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EFEITOS ANATOMOPATOLÓGICOS APÓS CONTAMINAÇÃO IN VITRO POR

CLORETOS DE MERCÚRIO E DE CÁDMIO EM TESTÍCULOS DO PEIXE

TELEÓSTEO Gymnotus carapo (tuvira) (LINNAEUS, 1758)

RENATA VASCONCELOS MOREIRA

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE

DARCY RIBEIRO - UENF

CAMPOS DOS GOYTACAZES/RJ

NOVEMBRO DE 2010

i

EFEITOS ANATOMAPATOLÓGICOS APÓS CONTAMINAÇÃO IN VITRO POR



RENATA VASCONCELOS MOREIRA

Dissertação apresentada ao Centro

de Biociências e Biotecnologia da

Universidade Estadual do Norte

Fluminense como parte das

exigências para obtenção do Título de

Mestre em Biociências.

Orientador: Prof. Dr. Edésio José Tenório de Melo

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE

DARCY RIBEIRO - UENF

CAMPOS DOS GOYTACAZES/RJ

NOVEMBRO DE 2010

ii

EFEITOS ANATOMOPATOLÓGICOS APÓS CONTAMINAÇÃO IN VITRO POR



Dissertação apresentada ao Centro

de Biociências e Biotecnologia da

Universidade Estadual do Norte

Fluminense como parte das

exigências para obtenção do Título de

Mestre em Biociências.

Aprovada em 12 de novembro de 2010.

Comissão examinadora:

_________________________________________________________________

Prof. Carlos Eduardo de Rezende (Dr. em Ciências Biológicas - Biofísica) - UENF

_________________________________________________________________

Prof. Eulógio Carlos Queiroz de Carvalho (Dr. em Patologia - Anatomia Patológica) -

UENF

_________________________________________________________________

Prof. Leonardo Gomes da Silva (Dr. em Biociências e Biotecnologia) - UFRJ

________________________________________________________________

Prof. Edésio José Tenório de Melo (Dr. em Ciências Biológicas - Biofísica) - UENF

(Orientador)

iii

“Não é o desafio com que nos deparamos que

determina quem somos e o que estamos nos tornando,

mas a maneira com que respondemos ao desafio.

Somos combatentes, idealistas, mas plenamente conscientes.

Problemas para vencer, liberdade para provar.

E, enquanto acreditamos em nosso sonho,

nada é por acaso.”

(Henfil)

iv

AGRADECIMENTOS

As nossas principais conquistas não são frutos de um trabalho isolado, tão

pouco individual, por isto agradeço, primeiramente, ao meu orientador Prof. Dr.

Edésio José Tenório de Melo, pela oportunidade de crescimento e por ter acreditado

em mim! Obrigada.

À minha querida mãe, pelo incentivo e apoio não só durante este período,

mas em toda minha vida.

Aos meus irmãos Alex e Alan, pela união, respeito e amizade.

Ao meu marido Leonardo pela cumplicidade e amor incondicional. Meu porto

seguro. Amo você!

À Juliana, minha “irmã”, pela amizade e, sobretudo, pelo apoio e

encorajamento para superar as dificuldades vividas.

Ao meu amigo Diogo, pelo carinho e por estar sempre me fazendo sorrir com

seu jeito espontâneo de ser.

A Cristiane Vergílio, pela ajuda indispensável durante a execução deste

trabalho, e, é claro, pelas sugestões e críticas.

Ao pescador César.

Ao Prof. Dr. Carlos Eduardo Veiga de Carvalho pela colaboração e incentivo.

Ao Prof. Eulógio Carlos Queiroz de Carvalho e aos técnicos Luciano Grillo de

Almeida, Luciana da Silva Lemos, Ricardo Guerreiro e Elizabeth Gonçalves Pires do

Setor de Morfologia e Anatomia Patológica do Laboratório de Sanidade Animal

(CCTA/UENF), por todo auxílio e disponibilidade.

v

Aos funcionários do Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, especialmente

as técnicas: Beatriz Ferreira Ribeiro e Giovanna Alves de Moraes, pela ajuda no

desenvolvimento da pesquisa.

Ao Laboratório de Ciências Ambientais (LCA).

As meninas do Setor de Toxicologia Celular: Carol e Laís pela ajuda nos

aquários e pela amizade, que mesmo em pouco tempo, foi muito importante para

mim.

A todos os professores do Laboratório de Biologia Celular e Tecidual, por todo

conhecimento transmitido durante esses anos. Em especial ao Prof. Dr. Flávio Costa

Miguens.

Aos membros da banca examinadora: Carlos Eduardo de Rezende, Eulógio

Carlos Queiroz de Carvalho e Leonardo Gomes da Silva.

À CAPES, FAPERJ e UENF pelo apoio logístico e financeiro.

vi

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS............................................................................................................... vii

LISTA DE TABELAS.............................................................................................................. viii

ABREVIATURAS..................................................................................................................... ix

RESUMO..................................................................................................................................x

ABSTRACT.............................................................................................................................. xi

1.INTRODUÇÃO.......................................................................................................................1

1.1.Metais Pesados ..................................................................................................................1

1.2.Mercúrio..............................................................................................................................3

1.3.Cádmio ...............................................................................................................................6

1.4.Contaminação in vitro e Exposição aguda .........................................................................8

1.5.Peixes nos estudos de Toxicologia ............................................................ .......................9

1.5.1.Espécie utilizada: Gymnotus carapo .............................................................................10

1.6.Testículos e espermatogênese em peixes .......................................................................14

1.7.Histopatologia.... ...............................................................................................................17

1.8.Efeito dos metais pesados nos testículos.........................................................................18

2.OBJETIVOS.........................................................................................................................20

2.1.OBJETIVO GERAL...........................................................................................................20

2.2.OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................20

3.MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................................21

3.1.Coleta dos exemplares de Gymnotus carapo...................................................................21

3.2.Preparação de soluções...................................................................................................22

3.3.Contaminação dos exemplares de Gymnotus carapo por HgCl2 e CdCl2 ........................22

3.4.Preparação para Microscopia Óptica (MO) ......................................................................26

3.5.Preparação para Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) ....................................27

3.6.Preparação para Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV).........................................27

4. RESULTADOS. ..................................................................................................................29

4.1.Efeitos tóxicos do HgCl2 e CdCl2 nos exemplares de Gymnotus carapo..........................29

4.2.Aspectos anatômicos do testículos de Gymnotus carapo ................................................30

4.3.Aspectos histológicos .......................................................................................................32

4.4. Aspectos ultraestruturais .................................................................................................40

4.5. Aspectos morfológicos dos espermatozóides de Gymnotus carapo ...............................43

5.DISCUSSÃO........................................................................................................................43

6.CONCLUSÕES....................................................................................................................48

7.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................49

vii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.Tabela periódica dos elementos químicos....................................................2

Figura 2. Principais alvos para toxicidade do Hg........................................................5

Figura 3. Foto da espécie Gymnotus carapo............................................................10

Figura 4. Localização do órgão elétrico em Gymnotiformes.....................................11

Figura 5. Localização dos testículos de Gymnotus carapo.......................................13

Figura 6. Testículos de Gymnotus carapo.................................................................14

Figura 7. Espermatogênese em peixes.....................................................................15

Figura 8. Localização da Lagoa de cima...................................................................21

Figura 9. Aspectos anatômicos do testículo de Gymnotus carapo............................31

Figura 10. Região do testículo de Gymnotus carapo onde foram realizados cortes

transversais................................................................................................................32

Figura 11. Organização estrutural do testículo de Gymnotus carapo (grupo

controle)......................................................................................................................35

Figura 12. Organização estrutural do testículo de Gymnotus carapo (grupo exposto

a 5µM e 10µM de HgCl2)............................................................................................36


a 20µM e 30µM de HgCl2)..........................................................................................37


a 10µM, 30µM e 40µM de CdCl2)...............................................................................38

Figura 15. Corte transversal dos testículos de Gymnotus carapo.............................39

Figura 16. Organização ultraestrutural do testículo de Gymnotus carapo (grupo

controle)......................................................................................................................41


exposto ao HgCl2 e CdCl2).........................................................................................42

Figura 18. Fotomicrografia dos espermatozóides de Gymnotus carapo corados com

Giemsa.......................................................................................................................44

Figura 19. Fotomicrografia (MEV) dos espermatozóides de Gymnotus carapo........45

Figura 20. Porcentagem de espermatozóides do grupo controle e do grupo exposto

ao HgCl2 e CdCl2 com flagelo e sem flagelo..............................................................46

viii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Resumo das alterações histológicas nos testículos de peixes causados

por metais pesados....................................................................................................19

Tabela 2. Tabela de conversão das concentrações de HgCl2 em µM para µg/g...... 24

Tabela 3 Tabela de conversão das concentrações de CdCl2 em µM para µg/g........24

Tabela 4. Número amostral, comprimento padrão e peso dos exemplares de

Gymnotus carapo utilizados para o experimento de HgCl2........................................25

Tabela 5. Número amostral, comprimento padrão e peso dos exemplares de

Gymnotus carapo utilizados para o experimento de CdCl2........................................25

Tabela 6. Numero de exemplares de Gymnotus carapo que morreram durante a

exposição ao HgCl2....................................................................................................29

Tabela 7. Número de exemplares de Gymnotus carapo que morreram durante a

exposição ao CdCl2....................................................................................................29

Tabela 8. Número amostral, peso do testículo e o índice gonadossomático dos

exemplares de Gymnotus carapo expostos ao HgCl2................................................31


exemplares de Gymnotus carapo expostos ao CdCl2................................................32

ix

ABREVIATURAS

Cd: Cádmio

CdCl2: Cloreto de cádmio

EODs: Descargas dos órgãos elétricos

Hg: Mercúrio

HgCl2: Cloreto de mercúrio

HgT: Concentração de mercúrio total

it: Tecido intersticial

L: Célula de Leydig

ppb: Parte por bilhão

ppm: Parte por milhão

PBS: Phosphate buffer solution

ROS: Espécies reativas de oxigênio

S: Célula de Sertoli

SPCI: Espermatócito primário

SPCII: Espermatócito secundário

SD: Espermátide

SPG: Espermatogônia

SPGI: Espermatogônia primária

SPGII: Espermatogônia secundária

SZ: Espermatozóide

x

RESUMO

Poluentes ambientais são lançados diariamente nos ecossistemas aquáticos e podem trazer sérias conseqüências para os organismos, dentre eles destacam-se os metais. Mercúrio e cádmio são metais reconhecidos por sua alta toxicidade e grande persistência no ambiente. Estudos anteriores demonstraram que mesmo em baixas concentrações, estes metais têm a capacidade de afetar o sistema reprodutor dos peixes, inibindo o desenvolvimento das gônadas e a espermatogênese. Com isso, o presente estudo tem como objetivo verificar se o HgCl2 e CdCl2 provocam alterações nos testículos e espermatozóides de Gymnotus carapo (tuvira). A contaminação foi realizada através de injeção intraperitoneal de solução de HgCl2 ou CdCl2

(5μM/10μM/20μM/30μM/40µM) por 24h, 48h, 72h e 96h. Alterações histológicas foram identificadas nos testículos dos peixes expostos ao HgCl2 e CdCl2, porém no grupo tratado com HgCl2 os efeitos foram considerados mais severos. Após tratamento com 5µM de HgCl2, alterações histológicas foram observadas a partir de 72 horas, enquanto que para 10μM, 20µM e 30μM essas alterações foram visualizadas em todos os tempos de exposição analisados. Em relação ao CdCl2, as alterações foram observadas a partir de 72h de exposição com 10µM. As lesões encontradas no tecido foram semelhantes em todas as concentrações administradas, sendo os efeitos observados progressivos com o aumento da concentração ao metal exposto. As alterações mais significativas identificadas no testículo dos espécimes expostos ao HgCl2 e CdCl2, incluem fibrose intersticial, hiperemia, desintegração intersticial e tubular, desorganização dos túbulos seminíferos, degeneração e agregação espermática. Além disso, pela análise ultraestrutural observamos as células germinativas em apoptose e em processo de vacuolização. Mudanças morfológicas foram visualizadas em espermatozóides de G. carapo. Após o tratamento com 20μM de HgCl2 e CdCl2 por 72/96h respectivamente, foram observadas deformidades na porção da cabeça e ausência de flagelo. Portanto, os resultados apresentados no presente estudo demonstram mudanças no testículo e nos espermatozóides de G. carapo, após exposição ao HgCl2 e CdCl2. Essas mudanças consequentemente vão afetar a reprodução desta espécie, levando prejuízos à nível de população. Assim as informações obtidas neste estudo demonstram que histopatologia gonadal pode ser um biomarcador de poluição por metais pesados nesta espécie de peixe.

