repaso i fase - bm

8/17/2019 Repaso i Fase - Bm

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Biotecnología Médica – 2016 Ing.Betty Salazar [email protected]

BI!"#$%&'(M)*I#(

+(S" I


2/57

"% %(B,(!,I *" *I(&$-S!I# &"$)!I#M%"#%(,


3/57

REGLAS

PRÁCTICAS

PROCEDIMIENTOS

+*(/ "#*

(S"&,(, %( #(%I*(* "I$!"&,I*(* *" %S *(!S

P,*#I*S "$ "S!*IS

I$"S!I&(#I$"S.

B"$(S P,#!I#(S *" %(B,(!,IBP%3


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• CONFIABLES: precisión y réplicas

• REPROD!CIBLES

• A!DITABLES: "#c$%en&ación

• RECONOCIDOS POR EL M!NDOCIENT'FICO: p$(licaci#nes


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REC!RSOS

REGLAS

CARACTERI)ACI*N

DOC!MENTACI*N

ASEG!RAMIENTO DE LA CALIDAD


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EDIFICACI*N E+!IPAMIENTO

• Áreas separa"as• ,es&$ari#• Desc#n&a%inación• Aire ac#n"ici#na"#• C#rrien&e es&a(ili-a"a

• E.&racción "e /ci"#sn$cleic#s

• Elec&r#0#resis• PCR


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M"S!,(SSan1re T#&al

Ca(ell#s

Cél$las B$calesBi#psias In 2i2#

Bi#psias en para0inaOrina3ecesEsp$

Aspira"# Br#n4$eal5 #&r#s 0l$i"#s c#rp#rales


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"4!,(##I-$ *" #I*S $#%"I#S


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(*$

• P"$!S(5 Des#.irri(#sa

• B(S"S $I!,&"$(*(S5 cisina6 1$anina6a"enina y &i%ina

• &,P +S+(!5 car1a ne1a&i2a e7i"r#s#l$(ili"a"

• "$%(#" P"$!" *" I*,-&"$5 En&re (ases

ni&r#1ena"as

• "$%(#" +S+*I)S!",5 En&re pensa y 1r$p#0#s0a


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(,$

• P"$!S(5 Ri(#sa

• B(S"S $I!,&"$(*(S.

• &,P +S+(!.

• "$%(#" P"$!" *" I*,-&"$.

• "$%(#" +S+*I)S!",.


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"4!,(##I-$

C8L!LASN!CLEADAS

TE9IDOS MICROORGANISMOS

SEPARACI*N DEGL*B!LOS RO9OS5 GL*B!LOSBLANCOS

FICOLL

FI9ADOS ODESPARAFINADOS:FORMALINA ; <

DESPARAFINAR:=ILENO

LISIS DE LA PAREDCEL!LAR

M EN)IMÁTICOM +!'MICOM MECÁNICOM MI=TO


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M8TODOS

FASE S*LIDA:S'LICA

FENOL>CLOROFORMO

Fase ac$#sa: ADN

Fase #r1/nica:l?pi"#s y pr#&e?nas

Ress cel$lares # "e(ris


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LISIS CEL!LAR

ELIMINACI*N DE PROTE'NAS

PRECIPITACI*N DEL ÁCIDO N!CLEICO

P!RIFICACI*N DEL AN

P!RE)A 5 CONCENTRACI*N


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REACTI,OS

Lisis eri&r#cis: EDTA6

Lisis le$cicis: SDS6 Tris6 EDTA

Cl#r#0#r%#: 0#r%ación "e 0ases

Fen#l y alc#7#l is#a%?lic#: e2i&a la 0#r%ación "e esp$%a

Is#pr#pan#l y e&an#l: precipi&ación

E&an#l: p$ri0icación


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*"!"##I-$ 7 ,"S%#I-$ *" #I*S$#%"I#S


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E L E C T R O F

O R E S I S

• C#nsis&e en el %#2i%ien "e%#léc$las a &ra2és "e $na %a&ri-

p#r la aplicación "e c#rrien&eeléc&rica

• Peine• Gel "e a1ar#sa # p#liacrila%i"a•

C/%ara elec&r#0#ré&ica• Elec&r#"#s • B$00er• C#l#ran&es

• C#ncen&ración "el 1el: a1ar#sa yp#liacrila%i"a

• ,arian&es: PFGE


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E S P E

C T R O F O T O M E T R ' A

• C#nsis&e en la &rans%isión "e la l$- a&ra2és "e $na s#l$ción6 para"e&er%inar la c#ncen&ración "e $n

s#l$ presen&e en la %is%a

LE5 DE LAMBERT > BEER

ABSORBANCIAS:• @;: c#%p$ess #r1/nic#s• @;: AN• @;: Fen#l• @;: pr#&e?nas

CONCENTRACI*N:• ADN: ; 1 %L H DO• ADN: M% H 6 DO• ARN: ; 1 %L H DO


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,$(

2608290 :2

Inace;table

,$(

2608290


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F L ! O R O

M E T R ' A

M I C R O F L ! I D O

S

• Se (asa en la0l$#rescencia 4$ees pr#p#rci#nal ala c#ncen&ración

•

Fl$#ró0#r#s:DABA6 3OEC3ST6PICOGREEN6OLIGREEN

• Se (asa en laelec&r#0#resis yla %a&ri- se

in&r#"$ce en $nc7ip

• Tecn#l#1?a La(>#n>a>c7ip

• C#ns&a "e%icr#canales

• Sis&e%aa$%/&ic#6%?ni%#s

2#lJ%enes yan/lisissi%$l&/ne# "e%$es&ras


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#(,(#!",I=(#I-$ *" #I*S $#%"I#S


