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GUIA TECNICA PARA IDENTIFICACIÓN DE
HAEMOPHILUS INFLUENZAE EN
MICROBIOLOGIA CLINICA
Laboratorio de Salud Pública
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INTRODUCCIÓN
Haemophilus influenzae se encuentra exclusivamente en el tracto respiratorio humano y
forma parte dela flora normal. Es un cocobacilo Gram-negativo no móviles poseen o no un
polisacárido serológicamente específico, que permite clasificarlos en 6 serotipos,
denominados a, b, c, d, e y f (clasificación de Pittman) y se correlacionan con la virulencia
de la bacteria (3).
H. influenzae serotipo b (Hib) causa enfermedad invasiva como meningitis, neumonía,
sepsis, bacteriemia y enfermedad localizada como otitis, conjuntivitis o sinusitis,
especialmente en los niños.
H. influenzae serotipo a (Hia) es reconocido como un importante patógeno emergente
que puede ser considerado el segundo tipo clínicamente más virulento entre los 6
serotipos. Este serotipo afecta especialmente a los menores de 2 años y se ha
demostrado la relación de algunos clones de Hia con enfermedades graves con alta
tasa de letalidad.
Otros serotipos como el Hif y el Hie afectan principalmente a los adultos con alguna
enfermedad predisponente y, en menor frecuencia, a la poblaciónpediátrica
Algunos aislamientos no poseen cápsula, por lo que no pueden serotipificarse y se los
denomina H. influenzae notipificables (HiNT), y es responsable del 20-30% de todos
los episodios de otitismedia aguda.
Modo de transmisión:
El único reservorio conocido de la bacteria está en los humanos, quienes la pueden portar
sin estar enfermos, se propaga a través de las mucosidades y/o de la saliva.
Afortunadamente, se considera que en la mayoría de los casos su capacidad de contagio
es limitada.
Prevención:
En Colombia, la vacuna contra H. influezae serotipo hace parte del plan ampliado de
inmunizaciones (PAI), desde 1998.
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Aspectos clínicos:
El cuadro clínico es variable y depende de la edad del paciente, en niños mayores de un
año y adultos se puede presentar fiebre, cefalea, fotofobia, nauseas, vómito y rigidez en la
nuca, purpura petequial o equimotica, en las formas graves se puede presentar coma,
convulsiones signo de focalidad neurológica. En niños menores de un año mayoría de los
casos cursa con ausencia de signos meníngeos, se puede presentar irritabilidad, fiebre o
hipotermia, alteración del estado general, rechazo de alimentos, vomito. Los otros signos
posibles incluyen apnea, convulsiones, alteraciones de la conciencia, fontanela
abombada, ocasionalmente rigidez en la nuca y erupción purpurica.
Tabla 1. Agentes etiológicos de MBA (Protocolo INS. 2014)
1. OBJETIVO.
Describir la metodología para el desarrollo del programa de vigilancia de meningitis
bacterianas producida por Haemophilus influenzae enfocado en su identificación y
determinación a partir de muestras biológicas.
Establecer los procesos de obtención, conservación y transporte de las muestras
para la detección de Haemophilus influenzae
2. ALCANCE
Este documento se tomará como referencia única para el programa de vigilancia de
meningitis bacteriana por Haemophilus influenzae, enfocado en la identificación y
GRUPO ETAREO AGENTES BACTERIANOS
Recién nacido ( 0 a 4 semanas)
Enterobacterias: Escherichia coli, Klebsiella. pneumoniae, Proteus sp. Streptococcus del grupo B. Listeria Monocytogenes Enterococcus spp
De 1 a 3 meses
Todos los a entes citados re ia ente s: Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae tipo b Neisseria meningitidis
De 2 a 5 años
Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae tipo b, Neisseria meningitidis
Mayores de 5 años
Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis
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determinación a través de métodos fenotípicos, en el Laboratorio de Microbiología del
Laboratorio Departamental de Salud Pública como parte del control de calidad
indirecto.
