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1  

Martin Däumer Labor Dr. Thiele Kaiserslautern

Resistenzen in der HIV-Therape - Wenn die Medikamente nicht mehr wirken -

AIDS Fälle in Deutschland

cART

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proteins  RNA  

RNA  

RNA  RNA  DNA  

DNA  DNA   provirus  

(co)receptors CCR5 / CXCR4

reverse  transcrip,on:  NRTIs,  NNRTIs  

viral  entry:  fusion  inhibitors,  

coreceptor  anagonists  

matura,on:  protease  inhibitors  

integrase  

integra,on:  Integrase  Inhibitors  

HIV Replikationszyklus und antiretrovirale Zielstrukturen

Drug class Generic name Abbreviation Trading name Company

NRTI

Zidovudine ZDV Retrovir ViiV/GSK Didanosine ddI Videx Bristol-Myers Squibb Stavudine d4T Zerit Bristol-Myers Squibb Lamivudine 3TC Epivir ViiV/GSK Abacavir ABC Ziagen ViiV/GSK Tenofovir TDF Viread Gilead Emtricitabine FTC Viread Gilead

NNRTI Nevirapine NVP Viramine Boehringer Ingelheim Rilpivirine RPV Edurant Janssen Cilag Etravirine ETR Intellence Janssen Cilag Efavirenz EFV Sustiva/Stocrin Bristol-Myers Squibb

PI

Saquinavir SQV Invirase, Fortovase Roche Ritonavir RTV Norvir AbbVie Indinavir IDV Crixivan Merck & Co. Nelfinavir NFV Viracept Agouron Pharmaceuticals Fosamprenavir FPV Telzir (Lexiva) ViiV/GSK Lopinavir LPV Kaletra AbVie Atazanavir ATV Reyataz Bristol-Myers Squibb Tipranavir TPV Aptivus Boehringer Ingelheim Darunavir DRV Prezista Janssen Cilag

EI Enfuvirtide ENF Fuzeon Roche Maraviroc MVC Celsentri ViiV/Pfizer

Raltegravir RAL Isentress MSD Sharp &Dohme INI Elvitegravir EVG B. v. Stribild Gilead Dolutegravir DTG Tivicay ViiV/GSK

Zugel. antiretrovirale Medikamente

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Fallbeispiel: N. M. *1971

◼  39 Jahre junger Mann

◼  ED HIV: Juni 2005

TDF, FTC, EFV

Fallbeispiel: N. M. *1971

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TDF, FTC, EFV

Fallbeispiel: N. M. *1971

TDF, FTC, EFV

Resistenztest

Fallbeispiel: N. M. *1971

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Definition Resistenz:""Als Resistenz bezeichnet man in der Medizin im engeren Sinn die Widerstandsfähigkeit eines Organismus gegenüber negativen äußeren Einflüssen (Noxen)."Im weiteren Sinn umschreibt Resistenz auch die fehlende bzw. nachlassende Wirkung körpereigener (Hormone) oder körperfremder Substanzen (Arzneistoffe), z.B. weil Rezeptoren auf den Zielzellen vermindert ausgeprägt werden."

aus:  

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HIV Mutationen entstehen spontan

Alle möglichen Punktmutationen entstehen jeden Tag

Fiele Schraibvähler

prä-genomische RNA zu proviraler DNA

1 auf 104 kopierte Basen

HIV RT: kein Korrekturmechanis

mus

HIV: hohe Replikationsrate

109 Viruspartikel pro Tag

HIV RT: unzuverlässig

+

+

Insuffiziente Suppression führt zur Selektion resistenter Virusvarianten

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HIV Quasispecies

Major viral population

Intermediate viral populations

Minor viral populations

Insuffiziente Suppression führt zur Selektion resistenter Virusvarianten

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Resistenzrisiko minimieren

HIV

Wirkstoff

HIV

Wirkstoff

Prinzip der Resistenz

empfindlich resistent

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Die Nomenklatur

M46 (Wildtyp) Mutation: M46I Austausch an der Position 46: Methionin gegen Isoleucin

Beispiel: Protease

33  35  10  

32  31  19  

12  10  

14  

1  ak?ve  Substanz  

≥2  ak?ve  Substanzen  

400mg  bid  800mg  bid  Ac,ve  control  

Viruslastreduk,on  zur  Woche  48  (log10  Kopien/mL)  

0   0.5   1   1.5   2  

n=    

TMC125-C223: Einfluss aktiver Substanzen auf die Viruslastsenkung

1.67 1.2

0.28

0.41 1.02

0.15

0.14 0.61

0

Cohen. BHIVA 2006, Abs. 2

0  ak?ve  Substanzen  

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Die Patienten mit dem geringsten Grad an Adhärenz haben die höchste Wahrscheinlichkeit eine Resistenz

gegenüber ihrer HAART zu entwickeln.

Richtig oder falsch?

