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REVISIÓN BIBLIOGRAFICA SOBRE LOS MICROORGANISMOS BIODEGRADADORES DE POLIETILENO DE BAJA DENSIDAD Y SUS
EFECTOS EN EL MATERIAL
Nelson Ricardo Acuña Molina
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACION PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA
BOGOTA D.C. 2017
I
REVISIÓN BIBLIOGRAFICA SOBRE LOS MICROORGANISMOS BIODEGRADADORES DE POLIETILENO DE BAJA DENSIDAD Y SUS
EFECTOS EN EL MATERIAL
Nelson Ricardo Acuña Molina
TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR POR EL TÍTULO DE LICENCIADO EN QUÍMICA
Directores: Jorge Alonso Leyva Rojas Dr.rer.nat
Josué Anselmo García Ortiz MSc. Codirector:
Mario Sánchez Rodríguez PhD.
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACION
PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN QUÍMICA BOGOTA D.C.
2017
II
Nota de Aceptación
Presidente del Jurado
Jurado
Jurado
Bogotá D.C. (01, marzo, 2017)
III
Dedicatoria
A mi madre y a todos los
maestros que incentivaron, y
potenciaron mi curiosidad y
amor a la ciencia, asi como
también a aquellos que me
guiaron y ayudaron para adquirir
mis conocimientos y habilidades
científicas.
IV
AGRADECIMIENTOS Le agradezco a mi madre por su apoyo constante, a mis profesores por todas sus enseñanzas en especial a mis directores y codirector Jorge, Josué y Mario por su esfuerzo y apoyo, a todos mis amigos que con sus consejos y sugerencias contribuyeron de alguna manera en la realización de este trabajo, en especial a David Leonardo Castilla y a Néstor Alexander Zambrano que amablemente aportaron por medio de sus revisiones y sugerencias.
V
CONTENIDO
Pág.
Lista de tablas X Lista de Figuras XI Lista de Gráficas XIII
Lista de Anexos XIV Abreviaturas XV Glosario XVI 1. RESUMEN 1 2. INTRODUCCIÓN 2 3 OBJETIVOS 2 3.1 Objetivos general 2 3.2 Objetivos específicos 3 4. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN 3 4.1. Definición del problema 3 4.2. Reseña histórica 4 4.3 Alternativas para el control del LDPE 5 4.3.1 Enterramiento en rellenos sanitarios del LDPE 5 4.3.2 La incineración del LDPE 5 4.3.3 La Pirólisis del LDPE 6 4.4. Políticas de reciclaje 6 4.4.1 Problema ambiental causado por el LDPE 7 5 MARCO TEÓRICO 7 5.1 Polímeros 8 5.1.1 Plásticos 8 5.1.2 Poli olefinas 8 5.1.2.1.1 El polietileno (PE) 8 5.1.2.1.2 Clasificación del PE 8 5.1.2.1.2.1 Polietileno de baja densidad (LDPE) 9 5.1.2.1.2.2 Polietileno lineal de baja densidad o (LLDPE) 9 5.1.2.1.2.3 Polietileno de alta densidad (HDPE) 9 5.1.2.1.2.4 Causas de la Inercia química del polietileno 10 5.2 Biopolímeros sustitutos del LDPE 10 5.2.1 Biopolímeros naturales 10 5.2.2 Biopolímeros sintéticos 10 5.2.3 Bioplásticos 11 5.2.3.1 Bioplásticos totalmente biodegradables 11 5.2.3.2 Bioplásticos biofragmentables 11 5.3 Biorremediación 11 5.3.1 Biodegradación de polietileno de baja densidad
(LDPE) 11
5.3.1.1 Biodeterioración 12 5.3.1.2 Asimilación 12
VI
5.3.2 Factores a tener en cuenta en la biodegradación del LDPE
12
5.3.2.1 Ruta de la biodegradación del LDPE 13 5.3.2.2 Iniciadores y aceleradores del proceso de
biodegradación, degradación abiótica 15
5.3.2.2.1 Fotólisis 15 5.3.2.2.2 Oxidación térmica 16 5.3.2.2.3 Oxidación mecano química 16 5.3.2.2.4 Mecanismos de despolimerización 16 5.3.2.2.4.1 Iniciación 16 5.3.2.2.4.2 Propagación 17 5.3.2.2.4.3 Terminación 17 5.3.3 Microorganismos reportados que degradan el
polietileno 17
5.3.3.1 Hongos como agentes degradadores de LDPE 21 5.3.3.2 Bacterias como agentes degradadores de LDPE 21 5.3.3.3 Consorcios microbianos 21 5.3.3.4 Enzimas reportadas 22 5.3.3.5 Biodegradación aerobia y anaerobia 23 5.3.3.5.1 Reacción básica de biodegradación de tipo
aeróbico 23
5.3.3.5.2 Reacción básica de biodegradación de tipo anaeróbico
23
5.3.3.6 Efecto en la biodegradación en la humedad del medio
23
5.3.3.7 Efecto del pH en el medio 24 5.3.3.8 Efecto de la temperatura 24 5.3.4 Aditivos utilizados para potenciar la degradación
del LDPE 25
5.3.4.1 El polietileno de baja densidad LDPE con almidón 25 5.3.4.2 Aditivos pro-oxidantes 26 5.3.4.3 Aditivos comerciales 29 5.3.4.4 Biosurfactantes vinculados en la biodegradación
del LDPE 33
5.3.4.5 Sustitutos biodegradables del LDPE 34
5.3.4.5.1 Los polihidroxi alcanoatos PHA 34 5.3.4.5.2 Almidón termoplástico 35 5.4 Técnicas y métodos utilizados en el estudio de la
biodegradación del LDPE 36
5.4.1 Técnicas instrumentales utilizadas para estudiar la biodegradación del LDPE
38
5.4.1.1 Técnicas espectrofotométricas, microscópicas y espectrométricas para el estudio de la degradación del LDPE
40
VII
5.4.1.1.1 Microscopia electrónica de barrido SEM 41 5.4.1.1.2 Microscopia de fuerza atómica 41 5.4.1.1.3
Espectroscopia UV – visible 41
5.4.1.1.4 Espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FTIR)
42
5.4.1.1.5
Espectroscopia de resonancia magnética nuclear NMR
42
5.4.1.1.6 Desorción láser asistida por la matriz con detección de masas por tiempo de vuelo MALDI-TOF MS
42
5.4.1.1.7 Espectrometría de plasma inductivamente acoplada a Emisión Óptica ICP-OES
43
5.4.1.1.8
Espectroscopia de difracción de rayos x (XRD) 44
5.4.1.1.9 Espectrometría fluorescencia de rayos x (XRF) 44 5.4.1.1.10 Espectroscopia de resonancia paramagnética
electrónica EPR 44
5.4.1.1.11 La espectroscopia de absorción atómica (AAS) 45 5.4.1.2 Técnicas cromatográficas para el estudio de la
degradación del polietileno de baja densidad LDPE 45
5.4.1.2.1 Cromatografía de gases acoplado a masas GCMS 45 5.4.1.2.2 Cromatografía de líquidos de alta eficiencia HPLC 46 5.4.1.2.3 Cromatografía de exclusión por tamaño o de
permeación en gel 46
5.4.1.3 Técnicas de análisis de sus propiedades mecánicas: Pruebas de tensión tensile test
47
5.4.1.3.1 Resistencia a la tensión 47 5.4.1.3.2 Módulo de tensión y la elongación hasta la ruptura 47 5.4.1.4 Técnicas de análisis térmico 47 5.4.1.4.1 Calorimetría diferencial de barrido DSC 48 5.4.1.4.2 Análisis térmico mecánico y dinámico DMTA 48 5.4.1.4.2.1 Análisis termo gravimétrico TGA 49 5.4.2 Métodos y pruebas utilizados en los estudios de
biodegradación del polietileno de baja densidad LDPE
49
5.4.2.1
Métodos principales de cultivo de microorganismos degradadores de LDPE
52
5.4.2.2 Medios para la realización de las pruebas 53 5.4.2.2.1 Pruebas de campo (In situ o in vivo) con medios
naturales 53
5.4.2.2.2 Pruebas de simulación con medios seminaturales 53 5.4.2.2.3 Pruebas de laboratorio (In vitro) 53 5.4.2.3 Los inóculos 53 5.4.2.3.1 Cultivos con inóculos amplios o de consorcios 53 5.4.2.3.2 Cultivos microbianos axénicos 53
VIII
5.4.2.3.3 Medios líquidos 53 5.4.2.3.4 Medios sólidos 54
5.4.2.4 Pretratamientos del LDPE 54 5.4.2.4.1 Aclimatación natural 55 5.4.2.4.2 Aclimatación artificial / pruebas de laboratorio 55 5.4.2.4.2.1 Ruptura por hidrólisis 55 5.4.2.4.2.2 Oxidación térmica 55 5.4.2.4.2.3 Procedimiento de foto degradación 55 5.4.2.4.2.4 Procedimiento de termo degradación 55
5.4.2.5 Pruebas de biodegradación 55
5.4.2.5.1 Prueba de enterramiento en suelo 55
5.4.2.5.2 Prueba de compostaje 56
5.4.2.5.3 Prueba de biodegradación en cajas Petri 56
5.4.2.5.3.1 Formación de zonas claras 56
5.4.2.5.4 Prueba de platos con hongos 56
5.4.2.5.4.1 Método de inoculación 56
5.4.2.5.5 Prueba de biodegradación In-vitro 57
5.4.2.5.5.1 Prueba de cultivo líquido 57
5.4.2.5.5.2 Prueba de toxicidad 57
5.4.2.5.6 Pruebas de hidrofobicidad 57
5.4.2.5.6.1 La prueba BATH (Bacterial Adhesion to Hidrocarbons)
57
5.4.2.5.6.2 Prueba de salado SOT (por sus siglas en inglés: salting out test)
58
5.4.2.5.6.3 Estudios de absorción de agua 58
5.4.2.5.6.1 Prueba del ángulo de contacto con agua 58
5.4.2.5.7 Pruebas de enzimas 58
5.4.2.5.8 Pruebas de evolución de gas (CO2 or CH4) 58
5.4.2.5.8.1 La prueba Sturm 59
5.4.2.5.8.2 Radiomarcación 59
5.4.2.5.8.3 Prueba de respiración 59
5.4.2.5.9 Prueba de la pérdida de masa 59
5.4.2.5.9.1 Porcentajes de degradación del LDPE reportados por algunos estudios
60
5.4.2.5.10 Pruebas físicas de la biodegradación 61
5.4.2.5.10.1
Índice de fluidez 61
5.4.2.6 Pruebas de identificación microbiana 62
IX
5.4.2.6.1 Viabilidad del biofilm microbiano 62
5.4.2.6.2 Pruebas de caracterización preliminar 62
5.4.2.6.3 Pruebas de identificación especifica 62
5.4.2.7 Productos de la biodegradación 62
5.5 Metodología propuesta 63
5.5.1 Test de viabilidad cuenta de microorganismos viables por dilución en placa
64
5.5.1.1 Obtención de muestra y selección de los microorganismos degradadores de LDPE en medio líquido SM
65
5.5.1.2 Identificación preliminar 65
5.5.1.3 Pruebas preliminares de identificación de hongos 66
5.5.1.4 Ensayo de biodegradación in vitro 67
5.5.2 Prueba de pérdida de masa 67 5.5.3 Identificación específica 67
5.5.3.1 Técnica polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP)
69
5.5.4 Pruebas instrumentales 69
5.5.4.1 Aplicación del FTIR al estudio de la biodegradación del LDPE
69
5.5.4.1.1 Variantes de la técnica 69
5.5.4.1.1.1 La espectroscopia FT-IR ATR 69
5.5.4.1.1.2 FT-IR reflectancia difusa (DRIFT) 70
5.5.4.1.2
Índices de cuantificación de la oxidación 70
5.5.4.1.2.1 Índice de carbonilo (CI) 70 5.5.4.1.2.2 Índice vinilo (𝐼V) 70
5.5.4.1.2.3 Porcentaje (%) de cristalinidad del LDPE 70
5.5.4.2
Cromatografía de gases acoplada a espectroscopia de masas GCMS
71
5.5.4.2.1 Cuantificación de la producción de CO2 71
6 ANÁLISIS 72
7. CONCLUSIONES 77
8. RECOMENDACIONES 78
9. BIBLIOGRAFÍA 79
X
LISTA DE TABLAS No Pág.
Tabla 1 Microorganismos biodegradadores de LDPE 18 Tabla 2 Enzimas involucradas en la biodegradación del
polietileno 22
Tabla 3 Clasificación esquemática de los diferentes medios ambientes en que ocurre la biodegradación del LDPE
24
Tabla 4 Estudio sobre la biodegradación del LDPE con prooxidantes
26
Tabla 5 Aditivos del polietileno de baja densidad (LDPE) 26
Tabla 6 Algunos aditivos comerciales reportados 29
Tabla 7 Susceptibilidad del polietileno modificado con bionolle
32
Tabla 8 Biosurfactantes producidos por distintos microorganismos
33
Tabla 9 Sustitutos del Polietileno de baja densidad (LDPE) 35
Tabla 10 Técnicas utilizadas para estudiar la degradación del Polietileno de baja densidad (LDPE)
38
Tabla 11 Principales técnicas de análisis térmico 48
Tabla 12. Test y métodos de cultivo usados para evaluar la biodegradación del LDPE
49
Tabla 13 Revisión de los métodos para el estudio de la degradación del LDPE
54
Tabla 14 Posibles residuos de la biodegradación 62
Tabla 15 Resultados en cifras de los elementos estudiados 73
Tabla 16 Reactivos requeridos con sus respectvas concentraciones
105
Tabla 17 Listado de sustancias para los medios y pruebas 111
Tabla 18 Procedimientos sugeridos para la siembra 114
Tabla 19 Relación entre género y resultados obtenidos en las pruebas bioquímicas
115
Tabla 20 Algunas características preliminares bacterianas 116
Tabla 21 Algunas características preliminares bacterianas 117
Tabla 22 Técnicas de muestreo para espectrometría FT-IR para el análisis del LDPE
119
Tabla 23 Condiciones óptimas de corrida cromatográfica 120
XI
LISTA DE FIGURAS Pag.
Figura 1 a Polietileno lineal de baja densidad (LLDPE) 9
Figura 1 b Polietileno de baja densidad (LDPE) 9
Figura 1 c Polietileno de alta densidad HDPE 9
Figura 2 Factores que afectan la biodegradación del LDPE 13
Figura 3 Rutas hipotéticas de transformación del polietileno hasta su total mineralización
14
Figura 4. Biodegradación del PE por β -oxidación 14
Figura 5 Iniciadores de la oxidación del PE 15
Figura 6 Mecanismo de ruptura hemolítica o fotólisis 16
Figura 7 Iniciación a partir de un agente metálico 16
Figura 8 Propagación de la foto oxidación 17
Figura 9 a Mecanismos de oxidación siguiendo las reacciones Norrish tipo 1 y 2
17
Figura 9 b Oxidación para la formación de ácidos grasos o esteres
17
Figura 10 Técnicas y métodos disponibles para el estudio de la degradación del LDPE
37
Figura 11 Esquema metodológico básico propuesto 64
Figura 12 Métodos preliminares de identificación metabólica 66
Figura 13 Metodología a realizar para la identificacion específica 68
Figura 14 Procedimiento para el aislamiento de los microorganismos biodegradadores de LDPE
100
Figura 15 Procedimiento para el cultivo, el aislamiento y la identificación de los microorganismos degradadores de LDPE
101
XII
Figura 16 Procedimiento para aislar los microorganismos degradadores de LDPE y su posterior propagación para realizar la extracción del DNA
102
Figura 17 Ensayo de biodegradación in vitro 103
Figura 18 Método propuesto es el registrado por Mahaku 104
Figura 19 Método tomado para extraer ADN es la registrada por El centro internacional de agricultura tropical-CIAT
105
Figura 20 Cuantificación del DNA microbiano 105
Figura 21 Propuesta metodológica para realizar la técnica RFLP 106
Figura 22 Identificación bacteriana utilizando, prueba de agar LIA, Kligler, tioglicolato y triptófano
107
Figura 23 Pruebas de identificación microbiana, pruebas de almidon, TCI, catalasa oxidasa
108
Figura 24 Pruebas de descarboxilación de lisina ornitina, fenilalanina deaminasa
109
Figura 25 Pruebas RM VP, OF y fermentación de glucosa 110
Figura 26 Medidas a tener en cuenta para la preparación de la muestra cuenta una muestra blanco, de PE no tratado en las pruebas, y un control negativo
118
Figura 27 Método propuesto para analizar el PE degradado 119
Figura 28 Metodología para el análisis de la evolución de CO2 usando GCMS
121
Figura 29 Cromatograma donde se muestran los gases que pueden ser cuantificados por CG-DCT
120
Figura 30 Metodología para el análisis de metabolitos usando GCMS
121
XIII
LISTA DE GRÁFICAS Pág.
Gráfica 1. A Variación de la producción de mundial de plásticos desde 1950 hasta 2010
4
Gráfica 1. B Variación de la producción de mundial de plásticos desde 1950 hasta 2013
4
Gráfica 2. Proporción de géneros reportados que se encuentran vinculados con la biodegradación de (LDPE)
75
Gráfica 3. Técnicas más utilizadas para estudiar la biodegradación del LDPE
76
XIV
LISTA DE ANEXOS
Pág.
ANEXO A1. Aislamiento y cuenta de los microorganismos biodegradadores de LDPE
100
ANEXO A2. Cultivo de microorganismos biodegradadores de LDPE
101
ANEXO B. Purificación de microorganismos biodegradadores de LDPE
102
ANEXO C Prueba de biodegradación de LDPE 103
ANEXO D Extracción de DNA de hongos 104
ANEXO E. Extracción de DNA de bacterias 105
ANEXO F. Discriminación entre grupos microbianos utilizando RFLP
106
ANEXO G1. Pruebas de identificación bacteriana 107
ANEXO G2. Pruebas de identificación bacteriana 108
ANEXO G3. Pruebas de identificación bacteriana 109
ANEXO G4. Pruebas de identificación bacteriana 110
ANEXO H Listado de sustancias para los medios y pruebas 111
ANEXO I Procedimiento sugeridos para la siembra 114
ANEXO J1 Tabla de características preliminares bacteriana 115
ANEXO J2 Características preliminares bacterianas 116
ANEXO J3 Características preliminares bacterianas 117
ANEXO K1 Procedimiento para el análisis del polietileno usando FTIR
118
ANEXO K2 Procedimiento para el análisis del polietileno usando FTIR
119
ANEXO L1 Cuantificación de la producción de CO2 e identificación de metabolitos
120
ANEXO L2 Cuantificación de la producción de CO2 e identificación de metabolitos
121
XV
ABREVIATURAS AFM: Microscopio de fuerza atómica. (del inglés Atomic Force
Microscopy) CI: Carbonyl Index CL: Chimio Luminicence DSC: Diferential Scaning Calorimetry EA: Elemental Analizer ESR: Electron spectroscopy resonance FTIR-ATR: free time infrared Attenued total refractance FTIR: Free time infrared GCMS: Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry HPLC: High Phase Liquid Cromatography HDPE: High density polyethylene IV: Vinyl Index ICP-OES: inductively coupled plasma-optical emission
spectroscopy LDPE: low density polyethylene LLDPE: Linear low density polyethylene MALDI-TOF: Matrix assisted Laser Desorption time of flight NMR: Nuclear Magnetic Resonance OM: Optical microscopy PBS: Polybutylene succinate PBSA: Poly Butylen Succinate Adipate PCL: Polycaprolactone PC: Polycarbonate PCR: Polymerase Chain Reaction PE: Polyethylene PES: Polyethylene Succinate PET: Poly ethylene tereftalate PHB: Polihidroxibutirato PHBV: Poli-3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato PMMA: Poly methyl metacrilate PP: Polypropylene PS: Polyestyrene PVC: Polyvinylchloride RFLP: Restriction Fragment Lenght Polymorphisms SEC: size exclusion chromatography SEM: Scanning electron microscopy TGA: Thermogravimetric analysis TLC: Thin lawyer chromatography UVS: Ultraviolet Spectroscopy
XRD: X-Ray Difraction
XVI
GLOSARIO
BIODEGRADACIÓN: es un proceso gradual de descomposición o acumulación causado por seres vivos, los cuales llevan a un cambio químico y estructural de las sustancias o materiales orgánicos e inorgánicos contaminantes. BIOCOMPATIBILIDAD: En 1987, la sociedad europea de biomateriales definió la biocompatibilidad como la habilidad de un material de actuar con una adecuada respuesta al huésped en una aplicación específica. BIOFILM: Es una formación celular junto a los productos metabólicos de tales células que crecen en la superficie de un material o sustancia. BIOREMEDIACIÓN: Es un tipo de biotecnología denominada biotecnología verde caracterizada por el uso de seres vivos o sus productos metabólicos para el control de contaminantes. BIOSURFACTANTES: son un grupo heterogéneo de metabolitos secundarios, producidos por seres vivos, principalmente por hongos y bacterias. Estas moléculas tienen propiedades emulsificantes y dispersantes, disminuyen la tensión superficial del agua de 72 a 25 mN/m aproximadamente. BIOTECNOLOGÍA: La biotecnología se define como: "Cualquier aplicación técnica que usa sistemas biológicos, organismos vivos o sus derivados, para fabricar o modificar productos o procesos para un uso específico” [1]. La biotecnología ha existido desde que la raza humana utilizó por primera vez la fermentación para hacer pan, queso y vino [1]. POLÍMERO BIODEGRADABLE: no especifica el tiempo y las condiciones bajo las cuales el polímero se degrada, solo indica que es degradable. CLONACIÓN: obtención de una población homogénea de células por el aislamiento de colonias individuales repetidas. De esto también se obtienen en forma pura cualquier número moléculas de DNA recombinante portadas por tal célula, el término es también usado en este contexto (frecuentemente como clonación de genes) y por una mayor extensión (con menor justificación) para las reacciones usadas en estas construcciones de tales recombinantes [2]. CROMÓFOROS: son los grupos funcionales que absorben ciertas longitudes de onda del espectro visible y refleja otras. COMPOSTABLE: material que se degrada en condiciones de compost, y cuyo nivel de biodegradación debe ser de al menos un 90% y debe ser logrado en menos de seis meses de acuerdo a la European standard on compostable packaging materials, EN13432. ENLACE COVALENTE: es una unión de dos o más átomos de elementos distintos, que se caracteriza por que los electrones externos de enlace son compartidos de forma simétrica.