3. RESPONSABILIDADES
Coordinador(a) grupo de laboratorio de salud pública: aprobar el presente
documento, supervisar el estricto cumplimiento de lo establecido en el mismo y
avalar los resultados que se generen de éste.
Profesional universitario o contratista responsable del área de microbiología clínica
del Laboratorio Departamental de Salud Pública: aplicar lo anterior con calidad,
oportunidad y avalar los resultados que se generen del mismo.
4. DEFINICIONES Y ABREVIATURAS.
Meningitis: Es la inflamación de las membranas que rodean al cerebro y la medula
espinal secundario a la presencia de una bacteria y que se caracteriza por un número
anormal de células (leucocitos) en el líquido cefalorraquídeo (LCR).
ACH: Agar chocolate
CIM: Concentración Inhibitoria Mínima
LCR: Líquido Cefalorraquídeo
LSP: Laboratorio de Salud pública
LSPD: Laboratorio de Salud pública Departamental
INS: Instituto Nacional de Salud
MBA: Meningitis Bacteriana Aguda
ATCC: American Type Culture Collection
5. CONDICIONES GENERALES
Las cepas aisladas de hemocultivos y LCR deben ser enviadas al Laboratorio
Departamental de Salud Pública por diferentes instituciones del departamento.
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Muestra ideal para realizar el diagnóstico de la MBA es el LCR recolectado por
punción lumbar, el cual debe recolectarse antes de instaurar cualquier terapéutica
antibiótica.
Todo liquido estéril que presente algún microorganismo se debe enviar el
aislamiento sin importar el microorganismo al LDSP, para líquido cefalorraquídeo
en el formato LCR, para hemocultivo en el formato Bacteriología general.
Seguir las medidas básicas de bioseguridad a través uso de los elementos de
protección individual como guantes, bata, tapaboca N95 y gafas durante la
recolección y procesamiento de las muestras. El nivel de contención recomendado
para los laboratorios que realizar el procesamiento de las muestras un nivel de
bioseguridad 2 (BSL-2).
6. FUNDAMENTO DEL METODO DE ENSAYO.
Agar chocolate o agar sangre: El objetivo es realizar el aislamiento del agente
bacteriano inicial para preceder a su identificación y caracterización. (Ver Anexo
No. 1)
Coloración de Gram: Este método permite diferenciar los agentes infecciosos
bacterianos en dos grandes grupos (Gram negativas y Gram positivas) basados en
las propiedades químicas y físicas de la pared celular, permitiendo orientar sobre
cuál es el posible agente bacteriano de acuerdo a la morfología y coloración
observada. Cuando se realiza a partir del LCR se debe hacer del sedimento luego
de centrifugar la muestra. (Ver Anexo No. 2)
Prueba oxidasa: La prueba de oxidasa determina la presencia de citocromo
oxidasa. El reactivo de oxidasa de Kovac (1% tetrametil-ρ-
hidroclorofenilendiamina) se torna en un compuesto purpúreo por la presencia de
microorganismos que contienen citocromo c como parte de su cadena respiratoria;
por lo tanto, una prueba de oxidasa dará una reacción púrpura. (Ver Anexo No. 3)
VITEK II (Ver Anexo No. 4)
7. LIMITACIONES O INTERFERENCIAS.
Falta de disponibilidad, accesibilidad y conocimiento de los protocolos de
procedimientos por parte del personal.
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Reactivos insuficientes, de mala calidad o vencidos.
Ausencia de recurso humano que cumpla con los requisitos de capacitación,
entrenamiento y experiencia para los procedimientos realizados en el área de
microbiología clínica.
