replikacija u eukariota

8/20/2019 Replikacija u Eukariota

1/17

11/10/201

Replikacija u eukariota

Brzina kretanja replikacijskih rašlji: 50 Nu/s

U eukariota postoji više ishodišta replikacije – 30 000 kod čovjeka (svakih 30-300 kpb)

Replikon – replikacijska jedinica

Osobitosti replikacije kod eukariota


2/17

11/10/201

Regulacija staničnog ciklusa U eukariotskom staničnom ciklusureplikacija DNA i stanična dioba sukoordinirane:

mitoza se događa nakon sintezeDNA, a ova dva procesa razdvajaju

faze G1 i G2

VAŽNO: Stanična DNA se morareplicirati samo jednom tijekom

staničnog ciklusa

Za regulaciju su bitni proteini ciklini i

kinaze ovisne o ciklinima (CDK)

Mitotski ciklini A i B se na kraju M

faze ubikvitiniraju i razgrađuju Nestanak ovih ciklina – nastajanjepre-replikacijskog kompleksa na

mjestima inicijacije replikacije

Inicijacija replikacije kod eukariota

ORC (origin recognition complex ) se veže naishodište replikacije, a proteini CDC6 i CDT1omogućuju vezanje replikacijske helikaze MCM2-7 na DNA

(analogija s proteinima DnaA, DnaC, DnaB)

Nastaje pre-replikacijski kompleks (pre-RC)

koji čini stanice kompetentnima za replikaciju (tzv. licencing )(kasna M- ili rana G1-faza)

pre-RC se još mora aktivirati da bi došlo do započinjanja replikacije u S-fazi

Ova aktivacija ovisna je o aktivnosti

protein kinaza CDK (koje su ovisne o ciklinima)

pre-RC


3/17


4/17


5/17

11/10/201

Aktivno mjesto kvaščeve DNA-polimeraze ε

Komentirajte aktivno mjesto.

Zašto je korišten ddC?

Hogg et al NSMB 2014

Potencijalna uloga P domene

P-domena (tamno plavo) okružuje novosintetiziranu dl DNA

Hogg et al NSMB 2014


6/17

11/10/201

Pokus produženja početnice u analizi procesivnosti

Određivanje procesivnosti u pokusu produženja početnice u uvjetima sa i bez heparina

(Heparin je glikozaminoglikan s puno negativnih naboja, te kompetira za vezno mjesto za DNA,čime se može razlikovati procesivan od neprocesivnog načina sinteze DNA (i RNA))

Uz heparin:

Pol δ (bez PCNA): procesivnost 2-3 NuPol ε exo- (bez PCNA): procesivnost do 28 NuPol ε-P1 (bez dijela P-domene): procesivnost 0 NuPol ε-P2 (mutacije 3 ak u P domeni koje interagiraju s dlDNA): smanjena procesivnost

Hogg et al NSMB 2014polimerizacijska aktivnost

Struktura i funkcija PCNA

PCNA ( proliferating cell nuclear antigen) – klizni držač DNA – analognafunkcija bakterijskoj β-hvataljcitri podjedinice stvaraju prsten (kod bakterija dimer)

3D struktura izuzetno slična, ali primarna nema nikakve sličnosti s bakterijskom β-hvataljkom

PCNA β-hvataljka


7/17

11/10/201

Struktura RFC

RFC (replication factor C ) – postavljač PCNA na DNA odmiče Polα i postavlja PCNA na DNA blizu početnice nakon čega se veže Polδ

Indiani and O'Donnell Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, 751 –761

a | Shown on the left is the crystal structure of the Saccharomycescerevisiae RFC (replication factor C) –PCNA (proliferating cell nuclearantigen) complex that was solved in the presence of ATP S (ProteinData Bank (PDB) code 1SXJ; ATP S is not visible in the structureabove). RFCD (also known as RFC2) and RFCE (also known as RFC5)do not contact the closed PCNA clamp. The diagrammaticrepresentation of the RFC –PCNA crystal structure on the right showsthe nomenclature for clamp-loader subunits, and PCNA is shown inbrown. b | Model of RFC –PCNA, which indicates that PCNA might openinto a right-handed spiral, thereby docking onto the spiral of AAA+domains of all five RFC clamp-loader subunits. c | Model of the DNAthat is positioned in the RFC –PCNA –ATP S structure. The AAA+domains of RFC subunits are arranged in a helix with a pitch thattracks the minor groove of B-form DNA. The C-terminal collarfunctions as a screw cap that blocks the continued threading of DNAthrough the structure. The diagram on the r ight illustrates how single-stranded DNA (ssDNA) at a primed site might bend sharply to exit outthe side of RFC. d | Top view of the RFC –PCNA –DNA model. The C-terminal collar is removed. The AAA+ domains of the RFC subunits arecolour coded as in panel a. PCNA is in grey and DNA is green andorange. The -helices of RFC subunits that track DNA are highlighted inyellow. Each subunit contains two of these -helices. Green spheresindicate a possible exit path for template ssDNA from the central

chamber.