XVII
FOTOLISIS: ruptura de un enlace mediante la energía transferida por fotones (luz) altamente energética, ejemplo UV. FUENTE DE CARBONO: es el material o sustancia que provee a los microorganismos de carbono, ejemplo: el polietileno. METABOLITO: producto bioquímico generado en el metabolismo celular. MINERALIZACIÓN: acción natural de transformación de compuestos químicamente complejos a otros de poca o ninguna complejidad. MONÓMERO: una estructura mínima o básica que se puede unir para formar una cadena o macro estructura. OLEFINA: compuestos químicos a base de carbono y que poseen enlaces dobles. POLÍMERO: es una macromolécula o aglomeración de muchos monómeros los cuales están unidos por enlace covalente. PROOXIDANTES: sustancias químicas que en virtud de su naturaleza química generan reacciones de oxidación. RADICALES LIBRES: son especies que contienen electrones de valencia desapareados los cuales son bastante reactivos. RELAJACIÓN: procesos de pérdida de viscoelasticidad, son fenómenos cinéticos, también denominado dispersiones. Cuando un material polímero se desplaza de su equilibrio por efecto de solicitaciones externas, el sistema tiende a volver a su estado inicial al cesar éstas. TERMOPLÁSTICOS: son plásticos que son reformables o remoldeables cuando se les aplica una temperatura y presión. TRANSICIÓN VÍTREA: se define como la temperatura a la cual un polímero amorfo (o la región amorfa de un polímero parcialmente cristalino) cambia de una situación de ser duro y relativamente quebradizo a una condición viscosa y gomosa. VISCOELASTICIDAD: cuando los materiales poliméricos disipan (calentándose o deformándose) una parte de la energía con que se les excita. XENOBIÓTICO: sustancia de origen antropogénico y que puede afectar negativamente a los seres vivos.
1
1. RESUMEN
El uso irracional y la resistencia a la degradación ambiental son las causas de que el polietileno de baja densidad (LDPE del ingles low density polyethylene) se acumule, lo que genera un grave problema medioambiental [3], debido a esto se han hecho investigaciones en la búsqueda de soluciones al problema, siendo las más importantes el sustituir completamente el LDPE o acelerar su proceso de biodegradación. El presente trabajo es un estudio bibliográfico en el cual se recopilan, comparan y organizan amplia y sistemáticamente los aspectos más relevantes reportados sobre la biodegradación del polietileno de baja densidad (LDPE) en los cuales están incluidos: los microorganismos capaces de utilizarlo como fuente de carbono; las enzimas utilizadas y la comparación de sus eficiencias a partir de la pérdida de masa, considerando las condiciones en las que se realizaron dichas pruebas; todas las técnicas de análisis disponibles, los aditivos o sustitutos existentes; Finalmente se propone una estrategia metodológica de identificación de los microorganismos y cuantificación de la biodegradación que sea adecuada para su implementación local. Palabras clave: Polietileno de baja densidad, biodegradación, microorganismos, pruebas espectroscópicas y microscópicas. ABSTRACT Irrational use and resistance to environmental degradation are the causes of Low Density Polyethylene (LDPE) accumulating, which generates a serious environmental problem [3], due to this research has been done in the search for solutions to the problem, the most important being to completely replace the LDPE or accelerate its biodegradation process. The present work is a bibliographical study in which the most relevant aspects reported on the biodegradation of low density polyethylene (LDPE) are collected, compared and organized in a broad and systematic way, including: microorganisms capable of being used as a source of carbon ; The enzymes used and the comparison of their efficiencies from the loss of mass, considering the conditions under which the tests were performed; All available analytical techniques, existing additives or substitutes; Finally, a methodological strategy for the identification of microorganisms and the quantification of biodegradation that is adequate for their local implementation is proposed. Keywords: Low density polyethylene, biodegradation, microorganisms, spectroscopic and microscopic proofs.
2
2 INTRODUCCIÓN
Globalmente se desechan 57 millones de toneladas anuales de polietileno de baja densidad LDPE, (por lo menos para el año 2005) [4]. Tan solo en Bogotá se desecha un estimado de 428 toneladas anuales, y este material puede tardar entre 100 y 1000 años para degradarse, por lo que su acumulación genera graves problemas [5]. Como forma de afrontar este desafío los investigadores han tomado dos enfoques principales: la búsqueda de posibles sustitutos o aditivos y el desarrollo de tecnologías y/o biotecnologías que permitan la biodegradación acelerada del polímero. Como posibles sustitutos se encuentran los biopolímeros alternativos como el polihidroxibutirato (PHB), sin embargo aún poseen altos costos de producción que los hacen poco competitivos [6, 7], actualmente, los esfuerzos se dirigen a la búsqueda de sustratos de menor costo [6, 7]. Otro biopolímero muy utilizado es el almidón, debido a que es altamente biodegradable, no obstante también tiene limitaciones como su baja resistencia a la humedad, baja procesabilidad e incompatibilidad con algunos polímeros hidrofóbicos [8]. Entre las tecnologías desarrolladas se encuentra la pirólisis pero es muy cara y consume mucha energía y la incorporación de aditivos estimulantes del proceso de biodegradación al LDPE, como ejemplos están el almidón, la celulosa, los prooxidantes y surfactantes los cuales contrarrestan su inercia y resistencia al ataque microbiano [9, 10, 11] sus inconvenientes esta en que aumentan los costos y generan residuos potencialmente contaminantes, a diferencia de las antes mencionadas la biotecnología es una alternativa popular por sus bajos costos y su relativo bajo impacto ambiental, su único inconveniente es el largo tiempo que aún se toma en degradar el LDPE. Los investigadores que han estudiado la biodegradación del LDPE en todas sus etapas y condiciones, se han apoyado en técnicas físico-químicas e instrumentales, tales como: propiedades mecánicas, microscopia de fluorescencia, espectroscopia infrarroja (FTIR), o cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GCMS), entre muchas otras, ya sea para identificar los microorganismos degradadores y sus enzimas, los productos intermedios o finales y la velocidad de la biodegradación.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL
Realizar una revisión bibliográfica sobre la biodegradación del polietileno,
en el cual se analicen las técnicas actuales en el estudio de la biodegradación del polietileno de baja densidad, además de aquellos microorganismos que naturalmente lo degradan, y a partir de los resultados proponer una metodología viable, que permita identificar los microorganismos biodegradadores del LDPE y su eficiencia.
3
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Realizar una revisión bibliográfica sobre los estudios de la
biodegradación del LDPE. Aportar una propuesta metodológica que permita identificar los
microorganismos que degradan el LDPE, aislados en los rellenos sanitarios y humedales ubicados en la sabana de Bogotá, incluyendo su posible eficiencia degradadora, que sea viable, rápida y eficiente teniendo en cuenta las condiciones de los centros de estudio de Colombia.
4 ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN
4.1 DEFINICIÓN DEL PROBLEMA
En el mundo la producción de plásticos para el año 2014 alcanzó la cifra de 311 millones de toneladas, entre estos los polímeros más utilizados están el: polietileno (PE), polipropileno (PP), poli cloruro de vinilo (PVC), polietileno-tereftalato (PET), poli estireno (PS), policarbonato (PC), y poli metil metacrilato (PMMA) (Plexiglás) [12]. (Ver Grafica 1) Estos siete polímeros componen cerca del 98% de todos los polímeros y plásticos encontrados en la vida diaria [12], de los cuales el 39,5% se utiliza en empaques desechables [13, 14]. De la producción total, el polietileno y el polipropileno componen el 48%. [15]. Y de acuerdo estimaciones son desechadas aproximadamente 57 millones de toneladas anuales de polietileno [16, 17]. El polietileno (PE) al igual que todos los demás plásticos posee una vida de alrededor de 1000 años y debido a que su velocidad de degradación o porcentaje de reciclaje es mucho menor que su producción y eventual desecho se genera su acumulación en ríos, mares y suelos, amenazando la diversidad biológica global, ya gravemente afectada. Para conocer los efectos de su acumulación (ver problema Ambiental causado por el polietileno PE no reciclado). América latina produjo en el 2014 el 5 % de la producción total [14], siendo el polietileno el de mayor demanda con un 37%, y el 9% corresponde al LDPE [5], gran parte será desechado y terminara en los ecosistemas naturales, y considerando que América Latina cuenta con el mayor número de países más ricos en biodiversidad [18], se puede entender la magnitud del problema. En Colombia el 14% de todos los residuos que se arrojan corresponde a desechos plásticos [19]. El polietileno de baja densidad al ser un xenobiótico representa una amenaza para los ecosistemas colombianos los cuales poseen el segundo lugar en biodiversidad con 56.343 especies [20], por lo que es crucial que se tomen medidas pertinentes para que esta no se vea afectada. En Bogotá en el 2005 la unidad ejecutiva de servicios públicos-UESP (actualmente unidad administrativa especial de servicios públicos-UAESP) juntó a la universidad de los Andes estimó que para ese año llegaron 950 toneladas de materias primas reutilizables MPR, de los cuales el 45% (428) correspondían a residuos
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plásticos, de éstos la mayor cantidad correspondía al polietileno de alta densidad HDPE (por sus siglas en ingles High density polyethylene) [5, 21] y para el año 2011 entre los residuos sólidos residenciales el polietileno correspondía al 62% [5].
Gráfica 1 a Variación de la producción de mundial de plásticos desde 1950 hasta 2010, tomada de [22]; 1. b Variación de la producción de mundial de plásticos desde 1950 hasta 2013. Basada en los datos de PlasticsEurope del 2010 y 2013 [23, 14].
4.2 Reseña histórica
Durante 60 años, desde la primera mitad del siglo XX el crecimiento de la producción ha sido exponencial como lo muestran las Gráficas 1a y 1b. Actualmente presenta un crecimiento anual del 1,5% de acuerdo a Plastic Europe [14]. Comúnmente se había pensado que los plásticos no eran tóxicos para el medio ambiente y no se consideraban xenobióticos, por lo que no se hacían estudios o campañas para su minimización y control, se desmintió en estudios hechos en la década de los setenta, en los que se demostró la presencia de partículas pequeñas de plástico en la superficie del mar Sargasso en 1971, que causaban la muerte a muchos seres vivos que las ingerían [24, 25], en los ochentas y noventas se había demostrado concluyentemente que los plásticos estaban muy lejos de ser inofensivos. Los primeros estudios sobre la biodegradación del polietileno se remontan al año 1980 por los investigadores AC Albertsson [9] y ZG banhidi, los cuales muestran la realización de estudios sobre la producción de 14CO2 por los hongos Fusarium rodolens. Acremonium kiliense, Aspergillus versicolor y Verticillium lecanii que eran alimentados con láminas de polietileno de alta densidad HDPE marcadas con 14C, con lo cual confirmaban que el plástico era la fuente de carbono. Posteriormente en 1991 se encontró que las especies Streptomyces badius 252, Streptomyces, setonii 75Vi2, y viridosporus de Streptomyces T7A producían una enzima extracelular degradadora de
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polietileno puro o con aditivos, como almidón, pro oxidantes, también se descubrió que eran enzimas degradadoras de lignocelulosa [26] [27]. En 1998 Iiyoshi y colaboradores [28] demuestran la biodegradación del PE por los enzimas lignina peroxidasa, manganeso peroxidasa y la fenol oxidasa o lacasa, basados en varios estudios hechos sobre biodegradación de lignina entre los cuales se podrían nombrar los hechos por Kirk TK, Farrell RL en 1987 [29]. Los bioplásticos no son nada nuevo, los primeros producidos datan de 1845, cuando se produjo por primera vez el ácido poli láctico (PLA), un poliéster termoplástico, hecho a partir de la fermentación de productos agrícolas como almidón de maíz, La Dow químicos revivió la producción de PLA en 1950, pero los altos costos de producción detuvieron su uso masificado [30]. En 1980, la British chemical industries (ICI) desarrolló Biopol, un bioplástico a partir de los polímeros poli hidroxialcanoatos PHA que son producidos por muchas especies de bacterias a partir de azucares de plantas o aceites, pero una vez más, la ICI fue incapaz de producir biopol de forma económica como para competir con plásticos convencionales [30]. Monsanto compró Biopol a ICI en 1996 [30]. En 1998. Monsanto descontinuo la operación de producción de bioplasticos debido a los altos costos y las limitadas oportunidades comerciales [30]. Monsanto vendió sus acciones a la U.S. bioscience company, Metabolix que inició investigaciones y desarrollo de procesos de manufactura de plásticos a base de PHB a bajos costos [30]. En el 2006, metabolix se unió a la gigante agricultora Archer Daniels Midland para comercializar un bioplásticos denominado Mirel compañía que lidera la producción y venta de bioplásticos para productos de uso diario, tanto de larga vida como desechables [30], claro está, a precios más caros que los producidos con plásticos a partir de materias petroquímicas. Por otro lado otros autores afirman que los siguientes PHA el Poli (butileno Succinato) (PBS), poli (etileno Succinato) (PESu), o el copolímero poli (butileno Succinato -co-butilen adipato (PBSA), son miembros de un grupo denominado comercialmente como ‘Bionolle’ inventados por Showa Denko (Japón) in 1990. [31, 32, 33, 34, 35, 36]. Durante el presente siglo veintiuno, ha habido toda una explosión de investigaciones en torno a éste tipo de materiales, de los cuales se ha basado parte de esta investigación.
4.3 Alternativas para el control del LDPE
4.3.1 Enterramiento en rellenos sanitarios del LDPE
El enterramiento tiene asociadas sus propias limitaciones, como que la tierra permanece inutilizable por un largo periodo de tiempo, de no ser por eso la tierra se podía utilizar para la agricultura y otras actividades relacionadas [37]. La tasa de degradación del polietileno es muy lenta en los rellenos, debido a que es un ambiente anaerobio, siendo degradado en alrededor de 500 años [38, 39].
4.3.2 La incineración del LDPE
Es común en países en desarrollo, hacer esto libera gases como: CO, CO2, PAHs, CCl4, dioxinas y furanos, etc. causantes de enfermedades como el
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cáncer de pulmón, ataques cardiacos y desordenes respiratorios como el asma. [40, 41, 42], Los productos finales de la incineración son cenizas y gases. Se estima que la huella de carbono del LDPE o polietileno es cercana a 6 kg CO2 por kg de plástico [43].
4.3.3 La pirólisis del LDPE
Una forma de eliminación de los residuos plásticos es a través de la pirolisis, muchos investigadores han estudiado la pirolisis del polietileno [44, 45]. La pirólisis con plasma es un método efectivo para destruir el polietileno de una manera ambientalmente amigable. El método usa una antorcha de plasma en un ambiente carente de oxígeno. El método tiene lugar a muy altas temperaturas (usualmente entre 325°C - 850°C). Las variaciones en temperatura durante la pirólisis causan la producción diferentes gases. Por lo tanto, a baja temperatura, usualmente los gases que se producen son: dióxido carbono, etileno, propileno, monóxido de carbono, butadieno y metano, mientras que, a altas temperaturas se producen adicionalmente: dióxido de carbono, monóxido de carbono y etileno, benceno, metano e hidrógeno [38, 46]. Sus inconvenientes son los altos costos por el elevado consumo energético y las tecnologías.
4.3.4 Políticas de reciclaje
El reciclaje como hábito, debe ser parte de las buenas costumbres de toda
nación, desafortunadamente se estima que solo el 1% del plástico desechado a
nivel mundial se recicla [14], aunque existen ejemplos alentadores de que si es
posible su máxima recuperación mediante el reciclaje, por ejemplo en el 2012
en el continente europeo la recuperación de energía alcanzó el 62% a través
del reciclaje, siendo uno de los mejores índices de reciclaje [14].
En la actualidad el reciclaje disminuye los impactos negativos y la demanda de
materias primas vírgenes. Aunque cabe mencionar que existen múltiples
restricciones, por lo que no es una solución íntegra para la problemática
ambiental y entre estos inconvenientes están:
Los termoplásticos pueden no ser reciclados si están tan contaminados que es más costoso limpiarlos que botarlos [5].
Los plásticos pierden sus buenas cualidades a medida que son reciclados, debido a las reacciones químicas, por lo que en la práctica el reciclaje se limita a unas cuantas veces.
El reciclaje no deja mucha ganancia y a veces es nula, por lo que solo es viable cuando hay mucha ganancia de por medio.
La separación de los plásticos no es tan fácil, debido a que no todos los plásticos son iguales se requiere personal capacitado, lo cual no es barato [5].
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4.4 Problema ambiental causado por el LDPE
Se ha informado la muerte de animales terrestres y acuáticos debido al consumo o atrapamiento en bolsas de polietileno [32]. El polietileno bloquea su tracto digestivo, también se sabe que los restos del polietileno no digerido después de la muerte de los animales son de nuevo ingeridos por algún otro animal lo que le ocasiona la muerte, y el ciclo continúa [47]. El polietileno no digerido es responsable de varios problemas en animales entre los que se podría mencionar:
Dificulta el proceso digestivo, el proceso de fermentación y el correcto mezclado de los alimentos en el estómago [47].
El polietileno ingerido bloquea la apertura entre el omaso y retículo que llevan a la muerte del animal si el polietileno no se retira [47].
La impacción: debido a la acumulación de una gran cantidad de rumen las bolsas de polietileno conducen a una ruminotomía [47].
El timpanismo: debido al bloqueo del retículo y omaso con el polietileno, la acumulación de gases del rumen llevan a la muerte del animal si no se quita apropiadamente [47].
La inmunosupresión: la acumulación de polietileno en el estómago de los animales (la vaca) lleva a una sensibilidad aumentada a las infecciones como el septicemia hemorrágica [47].
Debido a la polución “blanca” en el medio ambiente marino, mínimo 267 especies están siendo afectadas en las que se incluyen todos los mamíferos, tortugas marinas (86%) y aves marinas [48]. Quizá como material no sea químicamente tóxico, pero en los productos plásticos pueden existir monómeros residuales no unidos químicamente, agentes polimerizántes, productos de degradación, los cuales se podrían filtrar en los alimentos, podrían ser los ftalatos que son plastificantes usados para hacer a los plásticos suaves y flexibles como por ejemplo el bisfenol A, el Di-2-Etil Hexil ftalato (DEHP), di-n-butil ftalato (DBP)y el butil bencil ftalato (BBP), los cuales están asociados a anormalidades reproductivas, tal como un bajo conteo de esperma, cambios hormonales, engrandecimiento de las glándulas de la próstata, anormalidades en el número de cromosomas en los óvulos y cambios precancerosos en el seno y la próstata, obesidad y resistencia a la insulina [49]. El enterramiento de las bolsas y láminas de polietileno en el suelo provoca fenómenos como la obstrucción del agua, provocando la pérdida de fertilidad y devastación del suelo para el cultivo agrícola [32, 11].