8. RECOLECCION E IDENTIFICACION DE LA MUESTRA.
Figura 1. Mapa de proceso de identificación de H. influenzae
9. CONSERVACION DE LA MUESTRA
Colonias grandes, mucoides no
hemolíticas, redondas, entre
incoloras y color gris opaco en
agar chocolate suplementado
Coloración de Gram
Cocobacilos Gram negativos
Negativo
OXIDASA
Positivo
Haemophilus No Haemophilus
Vitek 2.0
Haemophilus influenzae
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Las muestras no deben ir refrigeradas y tampoco incubadas en el medio de
transporte amies con carbón activado (temperatura de envío: temperatura
ambiente entre 18 y 25°C)
Todas las muestras deben ser transportadas en triple embalaje correctamente
marcada y etiquetada con el nombre del paciente, historia clínica y fecha de
recogida del aislamiento cumpliendo con los protocolos de bioseguridad.
La muestra de LCR debe ser almacenada un envase plástico estéril o en un
criovial tapa rosca estéril y conservar a una temperatura de 2-8°C.
10. EQUIPOS
Materiales
Guantes
Caretas
Asa Bacteriológica
Escobillones estériles
Bombonera de anaerobiosis (Jarra con vela)
Encendedor
Láminas Portaobjetos
Cajas de petri
Tubos de ensayo
Pipetas Pasteur
Gradillas
Medios de Transporte Amies con carbón activado
Mechero
Equipos.
Microscopio
Incubadora
Balanza
Autoclave
pHmetro
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Nevera
Equipo automatizado (Vitek 2)
11. REACTIVOS CONTROLES Y MATERIALES DE REFERENCIA
Reactivo.
Agua Destilada
Solución salina
Hipoclorito
Medios de Cultivo
Tarjetas de Identificación para equipo automatizado
Controles:
Se realizará control de calidad con cepas ATCC microorganismos certificados para el
control de calidad en microbiología. Sus características genotípicas y fenotípicas
garantizan la identidad del microorganismo.
Material de referencia:
Laboratorio Departamental de Salud Pública. Protocolo de Procedimiento
Meningitis Bacteriana. Sección Microbiología. Bucaramanga, Santander. Marzo de
2004
Procedimiento para la Aplicación de las Normas de Bioseguridad en el Laboratorio
Departamental de Salud Pública (LDSP).
Guía para la vigilancia por laboratorio de Meningitis Bacteriana aguda (MBA)
Dirección de Redes en Salud Pública. Grupo de Microbiología - INS. 2014
Procedimientos para el diagnóstico de Neumonías y Meningitis Bacterianas y la
caracterización de cepas de Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae,
SIREVA II. Grupo Microbiologia, Instituto Nacional de Salud Bogotá – Colombia,
Organización Panamericana dela Salud- INS 2012
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12. DESCRIPCION DEL PROCEDIMIENTO
1. Cultivo a partir de la muestra enviada por la IPS al LDSP, Realizar el aislamiento del agente bacteriano inicial para preceder a su identificación y caracterización. 2. Una vez obtenido el crecimiento, se realizan las pruebas de identificación. (Ensayos que permiten identificar las características del metabolismo celular bacteriano y son específicas para cada agente. Estas pruebas se realizan a partir del cultivo puro. 3. El Laboratorio Departamental de salud Pública envía Las cepas una vez se hagan las pruebas necesarias al INS 4. En el INS funciona el Laboratorio de Referencia en Microbiología. El objetivo de enviar las cepas causantes de meningitis bacteriana es poder centralizar la información y tener datos actualizados y permanentes de los agentes causales que traen beneficios paraclínicos y epidemiológicos para la toma de decisiones en beneficio de la comunidad. 5. En caso de tener que remitir la muestra de LCR para otros ensayos bacteriológicos
adicionales como PCR remitir la muestra a temperatura de refrigeración (4-8°C). Para el
estudio de virus si el envío se demora más de 24 horas, la muestra debe congelarse de -
20 a -70°C, en todas las ocasiones utilizar el triple empaque indispensable para el
transporte de muestras y biológicos
13. CONTROL DE CALIDAD ANALITICO.
Programa de Evaluación Externa del Desempeño Directa (PEEDD)
El Grupo de Microbiología Clínica del LDSP realiza la Evaluación Externa del Desempeño
en Bacteriología y Resistencia a los Antimicrobianos (EEDB-RA) dirigida a la Red
Nacional de Laboratorios, como una herramienta para evaluar la competencia técnica de
los laboratorios en la identificación y realización de pruebas de sensibilidad antimicrobiana
de agentes bacterianos de importancia en salud publica entre los que se encuentran
microorganismos causantes de MBA.
