report chair
TRANSCRIPT
Изучение функциональной роли модификаций РНК с применением
методов системной биологии
Евфратов С. А.
Руководитель: проф., д.х.н. Сергиев П. В.
30S
50S
Декодирующий центр
Пептидил-трансферазныйцентр
Метилирование
Псевдоуридинилирование
Другие модификации
Нуклеотид Фермент
16S
Ψ516 RsuA
m7G527 RsmG
m2G966 RsmD
m5C967 RsmB
m2G1207 RsmC
m4Cm1402 RsmI
m4Cm1402 RsmH
m5C1407 RsmF
m3U1498 RsmE
m2G1516 RsmJ
m6
2A1518 RsmA
m6
2A1519 RsmA
Нуклеотид Фермент
23S
m1G745 RlmAI
Ψ746 RluA
m5U747 RlmC
Ψ955 RluC
m6A1618 RlmF
m2G1835 RlmG
Ψ1911 RluD
m3 Ψ1915 RluD
m3 Ψ1915 RlmH
Ψ1917 RluD
m5U1939 RlmD
m5C1962 RlmI
Нуклеотид Фермент
23S
m6A2030 RlmJ
m7G2069 RlmL
Gm2251 RlmB
m2G2445 RlmL
D2449 RldA
Ψ2457 RluE
Cm2498 RlmM
*C2501 RltA
m2A2503 RlmN
Ψ2504 RluC
Um2552 RlmE
Ψ2580 RluC
Ψ2604 RluF
Ψ2605 RluB
как модификации рибосомной РНК влияют на способность к трансляции?
как последовательность мРНК определяет
способность к трансляции?
Используемые методы
● Протеомика– 2D-DIGE
● Другие методы– Кривые роста
– RT RT-PCR
● Флуоресцентные репортёрныe конструкции– Инженерные 5'-UTR
– Природные 5'-UTR
– Природные промотеры
2D-DIGE
Опыт
Контроль
Cy3
Cy5
Суммарный белок
pH
+
-
ИЭФ
+-
SDS-ПААГЭ
Сканированиефлуоресценции
Реализация:Опыт — нокаут, контроль - WT3 реплики1 кросс-мечение
ΔrlmEΔrlmJ
ΔrsmHΔrsmA
sdhA
sdhA
sdhA
sdhA
pepDglpK
pepD glpKpepD glpK
pepD glpK
sucC
sucC sucC
sucC
sucB
sucB sucB
sucCaldA
aldA aldA
aldA
Флуоресцентные двухрепортёрные конструкции
RFP CER
T5 T5
5'-UTR 5'-UTR
Внутренний контроль
Ter
Варьируемая часть
(CER /RFP X
CER /RFPK
)KO
(CER /RFP X
CER /RFPK
)WT =
InAbXKO
InAbXWT =1
> 1 — инициация трансляции в нокаутном штамме идёт активнее, чем в диком типе
< 1 — инициация трансляции в нокаутном штамме идёт хуже, чем в диком типе
Флуоресцентные двухрепортёрные конструкции
● Инженерные– Различные
ШД/спейсеры
– Реинициация
– Вторичная структура 5'-UTR
● Природные– 5'-UTR (спец. регуляция
трансляции)
– Промотеры (спец. транскрипционные сигналы)
– Начало кодирующей области (эффекты элонгации)
Полуавтоматизированная трансформация с высеванием и
измерением флуоресценции
Компетентные клетки
Тестовые конструкции
Тепловой шокФенотипическая
экспрессия
Перенос на агар
РостколонийИнокуляцияИкубация
Считывание флуоресценции
Рандомизированные и мутационные библиотеки
GGCACACACCGGAGCNNNNCATATGAAAGAGACGGACGAGAG
GGCACCCGGAGCNNNNNNNCATATGAAAGAGACGGACGAGAG
GGCACACACCGGAGCNNNNNNNATGAAAGAGACGGACGAGAG
GGNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCGGAGCAACTATGAAAGAGACGGACGAGAG
GGNNNNNNNNNNATGAAAGAGACGGACGAGAG
GGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNATGAAAGAGACGGACGAGAG
GGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNATGAAAGAGACGGACGAGAG
CACACAACACCGGAGCAACTATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
AAGCCACAGGAGGAAAACGAATGAAAGAGACGGACGAGAG
TTAACTAGTGACTTGAGGAAAACCTAAATGAAAGAGACGGACGAGAG
4N
7N
7N-New
18N-SD
10N
20N
30N
30N-Down
dsrB (0,01)
eno (~25)
10% вероятность замены
Новые тестовые конструкции и массивы данных транслябельности
Использование рандомизированных библиотек
Электрокомпетентные клетки
Рандомизированная библиотека плазмид
Электропорация Фенотипическая экспрессия
Наращивание культуры
Клеточная сортировка