5 MARCO TEORICO
A continuación se presentarán brevemente los conceptos más importantes en
este estudio.
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5.1 Polímeros
Son sustancias macromoleculares, lo que significa que tienen un alto peso
molecular y que se forman por la unión de unidades moleculares discretas
denominadas monómeros, las cuales están unidos entre sí mediante enlace
covalente.
5.1.1 Plásticos
Son polímeros sintéticos generalmente de naturaleza química hidrófoba, que
normalmente poseen una alta durabilidad y resistencia, suelen no tener un
punto de fusión fijo y poseen en determinado intervalo de temperaturas
características flexibles y moldeables. Se calcula que pueden tardar entre 100 y
1000 años para degradarse dependiendo del tipo de plástico [42, 40, 50]. La
american Society for testing materials (ASTM) define plástico como:
“Cualquier material de un extenso y variado grupo que contiene como elemento
esencial una sustancia orgánica de gran peso molecular, siendo sólida en su
estado final; ha tenido o puede haber tenido en alguna etapa de su manufactura
(fundido, cilindrado, prensado, estirado moldeado, etc.) diferentes formas de
fluidificación, junta o separada, de presión o calor”.
5.1.2 Poli olefinas
Las poli olefinas son polímeros saturados compuestos exclusivamente por
carbono e hidrogeno y tienen un amplio rango de aplicaciones. Son ejemplos el
polipropileno PP y el polietileno PE, cuya fórmula general es CnH2n donde “n”
es el número de átomos de carbono, estos son los más usados por la
versatilidad que presentan y además son producidos a partir de materias
primas petroquímicas baratas [29].
5.1.2.1.1 El polietileno (PE)
El polietileno es un termoplástico compuesto exclusivamente por carbono e
hidrogeno, cuya formula general es [CH2CH2CH2]n que es un tipo común de
plástico, debido a muchas de sus cualidades y propiedades [51]. Algunas de las
cuales son: cristalinidad 50 a 60%, temperatura de fusión entre el rango de 110-
115 °C. Aunque existen múltiples tipos de PE pueden ser clasificados por un
rango de densidad 0.910-0.940 [g/cm3] [52].
5.1.2.1.2 Clasificación del PE
El polietileno al igual que cualquier polímero no posee un único grado de
cristalinidad, e incluso una sola muestra puede poseer varios grados de
cristalinidad agregados, sin embargo el polietileno tradicionalmente y por
cuestiones mecánicas, de apariencia y practicidad se puede clasificar en tres
tipos básicos de acuerdo a su grado de polimerización:
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5.1.2.1.2.1 Polietileno de baja densidad LDPE
Su estructura es muy ramificada (en cerca de 2% de los átomos de carbón)
[51]. Su peso molecular es de 100.000-300.000 [g/gmol] y su densidad es de
0,90-0,91 [gr/cm3] siendo el de menor densidad y esto se ve reflejado en sus
cualidades reológicas, se usa en la fabricación de bolsas desechables.
5.1.2.1.2.2 Polietileno lineal de baja densidad o (LLDPE)
El cual es una variante poco ramificada, se podría clasificar como de
cristalinidad intermedia, con un valor de 0,915 g/cm3 siendo relativamente
compacto.
5.1.2.1.2.3 Polietileno de alta densidad (HDPE)
Su estructura presenta el mayor grado de linealidad, su peso molecular es de
200.000-400.000, [g/gmol] y su densidad es de 0,94-0,97 0,91-0,94[gr/cm3],
debido a esto es un material muy rígido y fuerte siendo usado en la fabricación
de canecas plásticas.
4000
a)
b)
c)
1000
1000 Figura 1 estructuras del polietileno, a) polietileno lineal de baja densidad (LLDPE); b) polietileno de baja densidad (LDPE);c) pol ietileno de alta densidad HDPE.
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5.1.2.1.2.4 Causas de la Inercia química del polietileno
De acuerdo a Arutchelvi [53], el polietileno pero también las poliolefinas en
general son materiales inertes no susceptibles a la biodegradación por las
siguientes razones:
Por los esqueletos hidrofóbos, que consisten en largas cadenas de carbono, los cuales poseen una gran resistencia frente a la hidrólisis.
En algunos casos por la adición de antioxidantes y estabilizantes durante su manufactura.
Alto peso molecular. Alta densidad de empacamiento. Su presencia reciente en el planeta es causa de que las enzimas de los
microorganismos no hayan evolucionado completamente para degradar el material sintético [54, 32]. Sin embargo la evolución en la especificidad de las oxidoreductasas secretadas por los microorganismos es relativamente rápida [55, 31].
5.2 Biopolímeros sustitutos del LDPE
Los biopolímeros son materiales totalmente degradables, que dependiendo de
su origen pueden ser denominados biopolímeros naturales o sintéticos.
5.2.1 Biopolímeros naturales
Los biopolímeros naturales son materiales macromoleculares sintetizados por
las plantas, los animales, los hongos o bacterias, los naturales son comúnmente
utilizados como fuente de energía o como andamiaje estructural, son
rápidamente degradados, entre estos están: los ácidos nucléicos, las proteínas,
la celulosa, los ácidos murámicos, la amilosa, la amilopectina y muchos más.
5.2.2 Biopolímeros sintéticos
Los biopolímeros sintéticos son materiales macromoleculares sintetizados por
el hombre, los biopolímeros antropogénicos tienen la cualidad de ser
biocompatibles y biodegradables.
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5.2.3 Bioplásticos
Son materiales plásticos sintéticos, semisintéticos o naturales con
características similares a los plásticos tradicionales, pero con la ventaja de ser
degradables, pueden ser mezclas de polímeros sintéticos con naturales, o
pueden ser plásticos totalmente sintéticos, pero degradables, por ejemplo
están: el polietileno de baja densidad y el almidón termo plástico LDPE + TS
(del inglés: thermoplastic starch) o el poliácido glicólico (PGA) (del inglés poly
glycolic acid), el poliácido láctico PLA (del inglés poly lactic acid) y el
polihidroxibutirato PHB, los tres últimos mencionados son poliésteres y por lo
tanto son susceptibles a la hidrólisis de sus enlaces éster, de acuerdo a su
composición y velocidad de degradación pueden ser agrupados en dos grandes
clases [56].
5.2.3.1 Bioplásticos totalmente biodegradables
La sociedad americana para las pruebas y materiales (ASTM) (del inglés
American Society for Testing and Materials) y la organización internacional de
estándares (ISO) (del inglés International Standards Organization) define
plásticos degradables como:
“Aquellos que sufren un cambio significativo en la estructura química bajo
condiciones ambientales específicas. Estos cambios resultan en una pérdida de
propiedades físicas y mecánicas, medidos por métodos estándar. Los plásticos
biodegradables sufren degradación por la acción de microorganismos naturales
tales como bacterias, hongos, y algas” [12].
5.2.3.2 Bioplásticos biofragmentables
Los biopolímeros biofragmentables son mezclas de materiales, no son
completamente biodegradables, están compuestos de un componente
completamente degradable y un componente capaz de ser biodegradado,
ejemplo: polietileno y almidón, aunque estos tipos de mezclas de polímeros no
son completamente biodegradables, son efectivos para la reducción del
volumen de residuos de plásticos por fragmentación [57].
5.3 Biorremediación
Comprende la aplicación de agentes biológicos, principalmente microorganismos como catalizadores biológicos para degradar, desintoxicar o acumular productos químicos contaminantes.
5.3.1 Biodegradación de polietileno de baja densidad (LDPE)
El término “biodegradabilidad de polietileno” condujo a una confusión entre los científicos de polímeros y los microbiólogos, originados por el hecho de que
12
para los científicos de polímeros, la degradación significa la perdida de las propiedades físicas, mientras que para los microbiólogos es la completa mineralización del material [55]. De acuerdo a una nueva definición el término biodegradación incluye los factores bióticos y abióticos los cuales actúan sinérgicamente para descomponerlo en materia orgánica [31]. En un sentido estricto el LDPE se degrada por lo tanto es biodegradable, pero de acuerdo a Ohtake et al 1998 [58] una lámina de LDPE de 60µm se tarda completamente en degradar 300 años, y de acuerdo a muchas publicaciones esta estimación implica una tasa constante de biodegradación que es poco realista [31], por lo que se puede considerar prácticamente no biodegradable, sin embargo si se modifica su estructura, o se dan las condiciones óptimas, utilizando microorganismos aptos para su degradación es posible disminuir su tiempo de vida drásticamente. La biodegradación es un proceso complejo por lo que en su actual concepción esta dividida en dos etapas:
5.3.1.1 Biodeterioración
Es una etapa extracelular, caracterizada por la acción en conjunto de los
microorganismos y los factores abióticos que en conjunto dan como resultado
una fragmentación del LDPE en oligómeros y en el cambio químico del
polímero (oxidación) [31]. (Ver mecanismos de despolimerización.)
5.3.1.2 Asimilación
Posteriormente cuando estos oligómeros tienen el tamaño suficiente para ser
trasportados al citoplasma, los microorganismos los integran a las rutas
metabólicas donde son mineralizados [31].
5.3.2 Factores a tener en cuenta en la biodegradación del LDPE
Muchos microrganismos pueden degradar el LDPE, y para entender como lo
hacen hay que analizar: las enzimas liberadas, la hidrofobicidad, tanto de las
mismas enzimas como de las paredes celulares de las células microbianas y las
sustancias potenciadoras que liberan, como biosurfactantes, sin embargo
cuando se investiga la biodegradabilidad del LDPE, el efecto del ambiente no se
puede ignorar, para sobrevivir y prosperar se requieren que existan ciertas
condiciones o variables que afectan la actividad microbiana y por lo tanto la
biodegradación del LDPE, tales como: la disponibilidad de oxígeno, la cantidad
disponible de agua, la temperatura, el ambiente químico (pH, electrolitos, etc.)
[59], también hay que adicionar las características físicas químicas del LDPE, lo
cual se puede esquematizar en el siguiente mapa conceptual:
13
Figura 2 Factores que afectan la biodegradación del LDPE adaptada de [60, 61]
5.3.2.1 Ruta de la biodegradación del LDPE
Como tal no hay un solo mecanismo o una sola ruta, debido a que el proceso de la biodegradación es complejo y puede iniciarse de múltiples maneras, puede recorrer múltiples procesos o reacciones, de hecho en un principio la comunidad de investigadores estaba dividía por la condición en que debería estar el polímero para que pudieran actuar los microorganismos, algunos creían que era necesario la reducción del peso molecular y otros que atacaban sin importar el peso molecular [11, 62], posteriormente se comprobó que no es necesario bajos pesos moleculares para que inicien la degradación pero si lo facilita, además la mayoría de estudios lo hacen con cepas puras, lo cual es improbable que ocurra naturalmente [63], (como se puede ver en la tabla 1), son consorcios enteros los que participan en la biodegradación, y la biodiversidad de éstos varía de acuerdo al tipo de ambiente, por ejemplo: el suelo, mar, composta, lodo activado, etc. [64]. El mecanismo exacto es difícil de reconstruir, sin embargo se puede simplificar o esquematizar. La biodegradación del LDPE ocurre por dos mecanismos básicos: la hidro biodegradación y la oxobiodegradación [47], esos mecanismos dependen del
14
grado de oxidación del material y del tipo de aditivo adicionado, el cual puede ser almidón o pro oxidantes. Como resultado de los trabajos reportados se realizó un mecanismo de biodegradación hipotético el cual se muestra a
continuación.
Figura 4 Biodegradación del PE por β -oxidación Fuente [65]
Figura 3 Rutas hipotéticas de transformación del polietileno hasta su total mineralización basada en los artículos de [63, 45, 68].
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5.3.2.2 Iniciadores y aceleradores del proceso de biodegradación, la
degradación abiótica
La mineralización del polietileno inicia con una degradación abiótica u oxidación (ver Figura 5 ), que es causada por el medio ambiente, principalmente por la luz y las condiciones del entorno, tales como el pH, la salinidad, la disponibilidad de oxígeno, el estrés físico, la humedad, la temperatura, etc [42]. Facilitando el posterior ataque microbiano, a continuación se mencionara brevemente los más importantes.
Figura 5 iniciadores de la oxidación del PE
5.3.2.2.1 Fotólisis El LDPE es un polímero de baja degradabilidad porque esta principalmente
compuesto de enlaces C–C and C–H (𝜎 enlaces) cuya energía de enlace es del orden de 300–600 kJ/mol [66]. El principio de degradación establece que la cantidad de energía absorbida por una molécula debe exceder la energía de enlace. La energía de la radiación UV-A no es suficiente para romper los enlaces químicos del LDPE y causar la degradación del polímero [66]. La radiación UV-B (320-280) es particularmente eficiente en causar foto daño al LDPE y polímeros sintéticos [66]. La radiación UV-C tiene energía suficiente para
romper los enlaces 𝜎, pero la que es emitida por el sol es absorbida por la atmosfera y no alcanza la Superficie de la tierra [67]. De acuerdo a Baljit Singh, Nisha Sharma, la radiación UV-B cercana de la luz solar (290nm) posee la energía suficiente para romper los enlaces C-C 375 kJ/mol y C-H 420 kJ/mol del LDPE los cuales son equivalentes a una radiación UV-B de 320nm y 290nm respectivamente, el proceso conduce a la formación de radicales libres [68]. (Ver Figura 6).
16
5.3.2.2.2 Oxidación térmica Al igual que en la fotólisis, la termo degradación produce radicales libres que atacan el polímero, pero en la oxidación térmica el ataque ocurre al azar y no en los extremos terminales tal como ocurre durante la fotólisis, por ello la termo degradación puede empezar tanto en el interior como en la superficie, haciendo que el proceso sea más rápido [68], debido a que el LDPE es un polímero de adición (por radicales libres), el mecanismo de despolimerización corresponde al inverso de la polimerización y ocurre rápidamente a temperaturas de 200°C o mayores.
5.3.2.2.3 Oxidación mecano química Los agentes oxidantes como el ozono, el oxígeno o con ácido nítrico atacan las cadenas generando radicales libres, comprobado por Yamada-Onodera [69], hay estudios que indican que cuando el material es sujeto a estrés mecánico como: rotura, molido, rasgado y estirado se generan radicales libres y para demostrarlo se utilizó la espectroscopia de espín electrónico [70, 68].
5.3.2.2.4 Mecanismos de despolimerización
5.3.2.2.4.1 Iniciación
La fotólisis o termólisis inicia el proceso de formación de radicales como se verá a continuación:
Figura 6 mecanismo de ruptura hemolítica o fotolisis imagen tomada de [68].
Las reacciones se facilitan con la adición de catalizadores como metales de transición, por ejemplo: el hierro (Fe), cobalto (Co), manganeso (Mn) y titanio (Ti) entre otros, muchos polietilenos comerciales contienen compuestos metálicos como impurezas, a continuación se muestra el mecanismo que ocurre. [68].
Figura 7 Iniciación a partir de un agente metálico, imagen tomada de [68].
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Figura 9a. Mecanismos de oxidación, reacciones Norrish tipo 1 y 2, imagen basada de [68]; 6 b. Oxidación para la formación de ácidos grasos o esteres, adaptado de [96]
5.3.2.2.4.2 Propagación
El proceso se propaga cuando los radicales C* reaccionan con oxígeno formando el radical peróxido, el cual a su vez ataca cualquier compuesto que ofrezca electrones y posiblemente protones formándose un ácido o un éster en el proceso y un nuevo radical. (Como se muestra en la Figura 8).
Figura 8 Propagación de la foto oxidación. Adaptado de [68].
5.3.2.2.4.3 Terminación
Los grupos carbonilo actúan como cromóforos que permiten una iniciación de más radicales debido a que absorben en el UV cercano [68]. Posteriormente ocurre una ruptura de las cadenas por medio de las reacciones tipo Norrish 1 y 2 (Ver Figura 9a), finalmente terminan con la formación de fragmentos que contienen grupos funcionales como alquenos, alcoholes, esteres y ácidos carboxílicos, estos son utilizados por enzimas microbianas para su metabolización y final mineralización.
Actualmente muchos fabricantes de polietileno PE realizan un tratamiento posterior al proceso de fabricación induciendo la formación de alquenos y carbonilos en las cadenas para acelerar su degradación, replicando lo que ocurre cuando se expone al medio ambiente.
5.3.3 Microorganismos reportados que degradan el polietileno
Muchos microorganismos degradan el LDPE cuando las condiciones ambientales favorecen esta acción [51]. Se han publicado muchos estudios
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sobre biodegradación del polietileno, a continuación se presenta una recopilación de todos los microorganismos reportados o/y utilizados en los estudios de biodegradación del LDPE: Tabla 1 microorganismos capaces de degradar el LDPE reportados en la literatura. Tabla adaptada de [19, 71, 53, 42, 29, 63]
Dominio Genero Especie Referencias
1 bacteria
Acinetobacter baumannii [72, 73, 74]
ursingii [75]
sp [76]
2 Bacteria Acanthopleurobacter
pedís [77]
3 Fungi Acremonium kiliense [78, 79]
4 Bacteria Achromobacter denitrificans [80]
5 Fungi Alternaria alternata [81, 82]
6 Bacteria Arthrobacter, sp [83, 84]
paraffineus [65, 85]
defluvii [86]
viscosus [72]
koreensis [32]
7 Fungi Aspergillus: versicolor [78, 40, 79, 87, 88]
brasiliensis [89]
sp [90, 87, 67, 91, 50, 92, 93, 51]
flavus [76, 11, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 40] [101, 89, 102]
fumigatus 0 [99, 103, 89]
glaucus [11, 104, 76, 105]
niger [76, 106, 11, 107, 104, 108, 95, 109, 110, 111] [112, 97, 99, 105, 100, 101, 89, 102, 31, 113] [91, 114, 115, 116, 33]
nidulance [76, 11, 50]
terreus [103, 101, 102, 31, 88, 41, 115]
cremeus [11]
candidus [11]
ornatus [89, 11]
japonicus [97, 101, 102]
awamori [72]
tamarii [101]
oryzae [117, 95, 94]
8 Fungi Aureobasidium pullulans [31, 115, 118]
9 Bacteria Bacillus sp [11, 93, 89, 16, 119]
aerius [77]
pumilus [120, 72, 84]
brevies [121]
cereus [122, 123, 84, 71, 124, 99, 125, 105, 77]
circulans [126, 121]
halodenitrificans
[120]
amyloliquefaiens
[72, 127, 128, 129, 130]
amylolyticus [86]
megaterium [122]
mycoides [72, 131, 132]
sphaericus [71]
licheniformis [133]
subtilis [122, 76, 107, 86, 99, 134, 132]
thuringiensis [72]
19
weihenstephanensis
[135]
10 Bacteria Bacterium te68R [77]
11 Bacteria Brevibacillus borstelensis [122, 126, 136]
parabrevis [73]
sp [137, 138]
12 Bacteria Burkholderia cepacia [135]
13 Fungi Candida sp [99]
14 Fungi Cephalosporium
sp [100]
15 Fungi Chaetomium
globosum, [124, 106]
sp [98]
16 Fungi Cladosporium cladosporioides
[47, 139, 96]
cladosporioides
[47, 96, 140]
17 Fungi Curvularia sp [141]
senegalensis [118]
lunata [82]
18 Bacteria Delftia acidovorans [142]
19 Bacteria Desulfotomaculum
nigrificans [48]
20 Bacteria Diplococcus sp [11, 89]
21 Bacteria Escherichia coli BL21 [32, 135, 134, 136]
22 Bacteria Enterobacter asburiae [119]
23 Bacteria Flavobacterium sp [142]
24 Fungi Fusarium sp [100, 97, 90, 99, 143, 91, 82]
solani [103, 118]
25 Fungi Geotrichum sp
26 Fungi Glioclodium virens [111, 72, 106]
27 Fungi Helminthosporium
sp [100]
28 Fungi Humicola sp. [144]
29 Fungi Hyalodendron sp [145]
30 Bacteria Listeria sp [16]
31 Bacteria Lysinibacillus. sp [92]
32 Bacteria Microbacterium paraoxydans [146]
MK3 (DQ31 8884),
[147]
sp [147, 77]
33 Bacteria Micrococcus luteus [76, 72]
sp [16, 11, 99]
lylae B-429 [72, 105]
34 Fungi Moraxella sp [11, 104, 89]
35 Fungi Mortierella alpina [96]
subtilissima [72]
36 Fungi Mucor ruxii [94]
sp. [97, 99, 102]
circinelloides [40]
37 Fungi Nigrospora sp [100]
38
Fungi Nocardia steroids GK 911
[47]
asteroides [47, 96, 139]
39 Fungi Paecilomyces variotti [112, 31, 148, 115]
40 Bacteria Paenibacillus macerans [72]
41 Fungi Penicillium sp [97, 67, 99, 76, 100, 93, 144]
simplicimus [69, 149, 82]
frequentans [131]
20
pinophilum [109, 111]
ochrochloron [31, 115]
funiculosum [112, 106, 31, 115, 33]
implicatum [100]
42 Fungi Phanerochaete chrysosporium
[150, 13, 151, 13, 111, 152, 105, 153, 154]
chrysosporium ME-446
[28]
43 Fungi Pleurotus ostretus IZU-15413 [155, 105]
44 Bacteria Proteus vulgaris [76]
45 Bacteria Pseudomonas: aeruginosa [107, 142, 146, 99, 156, 105, 128, 157] [147, 77, 75]
citronellolis [73, 158]
chlororaphis [159]
sp [83, 137, 32, 160, 158, 50, 104, 137, 125, 76] [93, 138, 89, 99, 161, 11]
putida (KT2440 ATCC 47054) S3A MK4 (DQ31 8885) & PW1 (EU741 798),
[156, 107, 128, 162] [147, 77]
syringae DC3000 ATCC 10862
[156]
stutzeri [163]
fluorescens [72, 113, 75]
alcaligenes [48]
otitidis [77]
redolens [78, 9, 164, 165, 79]
46 Fungi Pullularia pullulans [106]
47 Fungi Pycnoporus sanguineus [166]
48 Bacteria Rahnella aquatilis [72]
49 Bacteria Ralstonia sp [142, 137]
50
Bacteria Rhodococcus: ruber C208, [167, 168, 169]
rhodochrous [170, 47, 96, 139]
erythropolis [142, 171]
sp [142, 138]
51 Fungi Rhodotorula sp [145]
52 Fungi Scopulariopsis brevicaulis [31, 115]
53 Bacteria Serretia marscence [172, 105]
54 bacteria Shewanella putrefaciens [32]
55 Fungi Sporotricum pullverulentum [173]
56
bacteria Staphylococcus aureus [76, 99, 113]
epidermidis [174]
xylosus [72]
sp [16, 11, 104, 89, 175]
piogens [99]
cohnii [72]
57 bacteria Stenotrophomonas
sp [142]
58
bacteria Streptococcus lactis, [76]
sp [11, 104, 89]
aureus B-324 [105]
59 bacteria Streptomyces: viridosporus T7A [151, 176, 112, 153]
setonii 75Vi2 [151, 176, 112, 153]
sp [94, 104, 50, 89]
coelicoflavus [177]
badius 252 [151, 176, 112, 153]
21
Se han reportado muchos microorganismos, los cuales pertenecen a bacterias, actinomicetos y hongos filamentosos, de los cuales muchos aún son especies desconocidas, pero aun así, son estudios relativamente nuevos e insuficientes para dar conclusiones finales, por lo que no hay razón para creer que sean todos los microorganismos degradadores existentes de LDPE, seguramente aún existen muchos por descubrir.