Palavras-chave: testículo, Gymnotus carapo, mercúrio, cádmio, histopatologia,

peixe.

xi

ABSTRACT

Environmental pollutants are released daily in aquatic ecosystems and can have serious consequences for the organisms, among the polluents include the metals. Metals mercury and cadmium are known for their high toxicity and great persistence in the environment. Previous studies had show that even at low concentrations, these metals are able to affect the reproductive system of fish, inhibiting gonad development and spermatogenesis. Thus, this study aims to determine if the HgCl2

and CdCl2 can causes changes in the testes and spermatozoa of Gymnotus carapo (tuvira). The contamination was performed by intraperitoneal injection of HgCl2 or CdCl2 solution (5μM/10μM/20μM/30μM/40µM) for 24h, 48h, 72h e 96h. Histological changes were identified in the testes of fish exposed to HgCl2 and CdCl2, but in the group treated with HgCl2 effects were considered severe. After treatment with 5μM HgCl2, histopathological changes were observed after 72 h, while for 10μM, 20μM and 30μM these changes were seen at all exposure times examined. In relation to CdCl2, changes were observed from 72 h exposure to 10µM. The lesions found in the tissue were similar at all concentrations administered, and the progressive effects observed with increasing concentration of the exposed metal. The most significant changes identified in the testes of fish exposed to HgCl2 and CdCl2, includes fibrosis, blood vessel congestion or hyperemia, interstitial and lobular disintegration, disorganization of the seminiferous lobules degeneration, sperm aggregation. Furthermore, by ultrastructural analysis we can observe the germ cells in apoptosis and vacuolization. Morphological changes also were observed in spermatozoa of G. carapo. After treatment with 20µM of HgCl2 and CdCl2 for 72/96h respectively, deformities were observed on the head and also the flagellum absence. Therefore, the results presented in this study show changes in the testis and spermatozoa of G. carapo after exposure to HgCl2 and CdCl2. These changes will go affect the reproductive success of this species, which may cause damage to the level of population. Thus the information obtained during this study show that gonadal histopathology may be a biomarker of heavy metal pollution in this fish species. Keywords: testes, Gymnotus carapo, mercury, cadmium, histopathology, fish.

1

1. INTRODUÇÃO

A ação antropogênica vem aumentando a concentração de vários compostos

químicos no ambiente aquático. Estes poluentes podem provocar graves

consequências em vertebrados e invertebrados e, com o passar do tempo, podem

comprometer sua permanência no ecossistema (Jobling,1995).

Dentre os contaminantes mais intensamente estudados nos ecossistemas

aquáticos estão os metais (Palenzuela et al., 2004). Os metais podem interromper

ou prejudicar a reprodução de animais aquáticos, afetando o sistema endócrino e

agindo nos órgãos reprodutivos e nos gametas desses organismos. Como resultado

desse distúrbio, o processo de desenvolvimento das gônadas é seriamente

prejudicado juntamente com a taxa de fertilização (Dietrich et al, 2004; Rurangwa,

1998).

1.1. METAIS PESADOS

A denominação “metal pesado” é aplicada a um grupo heterogêneo de

elementos, incluindo metais, semi metais e não metais (Figura 1) que possuem

número atômico maior do que 20 ou peso específico maior que 5 g cm-3 (Malavolta,

1994). São denominados tóxicos aqueles metais que produzem danos em pequenas

concentrações, dentre eles estão arsênio, cádmio, cobre, cromo, chumbo e

mercúrio. Em geral, metais tóxicos estão presentes em pequenas quantidades no

meio aquático por ação de fenômenos naturais, mas podem ser despejados em

quantidades significativas por atividades industriais, agrícolas e de mineração (Abel,

1989).

Um organismo aquático pode apresentar dois tipos básicos de

comportamento em relação aos metais: ou é sensível à ação tóxica de um

determinado metal, ou não é sensível, mas o bioacumula, potencializando seu efeito

nocivo através das cadeias alimentares de forma a colocar em risco organismos

situados nos topos destas cadeias (Viarengo, 1989).

2

Figura 1. Tabela periódica dos elementos químicos.

Fonte: grandeabobora.com

Os efeitos tóxicos dos metais podem incluir tanto a letalidade e efeitos

subletais, como alterações no crescimento, desenvolvimento, reprodução e

respostas farmacocinéticas, patológicas, bioquímicas e comportamentais (Baatrup,

1991).

A toxicidade dos metais está relacionada à sua capacidade de interferir em

reações enzimáticas, por meio do bloqueio ou deslocamento do íon essencial de

várias biomoléculas. Ainda possuem baixa mobilidade, em virtude das pequenas

dimensões e das cargas duplas e triplas, fazendo com que se acumulem por longo

período no ambiente (Conell & Miller, 1984).

A alta toxicidade de alguns metais para os organismos, mesmo em baixas

concentrações, reforça a importância de estudos relacionados com os efeitos

induzidos por esses elementos (Baatrup, 1991). Dentre os metais considerados

“pesados”, mercúrio e cádmio geram grande preocupação ambiental devido a sua

ampla utilização industrial, toxicidade e comportamento no ambiente (Búcio et al.,

1995).

3

Informações importantes sobre o potencial tóxico dos metais podem ser

obtidas de ambientes contaminados ou através de estudos de simulação em

laboratório, diferindo quanto ao objetivo e metodologias de avaliação. Estudos em

toxicologia ambiental devem considerar alguns aspectos importantes: modelo de

estudo, parâmetros analisados e desenho experimental (campo ou laboratório).

Deste modo, é possível contribuir com informações que possibilitem um melhor

entendimento do processo toxicológico do metais.

1.2. MERCÚRIO

O mercúrio é um elemento químico de número atômico 80, cujo símbolo Hg

deriva do nome grego Hidrargyrium, o qual significa prata líquida. Encontra-se no

grupo IIB da tabela periódica de classificação dos elementos e é o único metal em

estado líquido à temperatura ambiente (Hoffman et al., 1995).

O mercúrio é considerado altamente tóxico, devido a sua capacidade de

bioacumular nos organismos, biomagnificar através da cadeia alimentar e possuir

uma intensa ciclagem no ecossistema (Förstner & Wittman,1983). Dentre as formas

químicas destacam-se o mercúrio metálico Hg0 que é volátil e libera um gás

monoatômico: o vapor de mercúrio. Este é estável, podendo permanecer na

atmosfera por meses ou até anos, revelando-se, deste modo, muito importante no

ciclo do mercúrio, pois pode sofrer oxidação, originando o mercúrio mercuroso (Hg+1)

e o mercúrio mercúrico (Hg+2). Essas formas inorgânicas podem se ligar a elementos

como o cloro, enxofre ou oxigênio e originar compostos de mercúrio inorgânico

também designado como sais de mercúrio (sais mercurosos e mercúricos) (Malm et

al.,1997)

Um dos sais mais importantes industrialmente é o cloreto de mercúrio (I) ou

calomelano (Hg2Cl2) que é um composto branco, pouco solúvel em água e utilizado

como purgante, anti-helmíntico e diurético, e o cloreto de mercúrio (II) (HgCl2),

um sublimado corrosivo muito tóxico, empregado como desinfetante e utilizado em

muitas aplicações, incluindo as medicinais, entretanto, é uma das formas mais

tóxicas do mercúrio pela sua solubilidade em água em relação a outros compostos

de mercúrio (HSDB, 2000).

4

Quando um átomo de mercúrio se liga covalentemente a grupos metil (CH3),

dá origem a um composto orgânico conhecido como metilmercúrio. O metilmercúrio

(CH3Hg), por sua vez, é originado a partir do processo de metilação, através do

Hg2+, mediado por diversos microorganismos em ambientes aquáticos,

particularmente no sedimento (Malm et al.,1997).

As fontes naturais mais significativas de mercúrio são gaseificação da crosta

terrestre, as emissões de vulcões e a evaporação de corpos aquáticos (Who, 1991).

As fontes antrópicas ocorrem através de indústrias que queimam combustíveis

fósseis, produção eletrolítica de cloro-soda, produção de acetaldeído, incineradores

de lixo, polpa de papel, tintas, pesticidas, fungicidas, lâmpadas de vapor de

mercúrio, baterias, produtos odontológicos, amalgamação de mercúrio em extração

de ouro, entre outros (Canela,1995).

Independente da origem, o mercúrio na forma orgânica ou inorgânica pode

sofrer transformações no ambiente, o que torna sua distribuição ambiental bastante

complexa. Em geral o ciclo biogeoquímico do mercúrio exibe um equilíbrio dinâmico,

mas ações humanas podem introduzir elementos ou compostos mais rápidos e em

nível maior que os processos naturais, alterando os padrões dos ciclos e as

condições às quais a flora e a fauna estão adaptadas (Mauro et al., 1999).

O mercúrio atinge os ecossistemas aquáticos através da precipitação e por

meio do descarte de resíduos agro-industriais na proximidade de rios, lagos e

lagoas. A absorção deste elemento nos peixes ocorre pela alimentação ou

respiração branquial e a sua distribuição acontece por meio da circulação

sanguínea. A absorção do mercúrio é influenciada pela concentração deste

elemento, pela taxa metabólica e pela eficiência de absorção (disponibilidade),

determinada pelas características do ambiente aquático. Os níveis de mercúrio na

biota aquática variam entre as espécies de uma mesma localidade e para uma

mesma espécie em diferentes localidades (Azevedo, 2003).

A toxicidade do mercúrio e seus compostos se deve a sua forte interação com

grupos sulfidrila, R-SH de proteínas, enzimas (Lacerda, 1997; Baatrup, 1991) e

proteínas de baixo peso molecular (como coenzima A, cisteína, glutationa, entre

outros) (Valle & Ulmer, 1972). Nas sulfidrilas, o Hg2+ substitui o átomo de hidrogênio,

sendo capaz de inativar enzimas sulfidriladas, interferindo no metabolismo e nas

funções celulares. O mercúrio também se liga, afetando a configuração de purinas e

pirimidinas e ácidos nucléicos podendo levar danos ao DNA (Bucio et al., 1999).

5

Além disso, pode reagir diretamente com vários constituintes de membrana,

interferindo na integridade estrutural e nas propriedades físicas das membranas

celulares (Baatrup, 1991). A capacidade dos metais pesados atravessarem a

membrana para o interior das células pode prejudicar suas funções, causando a

morte celular e a destruição de qualquer tecido com a qual entrem em contato

(Azevedo, 2003).

