i

RESUMEN

El consumo de papaya se ha relacionado con brotes de Salmonella enterica. Evaluaciones realizadas en otros frutos revelan que la desinfección química no logra la completa inactivación de microorganismos patógenos. Uno de los factores que puede influir en la eficacia de los desinfectantes es la formación de biopelículas bacterianas sobre la superficie del fruto. El objetivo de este trabajo fue evaluar la efectividad de tratamientos de descontaminación sobre células de Salmonella enterica libres y en biopelículas en papaya. Se evaluó la capacidad de Salmonella para formar biopelículas inoculando en el epicarpio de papaya 50 µL (106 Log UFC/mL) de un cóctel de cinco cepas. Las papayas se almacenaron a 97 % de humedad relativa y 25 o 30 °C durante 72 h. Periódicamente se realizaron las siguientes evaluaciones: 1) recuento de Salmonella; 2) cuantificación de biopolímeros y 3) microscopía electrónica de barrido. Se determinó la eficacia de desinfectantes químicos [cloro (200 ppm), ácido peracético (80 ppm), agua electrolizada neutra (50 ppm)] y calentamiento óhmico (55 y 65 °C por 60 y 90 s) y la combinación de ambos. A 25 °C y 24 h de incubación, la población aumentó 1.1 Log UFC/cm2; la densidad óptica (DO595nm) también aumentó 0.6 unidades. Después de 48 h, la población y los polímeros de Salmonella mostraron un aumento de 2.2 Log UFC/cm2 y 1.31, respectivamente. No hubo diferencias estadísticamente significativas a las 72 h (p> 0.05). Se observaron resultados similares a 30 °C. Las micrografías electrónicas mostraron agregados de células bacterianas incrustadas en material polimérico. Los tratamientos con desinfectantes químicos redujeron menos de 2 Log de carga bacteriana (células libres y en biopelícula), mientras que el calentamiento óhmico resultó ser eficaz a 65 °C por 60 y 90 s reduciendo más de 5 Log UFC/cm². El calentamiento óhmico a 55 °C redujo alrededor del 40 % de la población y su eficacia incrementó a 44-50 % cuando se combinó con las soluciones desinfectantes. Ya que Salmonella puede formar biopelículas en el fruto y con ello incrementar su resistencia, el calentamiento óhmico es una buena alternativa para asegurar la inocuidad de productos frescos como la papaya.

(Palabras clave: biopelículas, agua electrolizada neutra, calentamiento óhmico, papayas, Salmonella enterica)

ii

SUMMARY

Papaya consumption has been linked to outbreaks of Salmonella enterica. Evaluations carried out in other fruits reveal that chemical disinfection does not achieve complete inactivation of pathogenic microorganisms. One of the factors that can influence the effectiveness of disinfectants is bacterial biofilms formation on the surface of the fruit. The objective of this work was to evaluate the effectiveness of decontamination treatments on free cells of Salmonella enterica and immerse into biofilms on papaya. The ability of Salmonella to form biofilms was evaluated by inoculating on the papaya epicarp 50 μL (106 Log CFU/mL) of a cocktail of five strains. Papayas were stored at 97% relative humidity and 25 or 30 °C for up to 72 h. The following evaluations were made periodically: 1) Salmonella quantification; 2) quantification of biopolymers and 3) scanning electron microscopy. The effectiveness of the chemical disinfectants [chlorine (200 ppm), peracetic acid (80 ppm), neutral electrolyzed water (50 ppm)] and ohmic heating (55 and 65 °C for 60 and 90 s) and combination of both was determined. At 25 °C, population increased 1.1 Log CFU/cm2; the optical density (OD595nm) also increased to 0.6 units. After 48 h, the Salmonella population and polymers showed an increase of 2.2 Log CFU/cm2 and 1.31, respectively. There were no statistically significant differences at 72 h (p> 0.05). Similar results were observed at 30 °C. The electron micrographs showed aggregates of bacterial cells embedded in polymeric material. The treatments with chemical disinfectants reduced less than 2 Log of bacterial load (free cells and into biofilm) compared to the ohmic heating that turned out to be effective in reducing more than 5 Log CFU/g at 65 °C for 60 and 90 s. Ohmic heating at 55 °C reduced around 40 % and its effectiveness increased to 44 - 50 % when it was combined with disinfectant solutions. Since Salmonella can form biofilms in the fruit and thereby increase its resistance, ohmic heating is a good alternative to guarantee safety of fresh produce such as papaya.

(Keywords: biofilms, neutral electrolyzed water, ohmic heating, papayas, Salmonella enterica)

iii

DEDICATORIAS

A mi papá Francisco†, el hombre que me enseñó a ser fuerte, a nunca dejar de

prepararme y alcanzar mis metas.

A mi mamá Irene y mis hermanos. A mi novio Gustavo. Los amo.

iv

AGRADECIMIENTOS

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por la beca otorgada

para cursar un posgrado de calidad.

A la Universidad Autónoma de Querétaro y la Facultad de Química por darme

la oportunidad de seguir creciendo en mi vida universitaria.

Al Posgrado de Ciencia y Tecnología de Alimentos y sus docentes por las

enseñanzas, apoyo, consejos y siempre recibirme con los brazos abiertos.

A la Dra. Montserrat Hernández Iturriaga por guiarme desde el inicio de mi

maestría. Siempre fueron buenos esos consejos, regaños, palabras de aliento

cuando los experimentos no salían bien y el estrés me consumía. Gracias por

recargarme la pila cada vez que nos reuníamos, gracias por su confianza, por creer

en mí.

A los doctores integrantes de mi comité de tesis: Dra. Marcela, Dr. Peniche, Dra.

Sofi y Dr. Alex por el aporte de sus conocimientos a mi proyecto, sus consejos y

paciencia.

A mi mamá por ser el motor de mi vida, por confiar, por su apoyo, por ser tan fuerte

e inspirarme a ser mejor. Mil gracias por todo te quiero mucho. A mis hermanos

Vane, Bryan, Homero, Juan y Paco por hacer la vida más llevadera, por las risas,

por los buenos y los malos momentos, por apoyarme. Los quiero mucho familia.

A mis amigos Probióticos y compañeros de generación Rebe, Vane, Itzel, Beto,

Raúl e Isac. Porque fueron como mi familia desde que llegue a Querétaro sin

conocer a nadie. Juntos fuimos poco a poquito y acompañándonos siempre,

sufriendo con las exposiciones de Bioquímica y las tareas de Diseño de

experimentos. Pero siempre encontrando el momento para divertirnos y celebrar.

Gracias por su amistad.

v

A mis amigos y compañeros de laboratorio Angie, Lalo, Carlos, Yuri por su alegría,

apoyo, consejos, por estar siempre. Por compartirme un pedacito de su vida, por

todas esas vivencias fuera y dentro del laboratorio que nos hicieron un gran equipo,

#TeamInocuidad, los quiero con todo mi corazón. A la Sra Martha, Dulce y Marla

por apoyarme con sus conocimientos y enseñanzas en mi trabajo.

A mi mejor amigo y amor incondicional Gustavo por sus palabras, apoyo, buenos

deseos, confianza, cariño. Porque estuviste siempre que te necesite, gracias por

creer en mí, gran parte de este título te lo debo a ti porque me inspiraste con tus

sueños. Gracias por consentirme, por tus abrazos que curan todo.

1

ÍNDICE GENERAL

1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 7

2. ANTECEDENTES ............................................................................................ 9

2.1 Papaya (Carica papaya L.). ............................................................................ 9

2.1.1 Origen y descripción ................................................................................. 9

2.1.2 Producción de papaya ............................................................................ 10

2.1.3 Procesamiento de la papaya ................................................................... 11

2.2 Microorganismos presentes en papaya ..................................................... 11

2.2.1 Microbiota nativa y enfermedades .......................................................... 11

2.2.2 Microorganismos patógenos ................................................................... 12

2.2.3 Brotes asociados al consumo de papaya ................................................ 14

2.3 Métodos de control de microorganismos patógenos en frutas ............... 15

2.3.1 Tratamientos físicos ................................................................................ 15

2.3.1.1 Calentamiento óhmico para la inactivación bacteriana .................... 18

2.3.2 Tratamientos químicos. ........................................................................... 19

2.3.3 Factores que afectan la eficacia de los tratamientos de descontaminación

20

2.4 Biopelículas bacterianas ............................................................................. 21

2.4.1 Formación de biopelículas bacterianas ................................................... 22

2.4.2 Composición de las biopelículas ............................................................. 24

2.4.3 Resistencia adquirida en células inmersas en biopelículas .................... 25

2.4.4 Formación de biopelículas en frutas ....................................................... 26

3. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................ 27

4. OBJETIVOS ................................................................................................... 28

2

4.1 Objetivo general ........................................................................................... 28

4.2 Objetivos específicos .................................................................................. 28

5. METODOLOGÍA ............................................................................................ 29

5.1 Materiales ...................................................................................................... 29

5.1.1 Equipos ................................................................................................... 29

5.1.2 Medios de cultivo .................................................................................... 29

5.1.3 Soluciones .............................................................................................. 30

5.1.4 Reactivos ................................................................................................ 31

5.2 Material biológico ......................................................................................... 31

5.2.1 Papayas .................................................................................................. 31

5.2.2 Cepas bacterianas .................................................................................. 32

5.3 Métodos ........................................................................................................ 32

5.3.1 Formación de biopelículas de Salmonella sobre la superficie de papayas.

32

5.3.1.1 Activación de las cepas y preparación del inóculo ........................... 32

5.3.1.2 Preparación del epicarpio de papaya ............................................... 33

5.3.1.3 Formación de las biopelículas.......................................................... 33

5.3.2 Evaluación de la eficacia de tratamientos de desinfección para inactivar

células de Salmonella libres y en biopelícula formadas en papaya ................... 35

5.3.2.1 Inoculación de la papaya ................................................................. 35

5.3.2.2 Aplicación de los tratamientos de desinfección química .................. 35

5.3.2.3 Aplicación de calentamiento óhmico ................................................ 36

5.3.2.4 Aplicación de calentamiento óhmico en combinación con soluciones

desinfectantes ................................................................................................ 37

5.3.2.5 Vida de anaquel del fruto después de tratamientos con calentamiento

óhmico 37

3

5.3.3 Diseño experimental y análisis estadístico .............................................. 38

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...................................................................... 39

6.1 Capacidad de Salmonella para formar biopelículas en el epicarpio de

papaya .................................................................................................................. 39

6.2 Efecto de tratamientos de desinfección sobre células de Salmonella

(libres y en biopelícula) en papaya .................................................................... 45

6.3 Efecto del calentamiento óhmico sobre células libres y en biopelícula de

Salmonella en papaya ......................................................................................... 48

6.3.1 Efecto de la combinación de calentamiento óhmico y soluciones

desinfectantes sobre Salmonella (células libres y en biopelícula) inoculada en

papaya ............................................................................................................... 50

6.4 Efecto del calentamiento óhmico sobre la calidad de la papaya ............. 53

7. CONCLUSIONES .......................................................................................... 59

8. REFERENCIAS ............................................................................................. 60

9. ANEXOS ........................................................................................................ 74

4

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Principales países productores de papaya en el mundo (miles de

toneladas).............................................................................................................. 10

Tabla 2. Crecimiento de Salmonella inoculada en papaya y almacenada a 25 y 30

°C durante 72 h. .................................................................................................... 40

Tabla 3. Reducción de la población de Salmonella después de tratamientos con

desinfectantes y calentamiento óhmico en papaya (células libres y en biopelícula).

.............................................................................................................................. 53

Tabla 4. Conteo de hongos en papaya después de tratamiento con calentamiento

óhmico. .................................................................................................................. 56

5

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 2.1. Principales fuentes de contaminación de frutas y hortalizas ............... 13

Figura 2.2. Etapas de la formación de biopelículas bacterianas. .......................... 23

Figura 5.1. Diagrama del sistema de calentamiento óhmico ................................. 36

Figura 6.1. Comportamiento de Salmonella en papaya almacenada a 25 (a) y 30 °C

(b).. ........................................................................................................................ 40

Figura 6.2 Cuantificación de biopolímeros producidos por Salmonella en papaya

almacenada a 25 °C.. ............................................................................................ 42

Figura 6.3 Población de Salmonella y biopolímeros formados en papaya

almacenada a 25 °C.. ............................................................................................ 43

Figura 6.4 Micrografías electrónicas de barrido (x5000) de biopelículas de

Salmonella formadas en la superficie de papaya almacenada durante 72 h.. ...... 44

Figura 6.5. Efecto del secado en la viabilidad de células de Salmonella inoculadas

en papaya.............................................................................................................. 46

Figura 6.6. Reducción de la población de Salmonella (células libres y en biopelícula)

en papaya desinfectada. ....................................................................................... 47

Figura 6.7. Efecto de la aplicación de calentamiento óhmico sobre la población de

Salmonella en papaya (células libres y en biopelícula).. ....................................... 49

Figura 6.8 Efecto del calentamiento óhmico (55 °C) en combinación con

desinfectantes sobre la población de Salmonella en papaya (células libres y en

biopelícula).. .......................................................................................................... 51

Figura 6.9. Firmeza (N) de frutos de papaya después de tratamiento con

calentamiento óhmico almacenada a 17 °C durante 9 días.. ................................ 55

6

Figura 6.10. Papayas tratadas con calentamiento óhmico en combinación con

desinfectantes después del almacenamiento durante 9 días a 17 °C. .................. 57

7

1. INTRODUCCIÓN

México es el quinto productor de papaya en el mundo con alrededor de

836,370 toneladas producidas en el año 2017. El consumo de papaya ha

ocasionado problemas de seguridad alimentaria ya que durante su producción

puede contaminarse con bacterias patógenas en diferentes puntos a lo largo de las

etapas del cultivo y cosecha. Además, previo a su consumo se requiere

manipulación (pelado y cortado) por lo que está fácilmente expuesta a condiciones

medioambientales antihigiénicas que conllevan a la contaminación cruzada. Su

consumo se ha relacionado con brotes de Salmonella enterica en Australia (2006)

(Gibbs et al., 2009) y Estados Unidos (EE. UU.). Específicamente en este último, en

2011 se reportaron casos de salmonelosis provocados por S. Agona (CDC, 2011) y

más tarde en 2017 se reportó otro brote en donde estuvieron implicados nueve

serovares de Salmonella: Urbana, Newport, Infantis, Anatum, Thompson, Kiambu,

Agona, Gaminara, y Senftenberg. En estos brotes ocurridos en EE. UU. la fuente de

contaminación fueron papayas importadas de México (CDC, 2017).

Las estrategias para evitar la presencia de microorganismos patógenos en

frutos mínimamente procesados se enfocan en: 1) La prevención de la

contaminación durante su producción en el campo mediante la implementación de

Buenas Prácticas Agrícolas, y 2) La aplicación de tratamientos de descontaminación

(físicos o químicos) durante su procesamiento.

