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REPÚBLICA DEL ECUADOR
UNIVERSIDAD CATÓLICA DE
CUENCA
UNIDAD ACADÉMICA DE INGENIERÍA
QUÍMICA, BIOFARMACIA, INDUSTRIAS Y
PRODUCCIÓN
FACULTAD DE BIOFARMACIA
“DETERMINACIÓN DE LA ENTEROBACTERIA
ESCHERICHIA COLI EN LA SALCHICHA DE POLLO
ELABORADA DE MANERA ARTESANAL Y EXPENDIDA EN
EL MERCADO 10 DE AGOSTO EN EL PERIODO
SEPTIEMBRE - NOVIEMBRE DEL AÑO 2014”
Trabajo teórico-práctico previo a la Obtención del título de Químico Farmaceuta
AUTORA: Karina Patricia Poma Ruiz
DIRECTOR: Q.F. Christian Fabián Sánchez Torres
CUENCA-ECUADOR
2014
II
DECLARACIÓN
Yo, KARINA PATRICIA POMA RUIZ, declaro bajo juramento que el trabajo aquí
descrito es de mi autoría; que no ha sido presentado para ningún grado o
calificación profesional; y, que he consultado las referencias bibliográficas que se
incluyen en este documento.
III
El suscrito catedrático de la Unidad Académica de Ingeniería Química,
Biofarmacia, Industrias y Producción de la Universidad Católica de Cuenca
CERTIFICA:
Que ha dirigido, revisado el proceso y desarrollo del presente trabajo teórico-
práctico titulado:
“DETERMINACIÓN DE LA ENTEROBACTERIA ESCHERICHIA COLI EN LA
SALCHICHA DE POLLO ELABORADA DE MANERA ARTESANAL Y
EXPENDIDA EN EL MERCADO 10 DE AGOSTO EN EL PERIODO
SEPTIEMBRE-NOVIEMBRE
DEL AÑO 2014”
A la señorita KARINA PATRICIA POMA RUIZ como previo requisito a su
incorporación de Químico Farmaceuta.
IV
DEDICATORIA
Este trabajo está dedicado en primer lugar a Dios, por darme la vida y darme
fortaleza en este camino.
A mi querida madre, por el tiempo, paciencia, quién con su cariño y amor me
acompaño a cumplir mi sueño.
A mi hermana que me ayudo con sus consejos y apoyo, sobre todo en aquellos
momentos de tristeza y alegría.
A mi esposo que ha estado a mi lado dándome el apoyo y cariño incondicional
para cumplir otra etapa en mi vida
.
V
AGRADECIMIENTOS
Agradezco primeramente a Dios por guiarme en este largo camino, para seguir
cumpliendo otras metas en mi vida, a mi mami Flor que me ha apoyo y me ha
sabido motivar para cumplir una etapa más en mi vida, a mi hermana Alexandra
por los consejos brindados.
A mi director del trabajo teórico practico al Q.F. Christian Sánchez Torres por su
colaboración para la culminación de este trabajo.
VI
ÍNDICE
PORTADA
DECLARACIÓN ........................................................................................... II
DEDICATORIA ............................................................................................ IV
AGRADECIMIENTOS .................................................................................. V
ÍNDICE ........................................................................................................ VI
OBJETIVO GENERAL. ............................................................................... XI
OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ...................................................................... XI
CAPÍTULO I
SALCHICHA DE POLLO .............................................................................. 1
1. Salchicha de Pollo .................................................................................... 2
1.1 Historia ................................................................................................... 3
1.2 Elaboración ............................................................................................. 4
1.3.1 Descripción del Proceso de Elaboración de Salchichas ....................... 6
1.4 DEFECTOS DE LOS PRODUCTOS CÁRNICOS COCIDOS................ 12
1.5 BPM...................................................................................................... 13
1.5.1 Definición: .......................................................................................... 13
1.5.1.1 Calidad alimentaria ......................................................................... 13
1.5.2 IMPLEMENTACIÓN DE BPM ............................................................ 14
CAPITULO II
Escherichia Coli .......................................................................................... 18
2.1 Historia: ................................................................................................ 18
2.1.1 Generalidades ................................................................................... 19
2.2 CEPAS DE LA BACTERIA ESCHERICHIA COLI ................................. 20
2.2.1 Escherichia coli Enteropatogénica (EPEC) ........................................ 20
2.2.2 Escherichia coli Enterotoxigénica (ETEC) .......................................... 21
2.2.3 Escherichia coli Enteroinvasiva (EIEC) .............................................. 21
2.2.4 Escherichia coli Enterohemorrágica (EHEC) ...................................... 22
2.2.5 Escherichia coli Enteroagregativa o enteroadherente (ECEA) ........... 22
2.2.6 Escherichia coli de adherencia difusa (ECEA) ................................... 22
2.3 Morfología............................................................................................. 23
2.3.1 Patogenia .......................................................................................... 25
2.3.2 Virulencia ........................................................................................... 25
VII
2.3.3 Infecciones urinarias .......................................................................... 25
2.3.3.1 Intoxicaciones. ................................................................................ 26
2.3.3.2 Síntomas ........................................................................................ 27
2.3.3.3 Tratamiento .................................................................................... 28
CAPÍTULO III
INVESTIGACIÓN DE CAMPO .................................................................... 29
3 Investigación de Campo .......................................................................... 30
3.1 DETERMINACIÓN DE LA ENTEROBACTERIA ESCHERICHIA COLI . 30
3.1.1.1 Materiales: ...................................................................................... 31
3.1.1 Preparación de la Muestra ................................................................. 33
3.1.2 Homogenizado................................................................................... 33
3.1.3 PROCEDIMIENTO ............................................................................ 34
3.2 Prueba de SIM ...................................................................................... 39
3.2.1 Fundamento ...................................................................................... 39
3.2.2 Resultados ......................................................................................... 40
3.3 Prueba de Citrato .................................................................................. 40
3.3.1 Fundamento ...................................................................................... 40
3.3.2 Resultados ......................................................................................... 41
3.4 TSI (Triple azúcar hierro) ...................................................................... 42
3.4.1 Fundamento ...................................................................................... 42
3.5 Urea...................................................................................................... 43
3.5.1 Fundamento: ..................................................................................... 43
3.5.2 Procedimiento para la inoculación ..................................................... 43
3.5.3 Interpretación de los resultados. ........................................................ 44
3.6 RM-VP .................................................................................................. 45
3.7 Medios de Cultivo ................................................................................. 46
3.7.1 Caldo agua Triptona .......................................................................... 47
3.7.1.1 USOS ............................................................................................. 47
3.7.1.2 PREPARACIÓN .............................................................................. 47
3.7.1.3 EMPLEO E INTERPRETACIÓN ..................................................... 47
3.7.2 Fundamento ...................................................................................... 47
3.7.3 Preparación ....................................................................................... 48
3.7.4 Resultados ......................................................................................... 48
3.8 EMB...................................................................................................... 48
VIII
3.8.1 Preparación ....................................................................................... 49
3.8.2 Incubación ......................................................................................... 50
3.8.3 Resultados ......................................................................................... 50
3.9 Agar MacConkey .................................................................................. 51
3.9.1 Fundamento ...................................................................................... 52
3.9.2 Preparación ....................................................................................... 52
3.9.3 Resultados ......................................................................................... 52
CAPÍTULO IV
ANÁLISIS ESTADÍSTICOS ........................................................................ 53
4.1 Análisis de resultados ........................................................................... 54
4.1.1 Recomendaciones ............................................................................. 61
4.2 Conclusiones: ....................................................................................... 62
LINKOGRAFÍA ........................................................................................... 64
ANEXOS .................................................................................................... 65
IX
“DETERMINACIÓN DE LA ENTEROBACTERIA ESCHERICHIA COLI EN LA
SALCHICHA DE POLLO ELABORADA DE MANERA ARTESANAL Y
EXPENDIDA EN EL MERCADO 10 DE AGOSTO EN EL PERIODO
SEPTIEMBRE-NOVIEMBRE DEL AÑO 2014”
X
INTRODUCCIÓN
En la presente investigación se realizará la posible detección e identificación del
microorganismo Escherichia coli en la salchicha de pollo.
En la actualidad está marcando una tendencia al consumo de alimentos más
sanos, bajos en grasas, alimentos funcionales entre otros.
Los embutidos, como las salchichas, son de los productos cárnicos más
consumidos por ser productos fáciles de cocinar y económicos.
Sin embargo estos productos presentan un elevado número de microorganismos.
La importancia del estudio microbiológico de la salchicha de pollo puede estar
basada en los siguientes aspectos:
Los productos cárnicos de pollo como la salchicha pueden contaminarse
con microorganismos patógenos o sus toxinas y provocar enfermedad en
el consumidor.
