as médias dos espectros de ATR-FTIR obtidos em
decorrência dos diferentes tratamentos com ácido fosfórico (H3PO4) propostos
no presente trabalho. É importante enfatizar que, para as análises do presente
trabalho, foi desconsiderada a região compreendida entre 2500 a 4000 cm-1,
pois o tratamento com ácido fosfórico não interfere no conteúdo de água
adsorvida, conforme justificado anteriormente.
22
Figura 2: Média dos espectros de reflexão por infravermelho obtidos, utilizando-se a técnica de ATR-FTIR, de amostras de esmalte submetidas aos diferentes tratamentos propostos, considerando-se a região compreendida entre 650 cm-1
e 4000 cm-1.
A figura 3 mostra a média dos espectros obtidos em cada grupo
experimental de tratamento do presente estudo, na região compreendida entre
650 cm-1 e 1200 cm-1. Por esta figura, é possível notar mudanças importantes
relacionadas principalmente à região do fosfato, componente mais influenciado
pela ação do ácido fosfórico.
22
Figura 3: Média dos espectros de reflexão por infravermelho obtidos, utilizando-se a técnica de ATR-FTIR, de amostras de esmalte submetidas aos diferentes tratamentos propostos, considerando-se a região compreendida entre 650 cm-1
e 1200 cm-1. As setas evidenciam a redução da intensidade da banda 954 cm-1
após os tratamentos, correspondente à vibração 1 do radical fosfato.
Pela análise da figura 3, pode-se observar que a aplicação de ácido
fosfórico possibilitou a significativa diminuição da área sob a banda de vibração
1 do radical fosfato quando comparado com o grupo sem tratamento,
independentemente do tempo de aplicação (setas vermelhas). Estes achados
comprovam o efeito promovido pelo ácido fosfórico no esmalte, o qual promove
a desmineralização superficial do mesmo, removendo o mineral e exercendo
pouca influência na matriz orgânica. Dependendo do tempo de aplicação,
podem ocorrer diversos padrões distintos de remoção de mineral, classificados
por Silverstone (1975) 26 como padrões de condicionamento tipo I (onde ocorre
a remoção apenas do centro dos prismas de esmalte); padrão tipo II (onde
22
ocorre a remoção da periferia dos prismas, deixando intacto o centro do
prisma) e padrão tipo III (define uma rugosidade generalizada na superfície do
esmalte, não apresentando semelhanças à morfologia prismática). Um estudo
de Chow & Brown (1973)27 demonstrou que concentrações de ácido fosfórico
superiores a 30% no esmalte resultam na formação de fosfato de monocálcio
monohidratado, o qual é mais solúvel que a hidroxiapatita e, por esta razão, é
facilmente removido durante a lavagem do condicionador ácido, procedimento
que foi executado em todas as amostras do presente estudo para simular a
aplicação clínica do produto. Por esta razão, não foi possível observar a
presença deste composto nos espectros de ATR-FTIR, mas sim apenas os
efeitos da remoção de material cristalino do esmalte.
Trabalhos anteriores mostram que a morfologia e o padrão de
condicionamento não diferem quando o ácido fosfórico é aplicado por 15, 30 ou
60 segundos28; tais assertivas condizem com os dados de ATR-FTIR do
presente trabalho, quando não se evidencia diferenças significantes entre o
conteúdo de fosfato presente nos grupos 15s, 30s, 45s ou 60s. Nestes
períodos, ocorre a remoção de cerca de 7 a 10 µm da superfície do esmalte.
Contudo, observa-se que o aumento da exposição do esmalte ao ácido
por 120s e 180s ocasiona uma significante redução da intensidade da banda
do radical fosfato em comparação com os demais tempos de exposição. Tal
fato é esperado, pois uma maior exposição leva à uma maior atividade de
desmineralização promovida pelo ácido fosfórico, representada por uma maior
perda de hidroxiapatita e, consequentemente, de fosfato.
22
A Figura 4 mostra os efeitos da aplicação de ácido fosfórico sobre a
matriz orgânica do esmalte, representada pelos conteúdos de carbonato e
amidas I, II e III.
Figura 4: Média dos espectros de reflexão por infravermelho obtidos, utilizando-se a técnica de ATR-FTIR, de amostras de esmalte submetidas aos diferentes tratamentos propostos, considerando-se a região compreendida entre 1300 cm-
1 e 1700 cm-1.
Por esta figura, também é possível observar que a aplicação de ácido
fosfórico promove significativa redução dos conteúdos de carbonato e amidas.
Tal fato sugere que ocorra uma desnaturação das proteínas que compõem a
matrix orgânica do esmalte pela ação do ácido, o que corrobora achados
anteriores relatados por Botta et al. (2011)29, os quais evidenciaram significativa
22
desnaturação do colágeno presente na dentina após aplicação do ácido
fosfórico por 15 segundos. Embora no esmalte o conteúdo proteico seja inferior
ao da dentina, os efeitos do baixo pH na matriz orgânica também puderam ser
evidenciados por ATR-FTIR, demonstrando que tal técnica mostra-se
apropriada para avaliar tais efeitos.
7. CONCLUSÕES
De acordo com os resultados obtidos no presente trabalho, é possível
concluir que a aplicação de ácido fosfórico sobre o esmalte dental promove a
redução de fosfato e interfere no conteúdo da matriz orgânica, tendo seus
efeitos uma relação positiva com o tempo de exposição ao ácido.
22
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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