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N!CLEASAS

TIPO DE ESCISI*NEN POSICI*N

TERMINAL OINTERNA

TIPO DE PENTOSA 5

BASE NITROGENADA

TIPO DE ENLACE

FOSFODI8STER

• En"#n$cleasa• e.#n$cleasa

• Tip# a: O3 K• Tip# (: O3 K

• DNAsas• RNAsas

Re2isar l#s &ip#s "e en"#n$cleasas &ip# I6 II y III


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Se lla%an a"e%/s "e n$cleasas "e res&ricción6 en"#n$cleasas "eres&ricción6 en-i%as "e res&ricción # res&ric&asas

Se n#%(ran c#n &res le&ras "el 1éner# y especie y $n nJ%er#r#%an#6 3aeIII

S$s si&i#s "e rec#n#ci%ien se presen&an en el ADN "Jple. y la7i"rólisis se "a ni2el "el enlace 0#s0#"iés&er

Mecanis%# "e %e&ilación6 i%pi"e la $nión "e la en-i%a "eres&ricción


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3IBRIDACI*N


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*"S$(!,(%I=(#'-$

R#&$ra "e l#s p$en&es "e 7i"ró1en# en&re pares "e(ases

Te%pera&$ra Áci"#s y (ases A1en&es4$?%ic#s

REA6FORMAMIDA 5

FORMALDE3'DO


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DNA CONSEC!ENCIA

DIANASONDAMARCADA 3IBRIDACI*N


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M8TODOS

En 0asel?4$i"a

En s#p#r&esóli"#

In si&$


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3IBRIDACI*N EN SOPORTE S*LIDO

DOT>BLOT 5 SLOT>BLOT

SO!T3ERN BLOT

NORT3ERN BLOT

ESTERN BLOT


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MI#,(,,(7S

+ragmentos de >cidos n?cleicos

ligon?cletidosMATRI)


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(MP%I+I#(#I-$ *" #I*S $#%"I#S5P#,


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DEFINICI*N

A%pli0icación "irec&a "e $nare1ión espec?0ica 0ra1%en "e

ADN # cADN para #(&ener%Jl&iples c#pias en c#r &ie%p#

RE+!ERIMIENTOS

• ADN "iana• "NTPs• M1Cl@• Pri%ers• En-i%a: ADN p#li%erasa


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"!(P(S *"% #I#%

Desna&$rali-ación

3i(ri"ación

El#n1ación

• Q@ Q C

• ; > C• En0ria%ien p#r

"e(a# "e la T%

• ; C• La ADN p#li%erasa

aUa"e l#s "NTPs ale.&re%# K "el pri%er


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,ARIANTES

4PCR

RT>PCR

• !&ili-a "#s en-i%as: &ranscrip&asa

re2ersa y ADN p#li%erasa• Tra(aa c#n 0ra1%ens ARN• A%pli0ica 0ra1%ens "e cDNA

• Mi"e la 2el#ci"a" a la 4$e se a%pli0ica• A%pli0ica y c$an&i0ica

si%$l&/nea%en&e• Re4$iere "e $n &er%#cicla"#r capa- "e

inci"ir $n 7a- "e l$- en la %$es&ra y

"e&ec&ar la 0l$#rescencia e%i&i"a• Necesi&a $na s#nsa c#n $n c#l#ran&e• S#n"as Ta1Man y Sy(r Green


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PCRani"a"a

PCRasi%é&rica

PCRa"ap&a"#res

PCR%$l&iple.

PCR lar1a • Re1i#nes "iana "e 1ran &a%aU# ; V(

• Se aUa"e #&ra en-i%a

• !sa c$a&r# pri%ers• Se "an "#s reacci#nes "e PCR

• Se aUa"en can&i"a"es %$y "i0eren&es"e a%(#s pri%ers

• C$an"# se &ra(aa c#n re1i#nes "esec$encia "esc#n#ci"a

• Di0eren&es 0ra1%ens• Di0eren&es &ip#s "e ce(a"#res


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S"#"$#I(#I-$ *" #I*S $#%"I#S


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Gil(er& Q: %é"# 4$?%ic#

San1er Q;: %é"# en-i%/&ic#

De&er%inación "e la sec$encia "en$cleó&i"#s "e $na %#léc$la espec?0ica

Es 0$n"a%en&al para 7acer pre"icci#nes s$(res$ 0$nción


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• Se s#%e&en a c$a&r# &ra&a%iens"i0eren&es6 se %arcan ra"iac&i2a%en&e

• Se reali-a $na elec&r#0#resis Ca"a

%anc7a in"ica la p#sición "e la (asesni&r#1ena"as

• Se 1eneran 0ra1%ens "e ADN "e 7e(rasencilla


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Marcae "el DNA: e.&re%# K

3i"rólisis selec&i2a 4$?%ica

Separación "e l#s 0ra1%ens

An/lisis "e l#s pr#"$cs

M8TODO +!'MICO DE MA=AM 5GILBERT

Se a;lica a sec?encias de (*$ menores a 2A0 ncletidos.