Além disso, em condições fisiológicas normais, os animais possuem um

balanço entre a geração e neutralização das espécies reativas de oxigênio (ROS).

Entretanto, quando os organismos estão expostos aos Hg e a outros metais

pesados, a taxa de produção das ROS excede a sua capacidade de neutralização

pelas defesas antioxidantes dos organismos (Figura 3), levando ao estresse

oxidativo (Stohs & Bagchi, 1995). Células sob estresse oxidativo desenvolvem várias

disfunções, em razão das lesões causadas pelas ROS aos lipídios, proteínas e DNA

(Ercal et al., 2001; Van Der Oost et al., 2003).

Assim, torna-se necessário conhecer os reais danos à saúde dos organismos

em diferentes níveis de organização biológica frente à exposição crônica e aguda a

este metal.

Figura 2. Principais alvos para toxicidade do Hg.

6

1.3. CÁDMIO

O cádmio é um elemento químico de símbolo Cd de número atômico 48 e

assim como o Hg está situado no grupo IIB (grupo 12) da tabela periódica de

classificação dos elementos. É um metal branco azulado que à temperatura

ambiente encontra-se no estado sólido.

O cádmio pode ser liberado no meio ambiente através de fontes naturais ou

antropogênicas, dentre as principais fontes naturais destaca-se o vulcanismo, spray

oceânico e queimadas de florestas (Hutton, 1987). Por outro lado, um aumento das

concentrações de Cd no ambiente tem ocorrido principalmente em função de suas

inúmeras aplicações industriais, como nos processos de galvanoplastia, além de ser

um elemento constituinte de baterias, pilhas, pigmentos, revestimentos elétricos,

estabilizantes e catalisadores (Fielder & Dale, 1983). Com isso, a produção,

utilização e emissões de Cd para o ambiente têm aumentado dramaticamente

durante o século 20, e consequentemente levado a contaminação dos ecossistemas

aquáticos (Burger, 2008).

A exposição ao cádmio nos humanos ocorre geralmente através de duas

fontes principais: a primeira é por via oral (por água e ingestão de alimentos

contamnados), e a segunda por inalação (através da fumaça do cigarro). Nesse

sentido, a inalação do fumo ou de aerossóis contendo cádmio pode causar doenças

pulmonárias crônicas ou agudas. Dentro de certas indústrias, a exposição

ocupacional é a fonte de contaminação predominante (Friberg, 1983). O cádmio

entra na corrente sanguínea, sendo absorvido pelo estômago ou intestino após a

ingestão do alimento ou da água, ou por absorção nos pulmões após a inalação. De

qualquer forma, uma vez que o cádmio é absorvido é fortemente retido, inclusive

baixas doses deste metal podem constituir um nível significativo no organismo

(Marettová et al., 2010).

Um vez absorvido, o cádmio é transportado pela corrente sanguínea até o

fígado. Pequenas quantidades desse complexo proteína-cádmio passam

continuamente do fígado para a corrente sanguínea, para ser transportado até os

rins. O rim excreta de 1 a 2% do cádmio obtido diretamente das fontes ambientais. A

concentração do metal nos rins é aproximadamente 10 mil vezes mais alta que a da

corrente sanguínea. A excreção fecal do metal representa uma mínima quantidade

7

do cádmio não absorvido no sistema gastrointestinal (Burger, 2008).

Além do fígado, rim e pulmões, outros órgãos também são danificados por

exposição ao cádmio em animais ou humanos, incluindo o sistema reprodutor, o

sistema imunológico e o sistema nervoso (Jarup; Akesson, 2009).

A toxicidade do cádmio está relacionada com a sua capacidade de substituir o

cálcio nas reações biológicas. Cádmio e cálcio são dois elementos intimamente

relacionados, com similaridades em muitos aspectos, devido a sua semelhança nos

raios iônicos. A captação celular de cádmio, ocorre principalmente através dos

canais de Ca +2 e Cd torna-se um potente bloqueador dos canais de Ca +2, inibindo a

captação celular de Ca +2 (Beyersmann & Hechtenberg, 1997).

O cádmio também é capaz de causar um aumento no estresse oxidativo pela

ligação a grupos sulfidrilas de proteínas e pela diminuição da glutationa (Valko et al.,

2005). Consequentemente, o estresse oxidativo pode promover alteração nos

mecanismos de reparo do DNA e indução da proliferação celular, que, por sua vez,

pode levar a tumorigênese (Beyersmann & Hartwig, 2008). Além disso, o cádmio se

liga preferivelmente a resíduos de cisteína de proteínas, em particular com a

metalotioneína e também pode inibir muitas enzimas. A metalotioneína é uma

enzima importante no transporte e armazenamento do cádmio e outros metais (Who,

1992).

Apesar de muitas pesquisas analisarem a concentração de cádmio em

tecidos internos dos organismos (Carignan & Villard, 2001), existe uma maior

necessidade de estudos em laboratório com este metal para avaliação dose-efeito

(tanto subletal como letal) tanto a nível celular como a nível tecidual (Burger &

Gochfeld, 2001; Stansley et al., 1991). Futuras descobertas nesse campo ajudariam

a aprofundar o conhecimento sobre os mecanismos básicos que determinam os

danos causados pelo cádmio, permitindo um maior conhecimento da sua toxicidade.

8

1.4. CONTAMINAÇÃO IN VITRO E EXPOSIÇÃO AGUDA

A realização de experimentos em laboratório é importante para a observação

dos efeitos nocivos do mercúrio e cádmio, na ausência de ações sinérgicas ou

antagônicas que podem ocorrer com outros elementos do ambiente. Nesse sentido,

os bioensaios de contaminação em laboratório oferecem à vantagem de avaliar a

toxicidade dos metais pesados em concentrações específicas, com isso as

mudanças induzidas por esses elementos utilizados podem ser empregadas para

observação da relação dose/resposta dos organismos expostos (Vergílio, 2009).

Segundo Rand e Petrocelli (1985), estudos em toxicologia aquática podem

ser qualitativos e quantitativos em relação aos efeitos tóxicos sobre os organismos

aquáticos. A toxicologia aquática também está relacionada com as concentrações

dos agentes químicos que podem ocorrer no ambiente aquático (água, sedimento e

alimento). A toxicidade de um composto químico depende da exposição, da

suscetibilidade do organismo, das características químicas do agente e de fatores

ambientais. A exposição é o contato/reação entre o organismo e o composto

químico, sendo que os fatores mais importantes relacionados à exposição são: o

tipo, a duração e freqüência da exposição e a concentração do agente químico.

Com relação à duração e a freqüência da exposição dos organismos ao

agente químico, Rand e Petrocelli (1985) afirmaram que na exposição aguda, os

organismos entram e contato com o composto químico num evento único ou em

eventos múltiplos que ocorrem num pequeno período de tempo, geralmente

variando de horas a dias. Nas exposições agudas, onde o agente químico é

rapidamente absorvido, geralmente os efeitos são imediatos, embora seja possível a

produção de efeitos retardados similares àqueles resultantes da exposição crônica.

A freqüência de exposição também afeta a toxicidade dos compostos

químicos. Uma exposição aguda pode resultar num efeito adverso imediato num

organismo, enquanto duas exposições sucessivas, com que a soma equivale à

exposição aguda única podem não ter efeito ou este ser pequeno, devido ao

metabolismo (desintoxicação) do composto químico pelo organismo entre as

exposições ou à adaptação do organismo ao composto. Organismos estressados

em função de exposição prévia a outras substâncias tóxicas também podem ser

mais susceptíveis aos compostos químicos, cenário comum na realidade dos

9

ecossistemas, pois normalmente há a presença simultânea de diferentes produtos

(Barak e Mason, 1990).

1.5. PEIXES NOS ESTUDOS DE TOXICOLOGIA

Os peixes constituem um grupo de grande importância nas avaliações de

toxicidade ambiental, pois refletem a saúde do ecossistema aquático, ambiente

fundamental para a sobrevivência dos seres vivos. Além disso, são vertebrados de

ampla distribuição e participam de diferentes níveis tróficos da cadeia alimentar,

sendo considerados excelentes modelos biológicos de estudo (Mela, 2004).

Os teleósteos são considerados excelentes organismos para o monitoramento

e estudo da disponibilidade dos metais pesados para as populações humanas, já

que os peixes podem acumular esses elementos em seus tecidos (Bastos et al.,

2006; Lacerda, 1997; Pfeiffer et al.,1992). Porém, deve ser considerado que alguns

fatores influenciam na acumulação de metais pesados pelos organismos, como o

tamanho, idade, ecologia do animal e hábitos alimentares (Haines et al., 1992).

A principal via de acesso à contaminação por metais pesados ao homem é

através do consumo de pescado. Os peixes constituem uma importante fonte de

proteínas, em especial para as populações que vivem nas proximidades dos corpos

d’água (Pfeiffer et al.,1992 ; Silva Filho et al., 2000).

10

1.5.1. ESPÉCIE UTILIZADA: Gymnotus carapo.

A tuvira (Gymnotus carapo) (Linnaeus, 1758) (Figura 5) é um peixe da classe

dos Actinopterígios de água doce e pertence à ordem dos Gymnotiformes, família

dos Gymnotidae (FishBase, 2010). Essa espécie é também conhecida sarapoá,

peixe espada, sarapó, carapó e ituí, sendo muito utilizada como isca viva na pesca

esportiva por ser a mais preferida de espécies consideradas nobres, como os

piscívoros de grande porte.

Figura 3. Foto da espécie Gymnotus carapo (Tuvira).

Os Gymnotiformes apresentam corpo anguiformes, abertura branquial muito

estreita e são desprovidos das nadadeiras dorsal e ventral; possuem nadadeira anal

muito longa, estendendo-se por quase toda a face ventral (Theodoro, 2003).

Também possuem órgãos elétricos que são utilizados para produzir choques (p. ex.:

poraquê) ou para a eletrocominucação (p. ex.: tuvira) promovida pela emissão de

uma pequena descarga elétrica. A tuvira utiliza o campo elétrico gerado por esta

descarga para sua orientação, que compensa sua falta de visão na hora de predar

espécies menores, como também para suas interações sociais, principalmente na

época de reprodução (Westby, 1975).

11

Figura 4. Localização do órgão elétrico em Gymnotiformes (A). Para localizar um

objeto, o cérebro do peixe elétrico emite um sinal de comando excitando os

eletrócitos (células contidas nos órgãos elétricos), essas células se tornam

polarizadas agindo como baterias interconectadas, resultando em descargas dos

órgãos elétricos (EODs) que são emitidas na água, gerando um campo elétrico (B)

(adaptado de Markham et al., 2009).

As tuviras habitam em locais rasos, com profundidades inferiores a um metro,

em áreas marginais de baías e vazantes, com bastante vegetação aquática

(Resende, 1999). Podem ainda sobreviver em valas, canais e pequenos lagos secos

(FishBase, 2010). Caracterizam-se por respiração aérea facultativa, sendo uma

adaptação comum em peixes que vivem em ambientes hipóxicos e pela bexiga

natatória altamente vascularizada (Moraes et al., 2002). Estudos feitos por Resende

(1999) e Resende e Pereira (2000) sobre os aspectos biológicos e ecológicos da

tuvira demonstram que esses peixes vivem em ambientes lênticos, com plantas

aquáticas, onde se abrigam e encontram alimento. Possuem ainda hábito noturno,

saindo no crepúsculo para águas mais abertas (Menin, 1989; Barbieri & Barbieri,

1984).