Los tratamientos físicos y químicos de descontaminación, como el uso de

luz ultravioleta (UV), radiación gamma, campos eléctricos pulsados y desinfectantes

químicos se han aplicado a frutos buscando eliminar la presencia de patógenos

como Escherichia coli O157:H7, Salmonella, Listeria monocytogenes y

Staphylococcus aureus. En el caso de los desinfectantes químicos se sabe que su

eficacia en frutas frescas se ve influenciada por varios factores como el tipo y la

concentración del desinfectante, el pH, la naturaleza de la superficie, la

internalización y la formación de biopelículas por el patógeno (Petri et al., 2015). Y

8

se sabe que la eficacia de los desinfectantes para eliminar completamente las

bacterias patógenas en productos frescos es baja (Huang et al., 2018).

La formación de biopelículas bacterianas en las superficies de los frutos

puede proporcionar un ambiente protector para los microorganismos patógenos,

reduciendo la eficacia de desinfectantes. Estas biopelículas se componen de

comunidades complejas de bacterias donde las células se encuentran embebidas

en una matriz autoproducida de sustancias poliméricas extracelulares (EPS, por sus

siglas en inglés), unidas entre ellas y adheridas a la superficie de los frutos (Yaron

et al., 2014). Las bacterias en las biopelículas son capaces de adaptarse

rápidamente a las condiciones ambientales cambiantes. Las EPS pueden

proporcionar una barrera física contra la difusión de agentes antimicrobianos y

ofrecer protección contra factores de estrés ambiental tales como radiación UV,

tensiones osmóticas y desecación (Coughlan et al., 2016). La capacidad de algunos

patógenos como Salmonella para formar biopelículas, representa un peligro ya que

una vez que la biopelícula se encuentra en el epicarpio del fruto fresco, puede

propiciar contaminación directa o cruzada a las superficies del equipo en la industria,

a otros frutos y a productos mínimamente procesados (Janssens et al., 2008).

Ante tal situación la implementación de nuevos métodos de

descontaminación efectivos durante el procesamiento de fruto es indispensable

para minimizar el riesgo de enfermar al consumidor. Tal es el caso del calentamiento

óhmico que se ha aplicado en jugos de frutas dando buenos resultados para la

inactivación de patógenos como E. coli, L. monocytogenes y Salmonella, además

de mantener la calidad nutricional y organoléptica del producto. Sin embargo, éste

no ha sido aplicado a frutas enteras.

En esta investigación se evaluó la eficacia de tratamientos de desinfección

química (cloro, ácido peracético y agua electrolizada neutra) y calentamiento óhmico

para inactivar células de Salmonella libres y en biopelículas formadas en la

superficie de papayas.

9

2. ANTECEDENTES

2.1 Papaya (Carica papaya L.).

2.1.1 Origen y descripción

El papayo (Carica papaya L.) pertenece a la familia Caricaceae, que incluye

35 especies colocadas en seis géneros. Es un arbusto frutal tropical semileñoso que

crece rápidamente, raramente se ramifica, con una fase juvenil corta de tres a ocho

meses. La papaya es la única especie del género Carica, siendo también la más

conocida y económicamente más importante dentro de la familia cultivándose

extensivamente en regiones tropicales y subtropicales alrededor del mundo (Ramos

et al., 2012). No hay evidencia arqueológica directa del centro de origen de la

papaya, pero la presencia de poblaciones naturales en México y Centroamérica y

su cultivo en México y Belice anteriores a los españoles sugieren un origen

mesoamericano (Vanburen et al., 2015). La fruta del papayo es una de las más

nutritivas de las 35 frutas comúnmente consumidas basándonos en el porcentaje de

la cantidad diaria recomendada de vitaminas A y C, folato, potasio, niacina, tiamina,

hierro, riboflavina, calcio y fibra. La papaya también se cultiva por su látex que

contiene la enzima proteolítica papaína utilizada para hidrolizar péptidos de cerveza,

ablandamiento de carnes y aplicaciones medicinales (Ming et al., 2007).

La clasificación taxonómica de la papaya es la siguiente (SIOVM, 2012):

REINO: Plantae

DIVISIÓN: Magnoliophyta

CLASE: Magnoliopsida

ORDEN: Violales

FAMILIA: Caricaceae

GÉNERO: Carica L., 1753

ESPECIE: Carica papaya L., 1753

10

2.1.2 Producción de papaya

En América, México es el segundo productor de papaya con alrededor de

836 370 toneladas cosechadas en el año 2017, y a nivel internacional ocupa el

quinto lugar (SIAP, 2017) (Tabla 1).

Tabla 1. Principales países productores de papaya en el mundo (miles de

toneladas).

País 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016

India 4,196 4,457.1 5,382 5,544 5,639.3 4,913 5,699

Brasil 1,871.9 1,854.3 1,517.6 1,582.6 1,603.3 1,481.1 1,424.6

Indonesia 675.8 958.2 906.3 909.8 840.1 851.4 904.2

Nigeria 750 760 775 800 850 870.8 836.7

México 616.2 634.3 712.9 764.5 836.3 883.5 951.9

(FAO, 2017)

Debido a que el papayo se reproduce por medio de semillas, se han

desarrollado un gran número de variedades. Entre las más conocidas a nivel

mundial se encuentran: ‘Solo’, ‘Bluestem’, ‘Graham’, ‘Betty’, ‘Fairchild’, ‘Rissimee’,

‘Puna’, ‘Hortusgred’, ‘Higgins’, ‘Wilder’, ‘Hortus’, ‘Gold’, ‘Petersen’, ‘Zapote’, ‘Pusa’,

y ‘Maradol’.

Por su importancia para nuestro país, destacan las siguientes variedades:

‘Maradol’: la fruta es alargada, cilíndrica, de gran tamaño, el color de su pulpa suele

ser anaranjado y puede llegar a pesar entre 1 y 3 Kg. ‘Solo’: esta variedad produce

frutos pequeños de forma aperada y de cuello corto, con pulpa color salmón y peso

entre los 400 y 800 g; se le conoce comúnmente como Hawaiana.

La papaya es cultivada en 19 entidades del país, siendo las cinco entidades

más importantes Oaxaca, Colima, Chiapas, Veracruz y Michoacán. En lo que se

11

refiere a las exportaciones de papaya la SAGARPA indicó que para el 2016

representaron ingresos de 92.8 millones de dólares, 38.9 % más que en el 2013

(SAGARPA, 2017).

2.1.3 Procesamiento de la papaya

La papaya se expende en los mercados generalmente como fruto entero,

previamente cosechadas, seleccionadas y lavadas. Además, en el mercado han

surgido varias presentaciones del fruto para su consumo: puré, mermeladas, jugos,

papaya deshidratada y fruta cortada mínimamente procesada. Por lo general, el

procesamiento mínimo de la papaya incluye: clasificación, limpieza antes del

procesamiento, lavado, pelado, corte en rodajas o cubos, uso de bajas

temperaturas, tratamientos químicos, y envasado, antes de ser comercializadas en

restaurantes, hoteles y público en general. Al ser un producto que se procesa

ligeramente mantiene un estado fresco conservando la mayor parte de los nutrientes

con él, por lo que el consumidor lo prefiere (Paull et al., 1997).

Adicionalmente, durante el procesamiento mínimo, las cáscaras, las

semillas y otras porciones no comestibles se eliminan. Por tanto, se reduce la carga

no deseada durante su transporte, lo que es importante en el comercio de

exportación para minimizar costos (Jayathunge et al., 2014).

2.2 Microorganismos presentes en papaya

2.2.1 Microbiota nativa y enfermedades

Se ha caracterizado la diversidad de bacterias endófitas en el mesocarpio y

semillas de variedades de papaya. Resultando que la variedad 'Red lady' posee

especies de Bacillus, Staphylococcus y Acinetobacter, la variedad 'Bangalore' tiene

especies de Bacillus y Kocuria y la variedad 'Solo' especies de Staphylococcus,

12

Acinetobacter, Bacillus y Enterobacter (Krishnan et al., 2012). También se ha

encontrado que el crecimiento de la papaya está amenazado por una enfermedad

viral causada por el virus de la papaya ringspot (PRSV) conocido comúnmente en

México como “virus de la mancha anular”. Éste es un miembro del género, Potyvirus,

y es transmitido por los áfidos (Wei et al., 2006). A principios del siglo XX se

identificaron especies del género Erwinia como patógenos en papaya; los síntomas

típicos que produce en los cultivares son manchas en las hojas que evolucionan en

lesiones foliares angulares (Gardan et al., 2004).

2.2.2 Microorganismos patógenos

Los productos frescos pueden contaminarse con bacterias patógenas a

través de diversas rutas en diferentes puntos a lo largo de las etapas del cultivo y

en la cosecha (Figura 2.1). Las fuentes de contaminación en el campo incluyen el

estiércol, el agua de riego, el suelo, la contaminación fecal, las semillas

contaminadas y el cambio climático. Los pasos posteriores a la cosecha, incluyendo

la recolección, el preenfriamiento, las operaciones de procesamiento, el lavado, la

desinfección y almacenamiento pueden conducir a contaminación con

microorganismos patógenos si no se utilizan adecuadamente de acuerdo con las

Buenas Prácticas de Manufactura (Ölmez, 2016).

13

Figura 2.1. Principales fuentes de contaminación de frutas y hortalizas. Fuente:

(Ölmez, 2016)

Se ha reportado la incidencia de microorganismos patógenos en la papaya.

Un estudio realizado en Calcuta en donde colectaron muestras de papayas frescas

cortadas (500 g) expendidas por vendedores ambulantes reveló que la fruta

contenía poblaciones elevadas de bacterias mesófilas aerobias y coliformes, y

detectaron la presencia de patógenos entéricos. De las treinta muestras de papaya

tomadas durante un período de 3 meses, 48 % resultó positivo para E. coli, 17 % a

S. aureus, 3 % a Salmonella y 3% a Vibrio cholerae (Mukhopadhyay et al., 2002).

Se ha demostrado que algunos microorganismos patógenos al hombre

tienen la capacidad de desarrollar en papaya cortada. E. coli O157: H7 y Salmonella

crecen rápidamente en papayas recién cortadas almacenadas a 25 °C, y sobreviven

14

durante la vida útil de las papayas cortadas mantenidas en refrigeración (4 °C)

(Strawn et al., 2010). E. coli O157: H7 puede crecer en jugo de papaya a 4 y 20 °C

(Yigeremu et al., 2001; Mutaku et al., 2005) . Penteado et al. (2004) encontraron

que la pulpa papaya es buen sustrato para la supervivencia y crecimiento de S.

Enteritidis a 10, 20 y 30 °C, y que la baja temperatura (10 °C) retrasa pero no inhibe

el crecimiento de esta bacteria. Varios estudios demostraron que L. monocytogenes

puede sobrevivir y crecer en la papaya recién cortada (Penteado et al., 2004a). Feng

et al. (2015), demostraron que S. aureus era capaz de crecer en mango, papaya y

piña cortados a 13 y 25 °C, y pudo sobrevivir durante la vida útil a 5 °C.

Estas investigaciones describen el potencial de supervivencia y crecimiento

de microorganismo patógenos en papayas, destacando la importancia de prevenir

su contaminación.

2.2.3 Brotes asociados al consumo de papaya

La papaya se consume principalmente como fruta fresca. Ahora bien, los

frutos recién cortados listos para consumo pueden ser fácilmente expuestos a

condiciones medioambientales antihigiénicas durante el procesamiento, como es en

el pelado y el corte, lo que conduce a la contaminación directa o cruzada con

bacterias patógenas del fruto mismo o del equipo. En todo el mundo, la proporción

de brotes de alimentos atribuidos a las frutas y hortalizas ha aumentado en los

últimos 20 años (Sharma et al., 2011). En 1996, se produjo un gran brote de

Salmonella en Singapur y por lo menos 116 trabajadores enfermaron. La cepa del

brote de Salmonella se aisló de varias frutas frescas cortadas, incluida la papaya

(Strawn et al., 2010). En 2003 en EE.UU. ocurrió un brote de salmonelosis en el que

estuvo implicada S. Saintpaul. En 2006 y 2007, 27 personas en los estados

australianos de Queensland y Australia Occidental se enfermaron al comer papayas

contaminadas con S. Litchfield (Gibbs et al., 2009). Asimismo, en 2011 se reportaron

un total de 106 casos de salmonelosis causados por S. Agona en los EE. UU. que

15

estuvieron relacionados con papayas importadas de México (CDC, 2011).

Recientemente, en julio de 2017 se presentó un brote multiestatal en EE.UU. de

infecciones causadas por nueve serovares de Salmonella: Urbana, Newport,

Infantis, Anatum, Thompson, Kiambu, Agona, Gaminara, y Senftenberg, en el cual

se reportó un total de 173 personas infectadas; la fuente de contaminación fueron

papayas de la variedad ‘Maradol’ nuevamente provenientes de México (CDC, 2017).

2.3 Métodos de control de microorganismos patógenos en frutas

El lavado se utiliza como método primario para reducir la materia orgánica

de los productos frescos. Sin embargo, el lavado y la desinfección pueden reducir

los niveles de patógenos, pero no garantizan su total eliminación. El grado de

reducción está influenciado por el antimicrobiano utilizado, las condiciones de

aplicación y el tipo de producto al que se aplique, entre otros (Foong-Cunningham

et al., 2012). En general, los métodos tradicionales de descontaminación de las

frutas y hortalizas frescas se pueden clasificar en: a) tratamientos físicos y b)

tratamientos químicos.

2.3.1 Tratamientos físicos

Se refieren a los métodos que hacen uso de calor, presión, irradiación, entre

otros, para reducir los microorganismos patógenos en los alimentos (Krasaekoopt y

Bhandari, 2010).

a) Luz ultravioleta (UV).

La luz UV es un tipo de radiación no ionizante con una longitud de onda que

oscila entre 100 nm y 400 nm, que normalmente se clasifica en tres tipos: UV-A

(315-400 nm), UV-B (280-315 nm) y UV-C (100-280 nm) (González-Aguilar et al.,

2010). El mecanismo generalmente reconocido de inactivación microbiana se

16

atribuye principalmente al daño directo producido en el ADN de los

microorganismos. La luz UV induce la formación de fotoproductos de ADN que

inhiben la transcripción y la replicación y conducen finalmente a mutagénesis y a

muerte celular. Su pobre poder de penetración limita su aplicación en el campo de

los alimentos (Liang et al., 2017).

Esta tecnología se ha aplicado en el melón, el mango, la manzana, la sandía

y la papaya recién cortados para prolongar su vida útil (Corbo et al., 2010). También

se ha reportado su efecto descontaminante sobre microorganismos patógenos.

Yaun et al. (2004) aplicaron luz UV-C a las superficies de manzanas ‘Red Delicious’

inoculadas con E. coli O157:H7, y lograron reducir aproximadamente 3.3 Log

UFC/g. Se ha reportado su eficacia contra S. Poona y L. monocytogenes inoculadas

en papaya recién cortada (Raybaudi-Massilia et al., 2013).

b) Radiación gamma.