Los microorganismos pueden encontrarse a nuestro alrededor: en los
animales, en la gente, en el aire, en la tierra, en el agua.
Las maneras de elaboración de la salchicha de pollo y su falta de higiene
contiene muchos microorganismos.
Para evitar la intoxicación por alimentos y prevenir infecciones, manipule la comida
con seguridad. Cocine bien las carnes, lave las frutas y verduras antes de
comerlas o cocinarlas y evite la leche y los jugos sin pasteurizar. La infección
también se puede adquirir al tragar agua en una piscina contaminada con
desechos humanos
Por tanto es de gran importancia la detección de la enterobacteria Escherichia coli
para evitar la contaminación, y propagación de enfermedad.
XI
OBJETIVO GENERAL.
Investigar sobre la enterobacteria Escherichia coli en la salchicha de pollo
elaborada de manera artesanal, mediante muestras microbiológicas, recogidas en
el mercado 10 de agosto en la ciudad de Cuenca.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Conocer sobre la elaboración de la salchicha de pollo artesanal
Establecer las posibles causas de contaminación al momento de su
elaboración
Realizar la investigación de campo
Proponer recomendaciones y conclusiones del tema planteado
1
CAPÍTULO I
SALCHICHA DE POLLO
2
1. Salchicha de Pollo
Los productos cárnicos cocidos, son derivados cárnicos elaborados a partir de
carne y grasa de cerdo o pollo, piel, vísceras, sangre recortes de la canal es decir
los subproductos comestibles de matadero. Debido a la composición de estas
materias primas los productos obtenidos son de corta duración. (Ballen, Manual
Técnico de Derivados Cárnicos III, 2001)
Las salchichas son embutidos a base de carne picada. Esta carne se introduce en
una envoltura, que es tradicionalmente la piel del intestino del animal. (wikipedia,
2014)
Definición:
Es el embutido cocido resultante de la emulsión de carne de especies animales
autorizadas, para consumo humano embutida en tripa o artificial, rellena o no, con
o piel o sin piel, ahumada o no, con sabor característico. (noticarnicos, 2009)
La salchicha es un producto embutido y escaldados son aquellos en cuya
elaboración se utiliza carne cruda de aves con picado variable, grasa y agua,
condimentos que se embuten con las tripas. (noticarnicos, 2009)
CARACTERÍSTICAS DE LA CARNE DESTINADA A LA ELABORACIÓN “Se deben tomar en cuenta las siguientes características: 1. Color: Depende de la edad del animal, si es un animal jovén la carne es rojiza
y clara e ideal para para la elaboración de embutidos escalados y cocidos. 2. Estado de maduración: Para la elaboración de los embutidos es necesario que
existan carnes de distinto tipo de maduración, para los embutidos escalados se utiliza una carne sin maduración apreciable, mientras que para los jamones y el tocino se utiliza carne madurada de 1 a 3 días.
3. Capacidad fijadora de agua
Los tejidos mal desangrados se oscurecen mucho si se utilizan para elaborar productos crudos, estos se utilizan para productos cocidos como los productos escaldados, la carne grasosa se utiliza para hacer productos crudos y cocidos. GRASA:
3
La grasa de los tejidos es utilizada para realizar productos cárnicos. La grasa dorsal y la fracción grasa de la carne son utilizadas para la elaboración de tipos de embutidos crudos, cocidos o escaldados. La grasa orgánica debe mantenerse refrigerada para evitar alteraciones en su contextura y sabor. VISCERAS Y DESPOJOS. Como vísceras y despojos se conocen las siguientes partes del animal: tripa, bazo, carne de la garganta, corazón, encéfalo, estómago, hígado, lengua, pulmones y riñones. Se consideran despojos también carnes mal desangradas, tendinosas. Estos se pueden utilizar en estado fresco, el hígado, el corazón y los pulmones se utilizan para preparar embutidos a base de hígado, embutidos”. (Wikipedia, 2014)
1.1 Historia
Nos llega su receta desde hace 3500 años, cuando fue inventada en Babilonia
cuando los cocineros babilónicos, rellenaron intestinos de animales con carnes
especiadas.
De allí paso a otras civilizaciones del mundo antiguo, (por eso de las conquistas y
las guerras), que las adoptaron, modificaron o crearon otra formas de este singular
manjar.
Fueron los romanos los que le pusieron el nombre de salsus, que dio origen a la
palabra "salchicha" que es como las conocemos hoy en día.
Cantada por Hornero en la Odisea "Cuando un hombre junto a una gran hoguera
ha rellenado una salchicha de grasa y sangre y la vuelve a un lado y a otro, y
espera con ansiedad que no tarde en asarse..." La decadencia de la salchicha
precedió a la del Imperio Romano.
Según el más antiguo tratado culinario romano que se conoce, escrito en el año
228 d.C., la morcilla o salchicha era uno de los platos predilectos en las lupercales,
las fiestas anuales paganas que se celebraban el 15 de febrero en honor del dios
pastoril Lupercus.
La evolución de la salchicha comenzó durante la Edad Media y fue pasando de la
gruesa tipo morcilla original, por diferentes formas hasta llegar a la forma esbelta
que comemos hoy y que es el ingrediente principal de la actualidad.
4
Alemania con sus salchichas gruesas, blandas y grasas fue en el país donde nació
en el año 1852 la famosa salchicha especiada, ahumada, envuelta en una delgada
tripa, casi transparente y con forma aerodinámica, una salchicha con una forma
ligeramente curva que los carniceros alemanes llamaron "Frankfurter" en honor de
su ciudad.
Tres hechos, sin embargo, son indiscutibles en la historia de la cocina y que se
han convertido en una verdad gastronómica:
La salchicha de Frankfurt nació en la década de 1850 en la ciudad alemana de
este nombre tenía forma curvada, y fue conocida alternativamente como
"salchicha dachshund", nombre que llegaría hasta América. (blogspot, 2009)
Fotografía #1 Fuente: http://es.wikipedia.org/wiki/Salchicha
1.2 Elaboración
Para la elaboración se suelen aprovechar las partes del animal, como la grasa,
las vísceras y la sangre de las aves.
5
Esta carne se introduce en una envoltura, que es tradicionalmente la piel
del intestino del animal, luego se cocina y encalado. (wikipedia, 2014)
FLUJOGRAMA DE ELABORACION DE LA SALCHICHA DE POLLO (Ballen,
Manual Técnico de Derviados Cárnicos III, 2001)
RECEPCION Y PESADO
DESHUESADO
DESPECIE
SELECCIÓN Y PICADO
CURADO Y HOMOGENIZADO
EMBUTIDO Y ESCALADO Temperatura 75 grados
3 5 grados centígrados
HUESOS DE ANIMAL
TEJIDO GRASO, TENDONES,
COLAGENO 2 – 5 mm
FLUJOGRAMA DE CARNE DE AVE
6
1.3.1 Descripción del Proceso de Elaboración de Salchichas
A continuación se explica brevemente la tecnología utilizada para el proceso de
elaboración de salchichas.
“Cortado y Molido.- Es un proceso previo de todo embutido, sobre todo cuando
se aplica en la producción la carne congelada en bloque, que necesariamente
deberá ser cortada en trozos por máquinas especiales llamadas guillotinas.
(Ballen, Manual Técnico de Derivados Cárnicos III, 2001)
Emulsificación o Trituración.- En la mayoría de los embutidos se aplica la
trituración de una parte de la masa cárnica o toda como por ejemplo chorizo,
salame, etc., en otros se emulsifican una parte y los otros constituyentes (jamón,
salchicha de pollo etc.). Se pican o se muelen solo para garantizar una estructura
específica.
Este proceso de emulsión es una destrucción mecánica de las fibras musculares
y efectúa una liga ósea una emulsión entre la proteína muscular (miosina), la
grasa y el agua.