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Programa de Evaluación Externa del Desempeño Indirecta (PEEDI)
Este PEEDI, se realiza mediante la caracterización fenotípica del 100% de los agentes
bacterianos de importancia en salud pública causantes de meningitis y neumonías
bacterianas.
14. ANALISIS Y EXPRESION DE RESULTADOS.
Morfología Cocobacilos
Tinción Gram negativos
Agar Chocolate
suplementado
colonias grandes, mucoides no hemolíticas,
redondas, entre incoloras y de color gris opaco.
Oxidasa Positiva.
Requerimiento
de factores
Hemina (X) y NAD (V) requiere de ambos factores
para su crecimiento
Porfirinas: Negativa
15. EMISION DEL INFORME DE RESULTADOS.
El documento que debe ser remitido al INS para solicitud de los ensayos es: FOR-
R01.5030-002 Envío de aislamientos invasores de Haemophilus influenzae
Los resultados realizados por INS se enviarán a las instituciones en su formato original en
archivo PDF, a través de correo institucional.
Los resultados que no cumplan con los criterios establecidos por el INS serán enviados a
las instituciones en formato de rechazo (establecido por el LDSP). Además, llevara anexo
el resultado del mismo
16. EXAMENES COMPLEMENTARIOS.
Determinación del requerimiento de factores X y V (Ver Anexo No.5)
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Prueba de aglutinación en látex Se realiza para la identificación de los serogrupos o
serotipos de H. influenzae a través de aglutinación en los cuales se utilizan antisueros
específicos que reaccionan con las capsulas bacteriana de estos. (Ver Anexo No. 6)
Prueba de síntesis de porfirinas (Ver Anexo No.7)
17. ANEXOS
Numero de Anexo Nombre del Análisis
Anexo No.1 Agar chocolate suplementado
Anexo No.2 Coloración de Gram
Anexo No.3 Prueba de oxidasa
Anexo No.4 VITEK
Anexo No.5 Prueba para requerimientos de factores de crecimiento
Anexo No.6 Serotipificación en láminas
Anexo No.7 Prueba de la síntesis de las porfirinas
Anexo No.1
AGAR CHOCOLATE SUPLEMENTADO
Este medio permite el crecimiento de microorganismo exigentes en sus requerimientos
nutricionales, por ejemplo: especies de Streptococcus, Haemophilus y Neisserias
patógenas.
Es un medio de cultivo ampliamente nutritivo por la presencia de peptonas, tripteína,
extracto de levadura, extracto de corazón y almidón. El agregado de sangre y suplemento
IsoVitalex con solvente aporta nutrientes, vitaminas y minerales adicionales. El cloruro de
sodio mantiene el balance osmótico y el agar es el agente solidificante
Preparación.
La composición química de la base de la tripticasa soya con extracto de levadura, de la
casa comercial DIFCO (Ref. 0662-17-0) es la siguiente:
Extracto de carne bovina 2,0 g
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• Suspenda 40g en un litro de agua destilada y lleve hasta ebullición para disolver el polvo
• Esterilice en autoclave a 121°C por 15 minutos
• Enfríe a 50°C (baño de María)
Procedimiento
Sembrar por superficie directamente el material de estudio
Control de calidad.
Incubar una caja de agar chocolate sin inocular de 24-48 h a 35 ± 2 °C. El medio debe
permanecer marrón chocolate, opaco, posiblemente poco homogéneo y no debe
observarse crecimiento.
Crecimiento.
El estudio del control de calidad de la sangre asegura que este medio mantenga el
crecimiento de microorganismos no fastidiosos y demostrará la alfa y beta hemólisis,
reacciones típicas de S. pyogenes y S. pneumoniae.