Silva & Oliveira (1997) concluíram que a tuvira está adaptada a uma dieta

predominantemente carnívora, com o bolo alimentar sofrendo uma rápida absorção

ao chegar ao intestino. Dessa forma, o intestino deste peixe está adaptado para uma

dieta constituída principalmente de pequenos organismos de fácil digestão. Nesta

espécie, a presença do estômago químico desenvolvido sugere uma adaptação à

digestão de uma dieta rica em proteínas.

12

Quando em ambiente natural, a tuvira alimenta-se principalmente à noite de

vermes, insetos (por exemplo, larvas de libélulas), camarão, peixe

(preferencialmente caracídeos de pequeno porte, por exemplo, Ctenobrycon e

curimatã) e matéria vegetal (FishBase, 2010).

A tuvira apresenta crescimento rápido em comprimento no seu primeiro ano

de vida, antes de alcançar a maturidade sexual, quando os indivíduos atingem, em

média, cerca de 20 cm de comprimento. Já quanto ao peso, o comportamento é o

inverso, uma vez que esses peixes começam a ganhar mais peso após o segundo

ano de vida (Barbieri & Barbieri, 1984).

Barbieri & Barbieri (1983), estudando um ambiente lêntico-lótico (represa) em

São Paulo observaram que houve uma relação direta entre o período reprodutivo de

Gymnotus sp. e a variação dos fatores abióticos, como temperatura da água,

concentração de oxigênio dissolvido, precipitação pluviométrica e fotoperíodo, não

evidenciando relação com a variação do pH e do nível da água. Entretanto, Resende

& Pereira, (2000), estudando ambientes sazonalmente inundados no Pantanal do

Mato Grosso do Sul, afirmam que a chegada da inundação é o fator desencadeador

da atividade reprodutiva.

Para Barbieri & Barbieri (1982, 1983, 1984) na Represa do Lobo (Estado de

São Paulo) a reprodução da tuvira ocorre de setembro a janeiro, com pico entre

outubro e dezembro, coincidindo com o início da época mais quente do ano. Os

mesmos autores observaram que para as fêmeas, o pico ocorre no mês de outubro

e, para os machos, nos meses de outubro a dezembro.

A reprodução da tuvira corresponde a um período de repouso intercalado por

períodos de atividade sexual os quais finalizam com o surgimento de nova prole.

Segundo Westby (1975) não é possível reconhecer macroscopicamente

diferenças sexuais na tuvira. Entretanto, alguns isqueiros da região do Pantanal

acreditam que tuvira fêmeas sejam mais amarronzadas e tuvira machos sejam mais

escuras, quase pretas.

A disposição das gônadas masculinas e femininas acha-se em um arranjo

semelhante ao tubo digestivo, pois os ovidutos e os dutos espermáticos dirigem-se

para a região cranial, terminando na papila genital que se encontra próximo ao

istmo, sob a cabeça, imediatamente posterior ao ânus (Figura 5) (González et al.,

2001).

13

Os machos, diferentemente das fêmeas, não apresentam alterações

morfológicas perceptíveis nos testículos que possibilitem identificar diferentes

estádios de maturação (Resende, 1999). A atividade espermatogênica dos machos

ocorre durante o ano todo, variando, porém, de intensidade, que é maior de

setembro a janeiro, com pico entre outubro e dezembro (Barbieri & Barbieri, 1982,

1983, 1984). A morfologia externa dos testículos da tuvira difere da descrita para a

maioria dos peixes teleósteos. Apresentam-se como órgãos pares, ovais,

consistentes (Figura 6) e com dois longos dutos espermáticos, ao contrário dos

testículos alongados que se estendem por todo o comprimento da cavidade

abdominal observado na maioria das espécies de teleósteos (Barbieri & Barbieri,

1984). Eles permanecem, independentemente de seu estádio de maturação,

próximos à extremidade caudal do conjunto visceral (Menin, 1989).

Figura 5. Localização dos testículos em Gymnotus carapo. Em A: seta indica o ânus

e a papila genital, em B: detalhe do duto deferente partindo do testículo até a papila

genital.

14

Figura 6. Testículos de Gymnotus carapo. Barra: 1cm

1.6. TESTÍCULOS E ESPERMATOGÊNESE EM PEIXES

Os testículos da maioria dos peixes são órgãos pares, assimétricos, podendo

estar parcial ou totalmente fundidos entre si e são frequentemente alongados,

embora existam outras formas como lobulados e foliáceos (Le Gac; Loir, 1999). Os

lóbulos testiculares são preenchidos por túbulos seminíferos os quais apresentam

paredes formadas por cistos que se apóiam na lâmina basal e que são revestidos

por prolongamentos citoplasmáticos das células de Sertoli (Matta, 2000).

A organização básica do testículo é comum a todos os peixes ósseos e

anfíbios. Este órgão tem as funções espermatogênica e androgênica, possuindo dois

compartimentos principais: intersticial e tubular. No compartimento intersticial ou

interlobular estão situados vasos sanguíneos, fibras nervosas, células e fibras do

conjuntivo, além das células de Leydig que possuem função esteroidogênica. A

produção de andrógenos é importante para diferenciação sexual, e para regulação

da espermatogênese (Weltizien et al., 2004). O compartimento tubular contém

células somáticas (células de Sertoli) e as células germinativas que irão formar os

espermatozóides, após passarem por um processo bastante complexo e altamente

organizado, a espermatogênese (Billard, 1990; Koulish et al., 2002) (Figura 7).

15

Figura 7. Espermatogênese em peixes. O epitélio germinal contém células de Sertoli

(SE) e células germinativas envolvidas por uma lâmina basal (LB) e células mióides

peritubulares (MI). No espaço intersticial são encontrados as células intersticiais ou

de Leydig (LE) e vasos sanguíneos (VS). A(Ind*): Espermatogônia tipo A

indiferenciada (célula-tronco); A(Ind): Espermatogônia tipo A indiferenciada; B (tardia):

Espermatogônia B tardia; Z/L: Espermatócitos primários em leptóteno e zigóteno; P:

Espermatócito primário em paquíteno; D/MI: Espermatócito primário em diplóteno /

metáfase; S/MII: Espermatócito secundário/ metáfase secundária II; E1:

Espermátide inicial; E2: Espermátide intermediária; E3: Espermátide final. (Adaptado

de Schulz et al., 2010).

Unidas entre si por complexos juncionais especializados, as células de Sertoli

dos teleósteos delimitam física e funcionalmente um clone de células germinativas

no mesmo estágio de desenvolvimento que tem origem a partir de uma única

espermatogônia primária, formando, assim os espermatocistos ou cisto

espermatogênico. Desta forma, as células de Sertoli fornecem as células

germinativas suporte físico e fatores importantes para sobrevivência, proliferação e

diferenciação das mesmas, estando ainda envolvidas na intermediação hormonal e

na fagocitose de restos celulares originados da espermiogênese (Weltizien et al.,

2004). As células de Sertoli que delimitam os cistos espermatogênicos se apóiam na

16

túnica própria, que é constituída pela membrana basal (camada acelular) e pelas

células tubulares mióides que possuem capacidade contrátil (Pudney, 1995; Le Gac;

Loir, 1999). Portanto, diferentes dos mamíferos, em peixes as espermatogônias

diferenciadas (a partir da espermatogônia primária) não estão em contato com a

membrana basal (Billard, 1984).

Exceto pelo arranjo cístico, no qual as células germinativas se desenvolvem

de forma sincronizada, provavelmente devido à presença de pontes intercelulares

(Russell et al., 1990; Koulish et al., 2002), o processo espermatogênico de

teleósteos assemelha-se muito ao de mamíferos. Durante a fase proliferativa, a

espermatogônia tipo A se divide e origina a espermatogônia secundárias ou do tipo

B que, depois de um número de divisões mitóticas que varia entre as espécies,

originam os espermatócitos primários, iniciando a fase meiótica. Após a primeira

divisão meiótica formam-se os espermatócitos secundários haplóides que, num curto

intervalo de tempo, originam as espermátides através da segunda divisão meiótica.

Em seguida ocorre a fase de diferenciação, no qual as espermátides se transformam

em espermatozóides (Silva, 1987). As espermatogônias primárias são as maiores

células germinativas na maioria das espécies de teleósteos, apresentando um

núcleo grande e claro, com pouca heterocromatina, contendo um ou dois nucléolos

bastante evidentes (Miura, 1999). Após sucessivas divisões, a partir da

espermatogônia primária, o número de espermatogônias secundárias por cistos

aumenta geograficamente, enquanto o diâmetro nuclear das mesmas sofre gradual

redução (Vilela et al., 2006).

Considerando-se o número de espécies de peixes, existem poucos relatos na

literatura a respeito da duração dos eventos espermatogênicos nestes vertebrados.

No entanto, pode ser evidenciado que, de maneira geral, a duração da

espermatogênese em peixes é bem mais rápida do que o observado para mamíferos

(Silva; Godinho, 1983; Koulish et al., 2002; França et al., 2002; Vilela et al., 2003).

17

1.7. HISTOPATOLOGIA

As lesões detectadas em células, tecidos ou órgãos representam uma

integração dos efeitos cumulativos dos estressores em nível fisiológico e bioquímico

e potencialmente em níveis mais altos de organização biológica (Myers & Fournie,

2002). Além disso, em função de possibilitar a visualização dos locais dos danos, as

respostas histopatológicas dos peixes a várias classes de xenobióticos precisam ser

determinadas e caracterizadas, sendo um indicativo dos sítios de ação de tal

xenobiótico (Hinton et al., 1976).

A histopatologia é reconhecida como uma importante ferramenta para

avaliação do impacto ambiental de poluentes em peixes (Oliveira Ribeiro et al;

2002). É um método capaz de detectar efeitos adversos agudos e crônicos em

vários tecidos e órgãos de peixes mediante exposição a diversos compostos

químicos. Além disso, a histopatologia pode fornecer uma indicação da saúde dos

peixes, determinando lesão precoce de células (Pieterse, 2004).

Recentemente, vem ocorrendo o enriquecimento e a implementação da

literatura relacionada aos efeitos histopatológicos de estresse ambiental. Isto tem

aumentado os argumentos quanto ao uso destes dados como indicador de

adversidades, efeitos crônicos subletais e injúrias para vertebrados aquáticos

(especialmente peixes) em ambientes biomonitorados ou mesmo em experimentos

em laboratórios (Myers & Fornie, 2002).

18

1.8. EFEITO DOS METAIS PESADOS NOS TESTÍCULOS

O mercúrio e o cádmio são dois metais capazes de provocar diversas

alterações testiculares devido à sua toxicidade, essas alterações são observadas em

uma variedade de modelos animais (camundongos, coelhos e peixes) em diferentes

fases de crescimento e maturidade (Thompson & Bannigan, 2008).

Segundo Lockhart e Uthe, 1972; McKim et al., 1976; Hodson et al., 1994;

Pelletier e Audet, 1995) em concentrações baixas o mercúrio tem a capacidade de

acumulação nas gônadas de peixes das espécies (Esox lucius, Salvelinus fontinalis,

Anguilla rostrata, Myoxocephalus aenaus), onde inibe o desenvolvimento gonadal

(Dey e Bhattacharya, 1989; Kirubagaran e Joy, 1992), reduz o crescimento

(Panigrahi e Misra, 1978; Rodgers e Beamish, 1982; Snarski e Olson, 1982; Weis e

Khan, 1990; Niimi e Kissoon, 1994) e função imunológica (Roales e Perlmutter,

1977) que pode afetar a sobrevivência da prole.

Estudos têm mostrado que exposição aguda in vivo a cádmio causa o

rompimento da barreira hematotesticular, perda de células germinativas, edema

testicular, hemorragia, necrose e esterilidade em várias espécies de mamíferos

(roedores, coelhos, cães, bezerros e cavalos).