La irradiación de alimentos convencional y de uso más frecuente se refiere

principalmente a la exposición a radioisótopos de cobalto-60 (o muy poco frecuente

de cesio-137) (Farkas et al., 2011). Durante la exposición del alimento al campo de

irradiación, se debe medir la cantidad de energía absorbida (en Gray o kiloGray

(kGy) para establecer el procedimiento correcto (Pinela et al., 2017). La irradiación

causa una modificación mínima en el sabor, el color, los nutrientes y otros atributos

de calidad de los alimentos.

En mangos la aplicación de dosis bajas de radiaciones gamma (0.25, 0.35

y 0.45 kGy) fue eficiente para la eliminación de un hongo (Lasiodiplodia theobromae)

(Santos et al., 2015). Además, la radiación gamma logró una reducción de 1 Log de

bacterias mesófilas en frambuesas (Cabo Verde et al., 2013).

c) Altas presiones hidrostáticas.

17

Las altas presiones hidrostáticas constituyen una tecnología en la cual se

somete a alimentos líquidos o sólidos, con o sin embalaje, a presiones entre 100 y

800 MPa (Castro y Saraiva, 2014). Ésta destruye los patógenos transmitidos por los

alimentos e inactiva enzimas, no conduce a una modificación sustancial de las

propiedades nutricionales, funcionales y organolépticas de los alimentos y aumenta

la vida útil de frutas y verduras frescas mínimamente procesadas (Pinela et al.,

2017). Se ha reportado su eficacia en la inactivación de S. Poona, S. Newport, S.

Stanley y L. monocytogenes en puré de melón (Mukhopadhyay et al., 2016).

d) Campos eléctricos pulsados.

La tecnología de campos eléctricos pulsados (CEP) implica la aplicación de

pulsos de alto voltaje (típicamente de 20 a 80 kV/cm) a alimentos colocados entre

dos electrodos. La intensidad del campo se consigue almacenando energía en una

batería de condensadores a partir de una fuente de alimentación, la cual es

descargada en forma de impulsos de alta tensión (Ramaswamy et al., 2005). Los

CEP mantienen la calidad de los alimentos reduciendo los cambios perjudiciales en

las propiedades sensoriales y físicas. Se ha demostrado que su aplicación induce

un aumento en la permeabilidad en la membrana citoplasmática de los

microorganismos que conlleva a su muerte (Saldaña et al., 2011).

Se ha logrado la descontaminación efectiva utilizando CEP de un batido de

frutas tropicales a base de piña, plátano y leche de coco inoculado con E. coli K12

(Walkling-Ribeiro et al., 2008). También se ha reportado la inactivación de S. aureus

y L. monocytogenes con este procedimiento (Saldaña et al., 2011).

Kim et al. (2017) demostraron el efecto antibacteriano de diodos emisores

de luz de 405 ± 5 nm (LED) contra varios serovares de Salmonella (Typhimurium,

Saintpaul, Newport y Agona) en papaya recién cortada.

Existen otras tecnologías que están en desarrollo como el calentamiento

óhmico. Estas nuevas herramientas aplicadas a la industria de productos frescos

18

están enfocadas en prolongar la vida útil y asegurar la inocuidad de los alimentos

sin comprometer las cualidades sensoriales y nutricionales.

2.3.1.1 Calentamiento óhmico para la inactivación bacteriana

El calentamiento óhmico es una técnica innovadora en la cual el alimento

se comporta como una resistencia eléctrica cuando se coloca entre dos electrodos

y una corriente eléctrica alterna se pasa a través de él. Debido a la resistencia

eléctrica, se genera calor a través de los alimentos lo que causa un incremento de

temperatura. La generación de calor tiene lugar de forma volumétrica (Marcotte et

al., 2010).

El calentamiento óhmico no sólo puede evitar las limitaciones de la

calefacción convencional, sino también puede mejorar la inactivación de los agentes

patógenos en los alimentos debido a los efectos combinados de calor y electricidad

(Park et al., 2013). Ya se ha demostrado que el calentamiento óhmico es eficaz para

inactivar S. Typhimurium, L. monocytogenes y E. coli O157:H7 en alimentos

líquidos, como jugo de naranja, jugo de tomate y jugo de manzana (Lee et al., 2012;

Park et al., 2013). Esta tecnología proporciona un calentamiento rápido y uniforme

con cambios estructurales, nutricionales y organolépticos mínimos en el alimento

(Lee et al., 2012).

El calentamiento óhmico se ha probado también en pulpa de papaya

utilizando dos electrodos de acero inoxidable (SS 316) separados 3 cm, a tres

gradientes de voltaje (6.66, 13.33 y 20 V/cm) y tiempos (1, 2 y 3 min). Siendo el

gradiente de voltaje de 13.33 V/cm por 2 min el más efectivo para la pasteurización

de la pulpa de papaya. Se comparó la pulpa tratada con pulpa no tratada. La pulpa

que recibió tratamiento, retenía 86.4 % de licopeno, 87.1 % de β-caroteno y 85.2 %

de ácido ascórbico además de que no hubo ningún daño estructural (Gomathy et

al., 2015).

19

2.3.2 Tratamientos químicos.

Se han utilizado diversos compuestos químicos para reducir las poblaciones

bacterianas en las frutas frescas ya sea antes del procesamiento o durante las

operaciones de pre y poscosecha (Corbo et al., 2010).

a) Cloro.

El cloro es un tratamiento común de descontaminación para productos

frescos a niveles de 50 a 200 ppm y a un pH de 6.0 a 7.5, con un tiempo de contacto

de 1 a 2 minutos. Diversos estudios han descrito la eficacia del cloro, sin embargo,

en presencia de materia orgánica en el agua, éste puede inactivarse y crear

subproductos nocivos para el medio ambiente y la salud (Foong-Cunningham et al.,

2012). Vadlamudi et al. (2012), reportaron la eficacia del cloro en la inactivación de

S. Poona en melones. El tratamiento con cloro ha logrado también inactivar E. coli

O157:H7 en superficie de naranja (Yoo et al., 2015).

b) Ácido peracético.

Se ha aplicado el ácido peroxiacético para lograr la desinfección de lechuga

cortada e inoculada con L. monocytogenes (Beuchat et al., 2004). También se ha

usado para eliminar la microbiota nativa de verduras recién cortadas como

zanahorias ralladas, col blanca y puerro (Vandekinderen et al., 2009; Lee et al.,

2014). Asimismo, se ha evaluado su eficacia en la inactivación de E. coli O157:H7

sobre lechuga fresca y zanahorias (Petri et al., 2015).

c) Agua electrolizada.

El agua electrolizada ácida (AEA) se produce al pasar una solución de sal

diluida (el cloruro de sodio y el cloruro de potasio se utilizan con mayor frecuencia)

a través de una célula electrolítica, dentro de la cual el ánodo y el cátodo están

separados por una membrana. En el lado anódico de la célula electrolítica se

20

obtiene el AEA y varios compuestos de cloro e iones tales como HOCl, OCl- y Cl2

gas (Gil et al., 2015).

El AEA ofrece la capacidad potencial de inactivar microorganismos con

mínimos efectos negativos sobre la salud humana y la calidad organoléptica y

nutricional de los alimentos. El AEA se ha utilizado como una alternativa a la

descontaminación con cloro con el propósito de garantizar la inocuidad y prolongar

la vida útil de las frutas y hortalizas frescas (Park et al., 2009).

Rahman et al. (2010) reportaron una reducción mayor de microorganismos

indicadores (mesófilos aerobios, mohos y levaduras) y patógenos (E. coli O157:H7

y L. monocytogenes) en espinacas frescas cortadas cuando aplicaron agua

electrolizada ligeramente ácida en comparación con las tratadas con agua

desionizada, ozono acuoso ó hipoclorito de sodio (NaOCl).

Una variante es el agua electrolizada neutra (AEN). El AEN se genera como

AEA, pero parte del producto formado en el ánodo es entonces redirigido a la

cámara del cátodo, dando lugar a una solución neutra (pH 8.0 ± 0.5) (Abadias et al.,

2008). Los resultados de los estudios actuales han mostrado una perspectiva

prometedora del uso de AEN en industrias de frutos recién cortados. El éxito

bactericida del AEN se debe principalmente a su alto potencial de oxidoreducción

junto con la presencia de cloro libre disponible y una acción de tipo surfactante

causada por la presencia de grupos OH libres (Monnin et al., 2015). El brócoli recién

cortado tratado con AEN mostró mejor retención de compuestos bioactivos

(capacidad antioxidante, fenoles y enzimas antioxidantes) que el tratado con NaClO

(Graça et al., 2011).

2.3.3 Factores que afectan la eficacia de los tratamientos de descontaminación

Entre los factores que afectan la eficacia de los tratamientos de

descontaminación se encuentran la dosis aplicada, el tiempo de exposición, la

21

humedad relativa (HR) y la temperatura (Netramai et al., 2016). Por otro lado, la

adhesión de las células bacterianas a sitios inaccesibles, como estomas y cavidades

de las hojas y frutos, provoca ineficacia de los tratamientos de desinfección ya que

pueden no tener acceso a los patógenos y además éstos pueden presentar

resistencia debido al estrés oxidativo y capacidad mejorada de reparación del ADN,

lo que representa otro reto para la industria de corte fresco (Ölmez, 2016).

Otros factores importantes que influyen en la capacidad de inactivación de

los desinfectantes incluyen:

1. La materia orgánica. El aumento de esta puede reducir la eficacia de

ciertos tratamientos antimicrobianos. Por ejemplo, en el caso de la

aplicación de cloro para mantener los niveles de cloro activo, debe

agregarse continuamente al agua para reemplazar el cloro perdido por

reacciones con la materia orgánica, iones y microorganismos (Foong-

Cunningham et al., 2012; Sharma et al., 2011).

2. El tiempo de contacto del tratamiento antimicrobiano. Tiempos de

aplicación más largos suelen dar como resultado tasas de muerte más

altas (Zhou et al., 2015).

3. Naturaleza de la superficie. Estudios han demostrado que la topografía

superficial y la hidrofobicidad de los frutos afectan significativamente la

eficacia de los desinfectantes sobre la remoción e inactivación de

patógenos (Wang et al., 2009).

4. El tipo de microorganismo. La presencia de biopelículas y de agregados

bacterianos en la superficie de los frutos y de las hojas puede permitirles

persistir durante más tiempo o protegerse de los desinfectantes (Behnke

et al., 2012; Netramai et al., 2016).

2.4 Biopelículas bacterianas

22

Las biopelículas son comunidades complejas de microorganismos en las

que las células se encuentran unidas a una superficie y entre ellas, y a su vez están

incrustadas en una matriz autoproducida de sustancias poliméricas extracelulares

(EPS) (Yaron et al., 2014). Éstas pueden estar formados por una sola o múltiples

especies bacterianas, como una sola capa o estructuras tridimensionales (Amrutha

et al., 2017).

2.4.1 Formación de biopelículas bacterianas

La formación de biopelículas se produce en cinco etapas: el desarrollo de

una película acondicionadora, la adhesión de células bacterianas, la producción de

polímeros extracelulares por las células adheridas, la maduración y dispersión de la

biopelícula (Figura 2.2). Las bacterias formadoras de biopelículas poseen apéndices

para anclarse y moverse a través de un líquido. Los flagelos les sirven para fijarse

a una superficie apropiada y también permiten la motilidad del microorganismo (Van

Houdt et al., 2010). Se cree que la etapa de adhesión celular bacteriana es

reversible debido a interacciones débiles entre la célula bacteriana y la superficie

sólida. En esta etapa, las bacterias se pueden eliminar fácilmente lavando

suavemente (Hall-Stoodley et al., 2004).

23

Figura 2.2. Etapas de la formación de biopelículas bacterianas.

Fuente: (Coughlan et al., 2016)

Una vez unidas, las bacterias proceden a colonizar la superficie a través de

la formación de agregados celulares conocidos como microcolonias. Bajo

condiciones ambientales permisivas, las microcolonias forman estructuras

dinámicas bidimensionales a medida que aumenta el número de células. Este

armazón madura adicionalmente en una arquitectura definida con células

dispuestas en estructuras simples o elaboradas que son adecuadas para prosperar

en su entorno particular (Coughlan et al., 2016).

Posteriormente, la adhesión de las células bacterianas se vuelve irreversible

debido a la adherencia intracelular por apéndices y la producción de EPS (Hall-

Stoodley et al., 2004). La formación de la biopelícula madura incluye monocapas

planas, estructuras tridimensionales “tipo hongo” o “tulipán” y canales de agua

intermedios para el intercambio de nutrientes y residuos (Jahid et al., 2012).

24

La etapa final en el ciclo de vida de la biopelícula implica el retorno de un

número de células adheridas al entorno circundante. Las células desprendidas

vuelven a su estado planctónico y dejan la biopelícula en respuesta a las señales

celulares (animándolas a buscar un sitio adicional cuando las condiciones sean

favorables). El desprendimiento se produce como resultado de cambios

ambientales, como la disponibilidad de nutrientes, el movimiento del líquido

circundante, erosión de partes de la biopelícula por uso de químicos o fuerza, entre

otros (Kaplan, 2010).

Una amplia gama de tamaños de cúmulos se separa de la biopelícula, de

células individuales a grandes grupos que contienen más de 1000 células, las

proporciones son dependientes de las especies que la componen y las condiciones

de crecimiento de la biopelícula (Behnke et al., 2011). Los grupos aislados pueden

comportarse de forma similar a los de la biopelícula cuando se exponen a

desinfectantes, especialmente poco después del desprendimiento (Rollet et al.,

2009).

2.4.2 Composición de las biopelículas

Las EPS pueden estar compuestas de polisacáridos, proteínas, lípidos,

ADN extracelular, células bacterianas muertas y otras sustancias poliméricas

hidratadas con 85 – 95 % de agua dependiendo del tipo de bacteria en la biopelícula.

Las funciones que tienen los EPS en la biopelícula son: ofrecer estabilidad

estructural y protección (Hall-Stoodley et al., 2004), mantener las células juntas y

también pueden agotar reactivamente los productos químicos descontaminantes y

retardar su difusión a las células (contribuyendo a la resistencia) (Behnke et al.,

2012), concentrar los nutrientes del medio ambiente circundante dentro de la

biopelícula, y evitan la desecación de la misma (Coughlan et al., 2016).

25

La matriz de EPS puede cambiar con respecto a las propiedades de difusión

o la viscosidad debido a la presencia de varias especies en la biopelícula causada

por un cambio en los patrones de expresión génica. Otros mecanismos que se han

observado en las biopelículas multiespecies son la transferencia conjugativa de los

factores de tolerancia y la protección entre especie a través de la estrecha

asociación espacial (Ghigo, 2001).