Cepas control
Inocular muestras representativas con las cepas siguientes. Incubar las placas a una
temperatura de 35 ± 2 °C en una atmósfera aerobia con dióxido de carbono. Efectuar
lectura de las placas después de 18 – 24 h y 42 – 48 h de incubación
Haemophilus influenzae ATCC 10211 Crecimiento de bueno a excelente
Hidrolizado ácido de caseína 17,5 g
Almidón 1,5 g
Hemoglobina 10,0 g
IsoVitaleX 10,0 g
Agar 16,0 g
Agua destilada 1000 mL
pH final 7.3 ± 0.2
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Neisseria gonorrhoeae ATCC 43069 Crecimiento de aceptable a excelente
Neisseria meningitidis ATCC 13090 Crecimiento de bueno a excelente
Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 Crecimiento bueno a excelente
Anexo No. 2
COLORACIÓN DE GRAM
Fundamento.
Según la reacción al Gram las bacterias se dividen en Gram positivas, se tiñen de color
violeta y en Gram negativas, se tiñen de color rojo. La división de las bacterias en Gram
positivas y en Gram negativas está dada por las diferencias físicas y químicas en la
composición de la pared celular.
La pared celular de las bacterias Gram positivas, está compuesta en un 50-60% por
peptidoglicano y en un 40-50% por ácidos teicoicos y polisacáridos. El peptidoglicano
(llamado también mureína, capa de glicopéptido o mucopéptido) está compuesto de N-
acetilglucosamina y N-acetil murámico. En las bacterias Gram positivas el cristal violeta se
fija a la pared celular y con la adición del lugol (mordiente), se produce el complejo cristal
violeta-iodo el cual es resistente a la decoloración. La pared celular de las bacterias Gram
negativas está compuesta por una delgada capa de peptidoglicano que constituye del 5-
10% del peso de la pared celular, recubriendo esta capa se encuentra una membrana
externa compleja, constituida por: fosfolípidos (20-30%), lipopolisacáridos (30%) y
proteínas (40-50%). El decolorante en las bacterias Gram negativas actúa como un
solvente de los lípidos presentes, permitiendo que el complejo cristal violeta-iodo se
libere, tomando la bacteria el colorante secundario o de contraste (safranina). Es
importante estandarizar los métodos de coloración para obtener resultados constantes y
fidedignos, para esto es necesario valorar los resultados con microorganismos control, en
los que se conozca la reacción al Gram.
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La coloración de Gram es una prueba critica para el diagnostico presuntivo y rápido de
agentes infecciosos, también sirve para valorar la calidad de la muestra clínica.
Estas características pueden estar influenciadas por muchos factores tales como:
• Edad del cultivo
• Medio de cultivo
• Atmósfera de incubación
• Método de coloración
• Presencia de sustancias inhibitorias.
Reactivos
Cristal violeta
Solución A de reserva
Solución B de reserva
La solución de trabajo se prepara mezclando una parte de solución A, con cuatro partes
de solución B.
Solución de yoduro de potasio
Colocar el yodo y el yoduro de potasio
dentro de un mortero, agregar 20 ml de agua destilada y mezclar hasta que los reactivos
Cristal violeta 2 g
Alcohol etílico absoluto 20 mL
Oxalato de amonio 0,8 g
Agua destilada 80 mL
Yodo 1 g
Yoduro de potasio 2 g
Agua destilada 300 ml
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estén en solución. Colocar la solución en un frasco ámbar, lavar el mortero con la
cantidad de agua necesaria para completar los 300 ml.
Decolorantes
• Lento: alcohol etílico (95%).
• Intermedio: alcohol etílico 95% + acetona (grado reactivo) 1:1
• Rápido: acetona (grado reactivo)
Safranina (Solución de contraste)
La solución de trabajo se prepara
mezclando 10 ml de la solución anterior con 90 ml de agua destilada
Procedimiento
• Fije la preparación con calor
• Cubra la preparación con cristal violeta por 1 minuto.