O cádmio também é capaz de provocar diversas lesões testiculares em

peixes de várias espécies. Embora os danos testiculares induzidos pelo cádmio

sejam reconhecidos por décadas atrás (Parizek, 1957), os mecanismos que levam a

esses danos ainda permanecem obscuros (Siu et al., 2009). A tabela 1 mostra um

resumo das principais alterações testiculares causadas por metais em diversas

espécies de peixes.

19

Tabela 1. Resumo das alterações histológicas nos testículos de peixes causados

por metais pesados (adaptado de Pieterse, 2004).

Metais pesados Rota de

exposição Espécies

Tecidos afetados

Lesões no tecido Referência

CdCl2 Água Brook trout Testículo Hemorragia Vasodilatação Congestão

Sangalang and

O'Halloran, 1972

CdCl2

1ppb Água

Salvelinus tontinalis

Testículo Necrose das

células de Leydig

Sangalang and Freeman,

1972

Cádmio

Injeção Intraperitoneal

Goldfish Testículo

Baixo índice de desenvolvimento espermatogênico

Aumento do número de macrófagos

Necrose das células germinativas com atrofia dos túbulos seminíferos

Infiltração de células inflamatórias

Fibrose

Tafanelli and Summerfelt,

1975

Chumbo e Cádmio

Água Clarias

batrachus Testículo

Estereidogênese comprometida (Cd)

Diminuição da reprodutibilidade (Pb)

Inibição da espermatogênese e Danos testiculares

Kalti and Sathyanesan,

1985

HgCl2 Água Clarias

batrachus Testículo

Inibição da atividade gonadal

Picnose das células de Leydig

Túbulos seminíferos menores

Kirubagaran and Joy,

1992

Obs: as setas indicam as alterações testiculares encontradas no presente estudo.

20

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

Este trabalho tem como objetivo verificar se os metais pesados (Cloreto de

Mercúrio e Cloreto de Cádmio) provocam alterações nos testículos de Gymnotus

carapo (tuvira).

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Descrever a estrutura do testículo e dos espermatozóides de Gymnotus carapo

(tuvira) através da microscopia óptica e eletrônica.

- Empregar a metodologia de contaminação in vitro e de contaminação aguda para

visualização de danos nos testículos.

- Descrever as alterações teciduais e celulares dos testículos e espermatozóides de

Gymnotus carapo (tuvira) expostos à ação do HgCl2 e CdCl2.

21

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. COLETA DOS EXEMPLARES DE Gymnotus carapo.

Os exemplares utilizados neste trabalho foram coletados na Lagoa de Cima

(Figura 7), localizada na região norte do Estado do Rio de Janeiro (21º 46’ S e 41º

31’W), obtidos diretamente de pescadores locais. As amostras foram coletadas

durante o período de março de 2009 a junho de 2010. No presente estudo foram

utilizados 112 exemplares machos de Gymnotus carapo. Durante a coleta foram

considerados todos os peixes, e somente através da dissecação, realizada no

Laboratório de Ciências Ambientais (LCA) foi possível identificar machos e fêmeas.

Figura 8. Localização da Lagoa de Cima.

22

Os peixes coletados foram transportados vivos em caixas de isopor com água

obtida de seu habitat natural, e encaminhados para o Laboratório de Ciências

Ambientais (LCA), na UENF, onde permaneceram acondicionados num sistema de

aquários de fluxo contínuo (livre de cloro, por evaporação), com circulação constante

da água por um sistema de bombas com filtros internos. A qualidade da água foi

monitorada, medindo-se amônia tóxica, nitrito, pH através de kits colorimétricos

(Labcon Teste – Alcon). Os valores de pH estão de acordo com o banco de dados

publicados pelo FishBase para a espécie (FishBase, 2010). Durante este período, os

peixes foram mantidos a uma temperatura média de 25ºC.

3.2. PREPARAÇÃO DE SOLUÇÕES

Para o preparo das soluções de HgCl2 e CdCl2 utilizadas nesse estudo, uma

solução estoque com o sal desses metais foi preparada, diluindo-se o sal em água

destilada na concentração de 0,1M. Diluições da solução estoque foram em H2O

destilada nas concentrações finais de 5μM, 10μM, 20μM, 30μM e 40μM (Vergílio,

2009).

3.3. CONTAMINAÇÃO DOS EXEMPLARES DE Gymnotus carapo POR HgCl2 E

CdCl2.

Para cada experimento de contaminação por HgCl2 e CdCl2 foram

selecionados 6 exemplares machos, sendo que quatro foram expostos ao HgCl2 e

CdCl2 (um para cada tempo de exposição 24h/ 48h/ 72h/ 96h) e 2 restantes foram

estabelecidos como controle (dissecados após 96h). O procedimento descrito

anteriormente foi repetido duas vezes consecutivas para HgCl2 nas concentrações

5μM, 10μM, 20μM e 30μM, em cada tempo de exposição, totalizando 8 exemplares

utilizados para cada concentração testada e 16 controles.

O experimento de CdCl2 também foi repetido por duas vezes consecutivas

nas concentrações 10μM, 20μM, 30μM e 40 μM, em cada tempo de exposição,

totalizando 8 exemplares utilizados para cada concentração testada e 16 controles

23

(Tabela 2 e 3). A concentração testada para os dois metais (HgCl2 e CdCl2) foi

diferente, pois durante a fase de teste observamos que os peixes expostos a

concentrações de 5μM de CdCl2 não apresentaram nenhuma alteração

anatomopatológica, justificando assim a utilização de concentrações mais altas

desse metal no decorrer do experimento.

A contaminação foi realizada através de injeção intraperitonial da solução de

HgCl2 e CdCl2 , nos tempos de exposição de 24, 48, 72 e 96 horas. No grupo

controle, por sua vez, foi injetado solução de PBS (Phosphate Buffer Solucion). A

contaminação aguda foi documentada após uma única dose nas concentrações

5μM, 10μM, 20μM e 30μM e 40μM, sendo o volume injetado de acordo com o peso

do peixe (Vergílio, 2009).

Após cada tempo de exposição, os exemplares de Gymnotus carapo foram

anestesiados para obtenção dos seguintes dados: peso total (PT) e comprimento

total (CT), logo foram seccionados para a retirada dos testículos, que foram então

pesados para obtenção do índice gonadossomático (IGS), através da expressão:

IGS= Pg/PCX100. Os testículos retirados foram utilizados para a análise histológica

e ultraestrutural.

24

Tabela 2. Tabela de conversão das concentrações de HgCl2 em uM para ug/g.

HgCl2 ug ug/g

5 μM: 135,7 1,04846

10 μM: 271,5 2,0884615

20 μM: 543 4,1769231

30 μM: 814,5 6,2653846

Tabela 3. Tabela de conversão das concentrações de CdCl2 em uM para ug/g.

CdCl2 ug ug/g

10 μM: 201,3 1,54846

20 μM: 402,6 3,09692

30 μM: 604 4,64615

40 μM: 805 6,1923

25

Tabela 4. Número amostral, comprimento padrão e peso dos exemplares de G.

carapo utilizados para o experimento de HgCl2.

Número de exemplares Comprimento (cm) Peso (g)

controle 20 31 125

5 µM 8 33 100

10 µM 8 31 110

20 µM 12 33 153

30 µM 8 32 161

Total 56 32 130

Obs: No grupo controle foram utilizados 20 exemplares, 16 exemplares foram utilizados para Histologia e 4 foram utilizados para Microscopia de Varredura. Na concentração de 20µM, 8 exemplares foram utilizados para Histologia e 4 exemplares foram utilizados para Microscopia de Varredura, totalizando 12 exemplares.

Tabela 5. Número amostral, comprimento padrão e peso dos exemplares de G.

carapo utilizados para o experimento de CdCl2.

Número de exemplares Comprimento (cm) Peso (g)

controle 20 31 120

10 µM 8 30 116

20 µM 12 31 130

30 µM 8 35 135

40 µM 8 34 128

Total 56 32 126

Obs: No grupo controle foram utilizados 20 exemplares, 16 exemplares foram utilizados para Histologia e 4 foram utilizados para Microscopia de Varredura. Na concentração de 20µM, 8 exemplares foram utilizados para Histologia e 4 exemplares foram utilizados para Microscopia de Varredura, totalizando 12 exemplares.

26

3.4. PREPARAÇÃO PARA MICROSCOPIA ÓPTICA (MO)

Pequenas porções do testículo (aproximadamente 5 x 5 x 5 mm3) foram

fixados por meio da técnica de imersão com formol tamponado 10% por 24 horas.

As amostras foram então desidratadas em séries crescentes de álcool (70% / 80%/

90% / 95 % por uma hora e 100% por 30 minutos, três vezes consecutivas),

sofrendo diafanização em (1:1) xilol:álcool e xilol puro, em processador automático

(Leica TP 1020). Por fim, as amostras foram incluídas em parafina a 60° C e

cortadas com o auxílio de um micrótomo tipo Minot (Leica RM 2145) para obtenção

de cortes de 5 μm. Os cortes foram corados com hematoxilina-eosina (HE) e

observados ao microscópio óptico de campo claro (Axioplan – Zeiss).

Microfotografias digitais foram obtidas através do microscópio Axioplan acoplado á

câmera Cannon Power Shot A610/620.

Adicionalmente, pequenas porções do testículo (aproximadamente 1,0 mm3)

foram fixados com tampão cacodilato de sódio 0,1M; formaldeído 4%; glutaraldeído

2,5%, sacarore 5%, cloreto de cálcio 5 mM e pós-fixadas com tetróxido de ósmio 1%

e ferricianeto de potássio 0,8%. Após sucessivas desidratações com acetona (50% /

70%/ 90%/ 100% comum / 100% comum / 100% super seca), as amostras foram

incluídas em resina Epóxi, para serem cortadas no ultra-micrótomo REICHERCUTS

LEICA em seções semi-finas de 0,4 μm e coradas com azul de toluidina 1% para

posterior observação em microscópio óptico de campo claro (ZEISS - AXIOPLAN).

27

3.5. PREPARAÇÃO PARA MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO

(MET)

Pequenas porções do testículo (aproximadamente 1,0 mm3) fixados com

tampão cacodilato de sódio 0,1M; formaldeído 4%; glutaraldeído 2,5%, sacarose 5%,

cloreto de cálcio 5 mM e pós fixadas com tetróxido de ósmio 1% e ferricianeto de

potássio 0,8% seguiram o mesmo processo realizado para microscopia óptica citado

anteriormente. Com o auxilio de um ultramicrótomo (Reichert Ultracur

ultramicrotome) e faca de diamante foram obtidos cortes ultrafinos (70nm) que foram

contrastados com acetato de uranila 5% (30min) e citrato de chumbo 0,2% em

0.01mol/L NaOH (5 min) (Reynolds, 1963). Depois de lavadas, as grades secas

foram guardadas para posterior observação em um Microscópio Eletrônico de

Transmissão (ZEISS TEM 900), com uma aceleração de voltagem de 80 Kv.

3.6. PREPARAÇÃO PARA MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA

(MEV).

Para o experimento de Microscopia de Varredura utilizamos espermatozóides

de peixes contaminados com a concentração de 20µM de HgCl2 e CdCl2 por 96h.

Essa concentração foi utilizada por ser considerada tóxica e por provocar alterações

nos testículos, visualizados através da histologia.