La expresión de las células que forman la biopelícula está bajo el control de

un sistema de regulación genética global que responde a fluctuaciones en la

densidad de población, conocido como detección del quorum (Fuqua et al., 1994).

Se ha descubierto que la detección del quorum es un factor clave en la formación

de la biopelícula por patógenos transmitidos por los alimentos. Smith et al. (2004)

señalan que en este sistema las células bacterianas interactúan entre ellas de tal

manera que se benefician entre toda la población de la biopelícula. Además de que

la señalización célula a célula incrementa la transcripción de genes responsables

de la supervivencia al estrés oxidativo, alterando la composición y la viscosidad de

las EPS, o influyendo en la arquitectura de la biopelícula y la distribución espacial

de diferentes cepas (Burmølle et al., 2006).

2.4.3 Resistencia adquirida en células inmersas en biopelículas

Las bacterias presentes en una biopelícula muestran hasta 1000 veces

mayor tolerancia a los antibióticos y biocidas que sus homólogos planctónicos (Ceri

et al., 1999). Estudios han demostrado que las bacterias en las biopelículas son

capaces de adaptarse a las condiciones ambientales cambiantes de una manera

rápida tanto a nivel fenotípico y genotípico (Amrutha et al., 2017).

Se ha demostrado que las células de biopelícula expresan perfiles proteicos

diferentes que las células planctónicas y también muestran diferentes tasas de

crecimiento como resultado de la disponibilidad limitada de nutrientes y oxígeno que

26

pueden hacerlos más tolerantes (Walters et al., 2003; Rani et al., 2007). Las EPS

pueden proporcionar una barrera física contra la difusión de agentes

antimicrobianos y compuestos de la respuesta de defensa y ofrecen protección

contra factores de estrés ambiental tales como radiación UV, tensiones osmóticas

y desecación (Yaron et al., 2014).

Se ha demostrado el crecimiento de L. monocytogenes en una biopelícula,

con desarrollo de resistencia al hipoclorito de sodio (Norwood et al., 2000). Además,

se estima que el 99.9 % de las bacterias en la naturaleza están unidas a una

superficie en forma de biopelícula (Murphy et al., 2002)

2.4.4 Formación de biopelículas en frutas

Durante el crecimiento y maduración de las frutas y hortalizas, así como

durante su cosecha, transporte, procesamiento y almacenamiento, surgen

oportunidades para el desarrollo de biopelículas en su superficie. La capacidad de

formación de biopelículas de patógenos bacterianos está altamente correlacionada

con la fuerza de adherencia y la persistencia en la superficie del producto fresco

(Beuchat, 2002). La capacidad de algunos patógenos como Salmonella para formar

biopelículas, representa un peligro ya que el desprendimiento de células que se

encuentren inmersas en estas estructuras puede ser de manera intermitente y llegar

a contaminar otros productos frescos y superficies de equipos en la industria

(Murphy et al., 2002).

27

3. JUSTIFICACIÓN

México es el quinto productor de papaya en el mundo, y su venta es una

fuente importante de divisas. Desafortunadamente las papayas producidas en

nuestro país y exportadas a EE. UU. han sido implicadas en brotes de salmonelosis.

Esta situación coloca a las papayas como un fruto de riesgo a los consumidores.

Escasa es la información que existe con relación a la eficacia del uso de

desinfectantes comúnmente usados en la industria de alimentos para inactivar a

Salmonella en la papaya. Sin embargo, evaluaciones realizadas en otros frutos

revelan que la desinfección química no logra la completa inactivación del patógeno.

Uno de los factores que puede influir en la eficacia de los desinfectantes es la

formación de biopelículas bacterianas sobre los frutos, ya que pueden servir como

sitios protectores para los microorganismos patógenos, y generar un microambiente

en el cual las células inmersas en él pueden adquirir resistencia ante los agentes

químicos.

Ante esta situación, es necesario investigar la aplicación de nuevos

métodos de descontaminación que garanticen la inocuidad y que no afecten la

calidad del fruto entero o mínimamente procesado. El uso de desinfectantes como

el agua electrolizada, el ácido peracético, y la aplicación de nuevas tecnologías

como el calentamiento óhmico, pueden ser una buena alternativa para reducir el

riesgo de enfermedad asociado al consumo de papaya.

28

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo General

Evaluar la efectividad de tratamientos de descontaminación químicos y

calentamiento óhmico sobre células libres y en biopelículas de S. enterica

inoculadas en papaya.

4.2 Objetivos específicos

1. Evaluar la capacidad de S. enterica para formar biopelículas sobre la

superficie de papayas.

2. Determinar la eficacia de tratamientos químicos para inactivar células libres

y en biopelícula de S. enterica inoculadas en papaya.

3. Determinar la eficacia del calentamiento óhmico para inactivar células libres

y en biopelícula de S. enterica inoculadas en papaya cuando se aplica

individualmente y en combinación con desinfectantes.

4. Evaluar el efecto del tratamiento con calentamiento óhmico en la calidad de

la papaya durante su almacenamiento.

29

5. METODOLOGÍA

5.1 Materiales

5.1.1 Equipos

Agitador mecánico, Vortex-Genie

Autoclave eléctrica de mesa, Market Forge

Balanza analítica digital, Precisa

Campana de flujo laminar, Veco

Centrifuga de mesa, Heraeus

Cuenta colonias, Reichert

Homogenizador de alimentos, Stomacher BagMixer

Incubadoras con refrigeración, Presicion ThermoScientific

Medidor de actividad de agua, AquaLab

Microscopio electrónico de barrido, EVO-50 Carl Zeiss

Potenciómetro, Jenway

Refrigerador, Velp Scientifica

Termo baño, Riossa

Texturómetro CT3 Texture Analyzer, Brookfield

Ultracongelador, REVCO, Thermo Scientific

Ultracentrífuga, Dynamica

5.1.2 Medios de cultivo

30

Agar xilosa lisina desoxicolato de sodio (XLD), BD Bioxon

Agar lisina descarboxilasa, Difco

Agar soya tripticaseína (AST), Dibico

Agar sulfito bismuto (SB), BD Bioxon

Agar triple hierro azúcar (TSI), Difco

Caldo neutralizante (CN), Difco

Caldo tetrationato, BD Bioxon

Caldo Rappaport Vassiliadis, BD Bioxon

Caldo soya tripticaseína (CST), BD Bioxon, Dibico

Caldo urea, BD Bioxon

Diluyente de peptona 0.1% (DP), BD Bioxon, Dibico

Medio rappaport – vassiliadis, Difco

Medio tetrationato, Difco

Peptona de caseína, BD Bioxon

5.1.3 Soluciones

Agua activada, Desy

Ácido peracético, Saniper 20

Solución salina isotónica (NaCl 0.85%)

Rifampicina (200 ppm)

31

5.1.4 Reactivos

Ácido acético glacial, Meyer

Ácido sulfúrico, Jalmek

Alcohol etílico, Golden Bell

Alcohol metílico, Golden Bell

Almidón, J.T. Baker

Antisuero polivalente (Poli A – I & Vi), Difco

Cacodilato de sodio 0.2 M

Cloro, Zeux

Cristal violeta, Hycel

Glutaraldehído al 3%

Permanganato de potasio, J.T. Baker

Sulfato de potasio, Golden Bell

Tetróxido de osmio al 1%

Yoduro de potasio, Golden Bell

5.2 Material biológico

5.2.1 Papayas

Las papayas cultivar ‘Maradol’ se adquirieron de mercados locales de la

ciudad de Querétaro, Qro.

32

5.2.2 Cepas bacterianas

Se empleó una mezcla de cinco cepas de S. enterica (S. Enteritidis ATCC

13076, S. Typhimurium ATCC 23595, S. Typhimurium ATCC 14028, S. Thompson

ATCC 8391, S. Montevideo ATCC 8387) del cepario del Laboratorio para la

Evaluación y Control de Riesgos Microbianos en Alimentos (LECRIMA) de la

Universidad Autónoma de Querétaro. Se indujo resistencia a rifampicina a las cepas

utilizadas de acuerdo al método señalado por Kaspar y Tamplin (1993).

5.3 Métodos

5.3.1 Formación de biopelículas de Salmonella sobre la superficie de papayas.

5.3.1.1 Activación de las cepas y preparación del inóculo

Cien µL de cada uno de los cultivos puros de las 5 cepas de Salmonella se

inocularon por separado en 3 mL de caldo CST a 37 °C por 24 h. Posteriormente se

hizo una transferencia a CST utilizando 100 µL del cultivo anterior e inoculando en

3 mL de CST; se incubó a 37 °C por 18 h. Después de la incubación, los cultivos se

lavaron centrifugando 1 mL de cada cultivo a 15 000 rpm por 2 min, se removió el

sobrenadante y las células se resuspendieron al mismo volumen de solución salina

isotónica (SSI), las suspensiones se homogenizaron y se centrifugaron

nuevamente; el procedimiento se repitió dos veces. Finalmente, se retiró el

sobrenadante y se resuspendió el paquete celular en SSI. Se tomó un mL de cada

cepa y se mezclaron en un tubo estéril. A partir de esta suspensión bacteriana se

prepararon diluciones decimales en agua destilada estéril (ADE) y se realizó el

recuento mediante la técnica de extensión en superficie en placas de AST

adicionado de rifampicina (200 ppm). Las placas se incubaron a 35 °C por 24 h.

33

5.3.1.2 Preparación del epicarpio de papaya

Las papayas se seleccionaron considerando a aquellas con características

similares de peso, tamaño, madurez, color y ausencia de daño mecánico. Se

lavaron con agua corriente antes de la inoculación, y se secaron a 22 ºC durante 50

min en campana de flujo laminar.

5.3.1.3 Formación de las biopelículas

Se inocularon por goteo 50 µL de la suspensión de Salmonella (~1 x 105

UFC/mL) sobre 3 cuadrados de 3 x 3 cm marcados en la superficie de la fruta. Las

papayas inoculadas se colocaron en contenedores de plástico con cierre hermético

a una humedad relativa (HR) de 97 % ajustada mediante la adición de una solución

saturada de sales de sulfato de potasio (Speranza et al., 2017), se incubaron a 25

°C y 30 °C durante 72 h. Se tomaron muestras periódicamente a las 0, 24, 48 y 72

h, para lo cual se cortó la porción inoculada de la papaya. En cada uno de ellos se

realizó: 1) recuento de la población; 2) cuantificación de biopolímeros; 3) y

microscopia electrónica de barrido (SEM).

5.3.1.3.1 Cinética de crecimiento de Salmonella enterica

Las células se recuperaron cortando la superficie marcada del fruto con un

bisturí estéril. La porción de papaya de 1 g se colocó en una bolsa de polietileno con

9 mL de DP y se homogenizó en un homogenizador mecánico por un min. A partir

del homogenizado se prepararon diluciones decimales en DP y el recuento de la

población de Salmonella se llevó a cabo en AST suplementado con rifampicina (200

ppm), empleando la técnica de extensión en superficie. Las placas se incubaron a

35 °C durante 24 h.

34

5.3.1.3.2 Cuantificación de biopolímeros.

Una porción de papaya inoculada se frotó con un hisopo humedecido con

SSI, se colocó en un tubo estéril con 2 mL de SSI y se agitó durante un min en

agitador mecánico. Posteriormente se retiró el hisopo y al sobrenadante, se agregó

metanol (2 mL), se dejó reposar por 15 min; se descartó el líquido y se añadieron 2

mL de cristal violeta al 0.1 % dejando en reposo 5 min. Se lavó dos veces con 2 mL

de ADE y se agregaron 2 mL de ácido acético glacial al 99.7 %; finalmente se

transfirieron alícuotas de 200 µL a una placa de 96 pocillos de fondo plano

transparente y se midió la densidad óptica a 595 nm por espectrofotometría (Coffey

et al., 2014).

5.3.1.3.3 Microscopía electrónica de barrido.

Las muestras destinadas a la observación de la formación de las biopelículas

se prepararon retirando secciones (1 x 1 cm x 1 mm) del epicarpio de la papaya y a

continuación se siguió el procedimiento descrito por Hernández-Iturriaga et al.

(2007) con algunas modificaciones. Las muestras se fijaron durante 4 h en

glutaraldehído al 3%, seguido de un lavado durante toda la noche con solución

amortiguadora de cacodilato de sodio 0.2 M, posteriormente se trató con tetróxido

de osmio al 1% durante 2 h y finalmente se lavó dos veces con solución

amortiguadora de cacodilato de sodio 0.2 M durante 15 min. Los tejidos fijados se

deshidrataron en una serie graduada de dos pasos de concentraciones de etanol a

4 ºC. Después de la deshidratación, los tejidos se secaron a punto crítico, se

montaron, se revistieron con oro y se examinaron con un microscopio electrónico

de barrido (EVO-50 Carl Zeiss).

Se seleccionaron los niveles de temperatura y tiempo que generaron la mayor

población y cantidad de biopolímeros de Salmonella para continuar con los

experimentos sucesivos.

35

5.3.2 Evaluación de la eficacia de tratamientos de desinfección para inactivar

células de Salmonella libres y en biopelícula formadas en papaya

5.3.2.1 Inoculación de la papaya

a) Células libres:

Papayas enteras y lavadas (descrito en el apartado 5.3.1.2) se inocularon por

goteo con 50 µL de la suspensión bacteriana de Salmonella (gotas de 10 µL de cada

una) a una concentración final de aproximadamente 106 UFC/mL. Los frutos

inoculados se secaron durante 50 min en una campana de bioseguridad.

b) Células en biopelícula:

Se emplearon las papayas anteriormente inoculadas en donde se formaron

previamente las biopelículas de Salmonella, almacenamiento durante 48 h a 25 °C

(apartado 5.3.1.3.).

5.3.2.2 Aplicación de los tratamientos de desinfección química

El día del experimento se prepararon las soluciones desinfectantes

empleando agua destilada estéril: hipoclorito de sodio (200 ppm), ácido peracético

(80 ppm), y agua electrolizada neutra (AEN) (50 ppm). Los desinfectantes se

distribuyeron en bolsas estériles (100 mL) y su concentración se verificó mediante

los métodos descritos en los Anexos A y B. Las papayas inoculadas con células

libres y en las que se formaron las biopelículas, se sumergieron por separado en las

soluciones desinfectantes y agua estéril (control) durante 5 min. Finalizado el tiempo

de exposición las papayas se removieron de las soluciones germicidas y se

neutralizaron con caldo neutralizante.