• Lave con agua
• Cubra la preparación con lugol por 1 minuto.
• Lave con agua.
• Cubra con el alcohol etílico sin tiempo lave rápidamente
• Lave con agua
• Cubra con safranina por 30 segundos.
• Lave con agua, dejar secar.
Control de calidad
• Observar la apariencia de los reactivos diariamente. Si el cristal violeta presenta un
precipitado o cristales sedimentados, refiltrar antes de usarlo. La evaporación puede
Safranina O 2,5 g
Alcohol etílico (95%) 100 mL
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alterar la efectividad de los reactivos, por lo tanto las soluciones de trabajo deben ser
cambiadas regularmente.
• Realizar con cepas conocidas un control diario, igualmente cuando se prepara un nuevo
lote de reactivos. Preparar dos extendidos, uno con Escherichia coli y otro con
Staphylococcus aureus a partir de un cultivo en caldo (estas cepas son las de control de
antibiograma).
Anexo No. 3
PRUEBA OXIDASA
Fundamento
Esta prueba determina la presencia de la enzima citocromo oxidasa. Para esta prueba se
puede usar el reactivo de Kovac (tetrametil-ρ-hidroclorofenilendiamina) o el reactivo de
dimetil (1% dimetil-ρ- hidroclorofenilendiamina dihydroclorido). En ambos casos, el
reactivo se torna azulpúrpura en presencia de la enzima.
Material y equipos
• Cultivo bacteriano fresco (24h)
• Papel de filtro
• Cultivo
• Pipeta
• Puntas de pipeta
• Reactivo de Kovac ( o dimetil)
• Cabina de bioseguridad II
Procedimiento
Nota: se debe evitar el uso de asas de cultivo de níquel a fin de evitar falsos positivos
• Preparar la cabina de bioseguridad II para el trabajo según lo estipulado en los
procedimientos estándar de trabajo (POE) del laboratorio
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• Introducir en la cabina la placa a testar, el papel de filtro y una alícuota del reactivo de
Kovac -Colocar una gota de reactivo en una pequeña tira de papel de filtro
• Con el asa de cultivo, tomar una pequeña cantidad de crecimiento bacteriano
(aproximadamente una colonia) con cuidado de no tocar el agar, y mezclar con la gota de
reactivo
•Esperar unos 10 segundos (10-30 minutos si se usa reactivo dimetil). Si el organismo es
oxidasa
Interpretación de resultados
• Positivo: la reacción tomará un color azul-púrpura
• Negativo: permanecerá incoloro
Anexo No.4
VITEK II
Fundamento:
El sistema automático VITEK usado en el ámbito de la microbiología clínica, e industrial.
VITEK automatiza todas las etapas necesarias para la realización de las pruebas de
identificación y antibiograma con las tarjetas VITEK. Está constituido por un
inoculador/sellador, un incubador/lector, un ordenador y una impresora. El
inoculador/sellador permite la inoculación de las tarjetas en pocos minutos. El
incubador/lector asegura simultáneamente la incubación y la lectura de las tarjetas para
una capacidad que varía de 32 a 480 tarjetas según el modelo. El ordenador equipado
con los programas de VITEK efectúa un control permanente de las operaciones en curso,
memoriza los valores, trata e interpreta los resultados. Este modelo reagrupa el inoculador
y el incubador/lector en el mismo módulo. Su capacidad es de 30 tarjetas.
Materiales:
Densichek
Pipetas automáticas
Vortex
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Tarjetas de ID y AST
Tubo plástico
Hisopos
Procedimiento:
Repicar:
• Con ayuda del hisopo contenido en el medio de transporte repicar la cepa en agar
solido según corresponda:
• Mueller Hinton para enterobacterias y Gram positivos.
• Agar Sangre para Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae
• Agar Chocolate para Neisseria meningitidis, Neisseria gonohrroeae, Haemophilus
influenzae.