Se debe controlar la cantidad de grasa en la emulsión, en relación con la fase
proteína-agua. Y otro factor a controlar es la temperatura, por encima de 16ºC
se desdobla o se rompe la emulsión. (Ballen, Manual Técnico de Derivados
Cárnicos III, 2001)
La trituración y la emulsificación se realizan en máquinas especiales llamadas
cutter; nombre que procede del inglés “to cut” es decir, cortar, que en realidad
son máquinas de cortar y mezclar y cuyo principio de funcionamiento es: un plato
o depósito que posee un movimiento rotativo, en el centro un vástago (eje) con
un juego de cuchillas (de 2 a 12) en diferentes formas pero generalmente en
forma de hoz, que giran a alta velocidad. El plato también se mueve a dos
velocidades generalmente de 10 a 50 revoluciones por minuto. Las cuchillas
7
giran a 4000 revoluciones por minuto. Algunas de estas máquinas pueden
elaborar productos sin previo troceado o molido de la carne, y también poseen
dispositivos automáticos suplementarios para carga y descarga mecánica y
controles muy sofisticados. (Ballen, Manual Técnico de Derivados Cárnicos III,
2001)
Mezclado.- Para ciertos productos el mezclado es un proceso fundamental para
lograr un buen producto. Durante este proceso se añaden todos los
componentes, condimentos y aditivos, y se debe lograr una buena mezcla ya
que es la base para lograr una masa bien ligada y consistente. Igualmente,
durante este proceso se puede elevar la temperatura de la masa, es
recomendable que no suba de 10ºC. (Ballen, Manual Técnico de Derivados
Cárnicos III, 2001)
Fotografía #2 Fuente: https://www.google.com.ec/search?q=mezcl
Emulsificadores o Molinos Coloidales.- Generalmente cuando se utilizan
rellenos cárnicos como pellejos, bembos, tendones, etc., en productos como
salchichas, patés, etc., en donde se necesita una buena trituración para lograr
una emulsión estable se utilizan molinos coloidales, que permitan una finura que
se puede variar. (Ballen, Manual Técnico de Derviados Cárnicos III, 2001)
Embutido y Amarre.- Independientemente de cómo se haya preparado la masa
del producto ya sea en la cutter solamente o combinada en ésta y después en la
mezcladora o simplemente en la mezcladora, la operación subsiguiente consiste
8
en introducir o embutir esta masa cárnica en las tripas o moles correspondientes
y realizar después el amarre final del producto.
Para el amarre de los productos se utilizan varios equipos que se acoplan a
las máquinas embutidoras, uno de esos equipos son las clipsadoras que utilizan
el alambre metálico para el amarre, otra forma son las máquinas torcedoras que
generalmente el sistema está acoplado a la embutidora. (Ballen, Manual Técnico
de Derivados Cárnicos III, 2001)
Tratamientos Térmicos.- Una vez embutido y amarrado el producto éstos se
disponen en los carros especiales para someterlos a los procesos térmicos. El
colgado de los embutidos se debe realizar teniendo cuidado de cumplir con
algunas recomendaciones, la separación entre barras evitan que se peguen
entre sí o con los marcos metálicos de los carros.
El tratamiento térmico se considera como la fase final del proceso tecnológico de
elaboración ya que después de esto el producto está en condiciones y
generalmente se incluyen las siguientes operaciones básicas: secado, ahumado,
cocinado y enfriamiento.
El secado se realiza a veces en una sala de oreo, antes de someterse a los
hornos, en otros se realiza dentro de los hornos con aire caliente. El ahumado
se realiza en hornos o cámaras de ahumado de distintos modelos o formas de
ahumado. Ahumado directo donde el humo se obtiene de quemas de aserrín o
leña por debajo del producto.
El proceso de ahumado básicamente le desarrolla el color al embutido que se
realiza después de la desnaturalización de la proteína. Los parámetros generales
son: temperatura de ahumado entre 70 y 80ºC dependiendo del grosor del
9
embutido por tiempos entre 0.5 y 2 horas. (Ballen, Manual Técnico de Derivados
Cárnicos III, 2001)
Cocción.- Existen los productos cocinados a los cuales no se les aplica otro tipo
de proceso térmico que la cocción y a los embutidos llamados ahumados y
cocinados o escaldados se aplican ambos procesos.
En la práctica los embutidos se sumergen en agua previamente calentada de 80
a 90ºC dependiendo del grosor del producto, y por tiempos de 30 a 150 minutos,
pero el parámetro a medir es la temperatura en el centro del producto que debe
ser de 68 a 70ºC. (Ballen, Manual Técnico de Derivados Cárnicos III, 2001)
Enfriamiento.- Después del tratamiento térmico, ahumado y/o cocción es
necesario enfriar rápidamente para evitar el desarrollo de microorganismos y para
evitar las mermas por evaporación de la superficie del producto. Es necesario
enfriar rápidamente a temperatura ambiente, para luego pasar a las cámaras o a
los locales de empaque. (Ballen, Manual Técnico de Derivados Cárnicos III, 2001)
10
Fotografía #3 Fuente: http://es.slideshare.net/IvanHinojosa1/elaboracin-de-
salchicha
“Los embutidos ocupan un gran volumen en la alimentación de la
población y en la economía de la industria de la carne, en algunos
países el consumo de embutidos asciende a 50% del total de la carne,
como por ejemplo Alemania, sin embargo, también existen países que
no tienen tradición en el consumo de productos cárnicos.
Los productos que se pueden elaborar en una planta procesadora de
embutidos son muy numeroso, esta diversidad se debe a los diferentes
procesos y procedimientos a la que puede ser sometida la materia
prima y sus agregados para obtener los productos finales” (slideshare,
2012)
11
Caracteristicas Organolepticas de la Salchicha de Pollo
“El producto se presenta como una mezcla con el magro y la grasa bien
separados (textura en grano de arroz) y con gusto característico sin flavor
ácida ni rancia.
Nótese que un salchichón o una salchicha seca regular tiene un peso entre
200 y 300 gramos.” (virtualunal, 2014)
Características físicas y organolépticas. Cuadro 1 (virtualunal, 2014)
COLOR: Amarillo oscuro
SABOR: Caracteristico
TEXTURA: Poco blando algo caracterisitco
OLOR: Tipico
Características Químicas
El análisis de las características químicas se hace tratando el producto sin las
tripas, es decir solamente la mezcla final, secas por supuesto. Las normas
aconsejan las características que se presentan en la siguiente tabla. (virtualunal,
2014)
12
Características Químicas
Cuadro 2 (virtualunal, 2014)
1.4 DEFECTOS DE LOS PRODUCTOS CÁRNICOS COCIDOS
“La mayoría de los defectos de estos productos son de producción, porque
generalmente se consideran de segunda categoría, por lo tanto no tienen los
mínimos cuidados.
Los defectos más frecuentes se presentan en la selección, limpieza y lavado de
las vísceras, en el tratamiento térmico previo en el picado y la cocción del
producto.
Otros de los factores que afecta la calidad de estos productos son la falta de aseo
e higiene de las instalaciones, equipos y operarios, que puede conducir a una
contaminación microbiana, que puede causar problemas de salud al consumidor.
Unas buenas prácticas de aseo y desinfección de la planta, los utensilios, equipos
y operarios a diario o las veces que sea necesario, evita la contaminación de los
productos”. (Ballen, Manual Técnico de Derviados Cárnicos III, 2001)
HPD (humedad del producto desgrasado) 52%
Lípidos * 30%
Colágeno / proteínas 20%
Azucares solubles totales * 2%
13
1.5 BPM
“Buenas Prácticas de Manufactura son una herramienta básica para la
obtención de productos seguros para el consumo humanos, que se centralizan
en la higiene y forma de manipulación.” (Wikipedia, 2014)
Fotografía #4 Fuente http://www.alimentosecuador.com/descargas/bt523dcb09ba209_BPM_Crifood.pdf
1.5.1 Definición:
“son un conjunto de herramientas que se implementan en la industria de
Alimentos, las cuales tienen como objetivo principal, la obtención de productos
higiénicamente procesados para el consumo humano.
Donde los ejes principales son las metodologías utilizadas para el control y
manejo de: materias primas, producto terminado, higiene del personal, control
de plagas, manejo de residuos, mantenimiento de instalaciones, equipos y
utensilios entre las más importantes.
La implementación de las BMP generan ventajas para los empresarios donde
se ven beneficiados en términos de reducción de pérdidas de producto por
descomposición o alteración producida por diversos contaminantes y a la vez,
contribuyen a mejorar el posicionamiento de sus productos, mediante el
reconocimiento de su marca relacionada a sus atributos positivos tanto de
calidad como de salubridad”. (Alimentosecuador, 2012)
1.5.1.1 Calidad alimentaria
14
Factores que determinan la calidad de los alimentos:
Propiedades nutricionales y físicas: aporte de nutrientes, valor nutritivo,
ingredientes, niveles energéticos, aditivos, solubilidad, transparencia, otros.
Propiedades higiénicas y sanitarias: condiciones básicas para que los
alimentos no sean peligrosos para la salud humana.
Propiedades organolépticas: color, sabor, textura, otros.
Propiedades comerciales: precio, envase, servicios al cliente, etiquetado del
producto, diferenciación de la competencia, rastreabilidad, otros.
Fotografía #5 Fuente ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/011/a1474s/a1474s05.pdf
1.5.2 IMPLEMENTACIÓN DE BPM
15
Para la implementación de las BMP se puede seguir la siguiente metodología
dividida en etapas:
Primera Etapa:
Difusión y lanzamiento del programa.
Se difundirán los objetivos del programa de BPM, su importancia, ventajas y
necesidades de implementación.