O fluido com espermatózoides dos peixes do grupo controle e do grupo

contaminado foram fixados com tampão cacodilato 0,1 M, formaldeído 4%,

glutaraldeído 2,5%, sacarose 5% e cloreto de cálcio. A amostra foi separada em

duas partes: uma foi centrifugada a 800 rpm por 15 min a 4 °C, o pellet foi lavado

duas vezes em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,2) por 30 min. A outra amostra não foi

centrifugada. Testadas as duas amostras, utilizamos a amostra não centrifugada

para análise no microscópio óptico e no varredura.

Três gotas da amostra foram aderidas com poly L lisina em lamínulas, pós -

fixadas com tetróxido de ósmio 1% e tampão cacodilato de sódio 0,1M, desidratadas

em séries crescentes de etanol e secas em C02 pelo método de ponto crítico (BAL-

TEC CPD 030 Critical Point Dryer), as amostras secas foram posicionados em um

suporte e cobertas com uma camada fina de ouro (BAL-TEC SCD 050 Sputter

Coater). A observação foi através de um Microscópio Eletrônico de Varredura (Zeiss

28

EVO 40 a 15Kv), utilizando elétrons secundários. Adicionalmente, o fluido seminal foi

colocado sobre a lâmina histológica, realizando assim um esfregaço celular. As

lâminas foram secas ao ar. Após esse processo, as células foram coradas com

solução de Giemsa (azul de metileno), por 30 minutos. As lâminas coradas foram

lavadas em H20 destilada e, após secas ao ar, a lamínula então foi aderida com

Bálsamo do Canadá ao esfregaço celular. Foram obtidas imagens dos

espermatozóides devidamente fixados e corados para contagem e análise

morfológica das mesmas, através do microscópio Axioplan acoplado á câmera

Cannon Power Shot A610/620.

29

4. RESULTADOS

4.1. EFEITO TÓXICO DO HgCl2 E CdCl2 NOS EXEMPLARES DE TUVIRA

A morte dos exemplares de Gymnotus carapo foi observada durante a

execução dos experimentos de contaminação in vitro, principalmente nas

concentrações mais elevadas de HgCl2 e CdCl2 (Tabela 6 e 7). É importante

ressaltar que na ocorrência de morte de um dos espécimes de Gymnotus carapo,

outro exemplar era contaminado em seu lugar, respeitando a concentração e o

tempo de exposição da amostra, para não haver a redução do número amostral.

Tabela 6. Número de exemplares de G. carapo que morreram durante a exposição

de HgCl2.

5µM 10µM 20µM 30µM

Até 24h 0 0 3 1

Entre 24 e 48h 1 1 1 2

Entre 48h e 72h 0 2 2 2

Entre 72h e 96h 1 1 2 2

Total 2 4 8 7

Tabela 7. Número de exemplares de G. carapo que morreram durante a exposição

de CdCl2.

5µM 10µM 20µM 30µM

Até 24h 0 0 0 1

Entre 24 e 48h 0 1 1 1

Entre 48h e 72h 0 1 1 1

Entre 72h e 96h 0 1 2 2

Total 0 3 4 5

30

4.2. ASPECTOS ANATÔMICOS DO TESTÍCULO DE Gymnotus carapo

Uma investigação externa foi realizada em cada peixe antes e após a execução

dos experimentos. Os peixes do grupo controle demonstraram estar saudáveis, de

acordo com as condições macroscópicas de suas brânquias, olhos e escamas. Os

órgãos internos também foram investigados.

Nos peixes do grupo controle, os órgãos internos como fígado, rim e testículos

demonstraram estar normais. Os testículos apresentavam-se consistentes e com

uma coloração amarelada (Figura 9A e B). Já os peixes que foram expostos a

concentrações de 30µM e 40µM de CdCl2 nos tempos de exposição de 24 a 96

horas, foram observados alterações no fígado e no rim, esses órgãos apresentavam

um aspecto liquefeito, já os testículos apresentavam um aspecto amarelado (com a

presença de sangue) e flácidos (Figura 9C e D). Nas concentrações abaixo de 30µM

e 40µM de CdCl2 e em todas as concentrações de HgCl2 não foi visualizada

nenhuma alteração significativa nos órgãos internos.

A fim de avaliar a mudança testicular em resposta à exposição ao HgCl2 e

CdCl2, o índice gonadossomático foi calculado (Tabela 8 e 9), através disso

observamos que houve uma diminuição no GSI do grupo que foi exposto a 30µM e

40µM de CdCl2 (0,05), quando comparado ao GSI do grupo controle (0,09) (Tabela

8). Esses resultados confirmam as alterações anatômicas visualizadas no grupo

exposto a 30µM e 40µM de CdCl2, concluindo que a redução do GSI pode ser uma

resposta do testículo ao CdCl2.

O índice gonadossomatico também foi calculado no grupo exposto ao HgCl2 e

observamos que não houve uma diminuição significativa do GSI do grupo exposto a

concentrações de HgCl2 (0.07), quando comparado ao GSI do grupo controle (0,07 e

0,06) (Tabela 9).

31

Figura 9. Aspectos anatômicos do testículo de Gymnotus carapo. Em A-B:

testículos (espécime controle), C-D: testículos (espécime exposto à 30µM de CdCl2

por 96 horas).


exemplares de G. carapo expostos ao HgCl2

N° de exemplares

Comprimento (cm) Peso (g)

Peso do testículo GSI

Controle 20 33 100 0,070 0,07

5µM 8 31 110 0,081 0,07

10µM 8 33 153 0,110 0,07

20µM 12 32 161 0,120 0,07

30µM 8 32 131 0,080 0,06

32


exemplares de G. carapo expostos ao CdCl2

N° de

exemplares Comprimento

(cm) Peso (g) Peso do testículo GSI

Controle 20 30 116 0,109 0,09

10µM 8 31 130 0,080 0,06

20µM 12 35 135 0,089 0,06

30µM 8 34 128 0,069 0,05

40µM 8 32 127 0,071 0,05

4.3. ASPECTOS HISTOLÓGICOS

Para análise histológica dos testículos do grupo controle e do grupo exposto

ao HgCl2 e CdCl2 foram realizados cortes transversais (Figura 10). O testículo de G.

carapo mostrou-se arredondado, envolvido por uma camada de epitélio peritoneal

(Figura 11A).

Figura 10. Região do testículo de Gymnotus carapo (seta) onde foram realizados

cortes transversais. Barra:1cm

33

Os testículos de G. carapo são formados por um grande número de túbulos

seminíferos com diferentes diâmetros (Figura 11B), dentro desses túbulos foram

visualizadas as células de Sertoli (S) e células germinativas (espermatogônias,

espermatócitos, espermátides e espermatozóides) (Figura 11B e 11C). As células de

Sertoli (S) são pequenas e em maior aumento possuem o formato triangular, muitas

vezes localizada na periferia dos túbulos associadas às células germinativas,

principalmente as espermatogônias (SPG) (Figura 11E).

Entre os túbulos seminíferos identificamos o tecido intersticial onde

encontramos as células de Leydig ou células intersticiais e vasos sanguíneos (Figura

11B, 11D e 11F). As células de Leydig são ovóides e geralmente aparecem em

grupos (Figura 11D). No peixe teleósteo esta célula é responsável pela síntese de

11 cetotestosterona (11KT), um hormônio que induz a progressão da

espermatogênese (Billard, 1990)

Assim, verificamos que a estrutura interna dos testículos do grupo controle

mostrava-se compacta, sem espaçamento. Os túbulos seminíferos tinham um

arranjo normal e entre estes túbulos o tecido intersticial não apresentava nenhuma

alteração. As células germinativas aparecem normais e os espermatozóides livres na

luz do túbulo sem aparente agregação (Figura 11A - 11E, 15A e 15B).

Durante a análise histológica dos testículos do grupo controle e do grupo

exposto ao HgCl2 e CdCl2, observamos o estágio de maturação gonadal seguindo a

escala de maturidade de Barbieri para G. carapo (1981), com isso, verificamos que a

maioria dos peixes encontravam-se no estágio II (Adultos em reprodução -maduros),

neste estágio os testículos possuem túbulos seminíferos que exibem células

germinativas em várias fases de desenvolvimento, principalmente espermátides e

espermatozóides.

Várias alterações histológicas foram identificadas nos exemplares expostos

ao HgCl2 e CdCl2, porém no grupo tratado com HgCl2 os efeitos foram visualizados

mais rapidamente. Após o tratamento com 5µM de HgCl2 alterações histopatológicas

foram observadas a partir de 72 horas, enquanto que para 10μM, 20µM e 30μM

essas alterações foram visualizadas em todos os tempos de exposição analisados.

As lesões mais significativas identificadas no testículo dos espécimes expostos ao

HgCl2, incluem aumento do tecido intersticial caracterizado por fibrose (Figura 12A,

12C, 15C, 15D), congestão dos vasos sanguíneos ou hiperemia passiva (Figura

12B), desorganização dos túbulos seminíferos (Figura 12D e 13A) desintegração

34

intersticial e tubular caracterizado por áreas com espaçamento (Figura 13B e 13D) e

variações acentuadas no tamanho dos túbulos seminíferos (Figura 13C).

Com relação ao grupo exposto ao CdCl2, às alterações histopatológicas foram

observadas a partir de 72h de exposição na concentração de 10µM. É importante

ressaltar que as lesões encontradas no tecido reprodutor do grupo exposto ao HgCl2

e CdCl2 foram semelhantes em todas as concentrações administradas, sendo os

efeitos progressivos observados com o aumento da concentração ao metal exposto.

As lesões mais significativas identificadas no testículo dos espécimes expostos ao

CdCl2, incluem proliferação do tecido intersticial entre os túbulos seminíferos (Figura

14A), fibrose (Figura 14B, 14F e 15E), congestão dos vasos sanguíneos ou

hiperemia passiva (Figura 14C), desorganização dos túbulos (Figura 14D),

degeneração do tecido, caracterizado por um processo de vacuolização (Figura 14E,

14F e 15F), agregação espermática na luz dos túbulos (Figura 14E).

35

Figura 11. Organização estrutural do testículo de Gymnotus carapo (grupo controle).

Em A: destaca-se a túnica albugínea envolvendo o testículo (seta) e o lúmen do

túbulo, B: as setas indicam os túbulos seminíferos. Inset: túbulos seminíferos, C:

destacam-se as células germinativas: espermatogônias, espermatócitos,

espermátides, espermatozóides e células de Sertoli (seta). Inset: Célula de Sertoli.

Em D as setas indicam células sanguíneas e células de Leydig. Inset: célula de

Leydig, F: destaca-se o tecido intersticial entre túbulos seminíferos. Inset: tecido

intersticial. TA: Túnica Albugínea, LI: Lúmen do túbulo, it: tecido intersticial, L: célula

36

de Leydig, S: célula de Sertoli, SZ: espermatozóides, SCI: espermatócitos primários,

SD: espermátides, SGI: espermatogônias primárias. Coloração: Hematoxilina e

Eosina. Barra de Escala: A: 200µm, B: 100µm, C-E: 50µm.


a 5μM e 10μM de HgCl2). Em A e C: as setas indicam fibrose. Insets: regiões do

testículo com fibrose, B: a seta indica hiperemia passiva, D: desorganização dos

túbulos seminíferos. Inset: região do testículo com desorganização dos túbulos.

Coloração: Hematoxilina e Eosina. Barra de escala: A-D: 100µm.

37


a 20μM e 30μM de HgCl2). Em A: desorganização dos túbulos seminíferos, B e D:

desintegração intersticial e tubular. Insets: região do testículo com o tecido

intersticial e tubular desintegrado. Em C: variações acentuadas no tamanho dos

túbulos seminíferos (setas). Coloração: Hematoxilina e Eosina. Barra de escala: A-D:

100µm.