5.3.3.1 Hongos como agentes degradadores de LDPE
De acuerdo a Volke-Sepulveda los hongos producen algunos polisacáridos que ayudan a colonizar el material [109]. Los autores Kim y Rhee [34]. Seneviratne [131], Kershaw y Talbot [180], Shah [181, 182] han encontrado que los hongos liberan proteínas hidrófobas que se ligan a la superficie del LDPE, producen mayor cantidad de biomasa, sobreviven a condiciones de baja disponibilidad de nutrientes, bajo pH y humedad [69], también es una ventaja la distribución y habilidad de penetración de las hifas, la ubicuidad de los mismos, lo cual se comprueba en el gran número de géneros encontrados, además de la altísima frecuencia con que se encuentran.
5.3.3.2 Bacterias como agentes degradadores de LDPE
Algunos investigadores han visto buenos resultados en la biodegradación de LDPE usando bacterias, por ejemplo se ha aislado Rhodococcus ruber (C208) capaces de degradar 0,86% por semana [183], cuya habilidad es atribuida a la hidrofobicidad de su superficie o membrana [167] [106]. Merina Paul Das y Santosh Kumar encontraron una alta hidrofobicidad (37-42) % en bacillus Amyloliquefaciens, y posteriormente probaron su capacidad para degradar LDPE realizando la prueba de variación de la pérdida de masa [129], encontrando porcentajes del 11 al 16 % en dos meses lo que significa que perdía un 2% por semana [127]. En algunas especies de Pseudomonas lograban una pérdida de peso por encima del 20% en LDPE durante 120 días, por lo tanto se degradaba a un ritmo de 1,25% por semana. [156, 158]. Por ejemplo Shah [181] encontró que las P. aeruginosa biodegradaron LDPE a un nivel de 35%.
5.3.3.3 Consorcios microbianos
Muchos investigadores concuerdan en que ya sean bacterias u hongos, la utilización de consorcios microbianos ofrece considerables ventajas sobre el uso de cultivos puros en la degradación de LDPE [120, 82]. Probablemente debido a la habilidad multifuncional y su mayor robusteza a las fluctuaciones ambientales [120, 82].
60 Fungi Trametes
versicolor IFO7043 [28]
versicolor ISU15413 [28]
61
Fungi Trichoderma viride [178, 31, 115]
hamatum [130]
62 Fungi Verticilium lecanii [78, 79]
63 bacteria Vibrio sp [16, 179]
22
Algunos autores definen las comunidades microbianas o consorcios como asociaciones de múltiples especies que coexisten en un mismo nicho. En los consorcios microbianos los microrganismos trabajan en forma multidisciplinar sobre el LDPE degradandolo en sus monómeros. De aquí que la actividad de los consorcios permite incrementar la degradación del polietileno [82].
5.3.3.4 Enzimas reportadas
Las enzimas son causantes directas e indirectas de la oxidación biótica del polietileno de baja densidad LDPE y otros plásticos, todas son enzimas extracelulares o también conocidas como exoenzimas, son secretadas por las células microbianas (ver tabla 2) las cuales catalizan la formación de una o varias reacciones en la superficie del LDPE, tales como son: la oxidación, la reducción, hidrólisis y esterificación. Los autores Seneviratne [131], Kershaw y Talbot [180], Shah [181, 184] demostraron que los hongos liberan enzimas hidrófobas que se ligan a la superficie también hidrófoba del LDPE, igualmente para las bacterias, como un resultado de esta investigación se presenta un listado de las enzimas reportadas en los estudios realizados sobre la biodegradación del polietileno. Tabla 2 Enzimas involucradas en la biodegradación del polietileno.
Enzimas Características y organismo fuente Referencias
Alcano hidrolasa (EC 1.14.15.3)
Fue encontrada en bacterias G. thermodenitrificans y P. aeruginosa que degradan el petróleo y el PE.
[32]
Celulasa Obtenida de Pleurotus ostreatus PLO6 y probada en PE oxodegradables.
[155]
Gelatinasa Rompe las estructuras poliméricas hidrófilas. [16]
Lacasa (EC 1.10.3.2)
Probada en PE oxodegradables, encontrada en: Rhodococcus ruber, Trametes versicolor, Curvularia lunata, Alternaria alternata, Penicillium simplicissimum Sporotrichum pullvurulentum y Fusarium sp.
[169, 124, 155, 173, 82, 29]
Lignina peroxidasa
Rompe enlaces C-C, encontrado en Sporotrichum pullvurulentum
[28, 81, 173, 29]
Lipasa Rompe los ácidos grasos producidos por otras enzimas.
[16, 185]
manganeso peroxidasa (MnP)
Fueron purificadas de los hongos Phanerochaete Chrysosporium, Bjerkandera adusta, Curvularia lunata, Alternaria alternata, Penicillium simplicissimum, Sporotrichum pullvurulentum y Fusarium sp. Usando DSC, EM se demostró que degradan PE,
[28, 186, 124, 155, 173, 82, 29]
Xilanasa Probada en PE oxodegradables [155]
Amilasa Ataca la matriz de almidón [134, 16]
Todas son exoenzimas, algunas usan oxígeno o peróxido para generar grupos carbonilo o hidroxilo en la superficie del material, otras hidrolizan los copolímeros almidón polietileno y otras rompen enlaces C-C, o C-C=O.
23
Cabe mencionar que hasta la fecha ningún trabajo ha realizado un estudio enfocado y detallado sobre las enzimas, su clasificación, la identificación de las estructuras primarias, secundarias y terciarias, formas de interacción con el sustrato, tiempo de acción, condiciones de acción, genes codificadores, etc., por lo que aún hay importantes vacíos por llenar..
5.3.3.5 Biodegradación aerobia y anaerobia
Los ambientes en donde ocurren las rutas metabólicas de biodegradación durante el proceso de asimilación, se pueden clasificar básicamente por la disponibilidad de oxígeno en el medio, el cual puede ser:
5.3.3.5.1 Reacción básica de biodegradación de tipo aeróbico
La reacción aerobica requiere como sumidero de electrones al oxígeno, el cual
se reduce a agua, es teóricamente la más exotérmica, y probablemente es la
mejor y más común para acelerar el proceso de biodegradación del LDPE.
La ecuación que representa el proceso de oxidación es la siguiente:
𝑂𝑙𝑖𝑔𝑜𝑚𝑒𝑟𝑜𝑠 + 𝑂2 → 𝐶𝑂2 + 𝐻2𝑂 + 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 + 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑑𝑢𝑜(𝑠)
5.3.3.5.2 Reacción básica de biodegradación de tipo anaeróbico
Es una reacción que ocurre sin la necesidad de oxígeno, suele liberar metano
como producto final, el proceso ocurre básicamente como se presenta en la
siguiente ecuación:
𝑂𝑙𝑖𝑔𝑜𝑚𝑒𝑟𝑜𝑠 → 𝐶𝑂 2 + 𝐶𝐻4 + 𝐻2𝑂 + 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 + 𝑟𝑒𝑠𝑖𝑑𝑢𝑜(𝑠) En el caso de los géneros Pseudomonas sp y Brevibacillus sp, Ambika Devi ha sugerido que la biodegradación anaeróbica es mucho más importante, debido a que veinticinco géneros de bacterias que degradan hidrocarburos se aislaron en el medio ambiente marino aislado del oxígeno atmosférico [80].
5.3.3.6 Efecto en la biodegradación en la humedad del medio
A su vez estos dos tipos de ambientes pueden ser subdivididos de acuerdo a la cantidad de humedad existente dando las siguientes categorías:
Ambientes acuáticos: ríos, mares, lagos, reservas subterráneas etc [187, 188].
Ambientes sólidos o secos: zonas de compost, reservas forestales, botaderos, etc.
El contenido de humedad en el sustrato tiene un efecto directo sobre el crecimiento de los microorganismos, por ejemplo un estudio en el que se usó el hongo Pycnoporus sanguineus para degradar LDPE pudo crecer más rápido y
24
de forma más intensa en el sustrato compuesto por 67% de polímero y 33% de sorgo a 22°C [189], que era el de mayor humedad. Tabla 3 clasificación esquemática de los diferentes medios ambientes en que ocurre la biodegradación del LDPE, tomada de [59]
Acuático Seco
Aeróbico Plantas aeróbicas de tratamiento de aguas residuales. Aguas de superficie : ríos y lagos, ambientes marinos
Suelos de superficie Residuos orgánicos en platas de compostaje Residuos en botaderos a cielo abierto
Anaeróbico Plantas anaerobias de tratamiento de aguas residuales Rumen de herbívoros
Sedimentos en lo profundo del océano Rellenos sanitarios Biogasificacion Digestión anaeróbica Lodos anaerobios
5.3.3.7 Efecto del pH en el medio
El valor del pH es un factor clave para la supervivencia y actividad de los
microorganismos, generalmente esta entre 6 y 8 de acuerdo a ASTM D 5988
[177].
En un estudio se encontró que un género de actinomicetos, las bacterias termófilas streptomyces coelicoflavus NBRC 15299 presentan un amplio rango de tolerancia al cambio del pH que va de 5 a 10 [177]. Lo interesante es que durante la actividad biodegradadora disminuye el pH a un valor de 5,6 en 24 días por lo que el microorganismo debe ser altamente tolerante a pH bajos. Para la Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter ursingii, todas bacterias mesófilas cuando se cultivaron en un medio con pH de 7,2 después de 7 días a 30°C, lo acidificaron a 6.41, 6.45, 6.52, las demás cepas sin identificar también acidificaron los medios, en un estudio en el que se usaron las bacterias Pseudomona putida S3A se encontró que el pH óptimo estaba en 6,5 en el cual alcanzó el mayor crecimiento en siete días [162]. Los hongos son naturalmente más resistentes a medios ácidos y por lo tanto a pH bajos degradan más rápidamente el LDPE, como lo presentan Nanda S, Sahu S, Abraham J [137], en donde exponen a los hongos Phanerochaete chrysosporium y a las bacterias Pseudomonas aeruginosa a medios en condiciones de pH: 4 y a temperatura ambiente, con agitación regular por ocho meses [137], el porcentaje de degradación fue de 50% para los hongos Phanerochaete chrysosporium y 35% para las Pseudomonas aeruginosa, los hongos se desarrollan rápidamente en los medios con LDPE, y las bacterias que logran degradarlo soportando tales condiciones probablemente sean acidófilas o al menos tolerantes a pH bajos.
5.3.3.8 Efecto de la temperatura
La temperatura óptima para la degradación parece distinta para cada especie
microbiana, sin embargo es común que sean temperaturas relativamente altas,
25
en varios artículos revisados las temperaturas óptimas correspondieron a
valores desde los 28 a 55°C.
Las bacterias termófilas Streptomyces coelicoflavus NBRC 15299 soportan
variaciones de temperatura desde los 12°a los 42°C, sin embargo su
temperatura para la degradación óptima fue de 28±2°C [177].
Para las bacterias Pseudomonas putida S3A se encontró que la temperatura
óptima estaba en 37°C [162].
En un estudio en el que se usó el hongo Pycnoporus sanguineus para degradar
LDPE el crecimiento se midió por porcentaje de invasión del sustrato,
encontrando que a 22°C, el porcentaje de invasión superó el 90% en un lapso
de 21 días, mientras que cuando la temperatura de crecimiento fue de 10°C, el
máximo crecimiento llegó apenas a un 32% [189]. En un estudio con tres
muestras de hojuelas de LDPE pre tratadas con radiación ultravioleta durante
68h, fueron incubadas por separado a 37°C, 46°C y 55ºC durante un mes, en
presencia de Bacillus borstelensis, la temperatura en la que se presentó el
mayor grado de biodegradación (14,2%) fue a 55°C [136].
5.3.4 Aditivos utilizados para potenciar la degradación del LDPE
Existen múltiples productos variantes del PE que contienen pro-oxidantes o aditivos biodegradables a continuación se mencionaran algunos.
5.3.4.1 El polietileno de baja densidad LDPE con almidón
El almidón es un polímero con alto valor como aditivo, en los estudios de biodegradación del LDPE la reducción de su alta hidrofobicidad mediante la inyección de almidón para la producción de LDPE biodegradable es una alternativa muy popular debido a que el almidón es natural y económico. La mezcla del almidón y el LDPE al ser hidrófila los microorganismos fácilmente acceden a su matriz y la degradan con enzimas como amilasas las cuales realizan un mecanismo tipo hidrodegradación [190, 191, 192]. El almidón está compuesto de amilosa y amilopectina, la cantidad de estos componentes es diferente entre varias fuentes de almidón, la proporción de estos dos tiene un efecto en el comportamiento del producto [115], entre mayor contenido de amilosa aumenta la elongación y la fuerza de la mezcla [193], probablemente debido a que es un almidón de menor ramificación, permite una mayor cristalinidad de la mezcla, Sin embargo, su uso tiene limitaciones debido a que ésta mezcla posee baja resistencia a la humedad, baja procesabilidad e incompatibilidad [6]. También se ha probado mezclas de otros polímeros naturales con el LDPE, tal es el caso del yute [194], el inconveniente de usar tales aditivos corresponde al de disminuir sus propiedades mecánicas, siendo probado por autores como Lee y Obasi [190] [195]. Causando una disminución de la resistencia a la tensión y reducción de la elongación, con lo cual se torna quebradizo y frágil
26
debido a la pobre adherencia a la matriz del aditivo y la aglomeración de sus partículas.
5.3.4.2 Aditivos pro-oxidantes
Los pro-oxidantes incluyen compuestos poliinsaturados, iones de metales de transición y complejos tales como tiocarbamatos [196]. Los aditivos que contienen pro oxidante sufren reacciones tipo foto degradación, termo degradación y quimio degradación, entre los compuestos fotos sensibilizadoras están: sales de metales, quinonas, benzofenol, benzofenonas etc.) se forman radicales que posteriormente generan grupos carbonilo que pueden ser utilizados por los microorganismos [9], (ver mecanismos de despolimerización) si el pro oxidante es un metal de transición como los esteres de metales como el Hierro, Cromo, Manganeso, entre otros la oxidación es secuencial [117], incrementan la ruptura del LDPE en un proceso que se denomina degradación oxidativa, tornando el material quebradizo y fragmentado, además el proceso es dependiente de las condiciones medioambientales como la cantidad de luz solar, humedad, pH, etc. Y también sus altos costos y sus propiedades limitadas restringen su uso [197]. Tabla 4 estudio sobre la biodegradación del LDPE con prooxidantes, adaptado de [117]
En el estudio denominado efecto de los prooxidantes en la biodegradation del polietileno (LDPE) por el aislamiento de hongos endogenos, Aspergillus oryzae. En el cual realizan pruebas de degradación de LDPE tratado con estearato de Fe, Co, Mn, y Ti, además se irradia con UV y se usa como sustrato para cultivar el hongo A. oryzae, a 27°C a 120 rpm, por los resultados arrojados no hay duda de que el uso de proxidantes acelera el proceso de biodegradación, pero adicionalmente para ver los buenos resultados es necesario exponer el material a algún agente físico como la radiación UV. Tabla 5 Aditivos del Polietileno de baja densidad (LDPE).
Aditivos composición del material
Ventajas Desventajas Referencias
Anhidrido Maleico
PE-g-MA Compatibilizante Costoso aun [115, 198]
Alcohol Polivinilo
LLDPE/PVA Es el único polímero con un esqueleto carbono -
Costoso aun [179]
Título Condiciones Tiempo (Meses)
Ensayo Porcentaje degradado
Referencias
Effect of prooxidants On biodegradation of polyethylene (LDPE) by indigenous fungal isolate, Aspergillus Oryzae
Tratado con estearato de Fe, Co, Mn, y Ti, UV y A. oryzae 27°C a 120 rpm
3 Control 0 [117] 3 UV 18
3 Estearato Mn + UV 47.2
3 Estearato Ti + UV 41.6
3 Estearato Fe + UV 36.1
3 Estearato Co + UV 34
3 Sin UV 5
27
carbono que es biodegradable bajo ambas condiciones aeróbica y anaeróbica
Policaprolactona Policaprolactona y LDPE
alta biodegradabilidad Su estructura cristalina es similar a la del polietileno.