Figure 5-38a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Nukleosomi i replikacija

Tijekom replikacije nukleosomi disociraju, a poslije se opet brzo reasociraju

Roditeljski histoni se raspodjeljuju nasumično na obje replicirane DNA H3-H4 tetramer je stabilan i jače se veže na DNA od H2A-H2B dimera

http://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureId=1sxjhttp://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureId=1sxj


8/17


9/17

11/10/201

Izrezivanje početnice Okazakijevi fragmenti su duljine 100-200 pb što odgovara duljini

DNA u nukleosomu (150-200 pb)

Nakon replikacije Okazakijevih fragmenata na njima se stvaraju

nukleosomi

S obzirom da su dijelovi DNA na početku i kraju nukleosomaslabije vezani na histone, taj dio DNA se može lakše razmotati ina tom dijelu Polδ istiskuje lanac kćer prethodno sintetiziranogOkazakijevog fragmenta s lanca kalupa, te istovremeno

dovršava “svoj” Okazakijev fragment

Istiskivanje lanca zove se strand displacement , ovu aktivnost

nemaju sve DNA-polimeraze

Istisnutu RNA/DNA početnicu izrezuje FEN1 endonukleaza;RNaza H razgrađuje RNA

Ovim se povećava vjernost replikacije jer je RNA/DNApočetnica nastala djelovanjem Polα/primaze koja nema 3’-5’

egzonukleaznu aktivnost

Pol δ ne može istisnuti lanac kćer s lanca kalupa u dijelunukleosoma gdje je DNA čvrsto vezana na histone (u područjuosi dvostruke simetrije, dyad axis), te ona disocira s kalupa

Nukleosomi zaustavljaju aktivnost Polδ – i zato su Okazakijevifragmenti kratki i odgovaraju duljini DNA koja je omotana u

nukleosomimaKurth i O’Donnell Trends Biochem Sci 2012

Krajevi eukariotskih kromosoma su linearni.

Problem replikacije linearnih kromosoma:

Zbog svojstva polimeraze koja sintetizira u 5’ → 3’ smjeru, 5‘-kraj nakonuklanjanja RNA-početnice bi se smanjivao u svakom ciklusu replikacije.

Telomere su krajevi linearnih kromosoma koji sadrže nekoliko stotina (i više)ponavljanja kratkih G-bogatih sljedova.

Humana telomerna DNA sadrži motiv AGGGTT koji se ponavlja oko 1500 puta.

Jednostanični eukarioti imaju 20-100 ponavljanja

Replikacija krajeva kromosoma


10/17

11/10/201

1

Zaštita krajeva kromosoma

Lanac bogat G nu je nešto duži, te se savija u petlju i sparuje s komplemetranimslijedom u drugom lancu telomere

Ova struktura (T-petlja) stabilizirana je proteinima i štiti kraj kromosoma odnukleaza

Telomere replicira telomeraza:

posebna DNA-polimeraza koja

sadrži RNA (150 Nu)

Telomeraza: reverzna transkriptaza

koja nosi vlastiti kalup

RNA služi kao kalup za produženjeG-bogatog lanca, te nosi informaciju

za nastanak telomernog slijeda

Početnica za sintezu telomera je3’-kraj kromosoma

Telomeraza je inaktivna u somatskim

stanicama, stoga se one ne mogu

beskrajno dijeliti, jer nakon

određenog broja dioba nemajufunkcionalne telomere

Skraćivanje telomera povezano je sastarenjem


11/17

11/10/201

Geni nekih virusa su izgrađeni od RNA. Retrovirusi prevode RNA genom uDNA djelovanjem reverzne transkriptaze.