Fotografía #6 Fuente: http://www.inti.gob.ar/noticiero/noticiero62.htm
Segunda Etapa:
16
Sensibilización y capacitación básica.
Los tutores de las industrias de alimentos realizarán la sensibilización y
capacitación al cuerpo gerencial acerca de:
Gestión de Calidad y Sistemas BPM.
Tercera Etapa:
Implementación y auditorías.
La implementación consistirá en aplicar las medidas necesarias para cubrir los
aspectos o requerimientos que abarcan las BMP”. (Alimentosecuador, 2012)
Fotografía #7 Fuente: http://www.alimentosecuador.com/descarga 1
17
CAPÍTULO II
ESCHERICHIA
COLI
18
Escherichia Coli
2.1 Historia:
“E. Coli es el organismo aeróbico más común en el tracto intestinal del hombre y
de los animales de sangre caliente. Habita generalmente en individuos sanos, no
patógena aunque puede haber cepas que causan problemas intestinales serios
(mortalidad infantil, serotipo O157:H7). Relación probablemente, simbiótica
porque la bacteria proporciona al animal la vitamina K que éste no puede
sintetizar”. (wikipedia, 2014)
Se trata de un microorganismo presente en el tracto entérico tanto el hombre como
los animales. Debido a su especificidad está considerado como un buen indicador
de contaminación fecal. No puede sobrevivir mucho tiempo en un ambiente extra
entérico, es por ello, que su detección en el alimento indica una contaminación
reciente. (wikipedia, 2014).
Fotografía #8 Fuente: http://es.wikipedia.org/wiki/Theodor_Escherich
19
Desde que Theodor Escheric la descubrió, se ha considerado que la Escherichia
Coli es una peligrosa bacteria anaeróbica facultativa, móvil, no esporulante, con
forma de bastón, que constituye parte normal de la flora residente del tracto
intestinal de los seres humanos, animales de sangre caliente y aves. En virtud de
que por lo regular se encuentra presente en muy altos niveles (millones por gramo
de contenido del intestino delgado), durante mucho tiempo se ha usado como
índice de posible contaminación fecal del organismo y para determinar la
presencia de patógenos en el agua y los alimentos. Desde mediados de 1940 se
ha acumulado evidencia de que ciertas cepas de Escherichia Coli causan diarrea,
en particular a los niños, y por ello se les dio la designación de EPEC. Sin
embargo, los datos actuales indican que hay más de un tipo de cepas patógenas
de E. coli. Estas se han subdivido en seis grupos, con base en su capacidad para
producir toxinas, adherirse e invadir las células epiteliales del intestino. Los grupos
de Escherichia Coli son: Escherichia Coli Enterotoxígena (ETEC), Escherichia Coli
Enteropatogénica (EPEC),
Escherichia Coli Enteroinvasiva (EIEC), Escherichia Coli Enterohemorrágica
(EHEC), Escherichia Coli Enteroagregante (EAEC), y la Escherichia coli de
adhesión difusa (DAEC). El mecanismo de infección y los síntomas que producen
son distintos en cierta medida, pero presentan características que se superponen.
(BHUNIA, 2008)
2.1.1 Generalidades
“Las bacterias del género E. coli son Gram-negativas, tienen forma de barra y
pertenecen a la familia Enterobacteria.
Esta bacteria es un habitante común de los intestinos de todos los animales,
incluyendo el de los humanos. Escherichia coli (E. coli) es quizás el organismo
procarionte más estudiado por el ser humano, se trata de una bacteria
unicelular que se encuentra generalmente en los intestinos animales y por ende
en las aguas negras.
20
Ésta y otras bacterias son necesarias para el funcionamiento correcto del proceso
digestivo.
Además produce vitaminas B y K. Los serotipos se asocian con virulencia. Una
tipificación incluye la determinación de los antígenos somáticos (O), capsulares
(K), flagelares (H) y de fimbria (F). Es un bacilo que reacciona negativamente a
la tinción de Gram (gramnegativo), es anaeróbico facultativo, móvil por flagelos
perÍtricos (que rodean su cuerpo), no forma esporas, es capaz de fermentar la
glucosa y la lactosa.
Es una bacteria utilizada frecuentemente en experimentos de genética y
biotecnología molecular. Cuando se usan métodos de cultivos aeróbicos, esta
bacteria es la especie dominante encontrada en las heces. Normalmente cumple
una función importante en el cuerpo, suprimiendo el crecimiento de especies
dañinas de bacterias así como también sintetizando cantidades apreciables de
vitaminas. Son pocas las cepas de E. coli capaces de causar enfermedades a los
humanos a través de diferentes mecanismos. Entre ellas están las cepas entero
invasivas (EIEC) responsables de una forma de la disentería bacilar”. (BHUNIA,
2008)
2.2 CEPAS DE LA BACTERIA ESCHERICHIA COLI
2.2.1 Escherichia coli Enteropatogénica (EPEC)
En todo el mundo estas cepas son importantes, por que causan diarrea infantil,
en humanos, conejos, perros y caballos, en especial en los sitios con poca higiene.
Las transmiten de manera directa o indirecta los portadores humanos. Se ha
implicado a numerosos serotipos (O111:H12:O55:H6) en brotes de enfermedades
de origen alimentario en distintos países. Estos patógenos no producen toxinas,
pero se unen de manera intima a las células epiteliales con la ayuda de los pili
formadores de haces y un factor de virulencia denominado factor de adherencia-
lesión-borramiento (EAF), que destruye las vellosidades de absorción y ocasiona
malabsorción y diarrea. Se requiere que una persona ingiera gran cantidad de
células para que desarrolle los síntomas que suelen aparecer luego de 3 horas.
Los síntomas predominantes son gastroenteritis, diarrea acuosa profusa, vómito y
21
fiebre de bajo grado. La causa principal de diarrea en los afectados por esta cepa
son seguramente los cambios provocados en la estructura de las células
intestinales. (BHUNIA, 2008)
2.2.2 Escherichia coli Enterotoxigénica (ETEC)
Estas cepas son las principales causantes de diarrea entre personas que viajan
es conocida como la diarrea del viajero o venganza de Moctezuma, así como en
lactantes en los países en vías de desarrollo que no cuentan con infraestructura
sanitaria adecuada. La aparición de esta enfermedad se debe a la capacidad del
patógeno para colonizar y adherirse a las células del epitelio intestinal, por medio
de los pili, para luego producir tanto toxinas lábiles como estables al calor o ambos
tipos de toxinas, estas no causan cambios histológicos en las capas de la mucosa.
En el intestino se observa poca o nula inflamación. Las toxinas interfieren la
síntesis de las proteínas celulares, incrementan la permeabilidad de la membrana
y el desequilibrio electrolítico, lo que ocasiona perdida intensa de fluidos (diarrea
acuosa). (BHUNIA, 2008)
2.2.3 Escherichia coli Enteroinvasiva (EIEC)
Estas cepas son conocidas porque causan disentería tipo shigelosis, primero se
unen a las células epiteliales y se mueven e invaden una a una diseminando la
infección en los intestinos. El daño celular ocasiona diarrea mucoide
sanguinolenta, similar a la disentería causada por Shigella. Los portadores
humanos diseminan la enfermedad de manera directa o indirecta. Se necesita la
ingestión de una cantidad elevada de células para que una persona manifieste los
síntomas. En 1971 se descubrió, en Estados Unidos, un brote provocado.
(BHUNIA, 2008)
Es inmóvil, no fermenta la lactosa. Invade el epitelio intestinal causando diarrea
sanguinolenta en niños y adultos. Libera el calcio en grandes cantidades
impidiendo la solidificación ósea, produciendo artritis y en algunos
casos arterioesclerosis. Es una de las E. coli que causa más daño debido a la
invasión que produce en el epitelio intestinal. (BHUNIA, 2008)
22
2.2.4 Escherichia coli Enterohemorrágica (EHEC)
Hasta hace poco tiempo (1982) se identificó a las cepas de este grupo cuyo
serotipo principal es el O157:H7) como causantes de la diarrea hemorrágica
intensa y del síndrome urémico hemorrágico en seres humanos (HUS). Otros
serogrupos pertenecen a O55, O26, O113, O117, se cree que los portadores son
los animales en particular el ganado lechero y bovino. (BHUNIA, 2008)
2.2.5 Escherichia coli Enteroagregativa o enteroadherente (ECEA)
Sólo encontrada en humanos. Son llamadas entero agregativas porque tienen
fimbrias con las que aglutinan células en los cultivos. Se unen a la mucosa
intestinal causando diarrea acuosa sin fiebre. No son invasivas. Producen
hemolisina y una enterotoxina ST similar a la de las enterotoxigénicas. Se le
asocian dos toxinas:
toxina termoestable enteroagregante (EAST)
Toxina codificada por plásmidos (PET) (Wikipedia, 2014)
2.2.6 Escherichia coli de adherencia difusa (ECEA)
Se adhiere a la totalidad de la superficie de las células epiteliales y habitualmente
causa enfermedad en niños inmunológicamente no desarrollados o malnutridos.