Выделение плазмид, ПЦР
Полупроводниковое секвенирование
Обработка данных полупроводникового секвенирования
Фильтр подлине
ВыделениеРандомизированного
ФрагментаФильтр по
длине
Фильтр по частоте
Отделение крайних фракций
Самыеслабые
Самыесильные
Фракции в динамическом диапазоне по отношениям
флуоресценции
Фракция - CER/RFP
Вст
реча
емос
ть
CER/RFP для данного варианта
База данных по C/R для всех вариантов
Библиотка Число ридов Варианты Охват, % Сильные Динамич. диапазон
Слабые
4N 114748 254 99,2 13 184 57
7N 107583 2206 13,5 110 1507 589
7N-rep 10578 66 0,40 13 50 3
7N-new 10112 16 9,7·10-2 13 3 0
18N-SD 128234 1985 2,9·10-6 426 1240 319
20N-new 53659 340 3,1·10-8 40 297 3
30N-new 14096 30 2,6·10-15 26 4 0
30N-down 58998 722 6,3·10-14 26 574 122
Обнаруженные статистические корреляции
4N P-value:
Спейсер 7.59e-01
Отжиг aSD 9.21e-02
ΔG фолдинга 1.56e-20
18N P-value:
Спейсер 9.29e-02
Отжиг aSD 6.13e-01
ΔG фолдинга 5.71e-145
7NN P-value:
Спейсер 1.68e-06
Отжиг aSD 1.66e-05
ΔG фолдинга 1.59e-43
7N P-value:
Спейсер 1.87e-17
Отжиг aSD 8.88e-27
ΔG фолдинга 4.12e-23
Очень сильный UTR: GGCATTAGAATATAAAATAGTGATG
мРНК
БелкиФлуориметрия
Гель-электрофорез
Коллекциянокаутов
Коллекциянокаутов
Роль модификацийрибосомной РНК
Предсказательнаямодель инициации
трансляцииИсключения
ПубликацииComparison of mRNA features affecting translation initiation and reinitiation
Ilya A. Osterman, Sergey A. Evfratov, Petr V. Sergiev* and Olga A. Dontsova
474–486 Nucleic Acids Research, 2013, Vol. 41, No. 1doi:10.1093/nar/gks989Published online 23 October 2012
Structural features of telomerase RNA gene in naked mole rat.Acta Naturae. 2014. V. 6. № 2 (21)
Sergey Efratov, Elena Smekalova, Andrey Golovin, Maria Zvereva, Olga Dontsova
НОВАЯ нкРНК: ВЫСОКИЙ УРОВЕНЬ ЭКСПРЕССИИ И ЯДЕРНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ РНК, ТРАНСКРИБИРУЕМОЙ С УЧАСТКА ГЕНОМА Danio rerio, СОДЕРЖАЩЕГО ПОВТОРЯЮЩИЕСЯ ЭЛЕМЕНТЫ
О. С. Шубернецкая, О. C. Стрелкова, Д. А. Скворцов*, С. А. Евфратов, В. Д. Черепанинец, Зверева, М. П. Рубцова, О. А. Жиронкина, И. И. Киреев, А. М. Оловников, О. А. Донцова
Тезисы конференций
● «Building a predictive model of translation initiator ability of 5'-UTR prokaryotic mRNA», Sergey Evfratov, Osterman Ilya, FEBS, 2013, СпБ
● «Building a predictive model of translation initiator ability of 5'-UTR prokaryotic mRNA», Sergey Evfratov, Osterman Ilya, Winter FutureBiotech, 2014, Звенигород
Курсовые и дипломные работы
● Курсовая работа «Изучение функциональной роли генов метилтрансфераз рибосомной РНК малой субчастицы RsmA, RsmB и RsmC», Крячков В.А., ХФ, 110гр, 2013.
● Курсовая работа «Изучение зависимости эффективности трансляция E. coli от расстояния между стартовым кодоном и последовательностью Шайна-Дальгарно при помощи двойной репортерной системы RFP-CER», Струнилин И.П., ФББ, 202гр, 2014
● Курсовая работа «Поиск новых элементов, определяющих эффективность трансляции, в 5'нетранслируемой области мРНК E. coli при помощи двойной репортерной системы RFP-CER», Карпова А.Д., ФББ, 201гр, 2014
● Курсовая работа «...», Погорельская А., ФББ, 2015.
● Дипломная работа «...», Савушкин Е., ХФ, 2015.
Чтение ¼ лекции в курсе «молекулярная биология» про повторяющиеся элементы