VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

RETROSPEKTÍVA MODERNEJ DIAGNOSTIKY RASTLÍN V SR

V POSLEDNÝCH DVOCH DESAŤROČIACH A JEJ SÚČASNÉ

ÚLOHY

RETROSPECTIVE OF THE MODERN PLANT DIAGNOSTICS

WITHIN THE LAST DECADES IN THE SLOVAKIA AND

RECENT DUTIES

Ľubomír Horváth

Oddelenie molekulárnej biológie NRL

ÚKSÚP Bratislava, Hanulova 9/A

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Budovanie moderných laboratórií úradnej fytosani-

tárnej diagnostiky ÚKSÚP

80-te roky, odbor OS

LBGA - biochemické a genetické analýzy rastlín, elektroforetická

identifikácia genotypov rastlín,

SS Haniska - ELISA testy vírusov v zemiakovej sadbe

90-te roky

Budovanie laboratórií v ÚKSÚP Hanulova

1996-1997 – návrh na zriadenie ODMB

1998 – zriadenie ODMB a OMB

1999 presťahovanie ODMB na Hanulovu

1992-1995 Výskumné projekty VTP1, 3VE Výskum biochemických,

molekulárnych a morfometrických techník na identifikáciu organizmov

a VTP2 Budovanie IS ÚKSÚP.

Projekt ELISA rizománia repy

PHARE a TWL projekty FM 1995, 1998

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Roky 2000

1999-2002 Štátny projekt RVT 27-11, 2 úlohy OMB - vývoj a štandardizácia

molekulárnych metód pre detekciu GMO a pre detekciu rastlinných patogénov

PHARE projekty FM 2001-2003 a TWL 2005.

EU negociačný proces, aproximácia EC legislatívy, acquis communitaire

2004 vstup do EU, členstvo OMB v ENGL v pozícii NRL podľa Nar. (ES)

1829/2003.

2006 akreditácia OMB NRL v SNAS podľa ISO/IEC 17025.

2007 členstvo OMB NRL a jeho pracovníkov v databáze EPPO Diagnostic

expertise s plným hodnotením (akreditácia a program kvality ISO17025,

štúdie validácie metód, validačné dáta, proficienčné testy, organiz. školení).

2007 poverenie OMB ako NRL ministrom MPSR podľa Nar. (ES) 882/2004

2007 validácia OMB NRL pre certicfikáciu DNA CRM z EC JRC IRMM

2007 členstvo vedúceho OMB NRL v ENGL Steering Commitee.

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Roky 2010

2011 získanie flexibilnej akreditácie OMB NRL v SNAS podľa ISO/IEC

17025.

Projekty EC JRC IHCP, EC JRC IRMM validačné a certifikačné projekty

Projekty UPOV / EUFRESCO ERA / ANSES / JKI (BBA) Kleinmachnow

validácia metód pre fytoplazmy, huby a bakteriózy zemiakov, štandardizácia

validačného procesu pre fytopatogény, ...

Organizovanie medzinárodných vorkšopov zameraných na fytodiagnostiku a

analýzy GMO. Poradenstvo pre zahraničné inštitúcie ČR, Rumunska,

Slovinska ...

2015 zrušenie odboru diagnostiky ÚKSÚP – zriadenie nového odboru OLČ

zdruţujúceho pre všetky laboratóriá ÚKSÚP. OD nepokrýval iba laboratórnu

činnosť.

2015-2016 zrušenie laboratórií OD v ÚKSÚP BA Hanulova –

presťahovanie do budov ÚKSÚP BA Matúškova.

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Popis a identifikácia odrôd rastlín v PAGE a SDS PAGE. Genetické markery rezistencie, napr. na Puccinia graminis, vyuţitie v šľachtení

pšenice (PVaS, 1992).