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Enlace N>1lic#s?"ic#

Enlace 0#s0#"iés&er


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ELIMINACI*N:

• G$anina: DMS y 0#r%ia

a%ónic#• G$anina y a"enina: /ci"#

0ór%ic#• Cisina: 7i"r#.ila%ina• Cisina y &i%ina:

per%an1ana "e s#"i#


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M8TODO EN)IMÁTICO DE SANGER

S?n&esis "e $n DNAc#%ple%en&ari#: ADN p#li%erasa

In&err$pción "e la el#n1ación:""NTPs 0al&a "e K O3

Separación "e l#s 0ra1%ens

An/lisis "e l#s pr#"$cs

%a enzima aCade los d$!Ps siem;re desde el eDtremo EF del ;rimer


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44/57

8


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,ARIANTE DEL M8TODO:PIROSEC!ENCIACI*N

• M#nire# a &ie%p# real "e la s?n&esis"e ADN

• La reacción "e p#li%eri-ación "el ADNa par&ir "e s$s "NTPs li(era PPi

•

Se 1enera l$%iniscencia c$an"# seaUa"en l#s n$cleó&i"#s a la ca"ena "eADN

#on éste método no Gay geles/ colorantes Hl?orescentes o dd$!Ps.


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A"ición "e"NTPs

Li(eración "ePPi

C#n2ersión "ePPi a ATP

Generación"e

l$%iniscencia

p#r ATP

ADN W "NTPs S$l0$rilasa APS W PPi H ATP

F#r%ación "elenlace

0#s0#siés&eren&re el "NTP y

el pri%er

L$ci0erasa:L$ci0erina a#.il$ci0erinaATP H l$-

Si el d$!P ?e Ga sido aCadido al medio dereaccin no es el com;lementario al ?e oc?;a la

;osicin ?e toca co;iar/ éste es degradado ;or ?naenzima llamada a;irasa antes de ?e se aCada el

sig?iente d$!P.


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PRO5ECTO

GENOMA3!MANO


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A %e"ia"#s "e l#s aU#s Q; se c#nci(ió el Pr#yec Gen#%a 3$%an#

El pr#yec se inició en QQ; y se plan&e# c#n $na "$ración "e aU#s6 per#l#s a2ances &ecn#ló1ic#s per%i&ier#n c$l%inarl# en p#c# %/s "e ;

Apr#. . ;Q p( "el 1en#%a 7$%an# en aU#s

AJn n# se sa(e c#n cer&e-a l#s 1enes 4$e &ene%#s El c#n#ci%ien "e lasec$encia n# i%plica el c#n#ci%ien "e -#nas c#"i0ican&es

"l ;royecto &enoma ?mano no es ?n Hin en sí/ sino ?na Jía ;ara conocer yentender la Jida en n?estro ;laneta


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btencin de (*$.

"scisin del *$( con enzimas derestriccin.

(m;liHicacin de los Hragmentos de (*$

Sec$enciación


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E9ERCICIOS


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52/57

AF

&(!!!(

((&#&#

&!(!!(

EF


53/57

AF

&(#(&(

!(#(&(

!!!!((

EF


54/57

EF

(!&&&(

!&&(#&#AF

AF

!(###!(##!&#&EF

T A G C


55/57

EF

&!(&(#

(!(&&(

#(!(!&

AF

T A G C


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• !" 7a p$ri0ica"# el DNA "e $na pl/s%i"# a par&ir "e $n pe4$eU#c$l&i2# El ADN l# s$spen"ió en $n 2#l$%en "e L 3a "il$i"# ;

L "e la %$es&ra en $n 2#l$%en 0inal "e %L "e a1$a es&érilL$e1# %i"ió las a(s#r(ancias "e la %$es&ra a @; y @; n%#(&enien"# las si1$ien&es lec&$ras: A@; H ;; y A@; H ;Q3allar:

a La c#ncen&ración "e ADN en l#s L "e la preparación "el

pl/s%i"#

( La can&i"a" &al "e ADN 4$e se p$ri0icó si1$ien"# el pr#c#l# "epreparación "el pl/s%i"#

c La p$re-a


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• !na s#l$ción "e ADN &iene $n 2al#r "e A@; H ; XC$/l es la

c#ncen&ración en n1 "e ADN%L

• !na s#l$ción "e ADN &iene $na a(s#r(ancia a @; n% "e ;"e&er%inar s$ c#ncen&ración e.presa"a en %ili%#lari"a"

•. !n scY "e ADN &iene $na c#ncen&ración "e Q 1%L XC$/l

ser/ la c#ncen&ración en p%#l "e ADNL

repaso i fase - bm

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