No se ha demostrado que pueda causar diarrea en niños mayores de un año de
edad, ni en adultos y ancianos. (Wikipedia, 2014)
23
Fotografía #9
Fuente:http://commons.wikimedia.org/wiki/File:E_coli_at_10000x.jpg
2.3 Morfología
“En la morfología de la Escherichia Coli se presenta:
Bacilo Gram negativo.
No forma esporas
Móviles (flagelos perítricos).
Miden 0.5 µ de ancho por 3 µ de largo.
Catalasa positiva.
Oxidasa negativos.
Reducen nitratos a nitritos.
Producen vitamina B y K.
Morfología y cultivo: Escherichia coli pertenece a las entero bacterias, una
familia de bacterias compuesta por numerosas especies de bacterias
gramnegativas”. (Sashenka Bonilla Rojas, 2011)
“Morfológicamente, las colibacterias son bacilos rectos generalmente
flagelados periticos y, por tanto, móviles. Pueden multiplicarse tanto en
condiciones aerobias como anaerobias y son fácilmente cultivables en
medios nutritivos sencillos. Catabolizan glucosa, lactosa y otros azúcares,
mientras que no pueden utilizar urea ni citratos. No se forma hidrógeno
sulfúrico. El rango decrecimiento se sitúa entre 4 y 46ºC. Al igual que las
24
restantes enterobacterias, las colibacterias son resistentes a las sustancias
tensioactivas. La compleja estructura antigénica se basa en antígenos O-
K- y H-. Los antígenos O son lipopolisacáridos (LPS), componentes
estructurales de la membrana externa. Una estructura química diferente de
LPS corresponde a una distinta especificidad serológica. Las cepas de
bacterias que poseen el antígeno O forman colonias brillantes sobre
medios de cultivo sólidos, por lo que se denominan formas S. Los
antígenos K son componentes capsulares. Sin embargo, no todas las
cepas llevan antígenos K. Las cepas de esta estructura antigénica suelen
ser más bien tóxicas y resistentes a la fagocitosis. Las colonias de las
cepas bacterianas con mucha sustancia capsular tienen un aspecto
mucoso. Las proteínas de los flagelos constituyen antígenos H”. (google,
2012)
Fotografía #10 Fuente: http://www.medicinabc.com/2013/06/escherichia-
coli.html#axzz3SE8ywWVA
25
2.3.1 Patogenia
La Escherichia coli puede causar infecciones intestinales y extra intestinales
generalmente graves, tales como infecciones del aparato excretor, vías
urinarias, cistitis, meningitis, peritonitis, mastitis, septicemia y neumonía Gram-
negativa. (Wikipedia, 2014)
2.3.2 Virulencia
La Escherichia coli está dividida por sus propiedades virulentas, pudiendo causar
diarrea en humanos y otros animales. Otras cepas causan
diarreas hemorrágicas por virtud de su agresividad, patogenicidad y toxicidad. En
muchos países ya hubo casos de muerte por esta bacteria. Generalmente le pasa
a niños entre 1 año y 8 años. Causado generalmente por la contaminación de
alimentos, y posterior mala cocción de los mismos, es decir, a temperaturas
internas y externas menores de 70 °C. (Wikipedia, 2014)
2.3.3 Infecciones urinarias
Son más comunes en mujeres por la corta longitud de la uretra (25 a 50 mm), en
comparación con los hombres (unos 15 cm). Entre los ancianos, las infecciones
urinarias tienden a ser de la misma proporción entre hombres y mujeres. Debido
a que la bacteria invariablemente entra al tracto urinario por la uretra (una infección
ascendente), los malos hábitos sanitarios pueden predisponer a una infección, sin
embargo, otros factores cobran importancia, como el embarazo, hipertrofia
benigna o maligna de próstata, y en muchos casos el evento iniciante de la
infección es desconocido. Aunque las infecciones ascendentes son las causantes
de infecciones del tracto urinario bajo y cistitis, no es necesariamente esta la causa
de infecciones superiores como la pielonefritis, que puede tener origen
hematógeno. (Wikipedia, 2014)
26
2.3.3.1 Intoxicaciones.
Ocurre cuando se ingiere el alimento o agua que contiene bacterias, parásitos,
virus o las toxinas producidos por estos microorganismos. La mayoría de los casos
de intoxicación alimentaria se dan a raíz de bacterias comunes como el
estafilococo o la Escherichia coli (E. coli.) (Medlineplus, 2014)
“Cuando los microorganismos ingresan al alimento, se denomina contaminación.
Esto puede suceder de diferentes maneras:
La carne de res o de aves puede entrar en contacto con las bacterias
normales de los intestinos de un animal que se está procesando.
El agua que se utiliza durante el cultivo o embarque puede contener
estiércol o desechos humanos.
El alimento se puede manipular de manera insegura durante la preparación
en tiendas de abarrotes, restaurantes o casas”. (Medlineplus, 2014)
La intoxicación alimentaria puede ocurrir después de comer o beber:
Cualquier alimento preparado por alguien que no se lave las manos
adecuadamente.
Cualquier alimento preparado usando utensilios de cocina, tablas de cortar
y otras herramientas que no estén totalmente limpias.
Productos lácteos o alimentos que contengan mayonesa (como ensalada
de col o de papa) que hayan permanecido fuera del refrigerador por mucho
tiempo.
Alimentos congelados o refrigerados que no se guarden a la temperatura
apropiada o que no se recalienten a la temperatura correcta.
Pescados u ostras crudas.
Frutas o verduras crudas que no se hayan lavado bien.
Carnes o huevos mal cocidos.
Jugos de frutas o verduras crudas
Agua proveniente de un pozo o arroyo, o agua de una ciudad o pueblo que
no haya sido tratada. (Medlineplus, 2014)
27
Muchos tipos de microorganismos y toxinas pueden causar intoxicación
alimentaria, como:
Enteritis por Campylobacter
Cólera
Enteritis por E. coli
Toxinas en pescados o mariscos dañados o en mal estado
Staphylococcusaureus
Salmonella
Shigella
Los niños y los ancianos tienen el mayor riesgo de intoxicación por alimentos. Así
mismo tienen más riesgo las personas que:
Padece una afección seria, como enfermedad renal, diabetes,
cáncer o VIH y/o SIDA.
Tiene un sistema inmunitario debilitado.
Viaja fuera de los Estados Unidos a áreas en donde hay más exposición a
los organismos que causan dicha intoxicación alimentaria.
Las mujeres embarazadas y lactantes tienen que ser especialmente cuidadosas
para evitar la intoxicación alimentaria. (Medlineplus, 2014)
2.3.3.2 Síntomas
Los síntomas de los tipos de intoxicación alimentaria más comunes con frecuencia
comienzan al cabo de 2 a 6 horas después de ingerir el alimento. Ese tiempo
puede ser más largo o más corto, según la causa de la intoxicación alimentaria.
(Medlineplus, 2014)
Los posibles síntomas abarcan:
Cólicos abdominales
Diarrea (puede tener sangre)
28
Fiebre y escalofríos
Dolor de cabeza
Náuseas y vómitos
Debilidad (puede ser grave)
Vómitos
2.3.3.3 Tratamiento
La mayoría de los casos por intoxicación alimentaria son leves y se mejora en un
par de días.
La meta es aliviar los síntomas y verificar que su cuerpo tenga la cantidad
apropiada de líquidos.
Recibir suficiente líquido y saber qué comer
Manejar la diarrea
Controlar las náuseas y los vómitos
Descansar lo suficiente
Tomar mezclas de rehidratación oral para reponer los líquidos y minerales
perdidos por vómitos y diarrea.. (Medlineplus, 2014)
29
CAPÍTULO III
INVESTIGACIÓN
DE
CAMPO
30
3 Investigación de Campo
“La recolección de datos se lo hizo mediante un estudio para poder determinar la
presencia de la bacteria escherichia coli y para eso se realizó la toma de varias
muestras de la salchicha de pollo, tomando en cuenta las variables como son
temperatura y carga microbiana presentes en el lugar de donde se extrajo las
muestras de las salchichas de pollo.
Se realizó el experimento tomando en consideración la temperatura del
establecimiento y detección de microorganismo para cada una de ellas.