Ninguna [64, 193]
Oxido de polietileno- poli hidroxibutirato
OP/ PHB Por su baja resistencia al impacto se mezcla y de esa manera se potencia sus cualidades y además potencia la biodegradación
Homopolímero puro es muy quebradizo tiene pobres propiedades mecánicas y es Costoso
[199, 200]
P H B V ( p o l i ( 3 - h id r o x i b u t i r a t o - c o-hidroxivalerato)
LDPE/PHBV Polímero Natural biodegradable (Producido por microrganismos) es menos quebradizo que su homopolímero el PHB y sus propiedades físicas y térmicas dependen el grado de contenido de HV
puro es muy quebradizo pero menos que el PHB tiene pobres propiedades mecánicas y es Costoso
[148, 193]
Colágeno hidrolizado
El colágeno hidrolizado y el polietileno de baja densidad
En un porcentaje del 20-30% permite obtener laminas transparentes, cohesivas y flexibles que son caracterizadas por tener respuestas térmicas y mecánicas satisfactorias
Porcentajes mayores tienen efectos adversos a las cualidades reológicas del material, la extracción de la sal es compleja y afecta la mezcla PE-HC
[57]
Trazas de metales de transición : Fe, Mn, Co, Ti
estearatos de Fe3+, Mn2+ estearato de Co2+ acetilacetonato de Co2+, 11-9Z, 12Z-Octadeca-9, 12-dihidroxi-10,13 dihidroxiactadecaneato Cobalto (II) nano-TiO2 foto
Los cuales pueden Aumentar la velocidad de oxidación por el oxígeno del aire y la escisión de las cadenas de PE bajo la influencia de la luz y / o calor. Partículas de Titanio foto catalíticas.
El tipo de metal y su concentración puede variar de acuerdo al proveedor comercial, requiere exposición lumínica, efectos de toxicidad para los microbios (Partículas de Titanio). [157]
[112, 201, 65, 85, 122, 117, 202, 170, 155, 133] [157, 203]
28
catalizador
Aditivos multifuncionales o en inglés (Multi functional aditives)
Fe, Co, Ni, contiene grupos: alcohol, alcano, enlaces dobles, ácido carboxílico.
Contiene múltiples grupos funcionales que hacen que sea fotosensible, posee efectos lubricantes y plastificantes, potencia la biodegradación sin afectar los parámetros de procesabilidad.
Experimental [197]
Almidón termoplástico TPS (del ingles Thermoplastic Starch)
Las proporciones pueden variar pero por lo general se encuentran en un 12% de almidón y 88% de LDPE
Aceleración de la biodegradación, Mejora de alguna de sus propiedades mecánicas.
Baja: resistencia a la humedad, y Procesabilidad, incompatibilidad con el PE Hidrofóbicos.
[204, 94, 8, 65, 191, 13, 205, 206, 207, 153] [106, 176, 137, 188, 190, 208, 209, 115, 116]
Aceite mineral LDPE + aceite mineral.
Se obtiene una colonización más la pérdida de peso a una concentración de 0,05%.
A concentraciones mayores a 0,05 tiene un menor efecto en la degradación del rápida incrementa en un 50% PE.
[106]
Aceite vegetal Triacil Gliceroles Los Triglicéridos contienen ácidos insaturados que son más susceptibles a la autoxidación.
[179]
Celulosa LDPE/celulosa Se usó Yute, madera
Potencia la biodegradación por facilitar el ataque de celulasas.
No presenta las mismas cualidades reológicas.
[210] [194]
Glicerol El glicerol/LDPE/ Almidón.
Facilita la biodegradación y cumple la función de plastificante.
Costo [211, 208, 115, 179]
Maleato o MAPE
Maleato/LDPE/ biopolímero
Se usa como compatibilizante.
Aumenta los costos
[190, 211, 208, 198]
PP PP/HDPE Mezcla de polipropileno y po Ietileno de alta densidad
Los dos son muy resistentes al ataque bacteriano por lo que no potencia la biodegradación.
Bajo condiciones de enterramiento se alteran las propiedades mecánicas.
[201]
poliol-glucósidos
modificación química del almidón por glucosilación y posterior transesterificación con el aceite de higuerilla
Es mucho más compatible con el LDPE y favorece la biodegradación.
Aumenta los costlas s
[8]
Cera de abeja, Cera
PE/Cera de abeja La cera de abeja
Es natural, hidrofóbica, y biodegradable.
Genera problemas en
[79, 211, 198]
29
es 14% hidrocarburos, 35% mono ésteres, 3% di esteres, y 12% ácidos grasos libres.
grandes cantidades (10%) cuando se realiza la plastificación por su bajo punto de fusión
Parafina PE/parafina Parafina comercial. Mezcla de alcanos entre los 20 a 40 carbonos
Proporciona Gran estabilidad térmica y potencia la hidrofobicidad.
Pierde parte de sus buenas cualidades reológicas y fisicoquímicas.
[211]
Pectina Pectina/PE [208]
HP Polietileno e hidrolizado de proteína PE/HP 20% y 40%.
Biodegradación de 35% con una aceptable resistencia a la tensión
Biodegradación de 50% con una pobre resistencia a la tensión
[94]
Ricinoleico linoleato de Cobalto
LDPE/RLCD Acelera la biodegradación de LDPE
No son conocidas las cantidades exactas que se obtuvieron para las pruebas.
[133]
Ácido poli láctico
LDPE/PLA Potencia la biodegradación Solo se han hecho estudios en escala de laboratorio y probablemente aumente los costos.
[12]
Los microorganismos inicialmente atacan los polímeros biodegradables, que contiene El LDPE, incrementando la porosidad y el área superficial, lo que acelera su subsecuente biodegradación [132].
5.3.4.3 Aditivos comerciales
En el mercado existe un gran número de aditivos comerciales, con marca registrada que aseguran acelerar la degradación del polietileno, a continuación se enlistaran algunos encontrados: Tabla 6 algunos aditivos comerciales reportados
Aditivos comerciales
Características o composición del material
Ventajas Desventajas Referencias
Biopol PHB Biodegradable Caro [53]
Nature grad Plus, NP
Películas de polietileno que contiene 9 % de almidón y pro-oxidante comercial (éster de ácido graso autooxidables, agentes catalíticos y de metales de transición).
Perdida peso: NP=36% LDPE≈2,004% HDPE≈1.0% (36 semanas)
Perdida de resistencia a la tracción: NP=82.76%, LDPE=13.04% HDPE=5.33%
[62]
30
TDPATM. TDPA®.
Metal estearatos (Fe, Ce, Co) Y ácido cítrico (típicamente Co) y almidón la degradación ocurre debido a la reacción del plástico con el oxígeno del aire (oxodegradación), también se inicia por exposición a los rayos ultravioleta (UV degradable), altas temperaturas y/o esfuerzos mecánicos. Fabricante: EPI
Han demostrado biodegradarse en materiales no tóxicos en un rango de tiempo comprendido desde unos pocos meses a algunos años, dependiendo de la formulación del aditivo En 2 años será degradado
Requiere que el material reciba luz solar para poder ocurrir el proceso de degradación.
[212] [47, 213, 139, 202, 196, 203]
Renatura hierro estearato y combinación de estabilizantes/antioxidantes fabricante Nor-X Industries
Sus características lo hacen ideal para ser adicionado al PE
De acuerdo a un estudio su biodegradación posiblemente no requiere que ocurra en condiciones anaerobias
[214]
Reverte paquete de foto- inhibición No revelado, paquete de ión prodegrable metálico y promotores de biodegradación (celulosa micronizada )Fabricante Wells Plastics Limited
Altamente amplía la gama de plásticos a la que puede servir como aditivo PP, PE, PS, PET, ABS De acuerdo a un estudio su biodegradación posiblemente no requiere condiciones anaerobias
Requiere que el material reciba luz solar para poder ocurrir el proceso de degradación
[214]
D2W® Contiene estearatos de Metales (típicamente Mn) y estabilizantes Fabricante Symphony Environmental
Paquete de aditivos que activan la oxo-degradación del polietileno luego de un periodo de tiempo preseleccionado. Los aditivos son incluidos durante el proceso de extrusión
De acuerdo a un estudio su biodegradación no ocurre en condiciones anaerobias
[215, 214]
Addiflex® PE oxodegradables hechos a partir de carboxilato de Metales como (Fe, Mn, Cu, Co, Ni),almidón, CaCO3; estearato, manganeso es identificado como AddiFlex HE Fabricante Add-X Biotech
aseguran producir la oxo-degradación del material hasta en un 90% su biodegradación posiblemente no requiere condiciones anaerobias
Requiere que el material reciba luz solar para poder ocurrir el proceso de degradación
[216]
Biopack el material se degradará posiblemente no requiere que [217]
31
debido a compuestos bioactivos que atraen a colonias de microorganismos
requiere condiciones anaerobias
el material reciba luz solar para poder ocurrir el proceso de degradación,
EcoSafe plásticos oxodegradables y biodegradables de composición no disponible
Paquete de aditivos que activan la oxo-degradación del polietileno luego de un periodo de tiempo preseleccionado.
Elevan el costo de producción y venta y requiere condiciones aerobias
[218]
Ecoflex Aliphatic/aromatic polyester
5-95% completamente biodegradable
Elevan el costo de producción y venta
[53]
Mater-Bi PCL/Starch (60:40w/w) La biodegradación con Mater-Bi fue del 75-88% en todas las pruebas.
Elevan el costo de producción y venta
Master Batch
20% de MB La degradación fue de 26% después de 20 meses
Es una velocidad de degradación poco satisfactoria aun.
[188]
Actimais (SMS Trioplast)
PE+ aditivos prooxidantes Acelera la biodegradación
Elevan el costo de producción y venta y requiere condiciones aerobias
ECM Biofilms Composición no disponible Permiten a los microorganismos producir las enzimas y ácidos que atacan las moléculas de hidrocarburos de cadena larga y los mineralizan.
Aumenta los costos de producción y venta
[219]
POLYCLEAN Masterbatch y contiene 6% almidón, (Fe, Zn, Ni, y/o Mn), aceite de soya y maíz.
Acelera la biodegradación
Elevan el costo de producción y venta
[176, 151]
DPE Polietilenos degradables Estearatos de metales de transición fabricante Willow Ridge Plastics, USA)
degradable por UV y oxidación, PDQTM6,
su biodegradación posiblemente no ocurre en condiciones anaerobias
[220]
Oxobiodegradable aditive
LDPE y BPE 10 (10 % aditivo oxobiodegradable ) fabricados por KK Polycolor India Ltd,
Cambia su fuerza tensil en un 17.036% y reducción en el
su biodegradación posiblement
[123][131, 221]
32
Muchos de estos aditivos se han puesto a prueba en trabajos como los que realizaron S. Łabużek, B. Nowak, J. Pająk [33], sobre la adición de Bionolle a las láminas de polietileno, las cuales fueron preparadas con 60% (wt/wt) de Bionolle grado 3001 [33], reportando los siguientes resultados: Tabla 7 susceptibilidad del polietileno modificado con bionolle, tomado de [33]
Ángulo de Contacto. 17.4º
e no ocurre en condiciones anaerobias
biodegradable polyethylene (PE-BIO), oxodegradable polyethylene (PE-OXO)
Composición desconocida Probablemente contenga, metales de transición y algunos compuestos orgánicos pros oxidantes.
PE-OXO no sufre reacciones de fotoxidación durante los primeros 30 días de exposición al UV-B, debido al contenido de agentes pro oxidantes, metales de transición, los cuales causan Inhibición de la descomposición de los hidroperóxidos bajo el efecto de radiación UV-B.
[66]
[Tween 60, 80 or 85 (Sigma)
Polysorbato Permite una mejor interacción entre los microorganismos y sus enzimas y el material
No tiene un efecto biodegradador si no se dan las condiciones
[106, 136]
L0235 Desconocido UV fotosensibilizador
Elevan el costo de producción y venta
[126]
Bionolle Poli (butileno Succinato) (PBS), poli (etileno Succinato) (PESu), o el copolímero poli (butileno Succinato -co-butilen adipato (PBSA)
Son totalmente biodegradables compatibles con el PE y PP posiblemente no requiere condiciones anaerobias ni luz
Elevan el costo de producción y venta
[31, 32, 33]
Scott–Gilead Technology
Metal ditiodicarbamato De acuerdo a un estudio su biodegradación posiblemente no requiere condiciones anaerobias ni luz
Elevan el costo de producción y venta
[214]
Titulo
Condiciones (Mes)
Aspergillus niger Penicillium funiculosum
The Las láminas Peso perdido
33
Se puede notar claramente en la Tabla 7 que el polietileno modificado con bionolle es degradado rapidamente por ambas especies de hongos, lo cual demuestra la eficacia de este tipo de productos. En el artículo denominado Biodegradación de polietileno por las Bacterias termófilas Brevibacillus borstelensis con LDPE con y sin pro-oxidante (L0235) e irradiado con Ultravioleta por 60 h antes de la incubación a 50°C [222]. Los cuales después de un mes presentaron los siguientes resultados: LDPE sin aditivo y con UV obtuvo un 6,2 ± 0,3% de degradación, LDPE con L0235 y con UV presentó un 7,8 ± 0,8% de degradación, LDPE sin aditivo y sin UV presentó un 2,5 ± 0,3% de degradación, y finalmente LDPE con L0235 y sin UV presentó un 5,6 ± 0,5% de degradación, demostrando la importancia de la adición de estas sustancias en el proceso de degradación. Probablemente sigan apareciendo cada día nuevas marcas y productos, de esa forma se impulse la caída de sus precios y la mejora de los aditivos.
5.3.4.4 Biosurfactantes vinculados en la biodegradación del polietileno
Al ser el polietileno apolar o Hidrofóbico no puede ser fácilmente atacado por los microorganismos [223]. Y de acuerdo a Yutaka T, la adherencia de los microorganismos a la superficie del LDPE, seguida por la colonización de la superficie expuesta es el mayor mecanismo involucrado en la degradación microbiana del plástico LDPE [64]. La adición de Biosurfactantes potencia la biodegradación, por ser éste un tenso activo que disminuye la tensión superficial entre la membrana celular y el LDPE, además se ha descubierto que ciertos microorganismos producen tales compuestos, por ejemplo las Pseudomonas auroginosa. producen ramnolípidos, (ver Tabla 8) sin embargo se ha demostrado que si se quiere potenciar la biodegradación se puede adicionar surfactantes artificiales tales como Tweed 60/80 [106, 136]. Los surfactantes biológicos poseen múltiples ventajas sobre sus contrapartes manufacturadas químicamente, incluyendo baja toxicidad, efectividad a temperaturas extremas, pH y salinidad [224]. Tabla 8 Biosurfactantes producidos por distintos microorganismos, adaptado de [223]
Susceptibility of Polyethylene Modified with
Bionolle to Biodegradation by Filamentous
Fungi
de polietileno fueron preparada con 60% (wt/wt) de Bionolle grado 3001.
LDPE
LDPE modificado
LDPE LDPE modificado
[33]
0.33 0 1.04 0 6.08
0.66 0.09 1.14 0.13 30.28
1 0.14 2.26 0.14 49.22
1.33 0.29 3.49 0.23 75.06
2 0.33 6.12 0.27 93.44
3 0.81 7.53 0.35 100
Tipos de surfactantes producidos Microorganismos
Glucolípidos Pseudomona aeuroginosa, Rhodoccocus erythrópolis, Nocardia erithropolis
Ramnolípidos, lípidos Manosil eritritoles (MEL), Celobiolípidos, Soforolípidos, etc.
Micobacterium sp, Pseudomona aeuroginosa
Lipopeptidos, lipoproteínas, Surfofactin, Bacillus licheniformis, Serratia marcescen,
34
5.3.4.5 Sustitutos biodegradables del LDPE
Se han descubierto y comercializado múltiples sustitutos biodegradables del polietileno de baja densidad, estos son polímeros biológicamente degradables (biopolímeros), con características similares, inferiores o mejores en ciertos aspectos, que las del LDPE [192], estos biopolímeros ofrecen beneficios ambientales tales como biodegradabilidad, contribuye a disminuir los gases de efecto invernadero y renovabilidad del material base [194, 225]. Además se han descubierto microorganismos como el Bacillus megaterium, capaces de sintetizar polímeros biodegradables como el PHB [145, 226].
5.3.4.5.1 Los polihidroxialcanoatos PHA
En la actualidad se han hecho polímeros biodegradables muy estudiados como el Poli (butileno Succinato) (PBS), poli (etileno Succinato) (PESu), o el copolímero poli (butileno Succinato -co-butilen adipato (PBSA), los cuales son miembros de un grupo denominado comercialmente como ‘Bionolle’ [31, 32, 33]. y a su vez éstos y muchos más hacen parte de la familia de polímeros denominada los polihidroxialcanoatos (PHAs), que en la actualidad están compuestos por más de 150 tipos, todos son poliésteres alifáticos
biodegradables con fórmula general monomérica de −[O-CH(R)-CH2-CO]−, donde las propiedades varían de acuerdo al sustituyente alquilo (R), por ejemplo el polímero alternativo polihidroxibutirato PHB, que en virtud a que su sustituyente (R) es el grupo metilo posee una alta cristalinidad, cuyo valor es superior al 50%, cobrando gran importancia en el campo de la industria durante los últimos años, por sus propiedades físico-químicas y ha sido considerado como un posible sustituto de plásticos derivados del petróleo como el polietileno de baja densidad LDPE, sin embargo es posible que existan otros con mejores cualidades, por ejemplo los estudios de H-S. Kim revelaron que el PBSA se degrada mucho más rápido que el PBS [35]. Otros candidatos para sustituir al LDPE o ser buenos aditivos son la policaprolactona (PCL), el ácido poli láctico (PLA) y el ácido poliglicólico (PGA). Algunos estudios han demostrado que la mezcla de biopolímeros como P (HB-3)/ poli (propiolactona), P (HB-3)/poli (etilen adipato), y P (HB-3)/poli (3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBV) aceleran la biodegradación comparadas con cada polímero puro, lo cual puede ser atribuido a el proceso de separación de fases de los componentes de la mezcla [148].
Artrofactina, Ptisolvina, viscosinamida, etc. Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis, Bacillus brevis, Bacillus polymixa.
Acidos grasos, fosfolípidos, lípidos Neutros
Corynebacterium lepus, Nocardia erythropolis, Thiobacillus thiooxidans
Surfactantes poliméricos Acinetobacter calcoaceticus, Candida tropicalis, Candida lipolytica, Pseudomonas fluorescens, Pseudomona aeuroginosa
Surfactante Particulado Acinetobacter calcoaceticus.
35
5.3.4.5.2 Almidón termoplástico
El almidón puro posee un punto de fusión superior a su punto de descomposición por lo que no se puede moldear, pero cuando se mezcla con un plastificante como el glicerol o los polioles, puede ser procesado bajo alta presión y temperatura, y este se denomina almidón termoplástico (TPS) [208], pero la cantidad de plastificante es importante, la interacción es débil cuando está en un porcentaje inferior al 10% por lo que se torna frágil pero cuando es superior al 20% se mejora su flexibilidad y elongación. Cuando es expuesto a bajas temperaturas o a plastificantes poliólicos sufre retrogradación que es la restructuración de los enlaces. Se ha utilizado almidón de muchas fuentes entre las cuales están: papa, frijol mung, cascara de maní, tapioca, maíz etc. [190, 208, 116, 115, 198, 182]. A continuación se presenta como resultado de esta revisión un listado de los posibles sustitutos que han sido probados en múltiples estudios sobre biomateriales y su biodegradación. Tabla 9 sustitutos del Polietileno de baja densidad (LDPE)
Sustitutos Características o composición
Ventajas Desventajas Referencias
Policaprolactona (PCL)
Se comporta de forma similar a plásticos como polietileno y polipropileno, transición vítrea -60°C, resistencia mecánica 23MPa, punto de fusión (PF) (60-65) °C.
Biodegradabilidad Su estructura cristalina es similar a la del polietileno. Relativamente barato alto porcentaje de elongación:700%
Es muy soluble en muchos solventes orgánicos, transición vítrea baja, baja resistencia mecánica.
[193]
Poli ácido glicólico (PGA) (del inglés polyglicolic acid)
Es el poliéster más simple, es altamente cristalino, con una valor de 45-55%, prácticamente insoluble en compuestos orgánicos, tiene un alto punto de fusión PF (220-225°C), transición vítrea (tv) de 35-40°C
Tiene excelentes propiedades mecánicas
De aplicaciones médicas limitadas por su baja solubilidad y su elevada tasa de degradabilidad cediendo productos ácidos, sus copolímeros tienen más usos.
[193]
Ácido poli láctico (PLA) (del inglés polylactide acid)
Hidrofóbico por el grupo radical lateral CH3 transición vítrea de 63.8°C, resistencia a la tensión de 32.22MPa
Es más resistente a la hidrólisis que el PGA, buenas propiedades mecánicas.