Adhärenz und Resistenz

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Geringe Adhärenz/Geringe Spiegel

Medikamentenresistenz

Therapieversagen

Wie entsteht Resistenz?

Resistenztest ja, aber wann?

...siehe „gemeinsamer Bundesausschuss“, 20.09.2005

  Bei Erstdiagnose / Erstvorstellung? Mögl. übertragene, resistente Stämme werden u.U. „überwuchert“

  Vor Therapiebeginn? (initial) Immer! „Es kann viel passiert sein!“

  Bei Therapieversagen? Selbstverständlich! Und die Viruslast? Zw. 200 und 500 Kop/mL kann man loslegen!

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Genotypische Resistenztestung

Plasma RNA RNA Extraktion

cDNA

Reverse Transkription/ 1. Polymerase Ketten Reaktion (PCR) des HIV-1 pol Gens (weitere „targets“)

PCR Produkt

2. Polymerase Ketten Reaktion Protease und Reverse Transkriptase

Sequenz Reaktion

Aufreingung (optional)

Elektrophorese, DNA Sequenzierer

Aufreingung

(optional)

M Probe 7-10 Tage

ViroSeq™ HIV-1 Genotyping software (Celera Diagnostics, Abbott)

Editieren von Sequenzen

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>09-21343(B) CCTCAGATCACTCTTTGGCAgCGACCCttCgTCACAATAAAAGTAGGRGG GCAGTTAAAGgAAGCTCTATTAGATACaGGAGCaGATGATACAGTATTAG aAGAAATGAATTTGCCaGGAAGRTGGAAACCAAAAHTRATAGGGGGAATT GGAGGTTTTATGAAAGTAAAACAGTATGAGGAAGTACCCATAGaAATCTG TGGACATAAGGTTACAGGTACAGTAGTAGTAGGACCTACACCTGCCAACA TAATtGGAAGGAATCTGTtGACTCAGCTtGGTTGCACTTTAAaTTTTCCC ATTAgTCCTaTtGAAACTGTACCAGTAAAATtAAAGCCaGGAATGGATGG cCcAaAAGTtAAACAATGGCCATtGACAGAAGAAAAAatAAAAGCATTAG TAGAAATTTGtacAGAATtGGAAAAGGAtGGGAAAATTTcaAAAATTGGG CCTGAaAATCCATACAATACTCCAGTGTTTGCCATAAAGAAAAAAGACGG TACTAAATGGAGAAAATTAGTAGATTTCAGAGAACTTAATAAGAGAACTC AAGACTTCTGGGAAGTTCAATTAGGAATACCACATcccgGAGGGTTAAAA AAGAACAAATCAGTAACAGTACTAGATGTGGGTGATGCATATTTTTCART TCCCTTACAtGAAGACTTCAGGAAGTACACTGCATTTACCATACCTAGTA CAAACAATGAGACACCAGGGATTAGATACCAGTACAATGTGCTTCCACAG GGATWERDIESLIESTHATGUTEAUGENGGAAAGGATCACCAGCAATATT AGAGCCCTTTAGAAAACAAAATCCAGAATTAGTTATCTATCAATACGTGG ATGATTTGTATGTAGGATCtGaCTtAgAaATAGGgCAgCATAGAaCaaAA ATAGACGAacTGAGAGAACaTCtgTGgaAGTgGGGGTTTtACACACCAGA CAAAaAACATCAGAAAGAACCTCCATTTCTTtGgATGGGTTATGAACTCC ATCcTGATAAATGGACAGTGCAGCCTATAGTGCTGCCAGAAAAAGACAGC TGGACTGTCAATGACATACAgAAGTTAGTGGGAAAATTGAATTGGGCAAG TCAaATTTACCCAGGGATTAAAGTAAGGCAATTATGCAAACTCCTTAGAG GAACCAAAGCACTGACAGAAGTAGTACCTCTAACGGAAGaAGCAGAGCTA GAACtGGCAGAAAACAGGGAGaTTCtGAAAGAACcAGTACATGGAGTGTA TTATGaCCCCTCAAAAGAYTTAATAGCAGAAAtAcAGAAGCAGGGGCAaG G

Das Ergebnis: „fasta“ Datei

2006100903 Protease L10F M46I M46L I54M L63P A71V L76V V82A V3I I15V S37N R57K D60E Q61E I62V I72T I93L

2006100903 Reverse Transcriptase M41L E44D S68G K103N V118I M184V L210W T215Y A98G D121H I135T D177E I178L E203D Q207E R211K L214F I293V

Genotyp: Mutationen

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Das Dilemma

cut-off

EFV (Sustiva®)

K103N

AZT (ZDV, Retrovir®)

M41L

T215Y

L210W

M184V empf. (aktiv)

res. (inaktiv?)