38


a 10µM, 30µM e 40µM CdCl2). Em A: as marcações indicam uma proliferação

intersticial entre os túbulos seminíferos. Inset: região entre túbulos com proliferação,

B: fibrose (seta). Inset: região do tecido com fibrose, C: hiperemia passiva (seta), D:

desorganização dos túbulos, E: agregação espermática (seta) e degeneração do

tecido. Inset: detalhe dos espermatozóides em agregação no lúmen do túbulo, F:

degeneração do tecido acompanhada de fibrose. Inset: região do tecido degenerada

e com fibrose. Coloração: Hematoxilina e Eosina. Barra de escala: A-F: 100µm.

39

Figura 15. Corte transversal dos testículos de Gymnotus carapo. Em A e B, detalhe

do tecido intersticial e células germinativas (grupo controle), em C e D as marcações

indicam o aumento de tecido intersticial entre túbulos seminíferos (grupo exposto a

HgCl2). Em E destaca-se o aumento do tecido intersticial e desorganização nos

túbulos, em F as setas mostram vacúolos entre as células germinativas indicando

uma degeneração do tecido (grupo exposto a CdCl2). Coloração: Azul de Toluidina.

Barra de escala: A-F: 20µm.

40

4.4. ASPECTOS ULTRAESTRUTURAIS

As observações ultraestruturais revelam que as espermatogônias primárias

(SPGI), que são as maiores células da linhagem germinativa, possuem o formato

arredondado, um núcleo esférico e central com cromatina granular e uniformemente

distribuída. O nucléolo proeminente é esférico e eletrodenso (Figura 16A). As

espermatogônias primárias se dividem mitoticamente para dar origem as

espermatogônias secundárias. As espermatogônias secundárias (SPCII) são

caracterizadas por uma diminuição no tamanho da célula, o núcleo é central e

agregação da cromatina difere segundo a fase do ciclo celular observada (Figura

16A).

Nos túbulos seminíferos, também podemos observar espermatócitos

primários (SPCI), que se originam de espermatogônias secundárias tardias e são

vistas em várias fases de desenvolvimento meiótico. Essas células possuem um

núcleo central esférico, com um formato regular, ocupando uma grande parte da

célula, o nucléolo não é visível e a presença de diferentes graus de condensação da

cromatina no núcleo revela que essas células estão em diferentes estágios da

prófase meiótica (Figura 16B). Os espermatócitos primários se transformam em

espermatócitos secundários, que são células menores que os espermatócitos

primários. Cistos de espermatócitos secundários são raramente observados.

Diversas espermátides (SPD) foram visualizadas na luz dos túbulos

seminíferos em diferentes estágios de espermiogênese (Figura 16B e C). Com o

avanço do processo de espermiogênese, as espermátides tornam-se células

menores e o núcleo ocupa grande parte da célula (Figura 16B e C). Ao mesmo

tempo, uma migração dos centríolos ocorre em direção à espermátide. Dependendo

do estágio da espermiogênese, o volume de citoplasma diminui consideravelmente e

ocorre um aumento no volume de mitocôndrias (Figura 16C).

A análise ultraestrutural também revelou alterações em células da linhagem

espermatogênica e essas alterações foram mais evidentes com o aumento da

concentração e tempo de exposição do organismo ao HgCl2 e CdCl2.

No grupo tratado com 20µM de HgCl2 por 72h, observamos na luz dos túbulos

seminíferos várias espermátides, que não possuíam formato arredondado e

apresentavam-se deformadas, com núcleo irregular e mitocôndrias maiores (Figura

17A). No grupo tratado com 30µM de HgCl2 por 96h, foram observadas alterações

41

mais severas, já que em algumas células germinativas não foi possível identificar o

seu estágio de desenvolvimento espermatogênico pois estavam totalmente

danificadas e algumas já se encontravam em processo apoptótico (Figura 17B).

Nos testículos dos espécimes tratados com 30µM e 40µM de CdCl2 por 96h e

24h respectivamente, observamos várias células germinativas em processo de

vacuolização (Figura 17C-17D).


controle). Em A destacam-se as espermatogônias, B: espermatócitos primários e

espermátides C: lúmen do túbulo com espermátides, D: espermatozóide. SPGI:

espermatogônia primária, SPGII: espermatogônia secundária, SPCI: espermatócitos

primários SPD: espermátides, SZ: espermatozóide N: núcleo, n: nucléolo, c:

centríolo, Ll: Lúmen do lóbulo, m: mitocôndria, f: flagelo.

42


exposto a HgCl2 e CdCl2). Em A, a seta indica uma espermátide com várias

mitocôndrias com o seu tamanho anormal, B: células germinativas em apoptose

(cabeça da seta) e restos celulares (seta), C: célula germinativa vacuolizada (seta),

D: célula germinativa danificada com pequenos vacúolos. n: núcleo, m: mitocôndria,

v: vacúolos.

43

4.4. ASPECTOS MORFOLÓGICOS DOS ESPERMATOZÓIDES DE Gymnotus

carapo.

Os espermatozóides de G. carapo são as menores células da linhagem

espermatogênica e são constituídos de uma cabeça arredondada (com ausência de

acrossoma), um flagelo alongado e uma peça intermediária (que não é evidente

nesta espécie de peixe) (Figura 16D, 18A e 19A e B).

Durante a análise morfológica dos espermatozóides do grupo controle foi

observado um núcleo arredondado e uma pequena parte do citoplasma evidente na

região ântero-posterior da cabeça (Figura 18A).

Para análise da morfologia dos espermatozóides do grupo exposto ao HgCl2 e

CdCl2 foi testado apenas uma concentração (20µM) nos tempos (24, 48, 72 e 96h).

No grupo exposto a 20µM de HgCl2 e CdCl2 por 24h e 48h não foi observado

nenhuma alteração significativa nos espermatozóides, já após 72h foram

observados espermatozóides com a cabeça totalmente corada indicando uma

máxima condensação do DNA (Figura 18B), além disso, verificamos por meio da

microscopia de varredura, espermatozóides apresentando cabeças deformadas e

com ausência de flagelo (Figura 19C-19F).

Através da análise quantitativa para verificação da presença de flagelo,

observamos que no grupo controle aproximadamente 90% dos espermatozóides

apresentavam flagelo. No grupo exposto a 20µM de HgCl2 (24h/72h) houve uma

diminuição do número de espermatozóides com flagelo (54% e 62%

respectivamente, Figura 20A). No grupo exposto a 20µM de CdCl2 (24h/ 96h)

também foi observado a diminuição do número de espermatozóides com flagelo (63

e 62% respectivamente, Figura 20B).

O cloreto de mercúrio e o cloreto de cádmio apresentaram efeitos similares na

morfologia dos espermatozóides expostos a 20µM, entretanto, o HgCl2 aparentou

ser mais tóxico do que o CdCl2. De acordo com a Figura 20, pode-se observar que o

percentual de espermatozóides com flagelo não variou muito em função do tempo

de exposição ao CdCl2 e HgCl2, porém, realizado um comparativo entre os metais,

foi revelado que a porcentagem do número de espermatozóides com flagelo foi o

mesmo (62%) para o HgCl2 e o CdCl2 nos tempos (72h e 96h respectivamente).

44

Figura 18. Fotomicrografia dos espermatozóides de Gymnotus carapo corados com

Giemsa. A: espermatozóides do grupo controle, B: espermatozóides do grupo

exposto a 20μM de HgCl2 por 72h, C: espermatozóides do grupo exposto a 20µM de

CdCl2 por 96h c: cabeça, f: flagelo. Barra de escala: A-C: 20µm.

45

Figura 19. Fotomicrografia (MEV) dos espermatozóides de Gymnotus carapo. Em A

e B: espermatozóide do grupo controle, C: espermatozóide do grupo exposto a

HgCl2 por 72h D: espermatozóides do grupo exposto a CdCl2 por 96h. c: cabeça e f:

flagelo. Barra de escala: A: 2μm, B, D e E: 1μm.

46

Figura 20. Porcentagem de espermatozóides do grupo controle e do grupo exposto

ao HgCl2 (A) e ao CdCl2 (B) com flagelo e sem flagelo.

47

5. DISCUSSÃO

Os bioensaios em laboratório têm como objetivo analisar a toxicidade dos metais

pesados em concentrações específicas e com isso as mudanças induzidas por

esses elementos podem ser empregadas para observação da relação dose/resposta

dos organismos expostos (Vergílio, 2009). Além disso, a análise histopatológica vêm

como uma ferramenta essencial para diagnosticar e fornecer uma descrição exata

das lesões causadas por metais em tecidos e células. Assim, torna-se importante

detectar estas alterações histopatológicas antes dos efeitos prejudiciais tornarem-se

visíveis nos níveis mais altos, como o nível de organismo ou população.

Os organismos, incluindo os peixes, podem responder de diferentes formas a

exposição ao Hg e Cd. Essa resposta irá depender tanto da dose quanto do tempo

de exposição a esses compostos químicos. Com isso, em alguns casos, o

organismo pode sofrer adaptação quando for exposto continuamente a um agente

químico. Porém, em outros casos, o composto pode induzir respostas, sendo

observadas principalmente através de danos celulares e teciduais. Finalmente, se a

exposição for quantitativamente além do limite de detoxificação dos organismos, ou

ocorrer por um período prolongado, se estabelece uma resposta tóxica que pode

ocasionar a mortalidade dos organismos susceptíveis (Boelsterli, 2007).

O testículo de peixe é um órgão pouco estudado, pois não é considerado alvo

direto do mercúrio e cádmio, porém nos últimos anos, estudos têm demonstrado que

o testículo vem sofrendo diversas alterações devido à exposição a esses poluentes

e com isso tem se mostrado importante nas avaliações de toxicidade ambiental

(Thompson & Bannigan, 2008; Siu et al., 2009).

Com base em estudos anteriores do grupo, onde foram utilizados em cultura de

células (hepatócitos HUH-7) e no tecido hepático de G. carapo várias concentrações

de HgCl2 em diferentes tempos de exposição, decidimos ajustar algumas dessas

concentrações para visualização de efeitos tóxicos nos testículos. No presente

estudo, a investigação das respostas celulares e sub-celulares por microscopia de

luz e microscopia eletrônica foram fundamentais para descrever as alterações

celulares precoces e danos testiculares nos peixes expostos a diferentes

concentrações de cloreto de mercúrio e cádmio.

Kirubagaran e Joy (1988) e Pelgrom et al. (1995) observaram que o mercúrio

e o cádmio têm a capacidade de inibir a gametogênese, induzindo lesões

48

testiculares (desorganização dos túbulos e desintegração das células de Sertoli). No

presente estudo, a desorganização dos túbulos seminíferos foi claramente

observada após 96h de exposição a 10μM de HgCl2. Além disso, foi observado

também outro tipo de lesão no tecido testicular como a desintegração dos túbulos e

do tecido intersticial após 72h de exposição a 20µM de HgCl2. Alterações similares

também foram observadas nos peixes expostos ao cádmio.

Adicionalmente, em estudo de contaminação subletal por cobre em O.

mossambicus (0.16; 0.40 e 2.00 mg Cu/L) por 96 horas, Pieterse (2004), também

observou no tecido testicular desorganização dos túbulos seminíferos e

desintegração do tecido intersticial e das células de Sertoli. Para o autor, essas

alterações degenerativas que ocorrem nos túbulos podem comprometer o processo

espermatogênico, fazendo com que haja uma mudança ou até mesmo uma

interrupção desse processo.