Es quebradizo y de pobre resistencia a la temperatura
[30]
Polihidroxibutirato (PHB)
similar al polietileno y polipropileno,PF:180°C tv: 55°C cristalinidad mayor a 50%
Insoluble en agua no tóxico, Natural biodegradable biocompatible piezoeléctrico termoplástico
Caro de producir y pobres propiedades mecánicas comparables al PLA, puro es quebradizo, susceptible a la
[227, 199, 200, 228, 193]
36
elastómerico
termodegradación a temperaturas cercanas al punto de fusión
Poli hidroxibutirato co valerato (PHBV)
Copolimero, pf: 108°C, tv: -5°C a 20°C
Altamente cristalino
El copolímero puro es quebradizo pero menos que PHB
[193]
Plastarch thermoplastic starch (TPS)
Almidón, los enlaces glucosídicos rompen a 150°C y a 250°C los gránulos colapsan
Biodegradable resistente al calor, barato
Inferiores cualidades mecánicas, quebradizo, higroscópico, amorfo
[53, 211, 208, 193]
Poli(Butileno Succinato) (PBS)
Poliéster de ácido succínico y etilenglicol, PF:(90-120)°C, tv:-45°C a -10°C entre el PE y PP, porcentaje de elongación 330%, Resistencia a la tensión de 330kg/cm
2
Características mecánicas comparables a las del polipropileno PP el polietileno baja densidad LDPE, buena procesabilidad mejor que PLA y PGA
Los microorganismos que lo degradan tienen una distribución limitada, depende fuertemente de los factores ambientales, insuficiente biocompatibiliad y bioactividad.
[53, 229]
Poli (Etileno Succinato) (PES)
Poli (p-dioxanona)(PPDO)
Poliéster de p-dioxanona (tv): -10°C-0°C
Buenas propiedades mecánicas, muchos microorganismo lo degradan.
Es más caro que el PBS
[193]
Si bien el polietileno puro es muy buen material y sus cualidades son difíciles de igualar, en la actualidad existen cuantiosas opciones de aditivos comerciales y no comerciales, todas novedosas y que poco alteran sus cualidades originales, acelerando su proceso de biodegradación, siendo positivo para el ambiente y la economía de las empresas basadas en estas poli olefinas, además es posible encontrar una gran cantidad de muy buenos sustitutos altamente biodegradables y biocompatibles, pero existen aún los siguientes inconvenientes: Casi todos los aditivos del polietileno de baja densidad LDPE y los biopolímeros alternativos en desarrollo son de 2.5 a 10 veces más caros, lo que implica que los esfuerzos se dirijan a la búsqueda de sustratos de menor costo [6, 67]. Las propiedades físico químicas de los biopolímeros alternativos frecuentemente restringen su uso [67], siendo necesario una mejora aún en éstos.
5.4 Técnicas y métodos utilizados en el estudio de la
biodegradación del LDPE
Existe una gran variedad de técnicas que permiten analizar la biodegradación
del polietileno de baja densidad LDPE, desde múltiples perspectivas, todas se
basan en principios fisicoquímicos y permiten estudiar variables específicas,
37
que en conjunto proporcionan un amplio y profundo panorama sobre su
degradación a través del tiempo.
Todas las técnicas están adaptadas en métodos específicos, mucho de los
cuales están estandarizados, facilitando de esa manera determinar la validez y
la reproducibilidad de los experimentos. Muchas de las técnicas permiten
analizar los cambios ocurridos en el material, por efecto de los
microorganismos o los factores abióticos, en estos últimos se incluyen los pre
tratamientos y los aditivos, el rango de posibilidades de estudio es muy amplio,
abarcando desde: el daño superficial, el cambio químico, la variación del peso
molecular y de sus propiedades físicas, etc. la selección de las técnicas
depende de factores como: costos, sensibilidad, necesidades, tiempo, etc. A
continuación en la Figura 10 se dividen de acuerdo al tipo de cambio, principio
y propiedades estudiadas.
Figura 10 tecnicas y métodos disponibles para el estudio de la degradación del LDPE, adaptado de [230, 42]
Alternativamente se han desarrollado métodos que se enfocan en el estudio de
los microorganismos, muchos de las cuales se basan en múltiples técnicas
tales como la microscopia de fluorescencia, la electroforesis, la PCR y la
microscopía óptica tradicional, la cromatografía de gases etc., siendo muy útiles
38
para conocer: los microorganismos que pueden utilizar el polietileno de baja
densidad (LDPE) como fuente de carbono y de energía, también los cambios
que ocurren en las poblaciones microbianas a través del tiempo, por ejemplo:
las enzimas liberadas, los metabolitos producidos, los cambios en la biomasa a
través de todas las etapas de crecimiento, etc.
5.4.1 Técnicas instrumentales utilizadas para estudiar la biodegradación
del (LDPE)
En la siguiente tabla se enlistan muchas de las técnicas que se han utilizado en
el estudio de la biodegradación del polietileno de baja densidad LDPE y las
otras variantes del polietileno.
Tabla 10 Técnicas utilizadas para estudiar la biodegradación del Polietileno de baja densidad LDPE
Técnica Nombre permite obtener Referencia
AAS Espectroscopia de absorción atómica (del inglés: Atomic absortion spectroscopy)
Permite determinar la concentración de un elemento las de las impurezas de los catalizadores o aditivos, se basa en la ley de Lambert beer.
[203]
AFM Microscopia de fuerza atómica, (del inglés: Atomic Force Microscopy)
El efecto de la biodegradación en la superficie del PE
[71, 160, 231, 119]
DMTA o DMA análisis Dinámico térmica mecánica
Fuerza mecánica, elongación a falla y módulo del polímero
[154, 57]
DSC Calorimetría por escaneo diferencial (del inglés: Differential Scanning calorimetry)
Temperatura de fusión y de Transición vítrea
[106, 168, 16, 147, 110, 85, 65, 109, 111, 71] [169, 112, 65, 201, 205, 232, 233, 126, 234, 235] [67, 189, 197, 115, 198, 57, 179]
EFM Microscopia de epifluorescencia (Epifluorescence microscopy)
Crecimiento de la biomasa
[117, 139, 41] [96, 47, 160, 119]
Electroforesis Electroforesis Determinación de la especie de microorganismo y sus proteínas, también para el aislamiento de plásmidos.
[132, 32, 80, 130]
EA Analizador elemental(Elemental Analyzer)
Permite determinar el contenido de carbono
[67, 196, 80, 197]
EDS Espectroscopía de dispersión de electrones (Electron dispersion Spectroscopy)
Permite encontrar la composición elemental (aditivos) de una muestra de polímeros
[157]
ESR o EPR Espectroscopia de resonancia paramangenetica electrónica (Electron spin resonance)
Estructura de los metabolitos y reactividad de los intermedios
[70]
ESI-MS Electron Spray Ionization ion trap Mass Spectroscopy
identificación de macromoléculas como proteínas y metabolitos
[80, 119]
FTIR-ATR o FTIR
Espectroscopia infra roja con transformada de Fourier
Cambios químicos, Cristalinidad.
(Fourier Transformed infra-red spectroscopy with Atenued refractance)
[156, 168, 65, 111, 236, 109, 122, 96, 231, 208] [127, 126, 106, 120, 16, 174, 83, 67, 62, 90] [232, 110, 233, 207, 235, 188, 170, 117, 47, 105]
39
[95, 149, 139, 135, 93, 145, 166, 237, 92, 202] [124, 132, 31, 196, 238, 84, 189, 155, 69, 211] [41, 119, 11, 158, 123, 133, 148, 221, 197, 116] [198, 66, 173, 82, 162, 57, 74, 179, 157, 33]
GCMS
Cromatografía de gases acoplada a espectroscopia de masas (Gas Chromatography coupled with mass spectroscopy)
CO2 evolución y Caracterización de los subproductos de la biodegradación. Y también la degradación Tanto térmica como foto lítica.
[65, 131, 143, 90, 87, 65, 111, 109, 236, 47] [79, 165, 51, 156, 122, 28, 131, 93, 80, 41] [74]
HT-GPC o SEC HT-SEC
Cromatografía de permeación en gel (gel permeation chromatography, size exclusion chromatography)
Distribución del Peso molecular Densidad, ángulo de contacto, viscosidad, distribución del peso molecular.
[67, 176, 85, 65, 69, 47, 239, 169, 112, 154] [149, 79, 96, 153, 170, 196, 119] [104, 149, 151, 69]
HPLC Cromatografía líquida de alto desempeño (High performance liquid chromatography)
Peso molecular y poli dispersidad, metabolitos como lípidos
[196, 155]
Instron universal test machine u otro
Tensiómetro, Extensómetro
cambios mecánicos, elongación tensión
[163, 67, 176, 71, 72, 160, 13, 240, 191, 155] [205, 232, 233, 206, 207, 94, 125, 188, 156, 151] [117, 11, 123, 28, 95, 190, 92, 62, 31, 196] [197, 116, 198, 57, 179, 33]
ICP-OES Espectroscopia de emisión dual de plasma y óptica (inductively coupled plasma-optical emission spectroscopy)
Para determinar la existencia de otros elementos traza como metales.
[67]
MALDI-TOF MS Espectroscopia de masas con Matriz asistida por desorción laser con tiempo de vuelo (Matrix assisted Laser Desorption time of flight)
Técnica de espectroscopia de masas que permite identificar Metabolitos generados y las proteínas para la identificación microbiológica
[65]
OM Microscopia óptica
Visualización de los microorganismos para una identificación preliminar
[154, 131, 102, 87, 132, 241, 91, 148, 81, 33]
NMR
Resonancia magnética Nuclear
Determina los aditivos [170, 96, 196, 80]
PCR Reacción en Cadena de la polimerasa (Polimerase chain reaction)
Clonación de los genes vinculados con la biodegradación, ejemplo: alcano hydroxylase gene alkb
[32, 84, 80, 155, 242, 158, 123, 128, 130]
SEM Microscpia electronica de escaneo Scanning electron microscopy
Erosión superficial(morfología)
[32, 106, 40, 117, 174, 67, 90, 147, 65, 109] [47, 239, 111, 96, 143, 155, 112, 65, 191, 167] [205, 139, 232, 233, 206, 234, 125, 188, 51, 156] [168, 127, 93, 101, 166, 237, 92, 102, 202, 124] [31, 196, 238, 170, 211, 208, 41, 119, 158, 123] [133, 148, 81, 209, 77, 116, 129, 82, 57, 179] [157, 33]
TGA Análisis Temperatura de [106, 168, 196, 238, 84, 80, 211, 208, 119, 158]
40
Termo gravimétrico
fusión y de Transición vítrea, también de descomposición térmica o degradación.
[197, 57]
TLC Cromatografía de capa fina (Thin lawyer chromatography)
Caracterización de los subproductos de la degradación.
[65, 105]
UVS Espectroscopia de ultravioleta y visible (UV-visible spectrophotometry)
Determinación de la concentración de biomasa o de la actividad de una enzima y la pureza del DNA
[117, 65, 160, 134, 124, 126, 238, 231, 73, 163] [128, 197, 127, 129, 75, 82]
XRD XSP WAXS SAXS (EDXA) (EDXMA) (EDAX)
Difracción de rayos x(X- Ray difracción) (Estructura cristalina y amorfa) del polímero y sus aditivos
[111, 152, 109, 65, 92, 80, 155, 179, 157] [119] [65] [65] [93]
X- RAY Photoelectron Spectroscopy
Wide angle X-ray scattering
Espectroscopia de rayos x en ángulo pequeño Small angle X-ray spectroscopy9+
energy dispersive X-ray analysis (or energy dispersive X-ray microanalysis)
XRF Fluorescencia de Rayos X, es un analizador de elementos para determinar aditivos
[170]
5.4.1.1 Técnicas espectrofotométricas, microscópicas y espectrométricas
para el estudio de la degradación del LDPE
De todas las técnicas encontradas, gran parte son técnicas espectrofotométricas microscópicas y espectrométricas, las cuales se basan en la interacción entre la materia (el polietileno de baja densidad LDPE) y la energía, cada uno de los sus átomos, absorbe, difracta o refleja la energía que se emite por las distintas fuentes, como son: los fotones de las distintas radiaciones electromagnéticas, (microondas, infrarrojas, visibles, ultravioletas, rayos X, etc.,) flamas (energía térmica), los electrones acelerados, etc., las cuales excitan sus electrones emitiendo señales que son registradas por detectores y procesados en ordenadores para ser finalmente analizados, de esta manera proporcionan datos relevantes sobre el material, como son: la composición química, cristalinidad, morfología superficial, análisis de los aditivos proporcionados, formación de radicales u otras especies y en la observación de los microrganismos que atacan el polietileno de baja densidad LDPE etc., todas estas técnicas son no destructivas, exceptuando las espectrométricas, todas son versátiles y muy sensibles, y todos los grandes avances en los estudios sobre biodegradación de LDPE no serían posibles sin la utilización de las técnicas espectrofotométricas, espectrométricas y microscópicas, a continuación se mencionara algunas.
41
5.4.1.1.1 Microscopia electrónica de barrido (SEM)
El microscopio electrónico de barrido, conocido por sus siglas en ingles SEM,
utiliza electrones en lugar de luz para formar una imagen. Para lograrlo, el
quipo cuenta con un dispositivo (filamento) que genera un haz de electrones
para iluminar la muestra, después los electrones que interactuan con la
superficie de la misma se capturan con detectores que transforman esas
señales en información valiosa como las formas, textura y composición química
de sus constituyentes [243].
La microscopia electrónica de barrido (SEM) tiene diversas aplicaciones en los
estudios de la biodegradación del polietileno de baja densidad. Porque permite
apreciar la morfología superficial de las capas del polímero, de esa manera se
pueden ver los pequeños cambios superficiales y la colonización microbiana,
las pequeñas imperfecciones estructurales, las separaciones entre diferentes
polímeros, etc. Las muestras son generalmente cubiertas con polvo de oro o
algunos iones metálicos antes de la examinación con SEM. La técnica de
presión variable SEM es útil en la observación directa sin ningún tipo de
metalización de la superficie a una adecuada magnificación [244].
5.4.1.1.2 Microscopia de fuerza atómica
La microscopía de fuerza atómica o AFM es un método para ver una superficie en su integridad. El método se aplica a materiales sintéticos, suaves y duros también a estructuras biológicas (tejidos, células, biomoléculas) [245].
5.4.1.1.3 Espectroscopia UV - visible
Todas las moléculas orgánicas e inorgánicas absorben en el ultravioleta y el visible, cuyas longitudes de onda medida en nanómetros, van desde los (200nm a los 800nm), siendo ésta la energía necesaria para excitar sus electrones, cuando se registra su absorbancia en todas las longitudes de onda pertenecientes al UV-visible se genera una huella única para cada molécula (espectro), además la intensidad de la absorbancia es directamente proporcional a la concentración, de acuerdo a la ecuación de Lambert Bourger Beer, el espectrómetro UV- visible permite observar tanto el espectro como su intensidad de esa manera puede identificar las moléculas y cuantificarlas. La espectroscopia UV- Visible es una técnica muy poderosa, por su increíble versatilidad, puesto que unida a otras técnicas como la quimioluminicencia CL y la cromatografía de capa fina TLC, permite un sin número de usos, entre los cuales están: la identificación de microorganismos por medio de la quimio taxonomía, análisis de viabilidad o crecimiento de biomasa, análisis de la actividad enzimática, actividad metabólica, cuantificación de proteínas y ácidos nucleicos, permite evaluar la hidrofobicidad de la superficie celular de acuerdo a la turbidez (prueba BATH), etc.
42
5.4.1.1.4 Espectroscopia Infrarroja con transformada de Fourier (FTIR)
La espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FT-IR) utiliza el hecho
de que las moléculas orgánicas absorben determinadas frecuencias en el
infrarrojo que son características de su estructura. Dichas absorciones son
frecuencias de resonancia, es decir, la frecuencia de la radiación absorbida
coincide con la frecuencia del enlace o del grupo que vibra.
La espectroscopia infrarroja con transformada de fourier FTIR permite
incontables aplicaciones entre las que están: La elucidación de estructuras
químicas y físicas, la observación de puentes de hidrógeno, la detección de
grupos terminales, el análisis de las reacciones de degradación, el análisis del
comportamiento de entrecruzamiento de las moléculas y el análisis de la
composición de copolímeros en forma líquida y sólida etc [244].
5.4.1.1.5 Espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR)
El fenómeno de la resonancia magnética es consecuencia de que existen
sistemas físicos (átomos, iones, núcleos, etc.) que poseen momento
magnético permanente. En presencia de un campo magnético, ese momento
interactúa con el campo y se produce desdoblamiento en los niveles
energéticos del sistema (efecto zeeman) [246].
La NMR Permite determinar la fracción soluble, la fuerza de tensión y los
cambios en el peso molecular, es un método indirecto de evaluación porque no
da ninguna idea de los cambios químicos del polímero. La espectroscopia NMR
(1H and 13C NMR) es el método más versátil que se puede usar como
herramienta analítica para muchos estudios de biodegradación del polietileno
de baja densidad LDPE [184, 244].
5.4.1.1.6 Desorción láser asistida por la matriz con detección de masas por
tiempo de vuelo MALDI-TOF MS
En la técnica de análisis (MALDI) (matrix-assisted laser desorption/ionization), el
analíto es primero cristalizado en una matriz con un gran exceso de un
compuesto, usualmente un ácido orgánico débil absorbente de ultravioleta (UV),
después del cual se le dispara radiación laser a la mezcla analíto matriz,
resultando en la vaporización de la matriz la cual porta el analíto.
Subsecuentemente la matriz absorbe la energía del láser y ioniza la muestra
puesto que le quita o dona electrones, por lo que la ionización es indirecta [247],
el analizador es de tipo de tiempo de vuelo o TOF (del inglés time of flight).
La MALDI permite una vaporización no destructiva y una ionización de
pequeñas y grandes biomoléculas, proporcionando una caracterización del
peso molecular y la distribución de las masas moleculares de los distintos
productos de la degradación del polietileno.
43
Permite la identificación de microorganismos biodegradadores de LDPE,
mediante el análisis de proteínas, principalmente ribosomales, a partir de
colonias o directamente de muestras a través de la creación de un espectro de
masas el que es específico para cada especie [248]. La implementación de
MALDI-TOF MS es sencilla, necesitando sólo un par de días para la
capacitación del personal, la identificación es rápida y el costo por cada muestra
es inferior al costo de otros métodos diagnósticos [248]. Esta tecnología ha
demostrado ser confiable, específica y rápida para la identificación de distintas
bacterias aeróbicas y anaeróbicas [248].
5.4.1.1.7 Espectrometría con Plasma Inductivamente acoplada a Emisión
Óptica ICP-OES
La espectroscopia con plasma inductivamente acoplada (ICP/OES) es una
herramienta poderosa para la determinación de metales en una variedad de
diferentes matrices de muestras [249]. La técnica se basa en la emisión
espontanea de fotones de los átomos y iones que han sido excitados en una
descarga de radiofrecuencia RF [249]. Presenta la mayor sensibilidad al
detectar hasta ultra trazas (ppq-ppb) [250].
En esta técnica una muestra liquida es inyectada bajo una fuente de plasma de
argón inducido por radiofrecuencia, usando una variedad de nebulizadores o
alguna técnica de introducción de muestras [249].
La ICP/OES puede ser acoplada a la cromatografía de gases (GC) o a la
cromatografía liquida de alto-desempeño (HPLC), lo que potencia el
desempeño de las técnicas cromatográficas y aumenta su sensibilidad, por lo
tanto es útil para la determinación de los metales presentes en el polietileno,
pertenecientes a impurezas, aditivos o catalizadores [249].
5.4.1.1.8 Espectroscopia de difracción de rayos x, XRD
La espectroscopia de difracción de rayos x (XRD) se fundamenta en que
cuando un haz monocromático de rayos x se enfoca en un cristal, éste forma
patrones de difracción y estos patrones reflejan las características
fisicoquímicas de las estructuras del cristal [251].
La espectroscopia de difracción de rayos x permite identificar, la
microestructura, el tamaño de los cristales y la orientación de las cadenas de
polietileno, también permite cuantificar el grado de cristalinidad del polietileno,
pues ningún polietileno es 100% cristalino (polimorfismo), siendo esto
importante porque la biodegradación se facilita en las regiones amorfas, y
también la cristalinidad misma varia en virtud del proceso de deterioro, de esta
manera se siguen los pasos del proceso de biodegradación [252].