Cada muestra analizada consistió en mantener la temperatura constante, fundas
estériles y realizando la cuantificación del microorganismo presente en las
salchichas de pollo elaborada de manera artesanal”.(Karina Poma Ruiz)
3.1 DETERMINACIÓN DE LA ENTEROBACTERIA ESCHERICHIA COLI
SEGÚN LA NORMA INEN 1529-8
Fundamento
Esta norma establece la técnica del número más probable para la determinación
de coliformes fecales y las pruebas confirmatorias de Escherichia cóli e
identificación de las especies del grupo coliforme fecal. (Instituto Ecuatoriano de
Normalización Inen, 1988)
“Este método se basa en la detectar la fermentación de la lactosa con producción
de ácido y gas a temperaturas de 44°C – 45°C, complementada con la prueba del
indol a esta misma temperatura.
E. coli es una especie bacteriana que a más de presentar las características del
grupo coliforme fecal, produce indol a partir del triptófano es positivo la prueba del
rojo de metilo, las cepas de indol positivas se llaman E. coli tipo I y se suponen
que su hábitat natural primario es el intestino”. (Salazar, 2012)
31
3.1.1.1 Materiales:
Pipetas serológicas de 1,5 y 10 ml
Stomacher con 90ml de agua de peptona
Instrumentos estériles para la toma y manipuleo de muestras
Cajas Petri
Erlenmeyer de 250ml
3 tubos tapa rosca cada uno con 9ml de agua de peptona
Gradillas
Balanza
Cocina Eléctrica
Baño María a 45,5°C
Estufa a 37°C
Autoclave
Refrigeradora para mantener las muestras a temperaturas adecuadas.
32
Estufa 37ºC
• Tubos tapa rosca, Tapas Probetas, S
stomacher
•
Balanza Autoclave
Baño María
Flujograma Autora Karina Poma 1
FLUJOGRAMA DE MATERIALES
UTILIZADOS
Para esterilizar los siguientes materiales:
Se pesa y prepara los reactivos
33
MEDIOS DE CULTIVO:
Caldo Verde Brillante Bilis-lactosa
Caldo de Triptona
Agar EMB
Agar SIM
Flujograma Autora Karina Poma 2
3.1.1 Preparación de la Muestra
Antes de abrir el envase se lo debe limpiar meticulosamente con alcohol al 70%,
evitando contaminar el contenido, generalmente estos alimentos se deben trabajar
con cuchillo o bisturí, cortando pequeñas porciones de diferentes niveles y de
distintas partes de alimento y transportándolos con una pinza a un recipiente
estéril en el que se llevara a la balanza para pesar 10gr. (Salazar, 2012)
3.1.2 Homogenizado
Preparacion de Caldo
Verde Brillante
Preparacion de Caldo de
Triptona
Preparacion de Agar EMB
Flujograma de Medios de Cultivos
34
“Con una pinza estéril transferir 10gr de la muestra (salchicha de pollo), al
frasco estéril el cual contiene 90ml de agua de peptona, luego
homogenizar en la licuadora durante 30 segundos con intervalos, evitando
el sobrecalentamiento de las cuchillas, porque pueden lesionar las formas
vegetativas, se comienza a bajar las revoluciones si el equipo lo permite
se va aumentando la velocidad en este caso no debe superar los 2
minutos, y así se obtiene la primera dilución 1/10.
Utilizar una pipeta estéril de 1ml y transferir 1ml de la suspensión inicial
1/10 a un tubo que contenga 9ml de agua de peptona estéril mezclar
cuidadosamente, de esta manera se obtiene la dilución 1/100.
Utilizar otra pipeta estéril de 1ml y transferir 1ml de la dilución 1/100 a otro
tubo que contenga 9ml de peptona así se obtiene la dilución 1/1000”.
(Salazar, 2012)
3.1.3 PROCEDIMIENTO
“Preparar el agua de peptona y caldo brilla
Pesar en la balanza 10gr de la muestra, colocar en el stomacher y licuar
poco a poco para no romper, tomar con una pipeta estéril y colocar en los
tubos.
una vez preparado, colocar en la autoclave, sacar el agua de peptona y
caldo brilla estériles y colocar en los tubos colocar en los stomachers 90ml
de agua de peptona.
Inmediatamente después de realizadas las diluciones con una pipeta
estéril, transferir 1ml de dilución 1/10 a cada uno de los tres tubos que
contengan 10ml de caldo verde brillante bilis lactosa (BGBL).
Con otra pipeta estéril, transferir 1ml de la dilución 1/100 en cada uno de
los tres tubos que contengan 10ml del caldo verde brillante bilis-lactosa
Con otra pipeta estéril, transferir 1ml de la dilución 1/1000 en cada uno de
los tres tubos que contengan 10 ml de caldo verde brillante bilis-lactosa
Dejar los tubos en baño maría a 35°C por 24 horas
Ver los cambios si hay producción de gas
Agitar cada uno de los tubos presuntivos positivos y con una asa de
inoculación a partir de cada uno de ellos sembrar por estría en la superficie
35
de placas individuales secas de agar EMB, identificar las placas, dejar
incubar las placas invertidas en la estufa a 37°C por 24 horas
Para confirmar la presencia de E. coli de cada placa coger de 2 a 3 colonias
bien aisladas y típicas (negras o verde brillo metálico) y sembrar en estrías
en tubos de agar nutritivo inclinados e incubar a 37°C por 24 horas”.
(Salazar, 2012)
Flujograma Autora Karina Poma 3
Diluciones
Realizar las DilucionesTriturar y Coloocar en Stomacher
Contar Colonias
Positivo Preparar agar y sembrar
BAÑO MARIA Y ESTUFA
FLUJOGRAMA DE E. COLI NORMA
INEN 1529-8
36
10 ml de muestra
90 ml de H2O de peptona
9ml de H2O de
peptona
10ml
1 ml 1 ml
9ml de H2O de
peptona
1/100 1/10 1/1000
Tubo vacío
Colocamos 1ml en cada uno delos 9 Tubos con caldo BRILA o LST con campanas Durham
con 10 ml. c/t.
Incubar a 45ºC x 24-48 horas. En Baño María
Con un asa redonda coger una búrbuja y pasar 3 veces en el caldo. Incubar a Baño María 45ºC x 24 horas. Realizar la prueba de Indol.
1 ml 1 ml 1 ml
37
a) De los tubos con caldo brilla que den positivo sembrar:
b) Sembrar en las cajas las muestras positivas:
Caldo Triptona: tubos con 3 ml.
1ra Prueba confirmatoria:
Prueba de Indol: Colocar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs. Positivo: anillo rojo Negativo: conserva su color.
AGAR EMB
Incubar en la estufa a 37ºC x 24 hr.
Sembrar una colonia de las cajas EMB con asa recta (en el tubo inclinado). Incubar a 37ºC x 24 horas. Realizar las pruebas bioquímicas.
Tubos de Agar Nutritivo inclinados 10 ml. C/T
1/1000A
1/1000B
1/1000C
1/10 A
1/10 B
1/10 C
1/100A
1/100B
1/100C
38
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
MEDIO POSITIVO NEGATIVO
UREA ROSADO AMARILLO
TSI ROSADO AMARILLO
CITRATO AZUL VERDE
MIL ROJO MORADO
MEDIO POSITIVO NEGATIVO
SIM ROJO AMARILLO
RM ROJO AMARILLO
VP ROJO AMARILLO
Sembrar con un asa recta una
colonia en cada tubo con 6 ml.
Incubar a 37ºC x 24hr.
Sembrar con una asa recta una colonia
sumergiéndolo una vez en cada tubo con
6 ml. Incubar en la estufa a 37ºC x 24hr.
SIM
TSI UREA MIL
CITRATO
VP-RM RM
RESULTADOS:
RESULTADOS:
39
3.2 Prueba de SIM
Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y
de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo.
Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.
Sembrar en un tubo de agua de triptona con un asa de cultivo puro incubar a 35 o
37°C por 24 horas. Si es positivo se torna un color rojo oscuro en la superficie del
reactivo, si es negativa conserva el color del reactivo original.
3.2.1 Fundamento
El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, y
particularmente de la tripteína, que puede ser oxidado por algunas bacterias para
formar indol.
En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol
producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovac´s o de Erlich, para
originar un compuesto de color rojo. Las cepas móviles pueden apreciarse en este
medio, por la turbidez que producen alrededor de la punción de siembra, mientras
que aquellas cepas productoras de sulfhídrico se distinguen por la formación de
un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el
medio se mantenga a un pH mayor a 7.2
Incubación
Durante 24 horas, a 35-37 °C, en aerobiosis.
Luego de la incubación, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovac´s o de Erlich
40
3.2.2 Resultados
Fotografía #11 SIM positivo Fuente Karina Poma
3.3 Prueba de Citrato
Con un asa de cultivo puro, sembrar por estría en la superficie de agar citrato
inclinado e incubar a 35-37°C. La reacción es positiva si hay crecimiento visible
que se manifiesta por o general en el cambio del medio de verde a azul.