36

5.3.2.3 Aplicación de calentamiento óhmico

El experimento se llevó a cabo a escala de laboratorio utilizando un sistema

de calentamiento óhmico especialmente diseñado para líquidos. El prototipo de

calentamiento óhmico fue manufacturado en el Centro de Investigación de Ciencias

Aplicadas y Tecnología Avanzada (CICATA) del Instituto Politécnico Nacional,

campus Querétaro. El sistema consta de una celda de acrílico (20 cm3) la cual esta

provista de dos electrodos de acero inoxidable (20 x 20 cm) por los que se hace

pasar corriente eléctrica. La temperatura se midió con una sonda termopar tipo T de

acero inoxidable aislada con vidrio y conectada a un medidor de temperatura (Digi-

Sense) (Figura 5.1). El sistema de calentamiento óhmico posee un transformador

variable que permite aplicar diferentes campos de fuerza eléctrica. Las papayas

inoculadas con células libres y en las que se formó la biopelícula, previamente

descrito en el apartado 5.3.2.1., se colocaron en la celda del equipo la cual contenía

agua como líquido conductor. Se aplicó voltaje de 15 V/cm a una temperatura de 55

°C y 65 °C durante 60 s y 90 s (Park et al., 2013).

Figura 5.1. Diagrama del sistema de calentamiento óhmico

37

5.3.2.4 Aplicación de calentamiento óhmico en combinación con soluciones

desinfectantes

Las papayas inoculadas y en las que se formó la biopelícula, previamente

descrito en el apartado 5.3.2.1., se trataron con calentamiento óhmico en

combinación con soluciones desinfectantes: hipoclorito de sodio 200 ppm, ácido

peracético 80 ppm y AEN 50 ppm. Las papayas se colocaron en la celda del equipo

de medidas 20 x 20 cm, la cual esta provista de dos electrodos de acero inoxidable

por los que se hace pasar corriente eléctrica. El líquido conductor fueron las

soluciones desinfectantes anteriormente mencionadas. Se aplicó voltaje de 15

V/cm. Los tratamientos se llevaron a cabo a 55 °C y 65 °C durante 60 s.

5.3.2.4.1 Cuantificación de células sobrevivientes.

Se cuantificaron las células de Salmonella en la papaya antes del secado,

después del secado, y después de la aplicación de los tratamientos con los

desinfectantes, con calentamiento óhmico y su combinación. Para ello, se cortó

asépticamente el epicarpio de la papaya inoculada (1 g) y se colocó en una bolsa

de polietileno, a la cual se le adicionaron 9 mL de caldo neutralizante (tratamientos

con desinfectantes) y 9 mL de diluyente de peptona (antes del secado, después del

secado y tratamientos con calentamiento óhmico). Las muestras se homogenizaron

empleando un homogenizador mecánico a velocidad media durante 1 min.

Posteriormente se realizaron las respectivas diluciones decimales en ADE, y se

llevó a cabo el recuento en ASTR mediante la técnica de vaciado en placa. Las

placas fueron incubadas a 35 °C por 24 h.

5.3.2.5 Vida de anaquel del fruto después de tratamientos con calentamiento

óhmico

38

Las papayas tratadas (55 y 65 °C por 60 s) y un control (no tratado) se

almacenaron durante nueve días a 17 °C. Se tomaron mediciones de la firmeza de

la papaya en los días 1, 5 y 9. Además, se realizó el conteo de hongos después de

los tratamientos con calentamiento óhmico.

a) Determinación de la firmeza en papaya entera

Las mediciones se tomaron de la parte central del fruto (ecuador) mediante

ensayo de penetración utilizando una sonda de 3 mm de diámetro empleando un

texturómetro. Se registró la fuerza de oposición del tejido a la penetración (7 mm de

longitud) de la sonda insertada a una velocidad de 5.3 mm/s. Los resultados se

expresaron en Newtons (N). El experimento se realizó tres veces y en cada

repetición se analizaron tres muestras.

b) Cuantificación de hongos

Se cortó una porción de papaya (1 g) y se colocó en una bolsa de polietileno,

a la cual se le adicionaron 9 mL de DP. Las muestras se homogenizaron empleando

un homogenizador mecánico durante un min. Posteriormente se hicieron las

respectivas diluciones decimales en DP y se colocó por duplicado en cajas Petri 1

mL de la dilución primaria. El procedimiento se repitió con las dos diluciones

decimales siguientes. A las placas con las alícuotas se les vertió agar papa dextrosa

acidificado (15 - 20 mL). Las placas fueron incubadas a 25 °C por cinco días.

5.3.3 Diseño experimental y análisis estadístico

Se empleó un diseño experimental unifactorial completamente al azar, donde

la unidad experimental representa una porción de 3 x 3 cm de la superficie de la

papaya y las variables de respuesta fueron las células sobrevivientes (Log UFC/cm²)

y la densidad óptica. Para los experimentos de vida de anaquel la unidad

experimental representa una papaya y las variables respuesta fueron la firmeza (N)

39

y el conteo de hongos (UFC/g). Los resultados se expresaron como la media ± la

desviación estándar. Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado y los

datos se analizaron por medio de un análisis de varianza y prueba de medias de

Tukey (p = 0.05) usando el programa estadístico JMP versión 8.0.

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 Capacidad de Salmonella para formar biopelículas en el epicarpio de papaya

La población de Salmonella inoculada en el epicarpio de papaya almacenada

a 25 °C después de 24, 48 y 72 h, se incrementó en 1.1, 2.1 y 2.1 Log UFC/cm2,

respectivamente (Figura 6.1a). Claramente se observa que las poblaciones de

Salmonella después de 48 y 72 h de almacenamiento permanecieron prácticamente

constantes. Con respecto al almacenamiento a 30 °C (Figura 6.1b) los resultados

fueron similares a 25 °C y estadísticamente no significativos (p>0.05) (Tabla 2).

Annous et al. (2004) reportaron incrementos semejantes de la población de

Salmonella (2-3 Log UFC/cm2) en la cascara de melones inoculados después del

almacenamiento durante 72 h. Los resultados obtenidos en nuestros ensayos

demostraron que la superficie de la papaya es capaz de soportar el crecimiento del

patógeno y que el incremento en el número de células podría contribuir a la

formación de biopelículas (Figura 6.3). Debido a que el aumento de la población

microbiana se asocia con la formación de biopelículas (Fu et al., 2016).

40

Figura 6.1. Comportamiento de Salmonella en papaya almacenada a 25 (a) y 30 °C

(b). Los valores representan la media de nueve tratamientos ± la desviación

estándar.

Tabla 2. Crecimiento de Salmonella inoculada en papaya y almacenada a 25 y 30

°C durante 72 h.

Tiempo (h) Log UFC/cm2

25 °C 30 °C

0 2.7 ± 0.26c 2.7 ± 0.20c

24 3.8 ± 0.11b 3.7 ± 0.15b

48 4.9 ± 0.15a 4.9 ± 0.05a

72 4.9 ± 0.10a 5.0 ± 0.05a

Entre columnas los valores representan la media de nueve tratamientos ± la

desviación estándar. Letras diferentes indican diferencia estadísticamente

significativa (p<0.05).

Para demostrar la presencia de biopelículas en la superficie del fruto se

recuperaron los biopolímeros del epicarpio de la papaya y se sometieron al

0

1

2

3

4

5

6

0 24 48 72

Log U

FC

/cm

²

Tiempo (h)

a)

0

1

2

3

4

5

6

0 24 48 72

Log U

FC

/cm

²

Tiempo (h)

b)

41

procedimiento de tinción con cristal violeta. Los valores medios de OD595nm

aumentaron de 0.08 a 1.3 unidades después de 48 h de incubación lo que indica la

síntesis de biopolímeros (Figura 6.2). El aumento en la producción de polímeros de

las 48 a 72 h de incubación fue discreto dado que la biopelícula se encontraba en

la etapa de maduración.

El valor de DO al tiempo 0 h resultó ser 0. Esto mostró que no había

formación de biopelículas por Salmonella en el epicarpio de la fruta. Puesto que las

células necesitan tiempo para adaptarse a las nuevas condiciones ambientales

(Tang et al., 2012). Las células bacterianas inoculadas requirieron tiempo para

migrar sobre la superficie del producto y buscar sitios adecuados para adherirse. Y

una vez que se unieron a la superficie del producto fresco, se rodearon de

biopolímeros.

El método colorimétrico con cristal violeta utilizado es una técnica de uso

frecuente con resultados reproducibles y que se realiza in vitro en una microplaca

de poliestireno (Dimakopoulou-Papazoglou et al., 2016; Lianou y Koutsoumanis,

2012). El ensayo de cristal violeta muestra la capacidad de formación de

biopelículas de las cepas bacterianas (Xu et al., 2016). Se ha reportado que las

biopelículas están formadas de 50 a 90 % por componentes exopolisacáridos

(Amrutha et al., 2017).

42

Figura 6.2 Cuantificación de biopolímeros producidos por Salmonella en papaya

almacenada a 25 °C. Los valores representan la media de nueve datos ± la

desviación estándar.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

0 24 48 72

DO

595nm

Almacenamiento (h)

43

Figura 6.3 Población de Salmonella y biopolímeros formados en papaya

almacenada a 25 °C. Los valores representan la media de nueve tratamientos ± la

desviación estándar.

En la figura 6.4d se observa el epicarpio de la papaya que no fue inoculado,

en el cuál podemos ver su estructura celulósica propia del tejido. Las micrografias

realizadas del epicarpio inoculado mostraron la unión de las células mediante

fimbrias y producción de polímeros desde las 24 h de incubación (Figura 6.4a) y

después de 48 h las células se encuentraban embebidas en material polimérico

(Figura 6.4b). Los polímeros proporcionan una cubierta protectora para los

microorganismos incluídos los patógenos y pueden ser un factor preponderante en

la generación de resistencia contra desinfectantes acuosos (Fu et al., 2016). Varios

son los componentes estructurales de las biopelículas de S. enterica, incluyendo

polímeros, fimbrias, proteínas de superficie, flagelos, celulosa y ácidos grasos. Entre

estos componentes, los polímeros son los elementos fundamentales de la matriz

extracelular de las biopelículas ya que dan como resultado la formación de una red

44

altamente hidrófoba de células firmemente compactas (Flemming y Wingender,

2010). Annous et al. (2005) observaron la formación de biopelículas de S. enterica

en el epicarpio de melón, después de 24 h de almacenamiento a 10 y 20 °C las

células se encontraban embebidas en material polimérico. Nuestra investigación

coincide con estos hallazgos de que el patógeno es capaz de formar biofilms en los

tejidos de los frutos.

Figura 6.4. Micrografías electrónicas de barrido (x5000) de biopelículas de

Salmonella formadas en la superficie de papaya almacenada durante 72 h. a) 24 h

de incubación. b) 48 h de incubación. c) 72 h de incubación. d) Control no inoculado

del epicarpio de papaya. Las flechas señalan los biopolímeros.

b)

d)

a)

c)

45

Una vez que se observó que desde las 48 h se formaban biopelículas en la papaya

y que el aumento de la biomasa y la producción de biopolímeros es similar a las 72

h, se decidió continuar con el menor tiempo (48 h) para los experimentos sucesivos.

6.2 Efecto de tratamientos de desinfección sobre células de Salmonella (libres y

en biopelícula) en papaya

En la primera etapa del trabajo se demostró que Salmonella es capaz de

desarrollar y formar biopelículas en la superficie de papaya. Ahora bien, en este

apartado se evaluó la eficacia de los desinfectantes cloro, AEN y ácido peracético.

Para ello se utilizaron los frutos inoculados con células libres y en los que se formó

biopelículas. Las poblaciones de Salmonella obtenidas de la papaya inoculada con

células libres fueron 6.4 y 5.3 Log UFC/cm2 antes del secado (AS) y después del

secado durante 50 min en campana de flujo laminar (DS), respectivamente. Para

los experimentos de células de Salmonella inmersas en biopelículas se obtuvieron

valores de 5.6 y 4.0 Log UFC/cm2 AS y DS, respectivamente (Figura 6.5). Lo anterior

indica que se pierden entre 1.1 y 1.5 Log por efecto del secado. A pesar de esta

pérdida, se obtuvo una población lo suficientemente grande (al menos 4 Log

UFC/cm2) para poder evaluar el efecto de los desinfectantes.

46

Figura 6.5. Efecto del secado en la viabilidad de células de Salmonella inoculadas

en papaya. AS: antes del secado; DS: después del secado. Los valores representan

la media de nueve tratamientos ± la desviación estándar.

La aplicación de los tratamientos descontaminantes con cloro (200 ppm),

ácido peracético (80 ppm) y AEN (50 ppm) redujo la población de células libres de

Salmonella en 1.7, 1.1 y 1.2 Log UFC/cm2, respectivamente. La reducción en células

en biopelícula fue de 1.2, 0.9 y 0.9 Log UFC/cm2, respectivamente. La

susceptibilidad de las bacterias dentro de las biopelículas se redujo en comparación

con el efecto sobre las células libres (Figura 6.6).

0

1

2

3

4

5

6

7

AS DS

Log U

FC

/cm

²

Células libres Células en biopelícula

47

Figura 6.6. Reducción de la población de Salmonella (células libres y en biopelícula)

en papaya desinfectada. AP: ácido peracético; AEN: agua electrolizada neutra.

Valores representan la media de nueve tratamientos ± la desviación estándar.

Lapidot et al. (2006) reportaron que después de que se formaron biopelículas

de S. Typhimurium en perejil las células fueron significativamente más resistentes a

los tratamientos de desinfección con cloro a una concentración de 100 ppm

(reducción <2 Log UFC/g). También se ha estudiado el incremento en la resistencia

de biopelículas de S. Enteritidis in vitro utilizando medio TSB diluido 20 veces

cuando fueron tratadas con cloro a 50 ppm; los resultados mostraron que la

temperatura ambiente y la baja disponibilidad de nutrientes mejoraron la resistencia

de la biopelícula (Yang et al., 2016).

Resultados similares se obtuvieron en nuestra investigación utilizando AEN,

observándose reducciones de 1.1 y 0.9 Log UFC/cm2 de células libres y en las

biopelículas formadas en las papayas, respectivamente (Figura 6.6). No hubo

diferencia estadística entre ambos tipos de células. A diferencia de otros estudios

0

1

2

3

4

5

Cloro (200 ppm) AP (80 ppm) AEN (50 ppm) Agua

Reducció

n (

Log U

FC

/cm

²) Células libres Células en biopelícula

48

en donde se ha demostrado la eficacia del AEN en la inactivación de células no

procedentes de biopelículas (Afari et al., 2015; Singh y Hung, 2018). Los autores

concluyeron que era posible que los desinfectantes acuosos no penetraran

eficazmente las capas de EPS de la biopelícula. El mecanismo de alta resistencia a

los desinfectantes acuosos aún no ha sido completamente entendido (Pang et al.,

2017). Nuestros resultados concuerdan con lo descrito por Hawkins et al. (2016)

quienes realizaron tratamientos con AEN (10 ppm) en carne de pollo y obtuvieron

una reducción de 0.56 Log de S. Typhimurium.