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Trendy v diagnostike rastlinných patogénov

v EU a EPPO

Zaradenie fytosanitárnej diagnostiky a úradných fytodiagnostických

laboratórií pod novelizované Nariadenie (ES) 882/2004

Vytváranie referenčných laboratórií EU a národných referenčných

laboratórií súčinnosti s EPPO v období od 2012

Nové úlohy pre členské štáty v oblasti legislatívy a posilnenia

diagnostických činností a kapacít v súlade s poţiadavkami EU,

finančného a personálneho zabezpečenia NRLs

Nariadenie (ES) 882/2004 o úradných kontrolách uskutočňovaných s

cieľom zabezpečiť overenie dodrţiavania potravinového a krmivového

práva a predpisov o zdraví zvierat a o starostlivosti o zvieratá

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Trendy v diagnostike rastlinných patogénov

v EU a EPPO

Návrh postupu budovania referenčných laboratórií EU-RL a NRLs pre diagnostiku rastlinných patogénov a škodcov:

DG SANCO and EPPO „EU Meeting on National reference laboratories for plant pest diagnostics and official analysis“ v Paris 26.-27.3. 2012

2nd EPPO Workshop for heads of laboratories „Plant pest diagnostic laboratories: towards national and regional reference laboratories“Hammamet, 7.-9.5.2013

Pri budovaní EU-RL sa predpokladá kofinancovanie členskými štátmi a EU grantom.

V EU je registrovaných 250 karanténnych organizmov, čo predpokladá vysokú komplexicitu národných sietí. Uvaţuje sa o zriadení viacerých EU-RLs. Predpokladá sa pyramidálna štruktúra EU-RLs a NRLs.

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Trendy v diagnostike rastlinných patogénov

v EU a EPPO

Technické záleţitosti v tejto oblasti sa týkajú nedostatku referenčných materiálov pre fytopatogény, proficienčné testy,

Akreditácia podľa ISO/IEC 17025 je základnou poţiadavkou pre EU-RLs a NRLs.

Pri štarte EU-RLs a NRLs sietí sa budú pouţívať EPPO a IPPC diagnostické protokoly, na prípravu a schvaľovanie legislatívy sa predpokladajú 2-3 roky

Budovanie EU a národných sietí RLs tématicky pokrývajúcich celý rozsah rastlinných komodít, produktov, mnoţiteľského materiálu, rastlín, lesných drevín a porastov

EUPHRESCO (ERA) zabezpečuje a bude zabezpečovať vedeckú podporu a odbornú úroveň diagnostiky EU.

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Úlohy a kompetencie NRLs, článok 33 Nar. (ES)

882/2004

NRL zabezpečuje systém kvality podľa ISO/IEC 17025:2005 pre oblasť

diagnostiky (dohľady, audity, proficienčné testy a úlohy vyplývajúce

z flexibility (validácia a verifikácia metód, atď.).

NRL spolupracuje s referenčným laboratóriom spoločenstva EU-RL v

oblasti svojej kompetencie, poskytuje informácie národným orgánom,

garantuje nové laboratórne metódy a metodické postupy, zúčastňuje sa

medzinárodných validačných testov organizovaných EU-RL.

Národným orgánom a laboratóriám poskytuje vedeckú a technickú pomoc

pri zavádzaní plánov kontrol, zúčastňuje sa odborných rokovaní na

národnej a medzinárodnej úrovni.

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

NRL plní koordinačné, metodické, školiace a poradenské úlohy

vyplývajúce z pozície NRL vo vzťahu k tuzemským laboratóriám, umoţňí

odborné stáţe za účelom harmanizácie diagnostických metód a v prípade

potreby organizuje porovnávacie testy.

Poskytuje odbornú a vedeckú pomoc v prípadoch sporu o výsledok

labaratórneho vyšetrenia iných labaratórií.

NRL je členským laboratóriom národnej a EU diagnostickej siete a

zúčastňuje sa plenárnych zasadaní s príslušným EU-RL

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Aktuálny stav v ÚKSÚP

Rastlinné patogény skúšané na OMB NRL:

Baktérie: Erwinia amylovora, Ralstonia solanacearum, Clavibacter michigenensis ssp. sepedonicus, Clavibacter michiganensis ssp. insidiosus, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Clavibacter michiganensis subsp. tessellarius, Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis, Agrobacterium tumefaciens, Xanthomonas campestris a ďalšie.

Fytoplazmy: Apple Proliferation Group phytoplasma (Candidatus Phytoplasma mali, Candidatus Phytoplasma pyri, Candidatus Phytoplasma prunorum) Aster yellows group phytoplasma, Stolbur group phytoplasma (Stolbur phytoplasma, Bois noir phytoplasma, Grapevine yellows phytoplasma), Elm yellows group phytoplasma (Alder yellows phytoplasma, Flavescence Dorée Grapevine phytoplasma, Robus stunt phytoplasma) a ďalšie.

Vírusy: Cauliflower mosaic virus (CaMV) a iné.