Kreuzresistenz und genetische Barriere

184V 3TC in FTC-vorbehandelten Patienten

184V FTC

FTC-resistentes Virus

54L

32I

76V/47V/54M

DRV

Darunavir-resistentes Virus

Wild-type virus

3TC-resistentes Virus 184V 3TC

FPV, dann DRV

32I ± 47V

76V or 54M

32I + 47V

Amprenavir-resistentes Virus

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RegaInst v7.0 ANRS AC11

TRUGENE HIV-1 Genotyping Test"

HIV ViroScorer™ v1.0 "

Genotypische Resistenztestung und Regel-basierte Interpretationsalgorithmen

geno2pheno ver3.0!

VirtualPhenotype

ZDV

Resistent intermediäre Resistenz eingeschränkteEmpfindlichkeit

Kommentar:

• 1 5 1 M• 69 ins• 3 aus (41L, 67N,

70R, 210W, 215F/Y,219Q/E)

• 2 aus (41L, 67N, 70R,210W, 215F/Y,219Q/E)

• 1 Mutation aus (41L,67N, 70R, 210W,215F/Y, 219Q/E)

• Falls an 215 eine andereMutation als F und Y vorkommtist dies ein Zeichen für archivierteresistente Viren

• Als TAMs werden gewertet: 41L, 67N, 70R, 210W, 215F/Y, 219Q/E• Wenn 65R vorliegt werden 2 TAMs abgezogen, sofern der Selektionsdruck auf

65R aufrecht erhalten bleibt• Wenn 74V, 181C, 184V/I vorliegen wird je eine TAM abgezogen, sofern der

entsprechende Selektionsdruck aufrechterhalten bleibt.• Für 184V/I gilt die Regel nicht, wenn 41L+ 210W+ 215F/Y oder mehr vorliegt.• Maximal Verbesserung um eine Kategorie pro Mutation bei 74V, 181C, 184V/I

Regelwerke, basierend auf Expertenmeinungen

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Befund????

Fertig????

Sicher nicht !!

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Fallbeispiel

Fallbeispiel

G.P. *12.09.1986 aktuelle Therapie: TDF, FTC, NVP VL: 8.900 Kop/ml CD4: 320 (19%)

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Fallbeispiel

Resistenztestung: PR: ./. RT: 65R, 103N, 181C, 184I

Vorhersage für Kombinationstherapien

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Klinische Konsequenz?

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Virusdynamik in der Therapiepause

05.09.2002

12.09.2002

19.09.2002

26.09.2002

K103N

Genotyp-Hist

orie

Kumulative Befundung

Aktuelle Entwicklungen!in der HIV-Resistenztestung!

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Verteilung Therapie-erfahrene/ Therapie-naive in der Resistenztestung 2000 und 2008

[%]

Viru

slas

t

Viruslast bei Anforderung der Resistenztestung

Däumer, 2011, unveröffentlicht

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Entwicklung der HIV-Resistenz am Beispiel von NNRTI-Mutationen

n=2085 (1/2007-12/2009)

Anz

ahl M

utat

ione

n

Fragen per E-Mail an: hiv.germany@bms.com

Prävalenz von übertragener Medikamenten Resistenz

Prevalence of drug resistance in first Prot/RT sequences from treatment naive patients (n=1.950) by year according to Prevalence of TDR: 10,4% (95% CI 9.1-11.8) p for trend = 0.6, 2001-2011

Overall Prevalence

NRTI

NNRTI

PI

7% (95% CI 6-8; p=0.7)

3% (95% CI 2-4; p=0.6)

3% (95% CI 2-4; p=0.7)

0% 5% 10%

16,0%  

14,0%  

12,0%  

10,0%  

8,0%  

6,0%  

2,0%  

0,0%  

4,0%  

(39)  2001  

(48)  2002  

(55)  2003  

(101)  2004  

(138)  2005  

(189)  2006  

(265)  2007  

(343)  2008  

(365)  2009  

(292)  2010  

(115)  2011  

Total TDR NRTI Resistenz NNRTI Resistenz PI Resistenz

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Grenzen der Standard-Resistenztestung

Blood  plasma   RNA  RNA  extrac,on  

cDNA  

Reverse  Transcrip,on/  Polymerase  Chain  Reac,on    

PCR  products  

2.  Nested  PCR    

Sequencing  Reac?on  

Purifica,on  (op,onal)  

Sequencer  Purifica,on  

(op,onal)  

M  Sample  

Sensitivity for minor variants: >20%

Die Suche nach der Nadel im Heuhaufen

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„Ultra-tiefe Resistenztestung“

...PQIYMDDHTRE...

Standard Sanger-sequencing

...PQIYVDDHTRE...

...PQIYMDDHTRE...

...PQIYMDDHTRE...

...PQIYMDDHTRE...

...PQIYMDDHTRE...

...PQIYMDDHTRE...

Ultra-deep sequencing

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Acknowledgments

Bettina Spielberger

Kirsten Becker

Anna Memmer

Alexander Thielen

Bernhard Thiele

Vielen Dank!!