Independientemente del tipo de desinfectantes los porcentajes de reducción

sobre las células libres o inmersas en biopelículas no fueron mayores a 33.3 y 23.9

%, respectivamente (Tabla 3). La Food and Drug Administration (FDA) de los

EE.UU. establece que un desinfectante para considerarse efectivo debe de reducir

la población de microorganismos representativos en al menos 5 Log o 99.999 %

(FDA, 1998), lo cual es fundamental para garantizar la inocuidad de los productos

frescos (Parish et al., 2003). Evidentemente, tomando como referencia estos

criterios, ninguno de los desinfectantes probados en este trabajo resultó efectivo

para reducir el riesgo de la presencia de Salmonella en papaya a los consumidores.

6.3 Efecto del calentamiento óhmico sobre células libres y en biopelícula de

Salmonella en papaya

Como alternativa a la desinfección química, se evaluó el efecto del

calentamiento óhmico para inactivar a células de Salmonella libres, o bien inmersas

en biopelículas formadas sobre la superficie de papaya bajo las condiciones

previamente establecidas (48 h de almacenamiento a temperatura de 25 °C).

La aplicación del tratamiento óhmico a 55 °C durante 60 ó 90 s redujo 2.4

Log UFC/cm² en ambos tipos de células (libres y en biopelículas) (p > 0.5).

49

Por otro lado, cuando se utilizó una temperatura de 65 °C a los mismos

tiempos de contacto (60 y 90 s) se logró la completa inactivación en ambos tipos de

células (>5 Log UFC/cm²), lo que se traduce en un tratamiento eficaz para eliminar

las bacterias patógenas en papaya (Figura 6.7).

Figura 6.7. Efecto de la aplicación de calentamiento óhmico sobre la población de

Salmonella en papaya (células libres y en biopelícula). Los valores representan la

media de nueve tratamientos ± la desviación estándar. *Valores no detectables, es

decir, por debajo del límite de detección (<1 Log CFU/cm2).

Estos resultados concuerdan con lo reportado por Park et al. (2017) quienes

obtuvieron reducciones de más de 5 Log en jugo de manzana inoculado con S.

Typhimurium y E. coli O157:H7 después de la aplicación de tratamiento con

calentamiento óhmico aplicando 30 V/cm durante 60 s. Resultados similares se

observaron en jugo de naranja y jugo de tomate aplicando 25 V/cm durante 30 s

(Lee et al., 2012).

50

El calentamiento óhmico consigue la inactivación bacteriana debido no solo

al efecto térmico sino también al eléctrico, esto conduce a la descomposición de

estructuras como la pared celular y la membrana citoplásmica causando rupturas y

la filtración del contenido intracelular por consecuencia de la electroporación. Estas

condiciones finalmente llevan a la muerte celular (Park y Kang, 2013).

Esta tecnología de procesamiento térmico es de reciente aplicación para

inactivar patógenos transmitidos por los alimentos. Nuestro trabajo es el primero en

explorar su eficacia en frutos enteros.

Los resultados obtenidos muestran que los niveles de reducción cuando se

utiliza el calentamiento óhmico son buenos, empleando una temperatura de 55 °C

se tienen reducciones de 44.9 y 40.5 % en células libres y en biopelícula,

respectivamente (Tabla 3). Y todavía aún mejor, se lograron reducciones del 100 %

de la población cuando se utilizó la temperatura de 65 °C incluso en el menor tiempo

de contacto (60 s) y en ambos tipos de células.

6.3.1 Efecto de la combinación de calentamiento óhmico y soluciones

desinfectantes sobre Salmonella (células libres y en biopelícula) inoculada

en papaya

Hoy en día los estudios de investigación se han centrado en técnicas de

desinfección combinadas para obtener mejores eficiencias.

Ya que los resultados anteriores mostraron que los tratamientos a 55 °C no

lograron la completa reducción de la población de Salmonella se pensó en incluir

soluciones desinfectantes [cloro (200 ppm), ácido peracético (80 ppm) y AEN (50

ppm)] con la finalidad de explorar un efecto sinérgico que resultara positivo para la

inactivación del patógeno.

51

Los resultados del tratamiento combinado de calentamiento óhmico (55 °C)

con cloro (50 ppm) mostraron el efecto bactericida más alto contra Salmonella

(Figura 6.8). Los tratamientos con AEN y ácido peracético mostraron resultados

similares que cuando se utilizó únicamente el calentamiento óhmico (Tabla 3). Se

esperaba lograr un mayor efecto de inactivación, sin embargo, no fue así

probablemente porque estos desinfectantes requieren un mayor tiempo de

exposición para ejercer su efecto bactericida. La reducción de las células en

biopelícula fue menor que en las células libres debido a que las primeras son más

resistentes a los desinfectantes químicos como se ha mencionado anteriormente.

Figura 6.8 Efecto del calentamiento óhmico (55 °C) en combinación con

desinfectantes sobre la población de Salmonella en papaya (células libres y en

biopelícula). AP: ácido peracético; AEN: agua electrolizada neutra. Los valores

representan la media de nueve valores ± la desviación estándar.

Se ha constatado el efecto potencializador del tratamiento de calentamiento

óhmico en combinación con carvacrol para la inactivación de E. coli O157: H7, S.

Typhimurium y L. monocytogenes inoculadas en salsa de tomate. En los

tratamientos individuales se inactivaron 0.6 y 2.1 Log UFC/g con carvacrol y

0

1

2

3

4

5

Cloro (200 ppm) AP (80 ppm) AEN (50 ppm)

Sobre

viv

iente

s (

Log U

FC

/cm

²) Células libres Células en biopelícula

52

calentamiento óhmico, respectivamente. Con el tratamiento combinado los tres

patógenos fueron inactivados por más de 5.0 Log UFC/g (Kim y Kang, 2017). En

papaya cortada e inoculada con Salmonella se ha reportado el efecto sinérgico de

tratamientos de luz UV-C y ácido málico; una reducción de 5.2 Log UFC/g fue

alcanzada usando esta combinación (Raybaudi-Massilia et al., 2013). Por otro lado

Huang et al. (2018) observaron una mayor reducción de Salmonella en moras

azules cuando se utilizó el tratamiento combinado de luz UV y ácido peracético, que

cuando se emplearon por separado.

Por su parte, los tratamientos con calentamiento óhmico a 65 °C en

combinación desinfectantes lograron reducir el 100 % de la población de Salmonella

(células libres y en biopelícula), resultados similares a los obtenidos con el

tratamiento óhmico únicamente. Por lo que utilizando estas condiciones no es

necesario utilizar desinfectantes. Lo que resulta beneficioso ya que representa un

menor costo economico para la industria a gran escala. Además, desinfectantes

como el cloro pueden formar subproductos tóxicos que pueden ocasionar posibles

peligros para la salud (Yoo et al., 2015; Feliziani et al., 2016).

53

Tabla 3. Reducción de la población de Salmonella después de tratamientos con

desinfectantes y calentamiento óhmico en papaya (células libres y en biopelícula).

Tipos de tratamientos

Condiciones

Células libres Células en biopelícula

Reducción % de

reducción Reducción

% de reducción

Desinfectantes Cloro (200 ppm) 1.7 ± 0.18d 33.3 1.2 ± 0.12c 23.9 AP (80 ppm) 1.1 ± 0.19e 23.2 0.9 ± 0.39c 19.2 AEN (50 ppm) 1.2 ± 0.26e 25.1 0.9 ± 0.18c 18.1

CO 55°C 60 s 2.4 ± 0.05c 41.9 2.3 ± 0.17b 37.7 55°C 90 s 2.4 ± 0.05c 41.9 2.4 ± 0.19b 40.5 65°C 60 s 5.2 ± 0.46a 100 4.8 ± 0.21a 100 65°C 90 s 5.8 ± 0.22a 100 6.0 ± 0.05a 100

*CO (55 °C) + desinfectantes

Cloro (200 ppm) 3.4 ± 0.40b 61.7 2.6 ± 0.23b 44.9

AP (80 ppm) 2.8 ± 0.95bc 50.2 2.3 ± 0.20b 39.8 AEN (50 ppm) 2.7 ± 0.25bc 48.3 2.6 ± 0.21b 44.7

*CO (65 °C) + desinfectantes

Cloro (200 ppm) 4.9 ± 0.16a 100 4.8 ± 0.17a 100

AP (80 ppm) 4.9 ± 0.16a 100 4.8 ± 0.17a 100

AEN (50 ppm) 4.9 ± 0.16a 100 4.8 ± 0.17a 100

AP: ácido peracético; AEN: agua electrolizada neutra; CO: calentamiento óhmico.

*Tratamientos durante 60 s. Entre columnas los valores representan la media de

nueve datos ± la desviación estándar. Valores en la misma columna seguidos de

letras diferentes indican diferencia estadísticamente significativa (p<0.05).

6.4 Efecto del calentamiento óhmico sobre la calidad de la papaya

Los tratamientos térmicos se han utilizado ampliamente para proporcionar

seguridad fitosanitaria contra una serie de insectos plagas y hongos en frutas

tropicales (Paull, 1995). Estos tratamientos utilizando calor se pueden lograr

mediante inmersión en agua caliente, aire seco y tratamientos de calor de vapor

(Singh y Rao, 2011). En nuestro trabajo los resultados obtenidos con los

tratamientos a 55 °C (Figura 6.9a) muestran que la firmeza de la papaya fue de 22

54

N a 16 N después de nueve días de almacenamiento en todos los tratamientos. La

fruta tratada con calentamiento óhmico no mostró diferencias significativas en la

firmeza durante el almacenamiento en relación con la papaya no tratada (p > 0.05).

Estos resultados coinciden con lo reportado por Chávez-Sánchez et al. (2013),

quienes demostraron que el tratamiento con agua caliente a 55 °C durante 3 min no

afectó negativamente a los variables de calidad de la pulpa y la piel de la papaya en

su etapa de madurez.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1010

15

20

25

No tratado

Cloro 200 ppm

AEN 50 ppm

AP 80 ppm

Agua

Almacenamiento (días)

Fir

meza (

N)

a)

55

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1010

15

20

25

No tratado

Cloro 200 ppm

AEN 50 ppm

AP 80 ppm

Agua

Almacenamiento (días)

Fir

meza (

N)

Figura 6.9. Firmeza (N) de frutos de papaya después de tratamiento con

calentamiento óhmico almacenada a 17 °C durante 9 días. a) Papayas tratadas a

55 °C por 60 s en combinación con desinfectantes. b) Papayas tratadas a 65 °C por

60 s en combinación con desinfectantes. AP: ácido peracético; AEN: agua

electrolizada neutra; Agua: calentamiento óhmico únicamente. Los valores

representan la media de nueve tratamientos ± la desviación estándar.

Cuando las papayas fueron sometidas al calentamiento óhmico a una

temperatura de 65 °C durante 60 s la firmeza varió de 21 N a 14 N en los frutos

tratados y de 22 N a 15 N en el control después de nueve días de almacenamiento,

esto es que no hubo diferencia significativa en las frutas tratadas con calentamiento

óhmico en comparación con las papayas no tratadas (p > 0.05) (Figura 6.9b). Los

frutos tratados no mostraron tejido del epicarpio lesionado por el calor, deterioro o

magulladuras (Figura 6.10). Además, se considera que los valores obtenidos están

dentro del rango del valor de firmeza de la papaya en condiciones comestibles que

varía de 17.3 N a 13.2 N (Bhosale y Sundaram, 2015).

b)

56

También se cuantificó el contenido de hongos después del tratamiento con

calentamiento óhmico. Se observó una actividad antifúngica en las papayas que

recibieron tratamiento, los conteos fueron de 10 UFC/g o se encontraban por debajo

del límite de detección (<10 UFC/g) (Tabla 4). En el control no tratado se obtuvo

mayor conteo de hongos en placa (30 UFC/g), además de que al final del

almacenamiento (nueve días) presentó daños visibles en el epicarpio por hongos

(Figura 6.10).

Cómo lo describieron Ayón-Reyna et al. (2017) quienes realizaron

tratamientos con inmersiones en agua caliente (48 °C) y agua caliente en

combinación con Ca, tanto el crecimiento micelial, como la germinación conidial de

Colletotrichum gloeosporioides (antracnosis) se inhibieron y se redujo la incidencia

del hongo en papaya. La pudrición de antracnosis, causada por este hongo es la

principal enfermedad en poscosecha de la papaya. La infección ocurre en la fruta

en desarrollo en el campo, pero permanece latente hasta que la fruta comienza a

madurar. Por lo tanto, es difícil prevenir el desarrollo de la enfermedad y esto puede

reducir significativamente la calidad y el valor comercial de la fruta durante el

almacenamiento y transporte (Li et al., 2013).

Tabla 4. Conteo de hongos en papaya después de tratamiento con calentamiento

óhmico.

Condiciones Desinfectante UFC/g

55 °C, 60 s Cloro (200 ppm) <10

AEN (50 ppm) 10

AP (80 ppm) 10

SD 10

65 °C, 60 s Cloro (200 ppm) <10

AEN (50 ppm) <10

AP (80 ppm) 10

SD 10

No tratado SD 30

AEN: agua electrolizada neutra; AP: ácido peracético; SD: sin desinfectante

57

Figura 6.10. Papayas tratadas con calentamiento óhmico en combinación con

desinfectantes después del almacenamiento durante 9 días a 17 °C. A) Papayas

tratadas a 55 °C; B) Papayas tratadas a 65 °C; C) Control. Cl: Cloro; AEN: agua

electrolizada neutra; AP: ácido peracético; SD: sin desinfectantes ST: sin

tratamiento.

Se ha reportado que los tratamientos térmicos poscosecha que se aplican a

la papaya mejoran la tolerancia del fruto al enfriamiento (Singh y Rao, 2011).

Adicionalmente, los tratamientos de exposición corta, como el que se presenta en

este estudio, presentan ventajas con relación a los tratamientos comerciales más

largos que van de 46 a 47.5 °C durante 40 a 90 min, ya que son más rápidos y

menos costosos (Chávez-Sánchez et al., 2013).

Los resultados de este estudio mostraron que los atributos de calidad propios

del fruto no mejoran sustancialmente cuando se combina el calentamiento óhmico

58

con los desinfectantes (cloro, AP y AEN), por lo tanto, y dado que los desinfectantes

presentan un efecto prácticamente nulo, resulta menos costoso aplicar únicamente

el calentamiento óhmico con fines de preservar la papaya.

Se requiere mayor investigación para determinar el efecto de los tratamientos

sobre otras variables físicas y químicas para la vida útil y la calidad de la papaya

tales como índice de color, sólidos solubles totales, acidez total titulable, sabor,

entre otros.

59

7. CONCLUSIONES

Los resultados del presente estudio demostraron que S. enterica tiene la

capacidad de formar biopelículas en el epicarpio de papaya después de 48 h de

incubación, lo cual es preocupante ya que estas estructuras le permiten persistir

sobre el fruto durante más tiempo. Las células inmersas en las biopelículas

mostraron un aumento en la resistencia a cloro, ácido peracético y AEN con relación

a las células libres.