Huby: Monilinia fructicola, Phytophtora ramorum, Phytophtora fragarie, Phytophtora kernoviae a ďalšie.

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Nové úlohy OMB NRL

- Validácia a akreditácia metód pre detekciu fytopatogénov Xylella fastidiosa

a Dickeya solani, v rámci EU projektu „Národný program monitorovania

škodlivých organizmov v SR“ (2015).

- Vývoj metódy pre detekciu geneticky modifikovaného mikroorganizmu

Bacillus subtilis podľa poţiadaviek EC RASFF #159120 v krmivách.

- Projekt JRC/EURL GMFF „Feasibility study: Ready-to-use PCR plates for

detection of Genetically Modified Organisms“ (2015).

- Zabezpečenie zmluvných výkonov pre SIŢP - env. monitoring GMO.

- Zabezpečenie zmluvných porovnávacích testov cDNA real-time PCR na

analýzu génovej expresie pre OUSA Bratislava.

- V zmysle poţiadaviek EU/EC a EPPO rozšíriť analýzy GMO (GMM, UNG,

LLP) a patogénov (Národný program 2015) o DNA sekvenovavanie a

bioinformatické analýzy a GC FAME profiling.

- Technologická náročnosť analýz sa kaţdoročne zvyšuje, kým napr. pre GMO

testy kedysi stačila analýza 2-3 génov, v súčasnosti je to 10-30 génov, vo

výnimočných prípadoch aj viac ako 50 génov.

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Vytváranie zbierok genotypov, kmeňov patogénov

a RM EPPO dotazník okt./nov. 2014

• Lyofilizácia vzoriek, uchovávanie vzoriek v hlbokomraziacich boxoch.

• Dlhodobé štatistiky výskytu a vývoja patogénov (variabilita).

• Vyuţitie popísaných vzoriek ako RM (odrody rastlín, patogény).

Bioinformatika • Špeciálne informačné systémy na uchovávanie a spracovanie dát z

molekulárno-biologických, array, mikrobiologických, morfometrických a

iných typov analýz (BioNumerics, S-PLUS 2000, ...).

OMB NRL vykonáva kontrolu rastlín, odrôd, osív, sadív, rastlinných

produktov, merkantilu, krmív, bioproduktov, potravinových vstupov a

ţivotného prostredia a potenciálnych agensov bioterorizmu (cca 1000

vzoriek/ročne, spolu asi 15 tisíc. individuálnych analýz).

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Aktuálny stav v ÚKSÚP

Beţné vírusy zemiakov - Potato viruses X, Y, M, A, S

Šarka sliviek - Plum pox virus

Viroid vretenovitosti hľúz zemiaka - Potato Spindle Tuber Viroid

Vírus čiarkovitej mozaiky - Wheat streak mosaic virus (WSMV)

Vírus mozaiky uhorky - Cucumber mosaic virus (CMV)

Vírus nekrotickej krúţkovitosti kôstkovín - Prunus necrotic riginspot virus a Vírus zakrpatenosti sliviek - Prune dwarf

Zvinutka zemiakov - Potato leaf roll virus (PLRV)

Fytoplazma chradnutia hrušiek - Pear decline phytoplasma

Proliferácia jablone - Apple proliferation phytoplasma

Bakteriálna škvrnitosť kôstkovín - Xanthomonas arboricola pv. Pruni

Baktériová nekróza aktinídie - Pseudomonas syringae pv. Actinidiae

Baktériová škvrnitosť jahôd - Xanthomonas fragariae

Baktériová škvrnitosť rajčiaka - Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Aktuálny stav v ÚKSÚP

Baktériové vädnutie lucerny - Clavibacter michiganensis subsp. Insidiosus

Baktériové vädnutie rajčiaka - Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis

Hnedá hniloba zemiaka - Ralstonia solanacearum

Krúţkovitosť zemiaka - Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus

Spála jadrovín - Erwinia amylovora

Askochytóza chryzantém - Didymella ligulicola

Biela hrdza chryzantém - Puccinia horiana

Červená hniloba koreňa jahody - Phytophthora fragariae

Hnedospórka - Melampsora medusae

Karanténne sypavky borovíc - Mycosphaerella dearnessii, Mycosphaerella pini

Mazľavá sneť - Tilletia indica

Moniliová hniloba - Monilinia fructicola

Náhle odumieranie dubov - Phytophthora ramorum

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Aktuálny stav v ÚKSÚP

Pleseň na drevinách - Phytophthora kernoviae

Rakovina kôry gaštana - Cryphonectria parasitica

Rakovinovec zemiakový - Synchytrium endobioticum

Tracheomykózne odumieranie jaseňov - Chalara fraxinea

Ţivicová rakovina borovice - Gibberella circinata

Háďatko borovicové - Bursaphelenchus xylophilus

Háďatko deštrukčné - Ditylenchus destructor

Háďatká zemiakové - Globodera rostochiensis a Globodera pallida

Háďatká citrónovníkov a banánovníkov - Radopholus similis a Radopholus citrophilus

sladkovodné ulitníky - Pomacea spp.