3.3.1 Fundamento
En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y
el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son
necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema
buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El cloruro de sodio mantiene el balance
osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en
medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los
microorganismos capaces de utilizar citrato como única fuente de carbono, usan
sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con la consiguiente producción
de alcalinidad.
El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato
permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato
da progresivamente, oxalacetato y piruvato.
Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que,
al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos
41
alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la producción de
citrato permeasa.
Siembra
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un inóculo
ligero, usando una ansa sin arrastrar el agar.
Incubación
A 35-37ºC, durante 24-48 horas, en aerobiosis.
Algunos microorganismos pueden requerir hasta 4 días de incubación.
3.3.2 Resultados
-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.
-Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo
bacteriano y no hay cambio de color
Fotografía #12 Prueba de Citrato Fuente Karina Poma Ruiz
42
3.4 TSI (Triple azúcar hierro)
Medio universalmente empleado para la diferenciación de enterobacterias, en
base a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido
sulfhídrico.
3.4.1 Fundamento
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes
adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los
hidratos de carbono fermentables.
El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido
sulfhídrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe, los cuales se
combinan con el ácido sulfhídrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El
rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance
osmótico.
Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del
indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido.
El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con
una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.
Siembra
A partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y extendiendo sobre
la superficie del medio.
Incubación
A 35-37°C durante 24 horas, en aerobiosis.
3.4.2 Resultados
1-Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo
solamente fermenta la glucosa.
43
2-Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo
fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa.
3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no
fermentador de azúcares.
4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el
microorganismo produce gas.
5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido
sulfhídrico
Fotografía #13 TSI Positivo Fuente Karina Poma Ruiz
3.5 Urea
Medio utilizado para la identificación de microorganismos, en base a la actividad
ureásica. Es particularmente útil para diferenciar Proteus, de otros miembros de
la familia Enterobacteriaceae.
3.5.1 Fundamento:
Evalúa en las bacterias la capacidad de utilizar la urea como fuente de nitrógeno,
mediante la enzima ureasa, que degrada la urea en dióxido de carbono
y amoniaco. El amoniaco actúa como fuente de nitrógeno y capta protones,
transformándose en amonio y alcalinizando el medio. Contiene rojo fenol como
indicador de pH, el cual vira el medio a fucsia cuando el pH se torna alcalino.
3.5.2 Procedimiento para la inoculación
Se toma una asada o una colonia de la bacteria en estudio y se inocula por
estriación en el bisel.
44
3.5.3 Interpretación de los resultados.
La positividad viene dada por una coloración rosada o fucsia en el medio.
Fotografía #14 Prueba de Ureasa Negativo Fuente Karina Poma Ruiz
45
3.6 RM-VP
Medio utilizado para la realización del ensayo de Rojo de Metilo y Voges
Proskauer. Es particularmente útil para la clasificación de enterobacterias.
3.6.1 Fundamento:
En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes necesarios para el
desarrollo bacteriano y la glucosa es el hidrato de carbono fermentable.
La glucosa puede ser metabolizada por los microorganismos, a través de distintas
vías metabólicas. Según la vía utilizada, se originarán productos finales ácidos
(ácido láctico, ácido acético, ácido fórmico), o productos finales neutros (acetil
metil carbinol).
Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podría ser reconocida por la adición
de un indicador como rojo de metilo, para revelar la presencia de productos ácidos,
y por la adición de alfa naftol e hidróxido de potasio para evidenciar la presencia
de productos finales neutros.
Voges y Proskauer, describieron una coloración rojiza que aparecía después de
adicionar hidróxido de potasio a los cultivos de ciertos microorganismos en medio
con glucosa. Esta coloración se debe a la oxidación del acetilmetil carbinol a
diacetilo el cual reacciona con la peptona del medio para dar un color rojo.
Siembra
Por inoculación directa, a partir del cultivo en estudio.
Incubación En aerobiosis, a 35-37°C por 3 días
3.6.2 Resultados
Prueba del rojo de metilo: Positivo: color rojo.
Negativo: color amarillo.
Fotografía #15 Fuente http://www.blinn.edu/natscience/phillips/micro%20pictures.htm
46
3.7 Medios de Cultivo
Un medio de cultivo consta de un gel o una solución que cuenta con los
nutrientes necesarios para permitir, en condiciones favorables de pH y
temperatura, el crecimiento de virus, microorganismos, células, tejidos vegetal eso
incluso pequeñas plantas. Según lo que se quiera hacer crecer, el medio requerirá
unas u otras condiciones. Generalmente se presentan desecados en forma de
polvo fino o granular antes de ser preparados; ya preparados pueden encontrarse
en estado sólido, semisólido o líquido. El objetivo último del cultivo es
variado: antibiograma, identificación, multiplicación. Uno de los sistemas más
importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento
en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material
alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el
crecimiento de los microorganismos es el Cultivo.
Fotografía #16 Fuente http://es.wikipedia.org/wiki/Medio_de_cultivo
47
3.7.1 Caldo agua Triptona
3.7.1.1 USOS
Usado como diluyente y para enriquecimiento bacteriano a partir de alimentos y
otros materiales de interés sanitario.
3.7.1.2 PREPARACIÓN
Disolver 25.5 g. en 1 litro de agua destilada. Distribuir y esterilizar en autoclave a
121ºC durante 15 minutos.
El caldo preparado es claro e incoloro.
3.7.1.3 EMPLEO E INTERPRETACIÓN
Sembrar el medio de cultivo con el material de muestra. Incubar aprox.18 horas.
a 37ºC.
Fotografía #17 Agua de Triptona Fuente Karina Poma
3.7.2 Fundamento
El agua triptona, por su base nutritiva, permite el desarrollo de diversas especies bacterianas, y debido a su alto contenido de triptófano, es un buen sustrato para la producción de indol.
COMPOSICIÓN
Triptona 10.0g
ClNa 5.0g
48
3.7.3 Preparación
Suspender 15g de polvo en 1 litro de agua destilada. Mezclar bien y distribuir.
Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
3.7.4 Resultados
Microorganismos Crecimiento
Escherichia coli ATCC 25922 Bueno
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Bueno
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Bueno
Control Negativo Resultado
Medio sin inocular Sin cambio
3.8 EMB
USOS
Agar selectivo para la demostración y el aislamiento de entero bacteriáceas
patógenas.
PREPARACIÓN
Disolver 36 g. en 1 litro de agua destilada. Esterilizar en autoclave a 121ºC
durante 15 minutos y verter en placas. El caldo preparado es claro e incoloro.
EMPLEO E INTERPRETACION
Sembrar el medio de cultivo con el material de muestra. Incubar aprox.18 horas.
a 37ºC.
Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo
de bacilos Gram negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias
nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia
Enterobacteriaceae.
49
Fotografía #18 Fuente http://es.slideshare.net/roberchavez/medios-de-
cultivo-y-pruebas-bioquimica-presentation
3.8.1 Preparación
Disolver 36 g. en 1 litro de agua destilada. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante
15 minutos y verter en placas. El caldo preparado es claro e incoloro..
Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones
Peptona 10.0 Suspender 36 g del polvo en un litro
de agua destilada. Reposar 5
minutos; mezclar, calentando a
ebullición durante 1 o 2 minutos
hasta su disolución. Esterilizar en
autoclave a no más de 121°C
durante 15 minutos. Enfriar a 45°C y
distribuir agitando suavemente.
Lactosa 5.0
Sacarosa 5.0
Fosfato dipotásico 2.0
Agar 13.5
Eosina 0.4
Azul de metileno 0.065
pH final: 7.2 ± 0.2
50
3.8.2 Incubación
De 24 a 48 horas a 35-37 °C, en aerobiosis.
3.8.3 Resultados
Microorganismos Tipo de Colonia
Escherichia coli ATCC 25922 Verdosas con brillo metálico y centro
negro azulado
Características del medio:
Placas preparadas: color púrpura.
Fotografía #19 E. coli positivo y siembra Fuente Karina Poma
51
3.9 Agar MacConkey
Al utilizar la lactosa en el medio, bacterias Lac+ como Escherichia
coli, Enterobacteria Klebsiella producen acidez, lo cual baja el pH bajo 6,8 lo que
tiene como consecuencia la aparición de colonias de color rosadas o rojas.
(wikipedia, 2014)
USOS
Para el cultivo de organismos coliformes.
PREPARACIÓN
Disolver 50 g. en 1 litro de agua destilada,
EMPLEO E INTERPRETACIÓN
Sembrar por estría en la superficie de la placa. Incubar a 37ºC de 18 a 24hr.