El tratamiento con calentamiento óhmico a 65 °C resultó ser efectivo para

inactivar a células de Salmonella libres o inmersas en biopelículas formadas en la

cáscara del fruto íntegro de papaya, ya que cumple con los criterios establecidos

por la FDA al inactivar más de 5 Log UFC del patógeno.

Se observó que el tratamiento óhmico aumenta la vida útil y preserva la

calidad de la fruta. Por lo que está tecnología resulta ser una alternativa rentable

que eventualmente puede aplicarse en la industria de productos frescos a gran

escala.

Este trabajo es el primero en explorar el calentamiento óhmico como una

alternativa para inactivar células de Salmonella inmersas en biopelículas formadas

en la cáscara del fruto íntegro. Los efectos de inactivación del calentamiento óhmico

dependen del tiempo de tratamiento y de la temperatura.

60

8. REFERENCIAS

Abadias, M., Usall, J., Oliveira, M., Alegre, I., & Viñas, I. (2008). Efficacy of neutral

electrolyzed water (NEW) for reducing microbial contamination on minimally-

processed vegetables. International Journal of Food Microbiology, 123(1–2),

151–158.

Afari, G. K., Hung, Y., & King, C. H. (2015). Efficacy of neutral ph electrolyzed water

in reducing Escherichia coli O157:H7 and Salmonella Typhimurium DT 104 on

fresh produce items using an automated washer at simulated food service

conditions. Journal of Food Science, 80(8), 1815–1822.

Amrutha, B., Sundar, K., & Shetty, P. H. (2017). Study on E. coli and Salmonella

biofilms from fresh fruits and vegetables. Journal of Food Science and

Technology, 54(5), 1091–1097.

Annous, B. A., Solomon, E. B., Cooke, P. H., & Burke, and A. (2005). Biofilm

formation by Salmonella spp. on cantaloupe melons. Journal of Food Safety,

25, 276–287.

Annous, B. a, Burke, A., & Sites, J. E. (2004). Surface pasteurization of whole fresh

cantaloupes inoculated with Salmonella Poona or Escherichia coli. Journal of

Food Protection, 67(9), 1876–85.

Ayón-Reyna, L. E., López-Valenzuela, J. Á., Delgado-Vargas, F., López-López, M.

E., Molina-Corral, F. J., Carrillo-López, A., & Vega-García, M. O. (2017). Effect

of the combination hot water-calcium chloride on the in vitro growth of

Colletotrichum gloeosporioides and the postharvest quality of infected papaya.

The Plant Pathology Journal, 33(6), 572–581.

Behnke, S., & Camper, A. K. (2012). Chlorine dioxide disinfection of single and dual

species biofilms, detached biofilm and planktonic cells. Biofouling, 28(6), 635–

647.

61

Behnke, S., Parker, A. E., Woodall, D., & Camper, A. K. (2011). Comparing the

chlorine disinfection of detached biofilm clusters with those of sessile biofilms

and planktonic cells in single- and dual-species cultures. Applied and

Environmental Microbiology, 77(20), 7176–7184.

Beuchat, L. R. (2002). Ecological factors influencing survival and growth of human

pathogens on raw fruits and vegetables. Microbes and Infection, 4(4), 413–423.

Beuchat, L. R., Adler, B. B., & Lang, M. M. (2004). Efficacy of chlorine and a

peroxyacetic acid sanitizer in killing Listeria monocytogenes on iceberg and

romaine lettuce using simulated commercial processing conditions. Journal of

Food Protection, 67(6), 1238–1242.

Bhosale, A. A., & Sundaram, K. K. (2015). Nondestructive method for ripening

prediction of papaya. Procedia Technology, 19, 623–630.

Burmølle, M., Webb, J. S., Rao, D., Hansen, L. H., Sørensen, S. J., & Kjelleberg, S.

(2006). Enhanced biofilm formation and increased resistance to antimicrobial

agents and bacterial invasion are caused by synergistic interactions in

multispecies biofilms. Applied and Environmental Microbiology, 72(6), 3916–

3923.

Cabo Verde, S., Trigo, M. J., Sousa, M. B., Ferreira, A., Ramos, a C., Nunes, I.,

Botelho, M. L. (2013). Effects of gamma radiation on raspberries: safety and

quality issues. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part A, 76(4–

5), 291–303.

Castro, S. M., & Saraiva, J. A. (2014). High-pressure processing of fruits and fruit

products. In Emerging Technologies for Food Processing (pp. 65–76). Elsevier

Ltd.

CDC. (2011). Multistate outbreak of human Salmonella Agona infections linked to

whole, fresh imported papayas. Fecha de consulta: Mayo 16, 2017, página:

62

https://www.cdc.gov/salmonella/2011/papayas-8-29-2011.html

CDC. (2017). Multistate outbreak of Salmonella Kiambu infections linked to imported

maradol papayas. Fecha de consulta: Diciembre 08, 2017, página:

https://www.cdc.gov/salmonella/kiambu-07-17/index.html

Ceri, H., Olson, M. E., Stremick, C., Read, R. R., Morck, D., & Buret, A. (1999). The

calgary biofilm device : new technology for rapid determination of antibiotic

susceptibilities of bacterial biofilms. Journal of Clinical Microbiology, 37(6),

1771.

Chávez-Sánchez, I., Carrillo-López, A., Vega-García, M., & Yahia, H. (2013). The

effect of antifungal hot-water treatments on papaya postharvest quality and

activity of pectinmethylesterase and polygalacturonase. Journal of Food

Science and Technology, 50(1), 101–107.

Coffey, B. M., & Anderson, G. G. (2014). Biofilm formation in the 96-well microtiter

plate. In A. Filoux & J.-L. Ramos (Eds.), Methods in Molecular Biology (Vol.

1149, pp. 631–641). New York: Springer US.

Corbo, M. R., Speranza, B., Campaniello, D., D’Amato, D., & Sinigaglia, M. (2010).

Fresh-cut fruits preservation: current status and emerging technologies. In A.

Méndez- Vilas (Ed.), Current Research, Technology and Education Topics in

Applied Microbiology and Microbial Biotechnology (pp. 1143–1154).

Coughlan, L. M., Cotter, P. D., Hill, C., & Alvarez-Ordóñez, A. (2016). New weapons

to fight old enemies: Novel strategies for the (bio)control of bacterial biofilms in

the food industry. Frontiers in Microbiology, 7(OCT), 1–21.

Dimakopoulou-Papazoglou, D., Lianou, A., & Koutsoumanis, K. P. (2016). Modelling

biofilm formation of Salmonella enterica ser. Newport as a function of pH and

water activity. Food Microbiology, 53, 76–81.

63

FAO. (2017). Crop Production. Fecha de consulta: Mayo 17, 2017, página:

http://www.fao.org/faostat/en/#data/QC

Farkas, J., & Mohácsi-Farkas, C. (2011). History and future of food irradiation.

Trends in Food Science & Technology, 22(2–3), 121–126.

FDA. (1998). Guidance for industry guide to minimize microbial food safety hazards

for fresh fruits and vegetables. Fecha de consulta: Agosto 16, 2018, página:

https://www.fda.gov/downloads/Food/GuidanceRegulation/UCM169112.pdf

Feliziani, E., Lichter, A., Smilanick, J. L., & Ippolito, A. (2016). Disinfecting agents

for controlling fruit and vegetable diseases after harvest. Postharvest Biology

and Technology, 122(2015), 53–69.

Feng, K., Hu, W., Jiang, A., Xu, Y., Sarengaowa, Li, X., & Bai, X. (2015). Growth

potential of Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus on fresh-cut

tropical fruits. Journal of Food Science, 80(11), M2548–M2554.

Flemming, H., & Wingender, J. (2010). The biofilm matrix. Nature Publishing Group,

8(9), 623–633.

Foong-Cunningham, S., Verkaar, E. L. C., & Swanson, K. (2012). Microbial

decontamination of fresh produce. In Microbial Decontamination in the Food

Industry (pp. 3–29). USA: Woodhead Publishing Limited.

Fu, Y., Deering, A. J., Bhunia, A. K., & Yao, Y. (2016). Pathogen biofilm formation

on cantaloupe surface and its impact on the antibacterial effect of lauroyl

arginate ethyl. Food Microbiology, 64, 139–144.

Fuqua, W. C., Winans, S. C., & Greenberg, E. P. (1994). Quorum sensing in bacteria:

The LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators.

Journal of Bacteriology, 176(2), 269–275.

Gardan, L., Christen, R., Achouak, W., & Prior, P. (2004). Erwinia papayae sp. nov.,

64

a pathogen of papaya (Carica papaya). International Journal of Systematic and

Evolutionary Microbiology, 54(1), 107–113.

Ghigo, J.-M. (2001). Natural conjugative plasmids induce bacterial biofilm

development. Nature, 412(6845), 442–445.

Gibbs, R., Pingault, N., Mazzucchelli, T., O’Reilly, L., MacKenzie, B., Green, J. Van

Buynder, P. (2009). An outbreak of Salmonella enterica serotype Litchfield

infection in Australia linked to consumption of contaminated papaya. Journal of

Food Protection, 72(5), 1094–1098.

Gil, M. I., Gómez-López, V. M., Hung, Y. C., & Allende, A. (2015). Potential of

electrolyzed water as an alternative disinfectant agent in the fresh-cut industry.

Food and Bioprocess Technology, 8(6), 1336–1348.

Gomathy, K., Thangavel, K., Balakrishnan, M., & Kasthuri, R. (2015). Effect of ohmic

heating on the electrical conductivity, biochemical and rheological properties of

papaya pulp. Journal of Food Process Engineering, 38(4), 405–413.

González-Aguilar, G. A., Ayala-Zavala, J. F., Olivas, G. I., de la Rosa, L. A., &

Álvarez-Parrilla, E. (2010). Preserving quality of fresh-cut products using safe

technologies. Journal Fur Verbraucherschutz Und Lebensmittelsicherheit, 5(1),

65–72.

Graça, A., Abadias, M., Salazar, M., & Nunes, C. (2011). The use of electrolyzed

water as a disinfectant for minimally processed apples. Postharvest Biology and

Technology, 61(2–3), 172–177.

Greenberg, A. E., Clesceri, L. S., & Eaton, A. D. (1992). Standard Methods for the

Examination of Water and Wastewater. In American Public Health Association

(18th ed., pp. 4–38). Washington, D.C: American Public Health Association.

Greenspan, F., & Mackellar. (1994). FMC. Technical Bulletin 4, peracetic acid, 35%.

65

Anal. Chem, (902), 20, 1061.

Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., & Stoodley, P. (2004). Bacterial biofilms: from

the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews Microbiology,

2(February), 95–108.

Hawkins, J. L., Vimini, B., Schwarz, J. G., & Nichols, P. (2016). Application of

antimicrobial agents via commercial spray cabinet to inactivate Salmonella on

skinless chicken meat. Journal of Food Protection, 79(4), 569–573.

Huang, R., Vries, D. De, & Chen, H. (2018). Strategies to enhance fresh produce

decontamination using combined treatments of ultraviolet, washing and

disinfectants. International Journal of Food Microbiology, 283(June), 37–44.

Iturriaga, M. H., Tamplin, M. L., & Escartín, E. F. (2007). Colonization of tomatoes

by Salmonella Montevideo is affected by relative humidity and storage

temperature. Journal of Food Protection, 70(1), 30–4.

Jahid, I. K., & Ha, S. Do. (2012). A review of microbial biofilms of produce: Future

challenge to food safety. Food Science and Biotechnology, 21(2), 299–316.

Janssens, J. C. A., Steenackers, H., Robijns, S., Gellens, E., Levin, J., Zhao, H., De

Keersmaecker, S. C. J. (2008). Brominated furanones inhibit biofilm formation

by Salmonella enterica serovar Typhimurium. Applied and Environmental

Microbiology, 74(21), 6639–6648.

Jayathunge, K. G. L. R., Gunawardhana, D. K. S. N., Illeperuma, D. C. K.,

Chandrajith, U. G., Thilakarathne, B. M. K. S., Fernando, M. D., & Palipane, K.

B. (2014). Physico-chemical and sensory quality of fresh cut papaya (Carica

papaya) packaged in micro-perforated polyvinyl chloride containers. Journal of

Food Science and Technology, 51(12), 3918–3925.

Kaplan, J. B. (2010). Biofilm dispersal: mechanisms, clinical implications, and

66

potential therapeutic uses. Journal of Dental Research, 89(3), 205–218.

Kaspar, C. W., & Tamplin, M. L. (1993). Effects of temperature and salinity on the

survival of Vibrio vulnificus in seawater and shellfish. Applied and Environmental

Microbiology, 59(8), 2425–2429.

Kim, M. J., Bang, W. S., & Yuk, H. G. (2017). 405±5 nm light emitting diode

illumination causes photodynamic inactivation of Salmonella spp. on fresh-cut

papaya without deterioration. Food Microbiology, 62, 124–132.

Kim, S., & Kang, D. (2017). Synergistic effect of carvacrol and ohmic heating for

inactivation of E. coli O157:H7, S. Typhimurium, L. monocytogenes, and MS-2

bacteriophage in salsa. Food Control, 73, 300–305.

Krasaekoopt, W., & Bhandari, B. (2010). Fresh-Cut Vegetables. In N. K. Sinha (Ed.),

Handbook of Vegetables & Vegetable Processing (1st ed., pp. 219–242).

Whiley-Blackwell.

Krishnan, P., Bhat, R., Kush, A., & Ravikumar, P. (2012). Isolation and functional

characterization of bacterial endophytes from Carica papaya fruits. Journal of

Applied Microbiology, 113(2), 308–317.

Lapidot, A., Romling, U., & Yaron, S. (2006). Biofilm formation and the survival of

Salmonella Typhimurium on parsley. International Journal of Food Microbiology,

109, 229–233.

Lee, H.-H., Hong, S.-I., & Kim, D. (2014). Microbial reduction efficacy of various

disinfection treatments on fresh-cut cabbage. Food Science & Nutrition, 2(5),

585–90.

Lee, S.-Y., Sagong, H.-G., Ryu, S., & Kang, D.-H. (2012). Effect of continuous ohmic

heating to inactivate Escherichia coli O157:H7, Salmonella Typhimurium and

Listeria monocytogenes in orange juice and tomato juice. Journal of Applied

67

Microbiology, 112(4), 723–731.

Li, X., Zhu, X., Zhao, N., Fu, D., Li, J., Chen, W., & Chen, W. (2013). Effects of hot

water treatment on anthracnose disease in papaya fruit and its possible

mechanism. Postharvest Biology and Technology, 86, 437–446.

Liang, M., Zhang, M., Bhandari, B., & Gao, Z. (2017). Recent developments in novel

shelf life extension technologies of fresh-cut fruits and vegetables. Trends in

Food Science and Technology, 64, 23–38.

Lianou, A., & Koutsoumanis, K. P. (2012). Strain variability of the biofilm-forming

ability of Salmonella enterica under various environmental conditions.

International Journal of Food Microbiology, 160(2), 171–178.