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Aktuálny stav v ÚKSÚP

Drozofila - Drosophila spp.

Fúzač čínsky - Anoplophora chinensis

Hrčiarka gaštanová – Dryocosmus kuriphilus

Kukuričiar koreňový - Diabrotica virgifera virgifera

Mínerky – Liriomyza spp.

Skočky – Epitrix spp.

Pracovisko Bratislava - všeobecná diagnostika,bakteriológia, mykológia,virológia, entomológia,nematológia

Pracovisko Zvolen - všeobecná diagnostika, mykológia, entomológia, nematológia

Pracovisko Vígľaš - diagnostika rakovinovca zemiakového a cystotvorných háďatiek zemiakov

Pracovisko Košice - všeobecná diagnostika, mykológia,entomológia, nematológia

Pracovisko Haniska - bakteriológia, virológia, nematológia, molekulárna diagnostika patogénov, pozberové skúšky zemiakov, testovanie ovocných drevín

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

EU trendy v detekcii a identifikácii rastlinných

patogénov Eur.J. of Plant Path. (2006) Vol. 116, No.1, EPPO dotazník okt./nov. 2014

• Posilnenie významu molekulárnych technológií v diagnostike, nástup

špecifických metód real-time PCR, hybridizačných microarray technológií

a FAME profilingu.

• Nové technológie TEM – okrem klasického negatívneho farbenia metódy

kryo TEM, imuno-TEM.

• Vyuţitie analýz DNA - sekvenovania a fragmentačných analýz (RFLP,

AFLP, SSR, SNPs) na genotypizáciu a stanovenie kmeňovej variability

patogénov.

• Automatizácia extrakcie DNA, liguid handling a analýz DNA.

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Family Genus Species Sub-

Species Strain

DNA Sequencing

DNA-DNA reassociation

Real-Time PCR

Molekulárno-biologické detekčné metódy

PCR

Immunology

Microarray

Podľa: Slide from Willy Valdivia-Granda, Orion BioTech

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Proteins DNA Fatty acids

Microscopy &

Image analysis

PAGE

SDS-PAGE

IEF-PAGE

GE-Isoenzymes

GC FAME

ELISA

PCR based methods

PCR-RFLP DNA-hybrid.

real-time PCR

AFLP SSR

DNA sequencing

TEM/STEM

Negat./posit.stain.

Vacuum coating

Cryo-techniques

Sectioning

DOA & Texture analysis

Molekulárne a mikroskopické techniky OMB NRL

RT-PCR

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Vedúci

OMB NRL a SMBL NRL

Skúšobné

molekulárno-

biologické

laboratórium

Laboratórium

elektrónovej

mikroskopie

Laboratórium

referenčných

materiálov

Skúšanie GMO,

rastlinných

komodít a krmív

Manažér kvality

Metrológ

Skúšanie

rastlinných

patogénov

Skúšanie odrôd,

osív a sadív

Príprava

vzoriek

Schéma

Oddelenia molekulárnej

biológie NRL

Zbierka

kmeňov a

genotypov

Príjem a sklad

vzoriek

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Príjem vz.

PC Elfo

PC GMO

PC patogény

PC pracovňa PC vedúci

PC ref.mat.

PC príjem

SK

SK

SK

SK SK

Označ.vz. Sklad prij.vz.

Tlač kódu

Lab1

Lab2

Lab3

Lab RM

Tlač kódu

Označ. RM Sklad RM

Sklad analyz.vz.