El agar MacConkey es un medio de cultivo específico para bacterias gram
negativas y cepas que fermenten la lactosa.
Fotografía #20 Fuente http://es.wikipedia.org/wiki/Agar_MacConkey
52
3.9.1 Fundamento
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el
desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla
de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el
desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva.
Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto
produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las
colonias, y la precipitación de las sales biliares.
Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.
3.9.2 Preparación
Suspender los ingredientes en el agua destilada. Calentar agitando
frecuentemente y dejar hervir hasta disolver completamente.
Esterilizar en autoclave a 121ºC (15 lb de presión) durante 15 minutos. Se debe
evitar el sobrecalentamiento. Enfriar entre 45ºC y 50ºC, colocar 20 mL de medio
por cada placa y dejar solidificar.
3.9.3 Resultados
Microorganismos Colonias
Escherichia coli ATCC 25922 Rojas con halo turbio
Características del medio
Medio preparado: rojo púrpura
53
CAPÍTULO IV
ANÁLISIS ESTADÍSTICOS
54
4.1 Análisis de resultados
DETERMINACIÓN DE ESCHERICHIA COLI EN LA SALCHICHA DE POLLO ELABORADA DE
MANERA ARTESANAL Y EXPENDIDA EN EL MERCADO 10 DE AGOSTO, DE LA CUAL SE
OBTUVO LOS SIGUIENTES RESULTADOS.
NORMA INEN 1529 – 8
CUADRO DE RESULTADOS DE PRUEBAS BIOQUIMICAS
#
M
U
E
S
T
R
A
S
URE
A
MIL SIM CITR
A-TO
MRVP TSI R
E
S
U
L
T
A
D
O
S
M
O
T
I
L
I
D
A
D
ROJO
DE
M
E
T
I
L
O
KO
H
S S
G
ENNE-
GRESI
MIENT
O
H2S
1 - - + - + + + + + E. Coli -
2 - - + - + + + + + E. Coli +
3 - - + - + + + - - E. Coli +
55
4 - + + - + + + + + E. Coli -
5 - + + - + + + + + E. Coli -
6 - + + - + + + + + E. Coli -
7 - + + + + + + + + E. Coli -
8 - + + - + + + + + E. Coli -
9 - + + - + + + + + E. Coli +
10 - + + - + + + + + E. Coli +
11 - + + - + + + + + E. Coli +
12 - - + - + + + + + E. Coli -
13 - - + - + + + + + E. Coli -
14 - + + - + + + + + E. Coli -
56
15 - + + - + + + + + E. Coli -
16 - - + - + + + - - E. Coli -
17 - + + - + + + + + E. Coli -
18 - - + - + + + + + E. Coli +
19 - + + - + + + + + Proteus
20 - + + - + + + - - E. Coli -
21 - + + - + + + - - E. Coli -
22 - + + - + + + + + E. Coli -
23 - + + + + + + - - E. Coli -
24 - + + + + + + + + E. Coli -
25 - + + + + + + + + E. Coli -
57
GRÁFICOS ESTADÍSTICOS
BACTERIAS PRESENTES
1.- Gráfico referente de la muestra número 2, número 3 positivas para E.
coli
2.- Gráfico referente a muestras negativas para E. coli, proteus positiva
muestra 8
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
0.2
MUESTRA 1 MUSTRA 2 MUSTRA 3 MUESTRA 4
NEGATIVAS
E. COLI
MUESTRA 5
MUESTRA 6
MUESTRA 7
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
E. COLIPROTEUS
MUESTRA 5
MUESTRA 6
MUESTRA 7
58
3.- Gráfico referente sobre las muestras 9, 10, 11 positivas para E. coli
4.- Gráfico referente a muestras 12, 13, 14,15 Negativas para E. coli
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
Muestra 8 Muestra 9 Muestra 10 Muestra 11
Positivo
Positivo2
Columna3
Negativos
Muestra 12
Muestra 13
Muestra 14
Muestra 15
59
5.- Gráfico referente a las muestras 16, 17 Negativas para E. Coli
6.- Gráfico referente a Muestras negativas para E. coli
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
MUESTRA 17
MUESTRA 18
MUESTRA 19
MUESTRA
E. COLI
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
E. COLI
E. COLI
60
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
0 5 10 15 20 25 30 35
UREA
MIL
SIM
CITRATO
MR-VP
TSI
H2S
NEGATIVO
POSITIVO
00.5
11.5
22.5
33.5
44.5
5
PRUEBAS
UREA
MIL
SIM
CITRATO
MR-VP
TSI
61
4.1.1 Recomendaciones
En los laboratorios de análisis microbiológico de alimentos tener en cuenta unas
reglas para no contaminar el ambiente:
Evitar la entrada de personas ajenas al laboratorio.
Evitar hablar toser y estornudar, durante las fases analíticas más
delicadas (toma de muestras, siembras, etc.).
No se podrá fumar, ni comer, en las zonas de análisis.
Las manos de los analistas estarán limpias, también las uñas.
Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas para mantener la
adecuada contención biológica.
Todas las superficies de trabajo se limpiarán y desinfectarán
diariamente y siempre que se produzca un derrame.
Conviene llevar el pelo recogido, durante el análisis.
Siempre se trabajará con bata blanca, que solo se usará en esta zona
de trabajo, y nunca saldrá con ella a la calle.
La rotura de placas o tubos que contengan cultivos bacterianos, se
limpiará minuciosamente y se desinfectará a conciencia.
Al elaborar la salchicha de pollo se debe tener en cuenta:
A fin de mejorar el valor nutricional de los productos se recomienda a la Unidad
de Cárnicos, se incluya dentro de su elaboración las buenas prácticas de
manufactura.
62
4.2 Conclusiones:
Se Investigó sobre la enterobacteria Escherichia coli que se encontró presente en
la salchicha de pollo elaborada de manera artesanal, en lo que respecta a sus
características, método de incubación, agares utilizados, y forma de diagnosticar.
Se obtuvo de las 25 muestras analizadas, se encontró 6 positivas con E. coli (las
muestras #2, #3, #9, #10, #11, #18).
Se Conoció la forma que se elabora la salchicha de pollo artesanal, mediante
los procedimientos, mezclado, emulsificación, molido, trituración, etc.
Se establecieron las principales causas de contaminación al momento de su
elaboración, las cuales fueron .asepsia del lugar, el manipular los alimentos
con manos sucias, y contaminación cruzada.
Se estableció y se dió recomendaciones al momento de su elaboración como
normas de higiene y buenas prácticas de manufactura para evitar la
contaminación.
Se realizó la investigación de Campo, obteniendo los siguientes resultados de
las 25 muestras recolectadas se obtuvo 6 muestras positivas con E. coli
Se propuso las recomendaciones que se debe seguir, tales como limpiar las
superficies de trabajo se limpiarán y desinfectarán diariamente y siempre que
se produzca un derrame.
63
Bibliografía
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Ciencias Agrarias de UNAD.
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EDICION. Bogotá: Javier de León Fraga.
Salazar, W. D. (2012). Manual de Prácticas de Laboratorio de micorbiología. Cuenca.
64
LINKOGRAFÍA
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65
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_o_enteroadherente_.28ECEA.29
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Wikipedia. (3 de noviembre de 2014). Wikipedia. Recuperado el 10 de noviembre de
2014, de Wikipedia:
http://es.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli#Infecciones_urinarias
66
67
1. RECOLECCIÓN DE MUESTRAS EN EL MERCADO 10 DE
AGOSTO
Fotos Karina Poma Ruiz
SELECCIÓN Y PREPARACIÓN DE LOS MATERIALES Y
MEDIOS A UTILIZAR
Materiales pesar
Preparación Autoclavar
Tubos Estériles
Fotos Karina Poma Ruiz
68
2. Colocar en los tubos y Stomacher los caldos preparados con
pipetas estériles
Fotos Karina Poma Ruiz
Fotos Karina Poma Ruiz
69
3. Pesar las muestras 10gr, hacer diluciones
Fotos Karina Poma Ruiz
70
4. Colocar en Baño María por 24 horas y Observar los resultados
Fotos Karina Poma Ruiz
71
5. Muestras positivas preparar EMB y observar las colonias que se
sembraron en la Estufa
72
6. Seleccionar las colonias
Fotos Karina Poma Ruiz
73
7. Deshacer las cajas Petri contaminadas colocar cloro y desechar
Fotos Karina Poma Ruiz
74
8. Preparación de las pruebas bioquímicas
Fotos Karina Poma Ruiz
75
9. Hacer hervir y autoclavar las pruebas bioquímicas
76
10. Colocar en la estufa por 24 horas
Fotos Karina Poma Ruiz
77
11. Observar los cambios en las pruebas bioquímicas
Fotos Karina Poma Ruiz