Marcotte, M., Ramaswamy, H. S., Karimi-Zindashty, Y., & Zareifard, M. R. (2010).

Ohmic heating effects on rheological and functional properties of foods. In Novel

Food Processing. Effects on Rheological and Functional Properties (pp. 21–34).

United States: CRC Press.

Ming, R., Yu, Q., & Moore, P. H. (2007). Sex determination in papaya. Seminars in

Cell and Developmental Biology, 18(3), 401–408.

Monnin, A., Lee, J., & Pascall, M. A. (2012). Efficacy of neutral electrolyzed water

for sanitization of cutting boards used in the preparation of foods. Journal of

Food Engineering, 110(4), 541–546.

Mukhopadhyay, R., Mitra, A., Roy, R., & Guha, A. K. (2002). An evaluation of street-

vended sliced papaya (Carica papaya) for bacteria and indicator micro-

organisms of public health significance. Food Microbiology, 19, 663–667.

Mukhopadhyay, S., Sokorai, K., Ukuku, D., Fan, X., Juneja, V., Sites, J., & Cassidy,

J. (2016). Inactivation of Salmonella enterica and Listeria monocytogenes in

cantaloupe puree by high hydrostatic pressure with/without added ascorbic

68

acid. International Journal of Food Microbiology, 235, 77–84.

Murphy, T. F., & Kirkham, C. (2002). Biofilm formation by nontypeable Haemophilus

influenzae: strain variability, outer membrane antigen expression and role of pili.

BMC Microbiology, 2, 7.

Mutaku, I., Erku, W., & Ashenafi, M. (2005). Growth and survival of Escherichia coli

O157:H7 in fresh tropical fruit juices at ambient and cold temperatures.

International Journal of Food Sciences and Nutrition, 56(2), 133–9.

Netramai, S., Kijchavengkul, T., Sakulchuthathip, V., & Rubino, M. (2016).

Antimicrobial efficacy of gaseous chlorine dioxide against Salmonella enterica

Typhimurium on grape tomato (Lycopersicon esculentum). International Journal

of Food Science & Technology, 51(10), 2225–2232.

Ölmez, H. (2016). Foodborne pathogenic bacteria in fresh-cut vegetables and fruits.

In Food Hygiene and Toxicology in Ready-to-Eat Foods (pp. 151–166). Turkey.

Pang, X., Yang, Y., & Yuk, H. (2017). Biofilm formation and disinfectant resistance

of Salmonella spp. in mono- and dual-species with Pseudomonas aeruginosa.

Journal of Applied Microbiology, 123(3), 651–660.

Parish, M. E., Beuchat, L. R., Suslow, T. V, Harris, L. J., Garrett, E. H., Farber, J. N.,

& Busta, F. F. (2003). Methods to reduce/eliminate pathogens from fresh and

fresh-cut produce. Comprensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2,

161–173.

Park, E. J., Alexander, E., Taylor, G. A., Costa, R., & Kang, D. H. (2009). The

decontaminative effects of acidic electrolyzed water for Escherichia coli

O157:H7, Salmonella Typhimurium, and Listeria monocytogenes on green

onions and tomatoes with differing organic demands. Food Microbiology, 26(4),

386–390.

69

Park, I., Ha, J., & Kang, D. (2017). Investigation of optimum ohmic heating conditions

for inactivation of Escherichia coli O157 : H7, Salmonella enterica serovar

Typhimurium, and Listeria monocytogenes in apple juice. BMC Microbiology,

117(17), 1–8.

Park, I. K., & Kang, D. H. (2013). Effect of electropermeabilization by ohmic heating

for inactivation of Escherichia coli O157: H7, Salmonella enterica serovar

Typhimurium, and Listeria monocytogenes in buffered peptone water and apple

juice. Applied and Environmental Microbiology, 79(23), 7122–7129.

Paull, R. E. (1995). Preharvest factors and the heat sensitivity of field-grown ripening

papaya fruit. Postharvest Biology and Technology, 6, 167–175.

Paull, R. E., & Chen, W. (1997). Minimal processing of papaya (Carica papaya L.)

and the physiology of halved fruit. Postharvest Biology and Technology, 12(1),

93–99.

Penteado, A. L., & Leitão, M. F. F. (2004a). Growth of Listeria monocytogenes in

melon, watermelon and papaya pulps. International Journal of Food

Microbiology, 92(1), 89–94.

Penteado, A. L., & Leitão, M. F. F. (2004b). Growth of Salmonella Enteritidis in

melon, watermelon and papaya pulp stored at different times and temperatures.

Food Control, 15(5), 369–373.

Petri, E., Rodríguez, M., & García, S. (2015). Evaluation of combined disinfection

methods for reducing Escherichia coli O157:H7 population on fresh-cut

vegetables. International Journal of Environmental Research and Public Health,

12(8), 8678–8690.

Pinela, J., & Ferreira, I. C. F. R. (2017). Nonthermal physical technologies to

decontaminate and extend the shelf-life of fruits and vegetables: Trends aiming

at quality and safety. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 57(10),

70

2095–2111.

Rahman, S. M. E., Ding, T., & Oh, D. H. (2010). Inactivation effect of newly

developed low concentration electrolyzed water and other sanitizers against

microorganisms on spinach. Food Control, 21(10), 1383–1387.

Ramaswamy, H., Chen, C., & Marcotte, M. (2005). Novel processing technologies

for food preservation. In D. M. Barrett, L. Somogyi, & H. Ramaswamy (Eds.),

Processing Fruits: Science and Technology (Second, p. 861). Florida, United

States: Science and Technology.

Ramos, H. C. C., Pereira, M. G., Gonçalves, L. S. A, Berilli, P. C. G., Pinto, F. O., &

Ribeiro, E. H. (2012). Multivariate analysis to determine the genetic distance

among backcross papaya (Carica papaya) progenies. Genetics and Molecular

Research : GMR, 11(2), 1280–95.

Rani, S. A., Pitts, B., Beyenal, H., Veluchamy, R. A., Lewandowski, Z., Davison, W.

M., Stewart, P. S. (2007). Spatial patterns of DNA replication, protein synthesis,

and oxygen concentration within bacterial biofilms reveal diverse physiological

states. Journal of Bacteriology, 189(11), 4223–4233.

Raybaudi-Massilia, R., Calderón-Gabaldón, M. I., Mosqueda-Melgar, J., & Tapia, M.

S. (2013). Inactivation of Salmonella enterica ser. Poona and Listeria

monocytogenes on fresh-cut “Maradol” red papaya (Carica papaya L) treated

with UV-C light and malic acid. Journal Fur Verbraucherschutz Und

Lebensmittelsicherheit, 8(1–2), 37–44.

Rollet, C., Gal, L., & Guzzo, J. (2009). Biofilm-detached cells, a transition from a

sessile to a planktonic phenotype: A comparative study of adhesion and

physiological characteristics in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiology

Letters, 290(2), 135–142.

SAGARPA. (2017). Papaya Mexicana. Fecha de consulta: Abril 17, 2018, página:

71

www.sagarpa.gob.mx/agronegocios/Documents/Estudios.../PAPAYA2009.pdf

Saldaña, G., Minor-Perez, H., Raso, J., & Alvarez, I. (2011). Combined effect of

temperature, PH, and presence of nisin on inactivation of Staphylococcus

aureus and Listeria monocytogenes by pulsed electric fields. Foodborne

Pathogens and Disease, 8(7), 797–802.

Santos, A. M. G., Lins, S. R. O., Silva, J. M., & Oliveira, S. M. A. (2015). Low doses

of gamma radiation in the management of postharvest Lasiodiplodia

theobromae in mangos. Brazilian Journal of Microbiology : [Publication of the

Brazilian Society for Microbiology], 46(3), 841–847.

Sharma, M., Luo, Y., & Buchanan, R. (2011). Microbial safety of tropical and

subtropical fruits. In Postharvest Biology and Technology of Tropical and

Subtropical Fruits (pp. 288–314). Maryland, USA: Woodhead Publishing

Limited.

SIAP. (2017). Atlas Agroalimentario 2017. Fecha de consulta: Junio 27, 2018,

página: http://nube.siap.gob.mx/gobmx_publicaciones_siap/pag/2017/Atlas-

Agroalimentario-2017

Singh, P., & Hung, Y. (2018). Efficacy of peracetic acid in inactivating foodborne

pathogens on fresh produce surface. Journal of Food Science, 00(00), 1–8.

Singh, S. P., & Rao, D. V. S. (2011). Papaya (Carica papaya L.). Postharvest biology

and technology of tropical and subtropical fruits: Volume 4 : Mangosteen to

white sapote. India: Woodhead Publishing Limited.

SIOVM. (2012). Carica papaya. Fecha de consulta: Marzo 11, 2018, página:

http://www.conabio.gob.mx/conocimiento/bioseguridad/pdf/20898_sg7.pdf

Smith, J. L., Fratamico, P. M., & Novak, J. S. (2004). Quorum sensing: A primer for

food microbiologists. Journal of Food Protection, 67(June), 1053–1070.

72

Speranza, B., Monacis, N., Sinigaglia, M., & Corbo, M. R. (2017). Approaches to

removal and killing of Salmonella spp. biofilms. Journal of Food Processing and

Preservation, 41(1), 1–9.

Strawn, L. K., & Danyluk, M. D. (2010). Fate of Escherichia coli O157:H7 and

Salmonella spp. on fresh and frozen cut mangoes and papayas. International

Journal of Food Microbiology, 138(1–2), 78–84.

Vadlamudi, S., Taylor, T. M., Blankenburg, C., & Castillo, A. (2012). Effect of

chemical sanitizers on Salmonella enterica serovar poona on the surface of

cantaloupe and pathogen contamination of internal tissues as a function of

cutting procedure. Journal of Food Protection, 75(10), 1766–1773.

Van Houdt, R., & Michiels, C. W. (2010). Biofilm formation and the food industry, a

focus on the bacterial outer surface. Journal of Applied Microbiology, 109(4),

1117–1131.

Vanburen, R., Zeng, F., Chen, C., Zhang, J., Wai, C. M., Han, J., Ming, R. (2015).

Origin and domestication of papaya Y h chromosome. Genome Research, 524–

533.

Vandekinderen, I., Devlieghere, F., De Meulenaer, B., Ragaert, P., & Van Camp, J.

(2009). Optimization and evaluation of a decontamination step with

peroxyacetic acid for fresh-cut produce. Food Microbiology, 26(8), 882–888.

Walkling-Ribeiro, M., Noci, F., Cronin, D. A., Lyng, J. G., & Morgan, D. J. (2008).

Inactivation of Escherichia coli in a tropical fruit smoothie by a combination of

heat and pulsed electric fields. Journal of Food Science, 73(8), 395–399.

Walters, M. C. ., Roe, F., Bugnicourt, A., Franklin, M. J., & Stewart, P. S. (2003).

Contributions of antibiotic penetration, oxygen limitation and low metabolic

activity to tolerance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to ciprofloxacin and

tobramycin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 47(1), 317–323.

73

Wang, H., Feng, H., Liang, W., Luo, Y., & Malyarchuk, V. (2009). Effect of surface

roughness on retention and removal of Escherichia coli O157:H7 on surfaces of

selected fruits. Journal of Food Science, 74(1), 1–8.

Wei, X. D., Zou, H. L., Chu, L. M., Liao, B., Ye, C. M., & Lan, C. Y. (2006). Field

released transgenic papaya affects microbial communities and enzyme

activities in soil. Plant and Soil, 285(1–2), 347–358.

Xu, Z., Liang, Y., Lin, S., Chen, D., Li, B., Li, L., & Deng, Y. (2016). Crystal violet and

XTT assays on Staphylococcus aureus biofilm quantification. Current

Microbiology, 73(4), 474–482.

Yang, Y., Mik, M., Zheng, Q., Lee, S., Lee, S., & Yuk, H. (2016). Biofilm formation of

Salmonella Enteritidis under food-related environmental stress conditions and

its subsequent resistance to chlorine treatment. Food Microbiology, 54, 98–105.

Yaron, S., & Römling, U. (2014). Biofilm formation by enteric pathogens and its role

in plant colonization and persistence. Microbial Biotechnology, 7(6), 496–516.

Yaun, B. R., Sumner, S. S., Eifert, J. D., & Marcy, J. E. (2004). Inhibition of

pathogens on fresh produce by ultraviolet energy. International Journal of Food

Microbiology, 90(1), 1–8.

Yoo, S., Ghafoor, K., Kim, J. U., Kim, S., Jung, B., Lee, D.-U., & Park, J. (2015).

Inactivation of Escherichia coli O157:H7 on orange fruit surfaces and in juice

using photocatalysis and high hydrostatic pressure. Journal of Food Protection,

78(6), 1098–1105.

Zhou, B., Luo, Y., Nou, X., Lyu, S., & Wang, Q. (2015). Inactivation dynamics of

Salmonella enterica, Listeria monocytogenes, and Escherichia coli O157: H7 in

wash water during simulated chlorine depletion and replenishment processes.

Food Microbiology, 50, 88–96.

74

9. ANEXOS

Anexo A

1. Valoración del cloro disponible (Greenberg et al., 1992)

Colocar 25 mL de la muestra

Adicionar 10 mL de yoduro de potasio al 10% y 5 mL de ácido acético

glacial, agitar

Titular con solución valorada de tiosulfato de sodio 0.01 M hasta

aparición de color amarillo pálido.

Adicionar 1 mL de solución de almidón al 1%, agitar

Titular con solución valorada de tiosulfato de sodio 0.01 M hasta

desaparición de color azul

Cálculos:

Cloro disponible (ppm) = V1 x N1 x 3.55 x 104

m

Donde:

75

V1 = Volumen de tiosulfato de sodio consumido en la titulación (mL)

N1 = Normalidad del tiosulfato de sodio

m = Cantidad de muestra

Anexo B

2. Valoración del ácido peracético (Greenspan & Mackellar, 1994)

Determinación de la concentración de ácido peracético.

Tomar una muestra de 50 mL de ácido peracético en un vaso de

precipitados.

Añadir 10 mL de ácido sulfúrico 2 N.

Valorar con permanganato de potasio 0.1 N hasta una coloración rosa

tenue y persistente (“a” mililitros consumidos de permanganato de potasio

0.1 N).

Añadir 10 mL de yoduro de potasio al 10%.

Valorar con tiosulfato de sodio 0.1 N, hasta que vire a color amarillo claro.

Se añaden unas gotas de disolución de almidón al 1% con lo que se

tornará oscura la solución.

Valorar con tiosulfato de sodio 0.1 N, hasta que adquiera un aspecto

incoloro (“b” mililitros consumidos de tiosulfato de sodio 0.1 N).

Cálculos:

Sean “a” los mililitros consumidos de permanganato de potasio.

a x 37 = ppm de peróxido de hidrógeno (H2O2)

Sean “b” los mililitros consumidos de tiosulfato de sodio 0.1 N

b x 74 = ppm de ácido peracético

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