Výstupy

Tlač výstupov

RIS

Technolpgický a informačný systém OMB NRL SK – Snímač kódu

RM – Referenčný materiál

BioNumerics

S Plus 2000

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Robotic epMotion 5075 LH & VAC

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Real-time PCR laboratory of the DMB NRL

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

PCR detection of CaMV

Positive CRT gene

191 bp

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

750 bp →

375 bp →

PCR Monilinia fructicola

PCR Phytophtora ramorum

720 bp →

527 bp →

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Real-time PCR detekcia

Monilinia fructicola

Genotypizácia MF

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

PCR/RFLP Test of Potato Stolbur

Phytoplasma

Samples:

1. DNA Ladder

2. Stolbur ref. sample

3. Aster yellows IB

4. Aster yellows IC

5.-9. Positive samples

Cooperation UP Olomouc

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

RESULT OF SPECIFIC PCR TESTS ON ASTER YELLOWS PHYTOPLASMA IN THE

RAPESEED:

A1, B1, C1, D1- diluted 1:10; A2, B2, C2, D2 - diluted 1:50; P- positive controls, diluted 1:50;

P1- positive control, diluted 1:10; S- spike reaction; N- negative control; V- H2O

controls; L1- 1 kb ladder; L2- 100 bp ladder

A1 A2 S B1 B2 P1 L1 L2 P P C1 C2 D L2 D1 D2 S N V V

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

RT PCR Detection of PSTVd

Samples:

2 x positive control

1 x DNA Ladder

2 x Water controls

3 Potato samples

Cooperation BBA Braunschweig

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Strain variability of bacteria Ralstonia solanacearum

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Event Characteristic

Bt11 Cry1Ab corn borer resistance + Glufosinate herbicide tolerance

TC1507 Corn borer, black cutworm and armyworm resistance + Glufosinate herbicide

tolerance

Mon810 Cry1Ab Corn borer protection

Mon863 Corn Rootworm Protection

MonGA21 Glyphosate herbicide tolerance

Nk603 Glyphosate herbicide tolerance

T25 Glufosinate herbicide tolerance

Mon810+GA21 Cry1Ab corn borer resistance + Glyphosate herbicide tolerance

Mon810+Nk603 Cry1Ab Corn borer protection + Glufosinate herbicide tolerance

Mon810+T25 Cry1Ab Corn borer protection + Glufosinate herbicide tolerance

Mon863+GA21 Corn Rootworm Protection + Glyphosate herbicide tolerance

Mon863+NK603 Corn Rootworm Protection + Glyphosate herbicide tolerance

Mon 810+Mon 863 (YG Plus) Cry1Ab Corn borer protection + Corn Rootwoom Protection

TC1507+NK603 Corn borer, black cutworm and armyworm resistance + Glufosinate herbicide

tolerance + Glyphosate Herbicide Tolerance

Mon 810+Mon 863+NK603 Cry1Ab Corn borer protection + Corn Rootwoom Protection

+ Glyphosate Herbicide Tolerance

Príklady autorizovanej GM kukurice

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Nová kategorizácia rastlinných komodít

Konvenčné produkty

Ekologické produkty

GMO produkty

IP produkty (Identity Preservation)

Non-GMO produkty

U IP produktov zákazníci očakávajú záruky čistoty od 0,1% do max. 0,5%,

priebeţne sa vykonávajú štandardné PCR testy všetkých dodávok.

U dodávateľov sa vykonáva audit na dôkaz, ţe vykupujú a spracúvajú výlučne tovar neobsahujúci GMO.

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Limity obsahu GMO v SR a EU

• Autorizované GMO v krmivách, potravinách a merkantile: max 0,9% (konfidenčný interval 95%), Nariadenie (ES) 1829/2003.

• Neautorizované (pending) GMO s pozitívnym hodnotením rizika v potravinách a merkantile: max. 0,5% (konfidenčný interval s 95% spoľahlivosťou).

• Nové Nariadenie (ES) 619/2011 pre krmivá - povolený limit 0,1% pre neautorizované GMO (pending & expired authorisation)

• Neautorizované GMO v potravinách a krmivách: 0% (+ detekčný limit metódy)

• Osivá, odrody, mnoţiteľský materiál: 0% (+ detekčný limit met.)

• Ekologické produkty: 0,9% autorizovaných GMO, ak národná legislatíva nepredpisuje ináč

• IP produkty: 0,1% aţ max. 0,5% (konfidenčný interval s 95% spoľahlivosťou).

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

2001 Prvé PCR testy fytopatogénov v SR

Stolbur

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

Baktérie RS, CMS, EA, Xcc, ..., huby MF, PR, ...

Xanthomonas campestris pv.c.

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015

VI. SRD Nitra, 20.-21.10.2015