• Agar sabouraud para hongos y levaduras.
Incubación.
Incubar las placas en posición invertida a 35+/- 2°C durante 18-24 horas.
Las placas de Haemophilus spp y Streptococcus spp, deben ser incubadas en
atmósfera del 5% de CO2.
Identificación y antibiograma,
Preparar los reactivos e insumos: tarjetas de identificación, solución salina, tubos,
pipetas y puntas.
Realizar prueba de catalasa, oxidasa y Gram para cada microorganismo aislado.
Preparación de la muestra:
TUBO 1: Tubo para identificación
adicionar 3ml de solución salina en tubo, adicionar de una a tres colonias y
disolverla, agitar con vortex y con ayuda del densicheck evaluar la densidad del
inoculo según criterios de Mac Farlan así:
Intervalo aceptable: McFarland. Microrganismos
0,50- 0,63 Gram negativos y positivos
1,80- 2,20 Levaduras
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2,70- 3,30 Neisseria/ Haemophillus
Tomar una tarjeta de identificación y colocarla en el cassette.
TARJETA VITEK2 UTILIDAD
VITEK GN Identificación de enterobacterias y Gram
negativos no fermentadores.
VITEK GP Identificación de enterococcus,
estreptococcus, estafilococos y
organismos Gram positivos.
VITEK NH Identificación de Neisseria spp,
Haemophilus spp
VITEK YST Identificación de levaduras y organismos
similares.
TUBO 2: Tubo para antibiograma
Inocular según corresponda:
Gram negativos: 3.0 ml de solución salina + 145ul de suspensión 0.45- 0.63en la
escala de Mac Farlan.
Gram Positivos: 3.0 ml de solución salina + 280ul de suspensión 0.5-0.63 en la
escala de Mac Farlan.
Levaduras: 3.0 ml de solución salina + 280ul de suspensión 0.5-0.63 en la escala de
Mac Farlan.
Tomar una tarjeta de antibiograma según corresponda.
TARJETA UTILIDAD
AST-N272 Pruebas de sensibilidad para bacilos
aerobios Gram negativos clínicamente
significativos frente a determinados
antimicrobianos.
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AST-P612 Pruebas de sensibilidad para
Staphylococcos spp, Enterococcus spp, y
S. agalactiae frente a determinados
antimicrobianos.
AST YST 08 Pruebas de sensibilidad para hongos.
Anexo No.5
DETERMINACIÓN DEL REQUERIMIENTO DE FACTORES X Y V
En el comercio hay tiras o discos de papel filtro impregnado de factores X o V. Los
factores X y V, ambos hidrosolubles, difunden fácilmente en agar. Los discos o tiras de
papel de filtro con estos factores se colocan sobre la superficie de un medio deficiente en
dichos factores como el agar tripticasa soya, previamente inoculado en forma masiva con
el organismo en estudio. La dependencia de la bacteria por los factores X y V se
determina observando el patrón de crecimiento de las colonias alrededor de las tiras de
papel.
Procedimiento
• A partir de un aislamiento puro, realice una siembra masiva sobre el agar o realice una
suspensión bacteriana en escala 0,5 de MacFarland y siembre el inóculo con el escobillón
sobre la superficie del agar en tres direcciones con el fin de asegurar la uniformidad de
este. Evite el contacto del asa con el agar chocolate, para evitar arrastrar los factores
contenidos en el medio.
• Coloque los discos o tiras X y V (BBL, Difco), sobre la superficie del agar en el área de
inoculación, a una distancia de 1 a 2 cm entre ellos.
• Incube la caja a 35ºC en 3 - 5% de CO2 durante 18 a 24 h.