Reverzna transkriptaza: RNA-ovisna DNA-polimeraza

(na temelju RNA-kalupa stvara DNA, obratno transkripciji)

DNA

polimeraza

Popravak DNA


12/17

11/10/201

1

• greške u DNA tijekom replikacije

• spontana oštećenja DNA • oštećenja DNA zbog djelovanja kemijskih i fizikalnih agensa, npr. zbog

reaktivnih vrsta kisika, ROS (reactive oxygen species)

mutacije: supstitucije, delecije, insercije

kemijska modifikacija baza

lomovi okosnice

unakrsne kovalentne veze izmeđuoba lanca DNA

Mehanizmi popravka grešaka i oštećenja u DNA

- popravak krivo ugrađenih nukleotida tijekom replikacije pomoću Pol I i Pol III- popravak krivo ugrađenih nukleotida nakon replikacije- direktni popravak

- popravak izrezivanjem baza

- popravak izrezivanjem nukleotida

Greške i oštećenja u DNA

Greške i oštećenja u DNA

Nastaje oksidacijom

Aflatoksin B1, produkt plijesni,

može se aktivirati citokromomP450, pri čemu nastaje reaktivnispoj (epoksid) koji možemodificirati G u DNA na N-7(nastaje alikilirani adukt) štouzorkuje transverzije G-C u A-T

Citokrom P450 sudjeluje u

detoksifikaciji organizma

Ponavljajući tripleti mogu dovesti do alternativnih struktura koji dovode

do povećanja broja ponavljanjatijekom replikacije


13/17

11/10/201

1

Spontana oštećenja DNA

Figure 5-44 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Plavo – hidrolitičke reakcije, deaminacija, hidroliza N-glikozidne veze (depurinacija)Crveno – oksidacijaZeleno – nekontrolirana metilacija pomoću S-adenozilmetionina

debljina strelice odgovara učestalosti

Depurinacija: 5000 purinskih baza dnevno u humanoj stanici

Spontanom deaminacijom citozina nastaje uracil (1 u 107 C dnevno, tj.100 puta dnevno

u humanoj stanici)

Deaminacija A i G je 100 x rjeđa

Figure 5-50a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Deaminacija baza

Deaminacija C 100x brža u jlDNA, nego u dl DNA(problem tijekom replikacije i transkripcije)

Hipoksantin se sparuje s C

Mutacija CG u TG, T se ispravlja


14/17

11/10/201

1

Geometrija pb s tautomernim oblicima

slična je geometriji WC parovima baza - jedan od uzroka ugradnje krivih

nukleotida tijekom replikacije

Dušične baze se mogu pojaviti urazličitim tautomernim oblicima

Figure 5-8 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Popravak krivo ugrađenog nukleotida tijekom replikacije pomoću pol I i III

http://www.flickr.com/photos/agathman/5428007501/http://www.flickr.com/photos/agathman/5428007491/http://www.flickr.com/photos/agathman/5428608654/


15/17

11/10/201

1

Mismatch repair – popravak krivo ugrađenih nukleotida nakon replikacije

Enzimi za mismatch repair prepoznaju novi

lanac jer kratko vrijeme nakon replikacije još nije metiliran na N6 adenina u GATC sljedovima

Nemetilirana DNA – strana DNA

Ovaj popravak je energetski vrlo skup

popravlja greške i do 1000 Nu dalje od mjesta metilacije

Mismatch repair – popravak krivo ugrađenih nukleotida nakon replikacije


16/17

11/10/201

1

Direktni popravak

UV svjetlo stvara kovalentne veze između susjednih pirimidina na istom lancu

Takav pirimidinski dimer ne može stati u B-DNA te blokira replikaciju

- fotokemijsko cijepanje pirimidinskih dimera enzimom DNA-fotoliaza

- enzim prepoznaje i cijepa dimer u originalne baze

- kod mnogih organizama, ali ne i kod čovjeka

Popravak izrezivanjem nukleotida

Za uklanjanje lezija koje uzrokuju veće strukturne promjene, npr. izrezivanjepirimidinskog dimera

Mehanizam: dva ureza na istom lancu DNA


17/17

11/10/201

Popravak izrezivanjem baze

1. DNA-glikozilaza: hidrolizira glikozidnu vezu između deoksiriboze i neispravne baze

ako se radi o uracilu: uracil-DNA-glikozilazaako se radi o npr. 3-metiladeninu: glikozilaza AlkA

2. Nastaje AP mjesto bez baze (apurinsko, apirimidinsko mjesto)

AP-endonukleaza urezuje okosnicu

deoksiriboza-fosfodiesteraza uklanja deoksiribozni fosfat

3. DNA-pol I ugrađuje ispravni nukleotid DNA-ligaza povezuje urez (poveže lanac)

Spontanom deaminacijom citozina nastaje uracil

koji se ovom vrstom popravka

uklanja iz DNA (da ne dođe do mutacije GC u AT)

Timin se koristi umjesto uracila u DNA kako bi povećaotočnost genetičke informacije (da se koristi uracil u DNA, ne bi se mogao razlikovati ispravno

ugrađeni uracil od uracila nastalog deaminacijom citozina)

Prepoznavanje krive baze pomoću DNA-glikozilaza

DNA-glikozilaza putuje duž DNA i izvrće baze, te ih “provjerava” na grešku

replikacija u eukariota

Documents