Segundo Wester e Canton (1992), testículos maduros de P. reticulata

expostos a 5.6µg MeHg/L durante três meses demonstraram alterações

histopatológicas incluindo a ocorrência de fibrose e inflamação no interstício. A

fibrose ocorre quando o tecido conjuntivo fibroso em excesso se desenvolve no

tecido testicular como um processo reparativo. Em nosso estudo a fibrose foi

observada nos testículos dos espécimes expostos a 5µM - 30µM de HgCl2 e a 10µM

- 40µM de CdCl2 nos maiores tempos de exposição, indicando que esse processo

ocorre como um tipo de defesa do tecido testicular contra os danos induzidos pelos

metais.

Além disso, verificamos que, nos testículos de espécimes expostos a 10µM

HgCl2 e a 30µM de CdCl2 houve um aumento das células sanguíneas nos vasos,

esse fenômeno é conhecido por congestão ou hiperemia. A hiperemia é causada

pelo aumento no volume de sangue em uma região pela intensificação do

abastecimento de sangue ou de uma diminuição do fluxo venoso. É um indício de

que está havendo uma inflamação aguda local. No presente estudo, a ocorrência de

hiperemia pode estar relacionada com o tempo de exposição ao HgCl2 e ao CdCl2, já

que esse evento foi documentado a partir de 24 horas nas concentrações descritas

acima.

Durante o andamento dos experimentos foi observada a morte de alguns

exemplares de G. carapo (Tabela 4 e 5), principalmente quando ambos estavam

expostos as maiores concentrações de HgCl2 e CdCl2. Isso indica que o tratamento

49

foi estabelecido desde concentrações sub-letais (5µM e 10µM) onde puderam ser

observados os efeitos progressivos da contaminação por HgCl2 e CdCl2, até

concentrações letais (20µM, 30µM e 40µM) onde a concentração foi num nível tal

que proporcionou a morte dos peixes analisados.

Em um estudo realizado por Predes et al. (2010), onde foram injetados

intraperitonealmente baixas doses de CdCl2 em ratos (1 e 1.2 mg/kg) foi observado

através da análise morfométrica uma diminuição no diâmetro dos túbulos

seminíferos após 7 dias de exposição, além disso, observações microscópicas

mostraram danos progressivos no tecido testicular de animais expostos ao CdCl2.

Após sete dias de exposição, o lúmen dos túbulos seminíferos foram preenchidos

com células germinativas degeneradas e agregado de espermátides com o núcleo

apoptótico. Vacuolização do epitélio seminífero também foi observado. Após 56 dias,

houve um aumento dos danos, resultando em túbulos seminíferos vacuolizados. De

acordo com Creasy (2001), a vacuolização é uma resposta morfológica comum do

epitélio testicular a vários tipos de agressões causadas por metais.

No presente estudo, os túbulos seminíferos apresentaram variações

acentuadas no tamanho após 72h de exposição a 30µM de HgCl2. Alterações como

degeneração, agregado de espermátides e espermatozóides e vacuolização do

epitélio e do túbulo seminífero também foram observados nos espécimes expostos a

40µM de CdCl2. Assim como o estudo citado acima, o presente estudo mostra que os

efeitos tóxicos do cádmio no aparelho reprodutor masculino foram dose-dependente,

as alterações mais drásticas foram visualizadas no tecido testicular de G. carapo na

concentração de 40µM de CdCl2.

Cameron e Foster (1963) demonstraram em um estudo realizado com

coelhos, que através de uma única injeção subcutânea de cloreto de cádmio

(18mg/kg) após 72h de exposição, foi possível observar nos testículos vários efeitos

histopatológicos, dentre eles destacam-se: desorganização do epitélio seminífero,

interstício distendido com extravasamento de células sanguíneas e aumento da área

intersticial. Para esses autores, as principais linhas de evidência para explicar o

efeito destrutivo do cádmio no tecido testicular são: (a) que inibe as enzimas sulfidril,

formando mercaptides com seus grupos SH, (b) que se combina com grupos

similares SH no aparato mitótico (c) que compete com o zinco. A última explicação é

a mais provável porque as injeções de zinco dão proteção contra danos induzidos

pelo cádmio, embora apenas por um período limitado.

50

No presente estudo nós observamos no tecido testicular de G. carapo o

interstício distendido após 72h de exposição a 10µM de CdCl2, além disso,

verificamos um aumento da área intersticial no tecido testicular dos exemplares

expostos a 20µM de HgCl2 (24 e 72h) e 30µM de CdCl2 (96h).

Homma - Takeda et al. (2001) mostraram a indução de apoptose em células

germinativas de camundongos machos que haviam sido expostos ao cloreto de

metilmercúrio (10 mg/kg por 8 dias). Após a contaminação, eles observaram o

fenômeno apoptótico principalmente em espermatócitos e espermátides. Apoptose é

um processo que está geralmente envolvido no desenvolvimento e homeostase

tecidual, mas também parece estar envolvido numa ampla faixa de condições

patológicas (Thompson, 1995). Muitos autores mostraram a formação de ROS na

toxicidade de metais pesados dentro das células, sendo proposto que estariam

envolvidos na citotoxicidade e apoptose (Bower, 2005; Lemarie et al., 2004).

As células que sofrem apoptose encolhem morfologicamente devido à perda

de volume citoplasmático, além disso, ocorre condensação da cromatina e restos

celulares de organismos apoptóticos ficam evidentes. Assim, a apoptose, é um

indicador precoce de estresse a xenobióticos e fornece dados sobre o estado de

saúde do organismo (Sweet et al., 1999).

Através de uma análise ultraestrutural, podemos observar em nosso estudo

que o testículo do grupo contaminado com 20µM de HgCl2 por 72h apresentou a

formação de espermátides deformadas com a presença de núcleos irregulares e

mitocôndrias maiores. No grupo tratado com 30µM de HgCl2 por 96h foram

observados alterações mais severas, já que em algumas células germinativas não

foi possível identificar o seu estágio de desenvolvimento espermatogênico, pois

estavam totalmente danificadas e algumas espermátides já se encontravam em

processo apoptótico.

A morfologia dos espermatozóides de peixes tem sido pouco investigada,

porém estudos com mamíferos sugerem que baixas concentrações de mercúrio

podem causar danos no flagelo (Mohamed et al., 1986; Rao, 1989)

Em estudos realizados por Popek, et al. (2006), Dietrich et al. (2004 e 2005),

Rurangwa, et al. (1998) onde foram testados em peixes várias concentrações de

mercúrio e cádmio (1, 10, 100 mg/l) em um curto período de tempo (0-24h), concluiu-

se que esses metais tem a capacidade de diminuir a qualidade dos gametas,

51

afetando a motilidade do espermatozóide, integridade do plasmalema e

fragmentação do DNA.

Kime, (1999) em uma revisão sobre os efeitos dos xenobióticos na

reprodução de peixes revela que a maioria das substâncias químicas presentes no

ecossistema aquático exerce efeitos nos testículos durante a espermatogênese o

que resulta em espermatozóides anormais, malformados e com motilidade reduzida.

Segundo este autor, a morfologia espermática pode, portanto fornecer uma boa

medida quantitativa do desenvolvimento dos efeitos aos xenobióticos.

No presente estudo, observamos através da microscopia óptica e eletrônica

alterações nos espermatozóides de G. carapo expostos ao HgCl2 e CdCl2. Essas

alterações incluem anormalidade na cabeça, ausência de flagelo e máxima

condensação do DNA.

É importante ressaltar, que as lesões encontradas no tecido reprodutor do

grupo exposto ao HgCl2 e CdCl2 foram semelhantes em todas as concentrações

administradas, sendo os efeitos progressivos observados com o aumento da

concentração ao metal exposto, porém no grupo tratado com HgCl2 os efeitos foram

considerados mais severos. Após 72h de exposição a 5µM de HgCl2 foi observado

alterações no tecido reprodutivo. Já o CdCl2 as alterações foram visualizadas após

72 horas de exposição a 10µM. Isso indica que o HgCl2 foi mais tóxico no tecido

reprodutor que o CdCl2.

A ocorrência de alterações histopatológicas documentadas no presente

estudo sugerem uma disfunção reprodutiva e uma falha no processo

espermatogênico no testículo de Gymnotus carapo após exposição ao HgCl2 e

CdCl2. Dessa forma, os resultados obtidos através da análise dos espermatozóides

e da histologia do tecido reprodutivo elucidam as alterações a nível celular e tecidual

induzidas pela exposição aos metais pesados, podendo ser empregadas como

ferramentas sensíveis no monitoramento ambiental e programas de avaliação de

áreas impactadas, apresentado assim a habilidade de complementar as análises

químicas.

52

6. CONCLUSÕES

Através de análise microscópica o testículo de Gymnotus carapo mostrou-se

arredondado e envolvido por uma camada de epitélio peritoneal. Internamente os

testículos são formados por um grande número de túbulos seminíferos com

diferentes diâmetros, dentro desses túbulos foram visualizados as células de Sertoli

(S) e células germinativas (espermatogônias, espermatócitos, espermátides e

espermatozóides). As células de Sertoli (S) são pequenas e em maior aumento

possuem o formato triangular, muitas vezes localizadas na periferia dos túbulos

associadas a células germinativas, principalmente as espermatogônias (SPG). Entre

os túbulos seminíferos identificamos o tecido intersticial onde encontramos as

células de Leydig ou células intersticiais e vasos sanguíneos. As células de Leydig

são ovóides e geralmente aparecem em grupos.

Os espermatozóides de G. carapo são constituídos de uma cabeça

arredondada (com ausência de acrossoma), um flagelo alongado e uma peça

intermediária (que não é evidente nesta espécie de peixe).

A metodologia de contaminação in vitro e de contaminação aguda empregada

no presente estudo foi realizada com sucesso. A espécie de peixe utilizada

(Gymnotus carapo) se adaptou bem as condições do laboratório.

Após testadas várias concentrações (5µM, 10µM, 20µM, 30µM, 40µM) de

HgCl2 e CdCl2 em diferentes tempos de exposição (24h, 48h, 72h, 96h) conclui-se

que tanto o HgCl2 e CdCl2 afetam o testículo de Gymnotus carapo, provocando

diversas alterações, tanto teciduais quanto celulares, porém neste estudo o HgCl2 foi

mais tóxico que o CdCl2. Os efeitos nos testículos foram visíveis a partir de 5µM para

HgCl2 e 10µM para CdCl2. As alterações nos testículos e espermatozóides foram

semelhantes para ambos os metais e progressivas com o aumento da concentração

e do tempo de exposição.

53

As lesões mais significativas identificadas no testículo dos espécimes

expostos ao HgCl2, incluem aumento do tecido intersticial caracterizado por fibrose,

hiperemia, desorganização dos túbulos seminíferos, desintegração intersticial e

tubular caracterizado por áreas com espaçamento e variações acentuadas no

tamanho dos túbulos seminíferos, já as lesões identificadas no testículo dos

espécimes expostos ao CdCl2, incluem proliferação do tecido intersticial entre os

túbulos seminíferos, fibrose, hiperemia, desorganização dos túbulos seminíferos,

degeneração do tecido caracterizado por um processo de vacuolização, agregação

espermática na luz dos túbulos.

Para análise da morfologia dos espermatozóides do grupo exposto ao HgCl2 e

CdCl2 foi testado apenas uma concentração (20µM) nos tempos (24, 48, 72 e 96h).

No grupo exposto a 20µM de HgCl2 e CdCl2 após 72h foram observados

espermatozóides com a cabeça totalmente corada indicando uma máxima

condensação do DNA, além disso, verificamos por meio da microscopia de

varredura, espermatozóides apresentando cabeças deformadas e com ausência de

flagelo.

54

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

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