Lectura
Examine visualmente la superficie del agar para comprobar la presencia del crecimiento
visible alrededor de los discos/tiras. Los aislamientos que dependen únicamente del factor
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X crecerán alrededor del disco/tira X y los que dependen solamente del factor V, crecerán
alrededor del factor V. Los aislamientos que requieren de los dos factores (X y V),
crecerán en medio de ambos discos
Control de calidad
Realice la prueba con las cepas control:
Requiere sólo factor V: H. parainfluenzae
Requiere factores X y V: H. influenzae
Anexo No.6
AGLUTINACIÓN EN LÁMINA
Las bacterias en suspensión se aglutinan cuando se mezclan con anticuerpos dirigidos
contra los componentes de la superficie. Esta técnica es un método simple y rápido para
identificar y serotipificar H. influenzae.
Procedimiento:
• Haga una suspensión densa (tubo #5 de la escala de McFarland) de la bacteria a
identificar, en solución salina a 0,85%.
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Suavemente mezcle la lámina repetidamente para las reacciones de aglutinación en la mina
Fuente: Manual de Laboratorio para la Identificación y Prueba de Susceptibilidad a los
Antimicrobianos de Patógenos Bacterianos de Importancia para la Salud Pública en el Mundo en Desarrollo Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Neisseria
gonorrhoeae, Salmonella serotipo Typhi, Shigella y Vibrio cholerae.
• Coloque por separado dos gotas de 5 ó 10 µl de la suspensión, en una lámina
portaobjetos limpia y agregue a una de ellas 5 ó 10 µl del antisuero polivalente y a la otra,
5µl de solución salina (control negativo).
• Observe la formación de grumos bacterianos antes de 1 minuto. Sólo una aglutinación
gruesa se debe considerar positiva.
• Sí la reacción con el polivalente es positiva, continúe con el anti-b y después con los
otros antisueros (anti-a,c-f).
El orden de los antisueros se basa en la prevalencia de los serotipos en una región.
Algunos aislamientos presentan una aglutinación pequeña con varios antisueros; en ese
caso debe resembrarse el aislamiento y estudiarse nuevamente frente a todos los
antisueros. Pueden ocurrir reacciones cruzadas especialmente en serotipos poco
frecuentes por ejemplo c y d. También pueden presentarse reacciones cruzadas de b, e y
f
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Interpretación
1. Aglutinación con el antisuero polivalente y no hay aglutinación con la solución salina
(control negativo).
• Es un H. influenzae capsulado
• Continúe la serotipificación con los antisueros monovalentes colocando primero el más
frecuente de los serotipos (b). Utilice la misma metodología empleada con el antisuero
polivalente.
• Continúe con el antisuero monovalente, que corresponda al segundo serotipo en
frecuencia para comprobar que no existe reacción cruzada con el antisuero monovalente.
• Sí hay aglutinación con el antisuero b y no se observa con el otro antisuero
monovalente, corresponde a H. influenzae serotipo b
• Sí no se observa aglutinación con el antisuero b, continúe la serotipificación con el
antisuero correspondiente al serotipo que sea segundo en frecuencia. Generalmente para
Latinoamérica es el a.
2. Aglutinación con el antisuero polivalente y hay aglutinación con la solución salina.
• El aislamiento esta autoaglutinando y el serotipo debe determinarse por la técnica de
reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
3. No hay aglutinación con el antisuero polivalente ni con la solución salina (control
negativo) El aislamiento no es capsular y se informa como H. influenzae NC.
(Comunicación personal, Mary Slack, PHLS de Oxford).
• Recuerde que si se demora mucho la lectura, la placa puede secarse y dar falsos
positivos.
• Un exceso de uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) puede dar un resultado
falso negativo.
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CONTROL DE CAMBIOS
CONTROL DE CAMBIOS
VERSIÓN FECHA DESCRIPCIÓN DEL CAMBIO
ELABORO REVISO APROBO
0 06/12/2020 Emisión inicial del documento
ROBINSON GALAN TORRES.
Profesional universitario
VIANEY EMILCE PORTILLA R.
Profesional universitario
FREDY BLANCO RIOS
Coordinador Grupo LSP
GERMAN MARIN
Director de Salud Integral
JAVIER VILLAMIZAR
SUAREZ
Secretario de Salud de
Santander