44
5.4.1.1.9 Espectrometría Fluorescencia de rayos X, XRF
La microscopia de fluorescencia se involucra la emisión de un fotón de rayos X
después de la ionización del átomo por un haz primario de rayos X, el fotón de
rayos X del tubo impacta la muestra donde interactuara con un electrón de las
capas internas del átomo, sacando el electrón del orbital, este espacio vacío se
llena prontamente por un electrón de las capa superior, este electrón tiene una
mayor energía que el electrón que lo remplaza, esta energía en exceso se
expulsa en forma de rayos x con una longitud de onda específica para el átomo
[250].
La técnica XRF permite encontrar elementos que van desde el Sodio al Uranio,
en estado sólido o líquido, en forma de capas delgadas o bulbosas, con un
amplio y dinámico porcentaje, requiere mínima preparación, es no destructiva,
permite un análisis rápido y multi elemento, es transportable a el campo de
análisis, bajos costos de mantenimiento y operación. Permite el estudio de
metales traza en el polietileno de baja densidad LDPE con muy buena
sensibilidad y un costo relativamente bajo [250].
5.4.1.1.10 Espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica
EPR
La espectroscopia paramagnética electrónica EPR es una forma de
espectroscopia de absorción de microondas, en la cual las transiciones se
inducen entre los niveles de energía de zeeman de electrones no apareados
[253].
Mientras que la NMR es una técnica espectroscópica estándar para la
determinación estructural de las moléculas, la estrechamente relacionada
espectroscopia EPR es aun escasamente conocida por muchos científicos
[254].
Esta discrepancia es originada por la carencia de sistemas naturales
paramagnéticos debido a el hecho de que la formación de enlaces químicos es
inherentemente acoplado al emparejamiento de dos electrones y como
resultado general un espín electrónico de cero, S= 0 [254].
El método está restringido a unos pocos sistemas paramagnéticos como son,
los complejos de metales de transición y los radicales libres, únicos que
poseen un electrón residual, siendo esto ventajoso por la selectividad que
presenta [254].
Cuando hay una ruptura de los enlaces covalentes en una molécula de
polietileno de baja densidad LDPE, se forman radicales libres inestables cuyo
carácter paramagnético los hace fácil de detectar e identificar con la EPR,
siempre y cuando la concentración de radicales este en los límites de
sensibilidad (̴1012 radicales) [253].
45
5.4.1.1.11 La espectroscopia de absorción atómica (AAS)
La espectroscopia de absorción atómica AAS por sus siglas en inglés Atomic
absortion spectroscopy, es una técnica analítica que mide la concentración de
los elementos. La absorción atómica es tan sensible que puede medir valores
menores a partes por mil millones de gramo (µg dm-3) en una muestra. La
técnica utiliza las longitudes de onda de luz absorbidas específicamente
absorbidas por un elemento. Las que corresponden a las energías necesitadas
para promover electrones de un nivel de energía a otro de mayor energía [255].
Se aplica en el análisis de los elementos traza presentes en el polímero.
5.4.1.2 Técnicas cromatográficas para el estudio de la degradación del
polietileno de baja densidad LDPE
La definición de la IUPAC (unión internacional de química pura y aplicada) de
cromatografía es:
“Un método físico de separación, en el que los componentes a separar se
distribuyen en dos fases, una estacionaria y otra que se mueve en una dirección
definida” [256].
Estos compuestos químicos, pueden ser compuestos orgánicos de moderada
masa molecular tales como ácidos grasos y muchos otros metabolitos, también
polímeros tales como ácidos nucleicos, proteínas o cadenas
macromoleculares, como las que componen el polietileno de baja densidad, por
lo tanto son muy utilizadas en los estudios sobre la degradación del polietileno
de baja densidad LDPE, porque permiten estudiar el cambio en la longitud de
las cadenas del polietileno de baja densidad LDPE, identificar microorganismos
solamente observando su perfil de ácidos grasos, analizar sus enzimas y el
material genético y hasta cuantificar la mineralización del polietileno, la
cromatografía se clasifica en cromatografía de partición y adsorción, siendo la
de partición en fase estacionaria líquida y la de adsorción en fase estacionara
sólida, aunque este trabajo no pretende un estudio de tallado de estas técnicas,
se mencionaran brevemente algunas de estas.
5.4.1.2.1 Cromatografía de gases acoplada a masas GCMS
La cromatografía de gases GC es un método cromatográfico común que se
basa en las diferencias en comportamiento de partición entre un flujo de fase
móvil y una fase estacionaria en orden de separar compuestos orgánicos o
inorgánicos volátiles o semivolatiles [244]. Es una de las técnicas más versátiles
y ubicuas en los laboratorios por ser sencilla, rápida, eficiente y sin lugar a duda
su aporte en el estudio de la biodegradación del LDPE es excepcional, por que
con esta técnica se pueden separar mezclas muy complejas, [257].
La GC técnica se usa para la identificación y cuantificación de monómeros o
solventes residuales en el LDPE, para el análisis de componentes volátiles o
impurezas, para la verificación de los niveles de aditivos en el LDPE, para la
46
cuantificación de contaminantes traza, para el análisis de los productos finales
de la biodegradación como el CO2, CH4, para el análisis de otros metabolitos
generados por los microorganismos, etc., un numero de detectores
especializados están disponibles, incluyendo ionización en flama FID (del inglés
flame ionization), emisión atómica AED (del inglés atomic emission), flama
fotométrica FPD (del inglés flame photometric) y conductividad térmica TCD (del
inglés thermal conductivity). Adicionalmente está disponible la espectrometría
de masas (MS), que permite una gran flexibilidad en evaluaciones cualitativas y
cuantitativas del polietileno [258], cuando se acopla con la espectroscopia de
masas como sistema de detección, es posible la identificación de virtualmente
todos los eluados con una muy alta sensibilidad, creando un sistema analítico
muy poderoso [257].
5.4.1.2.2 Cromatografía de líquidos de alta eficiencia HPLC
La técnica HPLC es el análogo de la cromatografía de gases pero, en fase
liquida, el secreto de su éxito son las partículas pequeñas y uniformes que
producen poca difusión arremolinante y su máxima transferencia de masa,
además permite analizar compuestos poco volátiles o estables [257].
La cromatografía liquida de alta presión (HPLC) es ampliamente usada para
separar moléculas en base a su tamaño. El principio de la técnica es que las
moléculas mayores eluirán primero, a medida que estas pasan a través de los
espacios en la columna, mientras más pequeñas sean estas eluiran
posteriormente porque estas tomaran mayor tiempo en pasar atravesar los
poros in el gel. La HPLC se usa para analizar los productos de la degradación
metabólica de los xenobióticos. Pudiéndose observar los productos de
biotransformación como son: el estireno, epoxistireno, fenilacetaldehido, y 2-
feniletanol etc. Los cuales fueron detectados por la cromatografía líquida de
alta presión en fase reversa [244].
5.4.1.2.3 Cromatografía de exclusión por tamaño o de permeación en gel
Es un método en el que la fase estacionaria es una malla o criba molecular, se
usa en columnas abiertas con alimentación por gravedad para separaciones
de preparación, y para separaciones de alta eficiencia [257]. Estas mallas son
carbohidratos poliméricos y acrilamidas que tienen una red abierta formada por
el entrecruzamiento de cadenas poliméricas, son hidrófilas, por lo que son
capaces de absorber agua e hincharse, causando la abertura de su estructura
[257]. El grado de entrecruzamiento determina el tamaño de los poros [257].
Las moléculas más grandes no penetraran en los poros por lo que eluirán más
rápido, y solo las más pequeñas quedaran atrapadas en los poros
permaneciendo en la malla.
La cromatografía de permeación en Gel (GPC) o cromatografía exclusión por
tamaño (SEC) se usa en la determinación de la distribución de las masas
47
moleculares del polietileno de baja densidad para determinar los cambios en el
peso molecular después de la biodegradación [244].
5.4.1.3 Técnicas de análisis de sus propiedades mecánicas: Pruebas de
tensión tensile test
También conocida como test de tensión, son probablemente los tipos de pruebas más fundamentales que se pueden realizar en cualquier material, las pruebas de tensión son simples, relativamente baratas, y completamente estandarizadas, mediante la tensión a cualquier material se puede determinar como el material reacciona ante las fuerzas aplicadas, se analiza la resistencia a la tensión, conociendo que tanto se estira [30]. Las propiedades mecánicas son medidas con el módulo de elasticidad, la resistencia a la tensión y la elongación del material, obtenidas a partir de los ensayos de tracción en la maquina universal de ensayos Instron. La cual ha sido estandarizada en la norma ASTM D638 “método test estándar para las propiedades de los plásticos”. El deterioro del polietileno de baja densidad LDPE se puede evaluar por el cambio en sus propiedades reológicas, estas propiedades dependen directamente en el peso molecular del polímero, su cristalinidad y la presencia de las ramificaciones y los efectos de cruzamiento, etc., [259].
5.4.1.3.1 Resistencia a la Tensión
Se mide como la fuerza medida por la celda de carga al tiempo de ruptura
dividido por la sección del área cruzada original de la muestra al punto de
sección cruzada mínimo.
5.4.1.3.2 Módulo de Tensión y la elongación hasta la ruptura
El Módulo de Tensión es la pendiente de la porción lineal de la curva estrés –
tensión, y la elongación de él espécimen hasta la ruptura se mide en términos
de su longitud inicial (L0) y longitud final
(L1), y es dado como:
𝐸𝑙𝑜𝑛𝑔𝑎𝑐𝑖ó𝑛 ℎ𝑎𝑠𝑡𝑎 𝑙𝑎 𝑟𝑢𝑝𝑡𝑢𝑟𝑎
= (𝐿1 − 𝐿0)
𝐿0∗ 100
5.4.1.4 Técnicas de análisis térmico
El análisis térmico comprende el estudio de la evolución de las propiedades de
una muestra o compuesto cuando es sometida a un calentamiento a altas
temperaturas.
Es una familia de técnicas denominadas análisis térmico, los miembros usados
en los estudios de biodegradación del LDPE son: la calorimetría de escaneo
diferencial DSC (del inglés differential scanning calorimetry), el análisis termo
gravimétrico TGA (del inglés thermo gravimetric analysis), y el análisis térmico
mecánico y dinámico DMTA (del inglés dynamic mechanical analysis). Sin
48
embargo existen muchas técnicas más, a continuación se en listan algunas
técnicas de análisis térmico.
Tabla 11 principales técnicas de análisis térmico, tomada de [260]
Propiedad Técnica Abreviación
Masa Termo gravimetría TG
Temperatura Análisis Térmico diferencial DTA
Entalpia Calorimetría diferencial de barrido DSC
Propiedades mecánicas Análisis termo mecánico TMA
Propiedades ópticas Termo microscopia TM
Propiedades magnéticas Termo magnetometría
Propiedades eléctricas Termo electrometría
Propiedades acústicas Termo sonometría TS
Evolución de gas radioactivo
Análisis térmico de emanación ETA
Evolución de partículas Análisis de termo partículas TPA
Todas las técnicas de análisis térmico son usadas para caracterizar una amplia
variedad de materiales, entre los que se encuentran los polímeros
termoplásticos como el LDPE.
5.4.1.4.1 Calorimetría diferencial de barrido DSC
La calorimetría diferencial de barrido DSC (del inglés Diferential Scanning
Calorimetry) permite el estudio de aquellos procesos en los que se produce una
variación de entalpia, por ejemplo determinación de calores específicos, puntos
de ebullición y de fusión, pureza de compuestos cristalinos, entalpías de
reacción y determinación de otras transiciones de primer y segundo orden [261].
La DSC puede trabajar desde la temperatura del nitrógeno líquido hasta unos
600°C [261].
El polietileno presenta precisamente todas sus transiciones térmicas en ese
intervalo. Por esta razón se emplea en la caracterización del LDPE, para
estudiar: la temperatura de transición vítrea Tg, la temperatura de fusión, las
reacciones de polimerización, los procesos de curado, el análisis de
polimorfismos, la cinéticas de reacción, el tiempo e inducción a la oxidación y
descomposición, también se pueden hacer estudios de compatibilidad de
mezclas del LDPE con otros polímeros [261].
5.4.1.4.2 Análisis térmico mecánico y dinámico DMTA
Es una técnica empleada en el estudio de las propiedades viscoelasticas de un
material, basada en la aplicación de energía mecánica mediante perturbaciones
sinusoidales en la zona elástico lineal de los ensayos esfuerzo- deformación
con el fin de determinar sus propiedades dinámicas [262].
El análisis térmico mecánico dinámico DMTA (del inglés Dynamic Mechanical
Analysis), permite estudiar la respuesta del polímero a las solicitaciones
49
exteriores en un amplio intervalo de tiempos y temperaturas, y también permite
observar propiedades como: la transición vítrea, relajaciones secundarias,
copolímeros, compatibilidad de mezclas, orientación, resistencia al impacto,
presencia de agua, polímeros naturales, peso molecular, irradiación, reacciones
de curado, envejecimiento físico, adhesión y fricción, aislamiento acústico,
fluorescencia [262].
5.4.1.4.2.1 Análisis Termo Gravimétrico TGA
El análisis termo gravimétrico TGA (del inglés Thermogravimetric analysis)
provee una información de caracterización complementaria y suplementaria
para la técnica térmica más comúnmente usada, la DSC [263].
La TGA mide la cantidad y tasa (velocidad) de cambio en la masa de una
muestra de polietileno como una función de la temperatura o el tiempo en una
atmosfera controlada [263].
Las medidas son usadas primeramente para determinar las estabilidades
térmicas y/o oxidativas del material (polietileno de baja densidad), también sus
propiedades composicionales. La técnica puede analizar muestras de
polietileno de baja densidad LDPE que exhiban tanto pérdida de masa como
ganancia debido a la descomposición, oxidación o pérdida de compuestos
volátiles (tal como la humedad). La técnica permite distinguir sutiles pero
importantes diferencias entre varias muestras de polietilenos como: la cantidad
de aditivos, grado de cristalinidad, el análisis composicional de mezclas de
polietilenos, cinética de la descomposición, bajos niveles de volatiles etc [263].
5.4.2 Métodos y pruebas utilizados en los estudios de biodegradación del
polietileno de baja densidad LDPE
Existen muchos métodos que permiten estudiar la biodegradación del
polietileno, algunos han sido diseñados y estandarizados por organizaciones
como la: organización internacional de estándares o ISO (del inglés
International Standard Organization) y la sociedad americana de pruebas y
materiales o ASTM (del inglés American Society for Testing and Materials), los
métodos tienen múltiples propósitos, pueden interesarse en las condiciones de
la biodegradación, en los productos, en los microorganismos, etc.
A continuación se presentaran todos los métodos que se encontraron en los
artículos publicados sobre biodegradación de polietileno de baja densidad.
Tabla 12 Test y métodos de cultivo usados para evaluar la biodegradación del LDPE. Adaptado de [264]
Nombre del Test Características Referencias
Prueba de biodegradación
Stürm test (OCDE 301B, ISO 14852, ASTM D5988–03 KS
[51, 127, 101, 92, 62, 196, 32, 73, 201, 128] [40, 81, 209, 197]
50
respirometrica Stürm (del inglés respirometric biodegradation tests.)
M3100-1:2002;MOD ISO 14855:1999, prEN 14046) o variantes para obtener la evolución de CO2.
Prueba de adherencia a hidrocarburos BATH (por sus sigla en inglés bacterial adhesion to hidrocarbons)
Adhesión bacteriana a hidrocarburos, para la evaluación de la hidrofobicidad de la superficie celular bacteriana.
[160, 237, 126, 73, 106, 127, 129]
Prueba de salado SAT (por sus siglas en inglés: salting out test)
El Test de agregación de sal para medir la hidrofobicidad de la superficie celular.
[106]
Demanda biológica de oxigeno BOD (del inglés Biological oxigen demand)
Test sobre la demanda de oxígeno en medio líquido o en medio solido es (ISO 14851) recomendado por 117 días
[238, 73, 163, 158, 128]
Prueba de composta CP (del inglés Compost test)
Test Compost bajo condiciones de laboratorio (ISO/DIS 20200, EN 261085, ISO 14855 y ASTM D5958, ASTM 5338-98. ) recomendado por 50 días
[104, 67, 92, 202, 11, 239, 194, 133, 197]
Condiciones Anaeróbico (ASTM D5210) por 58 días pruebas
anaeróbicas [214]
Prueba de degradación Headsp 25°C (Biodegradation Assays).
En un Erlenmeyer cerrado a 25°C (OCDE 301D, ASTM D5988-96 o modificado 30°C o 37°C ) recomendado por 48 días
[96, 237, 88, 238, 161, 84, 117, 41, 119, 128] [162, 74, 179]
Prueba de degradación (Headsp 50°C)
En un Erlenmeyer cerrada a 50°C (OCDE 301D, ASTM D5988-96 modificado) recomendado por 48 días
[48, 104, 126, 158]
Compost a escala piloto Test Piloto de compost (EN 14045) o KS método estandar para determinar biodegradación aeróbica bajo condiciones compostaje controladas ASTM D M3100-1:2002; MOD ISO 14855:1999. por 84
días
[104, 67, 92, 202, 99, 135, 196, 32, 214, 194] [209]
Prueba de enterramiento en suelo SOT (del inglés Soil burial test ) (lab)
Test en suelo reconstruido en el laboratorio (DIN 53739) ISO 846/2000, ASTM D 5988 (ASTM D 5988-09) ASTM D 5338-98. En un suelo de jardín ASTM D 5247–92.
[15, 190, 92, 62, 202, 265, 201, 113, 9, 196] [164, 78, 72, 194, 133, 209, 115, 179]
Prueba de suelo de Agricultura (en inglés agriculture soil test)
Test de muestra enterrada en suelo real para agricultura
[16, 104, 132, 208]
Prueba de zona de color o clara(en inglés Color zone assay) o clear zone test
La eficiencia se determina por el color de la zona formada en los platos solidos emulsificados con LDPE-. Indicador Purpura de Bromocresol para detectar algún cambio en el pH of el medio.
[75, 144]
Pruebas de enzimas (en inglés Enzime test)
Test Enzima, lacasa test con laccase screening médium, LSM.
[134, 124, 174, 155, 16, 82]
Estudio de absorción de agua (WAS del inglés Water Absorption Study)
De acuerdo a las normas ASTM D1037 -99, ASTM D-570.immersion de una muestra15xl5x3mm en agua destilada a temperatura ambiente se mide el peso ganado. Para biopolímeros hidrófilos como el almidón plastificado.
[190, 211, 208, 116, 179]
Valoración cuantitativa De acuerdo a la norma ASTM G21-90 se [198]
51
del crecimiento de hongos( en inglés Quantitative assessment)
cuantifica el crecimiento de biocapas de hongos en cajas petri sobre el polietileno
Prueba de viabilidad metodo de conteo de platos (viability tests) (plate counting method or others )
Número más probable en orden de examinar el cambio de la actividad de las bacterias en el suelo durante la prueba, conteo microbiano por el estudio de las UFC, también las Pruebas Redox, CTC- Fluorescente y TTC (2, 3, 5- cloruro trifeniltetrazólio) como indicadores de viabilidad.
[62, 92, 156, 132, 238, 84, 163, 16, 119, 242] [209, 77, 116, 127, 157]
Prueba de cultivo liquido (Liquid culture test)
La degradación se cuantifica por la estimación de carbón orgánico total soluble en agua (TOC) y pH de los medios de cultivo
[144]
Condiciones de exposición marina (Marine exposure conditions)
Se sumerge a 3 m conectados a un flotador, y se deja desde varios meses a un año, se analiza las condiciones del mar, pH, OD, salinidad, etc.
[188, 231, 240, 266]
Índice de flujo fundido MFI (del inglés Melt flow index,
De acuerdo a la norma ASTM D1238, ASTM D3418. Con probador MFI para el análisis de la temperatura de fusión del polímero.
[208, 221, 198, 179]
Cultivo en cajas Petri con PE (en inglés polymer containing agar (MSM) plates)
Se siembra en medios selectivos con PE como fuente de carbón Método de conteo de plato, método de zona clara, ASTM G21.
[32, 161, 80, 16, 119, 123, 69, 91, 128, 114] [51, 116, 82, 179, 175, 157, 144]
Pruebas de tinción pruebas bioquímicas y microscópicas (en inglés Gram staining Biochemical test Macroscopic test)
Características, Identificación y Caracterización de los Microorganismo
[76, 134, 237, 145, 135, 48, 124, 132, 99, 267] [73, 16, 11, 123, 241, 91, 128, 75, 175, 157]
Quimioluminiscencia de ATP
La Quimioluminiscencia de ATP permite el estudio de la Biomasa.(actividad metabólica de la célula)
[96, 122, 84]
Secuenciación molecular o en inglés (Molecular level (16S rRNA, or 18S rRNA gene sequencing) test
Secuenciación del 16s rRNA o 28S rRNA que Permite identificar las especies de hongos o bacterias que degradan el LDPE.
[122, 168, 95, 126, 32, 73, 106, 84, 80, 63] [41, 119, 242, 158, 123, 128, 81, 127, 129, 130] [157]
Análisis de PCR (en inglés (RAPD)-PCR Analysis)
Random Amplified Polymorphic DNA para realizar un perfil del DNA
[242]
Viscosidad y peso molecular V MW (del inglés viscosity molecular weight)
Viscosidad y Peso Molecular promedio es la correlación entre la viscosidad intrínseca del polietileno y su peso molecular fue usado para estimar la reducción en el número promedio del peso molecular (Mn)
[126]
Actividad metabólica, cuantificación de proteína
Análisis de Biomasa. (actividad metabólica de la célula) Fluoresceína di acetato FDA, TTC reducción test, ATP test, método Lowry para cuantificar la proteína celular total.
[96, 106, 160, 126, 170, 123, 241, 127, 129, 82]
Prueba de acidos grasos FAME (del inglés Fatty acid methyl ester
Análisis de los productos de la degradación e identificación de los microorganismos
[80]
52
Todos los métodos desarrollados y realizados por los autores se enfocan en múltiples aspectos de interés, tales como son: las condiciones, tanto previas y como durante los experimentos, tiempos, variables a analizar, el tipo de material, microorganismos utilizados, entre muchas otras. A continuación se explicaran brevemente algunos métodos de acuerdo a la variable a estudiar.
5.4.2.1 Métodos principales de cultivo de microorganismos degradadores
de LDPE
En la biodegradación del LDPE, sin importar el tipo de medio de cultivo a utilizar, se debe tener en cuenta las siguientes variables: el tipo o tipos microorganismos, la disponibilidad de oxígeno, la cantidad disponible de agua, la temperatura, el ambiente químico, pH, electrolitos, etc. A continuación se presentan las aproximaciones generales a los métodos de cultivo utilizados en los experimentos de biodegradación del LDPE y las demás variantes.
analysis test
Pérdida de peso WL (del inglés Weight loss test)
Disminución del peso del LDPE, el cual esta estandarizado de
acuerdo a la norma ASTMD 5338 en un periodo de 90 días. [161, 126, 76, 125, 156, 16, 117, 83, 11, 90] [167, 71, 160, 231, 137, 99, 191, 234, 131] [207, 153, 106, 168, 16, 178, 172, 107, 94, 104] [50, 105, 127, 190, 138, 145, 166, 134, 89, 237] [202, 48, 124, 88, 238, 80, 158, 194, 241, 128] [114, 115, 82, 179]
Prueba mecánicas Mechanical tests
Estandarizados por las normas ASTM D882 ASTM D638, ASTM D638-99, ASTM A370. Se mide la resistencia a la tensión y % de elongación.
[117, 119, 123, 197, 116, 115, 208, 198, 57, 74]
Aclimatación natural en ingles Natural weathering
De acuerdo a la norma ASTM D 1435-99 se monta el PE en una plataforma
[179]
Prueba de Angulo de contacto del agua WCA (del inglés water contact angle test)
Angulo de Contacto con agua y Energía superficial, deposición de la gota. Grado de oxidación de la superficie del material
[120, 71, 266, 231, 119, 123]
Prueba de dureza HT (del inglés Hardness Test)
De acuerdo a la norma ASTM D2240 en modelo Durometer
[116]
53
5.4.2.2 Medios para la realización de las pruebas
De acuerdo al sitio o lugar que proporciona el tipo de medio de cultivo se puede dividir en tres modalidades básicas:
5.4.2.2.1 Pruebas de campo (In situ o in vivo) con medios naturales
De ubicación natural, tales como: compost, rellenos, botaderos, etc., son medios naturales conocidos pero no controlados, lo que implica una irreproducibilidad en otros sitios y una aleatoriedad de las variables [259].
5.4.2.2.2 Pruebas de simulación con medios seminaturales
Son pruebas de biodegradación que se realizan a escala de laboratorio con medios seminaturales, con condiciones parcialmente controladas, los medios son conocidos y se pueden controlar en un nivel medio.
5.4.2.2.3 Pruebas de laboratorio (In vitro)
Son pruebas cuyas variables son casi completamente controladas, y se ubican en el laboratorio, los medios son conocidos y controlados con gran precisión, dando la posibilidad de comparar experimentos de diferentes laboratorios.
5.4.2.3 Los inóculos
Los inóculos que presentan los cultivos se pueden clasificar en dos categorías
básicas.
5.4.2.3.1 Cultivos con inóculos amplios o de consorcios
Son comunidades microbianas naturales, que contienen los microorganismos
que actuarían como una comunidad, como realmente lo hacen, sin embargo
hay que tener en cuenta que existe una fracción de microorganismos no
cultivable y que constituye el 90% de la biodiversidad real [268]. Generalmente
es lo primero que se aísla.
5.4.2.3.2 Cultivos microbianos axénicos
Los cultivos axénicos son cultivos con cepas microbianas puras, definidas con
medios simples y permiten deducir información concerniente al efecto
degradador y el mecanismo de biodegradación del LDPE que realizan los
determinados microorganismos [161].
5.4.2.3.3 De acuerdo a la composición de los medios se pueden clasificar
como:
5.4.2.3.4 Medios líquidos
Son medios libres de agar, contienen nutrientes minerales y suelen ser preparados en Erlenmeyer, son útiles como medios iniciadores o de enriquecimiento. Tienen la condición de permitir una competencia libre entre especies por los recursos, lo que genera selectividad.
54
5.4.2.3.5 Medios sólidos
Con una concentración de 1,5 al 2 % de agar, son útiles porque permiten hacer los análisis preliminares y no generan competencia por los recursos entre los microorganismos, excepto por la fuente de carbono que es la que genera la selectividad, por lo que sirven para identificar las colonias una vez estas sean pre seleccionadas para degradar LDPE.
A continuación se presenta una exposición de las ventajas y desventajas de las variaciones en los métodos de estudio de la biodegradación del polietileno de baja densidad y otras variantes. Tabla 13 Revisión de los métodos para el estudio de la degradación del LDPE, Adaptado de [42]
Todos los diferentes tipos de métodos de biodegradación son útiles e
importantes, por los datos que aportan, siendo todos complementarios, se
pueden centrar en: el entorno, los pretratamientos, los microorganismos y sus
eficiencias, etc.
5.4.2.4 Pretratamientos del LDPE
Los pretratamientos son opcionales, permiten simular y/o acelerar el proceso de
biodegradación natural, los siguientes fueron tomados de los trabajos de Nowak
[31].
Campo (In vivo)
Simulación Laboratorio (In vitro)
Proceso a. enterramiento de los muestras de plásticos en el suelo. b. ubicándolos en un lago o rio.
Enterramiento de las muestras de plásticos en compost, suelo o agua de mar ubicados en condiciones controladas (temperatura, pH, humedad).
Medios inoculados definidos con poblaciones microbianas definidas (ejemplo: .lixiviados,) o cepas microbianas individuales o enzimas las cuales podrían haber sido especialmente seleccionadas para el PE
ventajas Más fáciles y ampliamente usados, son más realistas en simular el proceso de biodegradación natural.
Prácticamente es lo más sugerido;
Mejores herramientas analíticas disponibles que serían usadas para las pruebas de campo.
1. hay una tasa más rápida de degradación que bajo condiciones naturales. 2. Preferido para muchas investigaciones sistemáticas.
Desventajas a. estas condiciones no pueden ser bien controladas. b. las oportunidades Analíticas para monitorear el proceso de degradación son limitadas.
Carencia de reproducibilidad debido a variada población microbiana
Este método no puede ser usado para probar la biodegradación en términos de metabolismo por un microorganismo
55
5.4.2.4.1 Aclimatación natural
La exposición al aire libre se realiza con muestras montadas en plataformas de prueba, orientadas bajo condiciones estándar para exponer el material al espectro completo de radiación junto a la temperatura y humedad de la lugar [179].
5.4.2.4.2 Aclimatación artificial / pruebas de laboratorio
Las pruebas de laboratorio comprenden el uso de cámaras ambientales y luces artificiales para aproximadamente replicar las condiciones exteriores pero con un tiempo reducido y mayores controles en las condiciones [179].
5.4.2.4.2.1 Ruptura por hidrólisis
La hidrólisis de las capas se lleva a cabo con buffer fosfato (pH 7.4) con azida de sodio para prevenir el crecimiento de microrganismos por 84 días [31].
5.4.2.4.2.2 Oxidación térmica
La foto- y /o termo degradación del LDPE se logra por la ubicación de las muestras en un horno adaptado para 16 días. Cada 24 horas, se cambia la locación de las muestras en una dirección en sentido de las manecillas del reloj [31].
5.4.2.4.2.3 Procedimiento de fotodegradación
Las láminas se ubican a 15 cm de la lámpara, entonces se irradian con UV usando lámpara de vapor a baja presión que genera energía entre los 280 nm and 370 nm, en atmosfera aire y a temperatura ambiente [31].
5.4.2.4.2.4 Procedimiento de termodegradación
La muestra se sujeta a calentamiento a 50°C a oscuras, y es expuesta al aire libre [31].
5.4.2.5 Pruebas de biodegradación
Las pruebas que estudian la biodegradación del LDPE pueden ser directas o
indirectas, lo cual significa que hay pruebas que permiten cuantificar el grado de
mineralización, (efecto final o directo) causado por los agentes abióticos y
bióticos al LDPE expuesto, y también hay pruebas que analizan los efectos
intermedios que ocurren antes del proceso de mineralización, estos podrían ser
por ejemplo: los metabolitos que se producen, la perdida de sus cualidades
fisicoquímicas, la alteración de su morfología, la formación de biocapas, entre
muchos otros cambios .
5.4.2.5.1 Prueba de enterramiento en suelo
El método de enterramiento en Suelo es uno de los métodos frecuentemente usados para la determinación de la biodegradabilidad del polietileno. En este método, la prueba de biodegradación se realiza bajo condiciones naturales o de laboratorio. Las muestras con un peso y dimensiones definidas se entierran a
56
una profundidad específica en el suelo, por diferentes intervalos de tiempo [269, 179].
5.4.2.5.2 Prueba de compostaje
Las condiciones ambientales de la prueba de compostaje son las siguientes: altas temperaturas (58 °C); condiciones aeróbicas; propio contenido de agua (cerca del 50%). compost maduro se usa como matriz sólida, como una fuente de microrganismos termófilos (inóculo), y como una fuente de nutrientes. El método se basa en la determinación de la evolución neta de CO2, i.e. el CO2 liberado de la mezcla de polímero en el compost menos el CO2 liberado del compost sin polietileno (blanco) probado en un reactor diferente [184].
5.4.2.5.3 Prueba de biodegradación en cajas petri
La prueba en cajas petri ha sido inicialmente desarrollada para valorar la resistencia a la degradación microbiana. Varios métodos han sido estandarizados por organizaciones de estandarización tales como la ASTM y la ISO. Estas ahora también se usan para ver si un material polimérico permitirá el crecimiento de microorganismos. El principio del método requiere ubicar el LDPE en la superficie de un agar de sales minerales en una caja petri que no contiene ninguna fuente adicional de carbono. El materia de prueba y la superficie del agar se esparce con una mezcla estandarizada de inoculo de las bacterias conocidas y/o hongos. El material de prueba (LDPE) se examina después de un periodo predeterminado de incubación a temperatura constante por la cantidad de crecido en su superficie y finalmente se limpia el material y se vuelve a pesar o examinar y se compara [59].
5.4.2.5.3.1 Formación de zonas claras
Es un método simple y semi-cuantitativo. Es una prueba en platos de agar en la cual el polímero se dispersa como partículas muy finas dentro del medio de agar sintético, este resulta en un agar de apariencia opaca, después de ser inoculado con microrganismos, la formación de un halo claro alrededor de la colonia indica que los organismos están son al menos capaces de des polimerizar el polímero, el cual es el primer paso a la biodegradación [269].
5.4.2.5.4 Prueba de platos con hongos
Para probar la habilidad de las cepas de hongos para atacar las capas de polietileno, las cepas se cultivan en medio agar mineral básico MBA (del inglés
mineral base agar) el cual se describe en la norma ASTM G21-90. El medio libre de carbono que no sea el LDPE suele ser suplementado con 0.02 % de extracto de levadura y el pH se ajusta a 6.5 [144].
5.4.2.5.4.1 Método de Inoculación
La incubación en el medio con hongos en la lámina polímero puede ser
realizado de acuerdo con la método standard BS EN ISO 846:1997, que
57
contiene la fuente de carbono (el LDPE), la cual se requiere para que ocurra el
crecimiento estos [148].
Al polímero se le realiza un análisis por FTIR, se pesa y esteriliza con
radiación UV por 15 minutos, se ubica en la superficie de un medio sólido en
cajas petri, y entonces se esparcen 0.1 ml de las suspensión de esporas.
Después de estos procedimientos, las placas se incuban en una incubadora
bacteriológica (SOLAB) a una temperatura de 28 °C [148].
5.4.2.5.5 Prueba de biodegradación In-vitro
La habilidad de las bacterias aisladas para degradar LDPE se estudia con la prueba de biodegradabilidad in vitro. Las bacterias aisladas se mantienen en caldos nutritivos o agar medio nutritivo. Los cultivos líquidos de 50 ml se incuban en erlenmeyer de (250 ml) con un agitador rotatorio (150 rpm) a 30° C por 30 días [237].
5.4.2.5.5.1 Prueba de cultivo Líquido
La cuantificación de la degradación se estudia analizando la biocapa o biofilm desarrollada en la lámina de polietileno, por medio de la estimación del carbón orgánico total soluble en agua (TOC) y el pH de los medios de cultivo [144].
5.4.2.5.5.2 Prueba de toxicidad
El caldo de cultivo generado durante treinta días, se le adiciona a la planta V.
radiata, en un matero se depositan 10g de suelo de jardín y se siembran las
semillas de V radiata, las cuales se humedecen regularmente con 5 ml del caldo
de cultivo [74].
5.4.2.5.6 Pruebas de hidrofobicidad
Con éste tipo de pruebas se puede estudiar tanto el material, como los microorganismos que se adhieren al mismo, la hidrofobicidad del polietileno de baja densidad es propia a su naturaleza, sin embargo, cuando se forman grupos funcionales por acción biótica o abiótica disminuye un poco esta propiedad, facilitando la acción de los microorganismos que actúan en su superficie y probando que esté se está mineralizando, existen múltiples métodos que permiten determinar la hidrofobicidad del material, por ejemplo: el ángulo de contacto con el agua, la energía superficial, la deposición o caída de la gota y el diámetro que genera, ahora, también el grado de hidrofobicidad de los microorganismos y sus enzimas mejora la adhesión al polietileno de baja densidad, por lo que se pueden utilizar las pruebas (BATH) y (SOT), debido a que éste trabajo se enfatiza en los microorganismos, a continuación se presentaran brevemente estas últimas pruebas mencionadas.
5.4.2.5.6.1 La prueba BATH (Bacterial Adhesion to Hidrocarbons)
Está basada en la afinidad de las bacterias por un hidrocarburo tal como el hexadecano. A mayor hidrofobicidad de las células bacterianas mayor su
58
afinidad por el hidrocarburo, resultando en la transferencia de las células de la suspensión acuosa a la fase orgánica y una consecuente reducción de la turbidez del cultivo [237].
5.4.2.5.6.2 Prueba de salado (SOT) (por sus siglas en inglés: salting out test)
El Test de agregación de sal consiste en que a mayor es la hidrofobicidad de la superficie celular es más baja la concentración de sal requerida para inducir agregación celular y precipitación.
5.4.2.5.6.3 Estudios de absorción de agua
Los estudios de absorción de agua se pueden llevar a cabo según la norma ASTM D 570. Esta prueba cubre la determinación de la tasa relativa de absorción de agua por el LDPE cuando se sumerge en agua [179].
𝑊% =𝑊1 − 𝑊0
𝑊𝑜∗ 100
W0 es peso inicial, antes de sumerjirlo en agua y W1 es el peso final despues de sumerjido en agua. Cuando el LDPE se oxida producto de la biodegradación se incrementa la presencia de grupos hidroxilos en la superficie del LDPE, lo que aumenta la afinidad por el agua [179].
5.4.2.5.6.1 Prueba del ángulo de contacto con agua
La hidrofobicidad se determina usualmente por medio del ángulo de contacto de
la superficie con el agua, entre más hidrófila la superficie es más pequeño el
ángulo de contacto [71, 120].
5.4.2.5.7 Pruebas de enzimas
En las pruebas de enzimas al LDPE se le adiciona un sistema buffer, que contiene una o varios tipos de enzimas purificados. Estos ensayos son muy útiles en el examen de la cinética de despolimerización. El método es muy rápido (de minutos a horas) y puede dar información cuantitativa [59].
.
5.4.2.5.8 Pruebas de Evolución de Gas (CO2 or CH4)
La evolución de dióxido de carbono o metano de un substrato representa un
parámetro directo de la mineralización. Por lo tanto, la evolución de pruebas
de gas es una herramienta importante en la determinación de la
biodegradabilidad del LDPE. Un número de métodos bien conocidos se han
estandarizado para la biodegradación aeróbica, tal como la (modificada) prueba
Sturm y la prueba controlada de compostaje en laboratorio [59].
También para biodegradaciones anaeróbicas, tales como la prueba de lodos
anaeróbicos, y la prueba de digestión anaeróbica. Aunque los principios de
estas pruebas son las mismas, estas podrían diferir en la composición de los
59
medios, inoculo, la forma de los sustratos que son introducidos, en la técnica
para medir la evolución de gas [59].
5.4.2.5.8.1 La prueba Sturm
Consiste en la cuantificación de la evolución de dióxido de carbono (CO2), la cual es una indicadora de la velocidad de crecimiento celular y el consumo del material durante la biodegradación, la prueba se basa en la captura del CO2 en
una solución de hidróxido de potasio (KOH) 1M para formar HCO3⁻ posteriormente titularlo con cloruro de bario (BaCl) [51].
5.4.2.5.8.2 Radiomarcación
En contraste al análisis de residuos, la medida simple de la evolución total de
CO2 y 14CO2, es no destructiva y puede medir la biodegradación final. Si
apropiadamente la prueba de material 14C está disponible, la medida y sus
interpretaciones son relativamente directas. Los materiales que contienen una
distribución aleatoria del marcador 14C el cual se expone a un ambiente
microbiano seleccionado. La cantidad de carbono 14C en el dióxido
evolucionado se estima usando un contador de cintilaciones [184].
5.4.2.5.8.3 Prueba de Respiración
La actividad aeróbica microbiana se caracteriza por utilizar oxígeno, la
biodegradación aeróbica requiere de oxígeno para la oxidación de sus
compuestos a sus minerales constituyentes tales como CO2, H2O, SO2, P2O5,
etc. El oxígeno utilizado durante la incubación se llama (demanda de oxigeno
bioquímico o biológico) (BOD del ingles biological oxigen demand), es por lo
tanto una medida del grado de la biodegradación. Varios métodos se basan en
la medición del BOD, frecuentemente expresados como un porcentaje de la
demanda teórica de oxígeno (TOD) de los compuestos. El TOD, el cual es la
cantidad teórico de oxigeno necesaria para la oxidación completa del sustrato
en sus constituyentes minerales, puede ser calculada considerando las
composiciones elementales y la estequiometria de la oxidación o basada en
determinaciones experimentales de la demanda química de oxígeno (COD del
ingles chemical oxigen demand) [59].
5.4.2.5.9 Prueba de la Pérdida de masa
Como su nombre lo indica esta prueba determina la variación directa de la masa del polietileno de baja densidad que ha sido expuesto a las condiciones de biodegradación. El principio básico de la perdida de la masa es la adherencia y biodegradación de los microorganismos al LDPE, los cuales se han preseleccionado por su capacidad de utilizarlo como fuente de carbono. Su procedimiento consiste en pesar con un micro balanza el material antes y después de realizar una prueba de cultivo.
60
5.4.2.5.9.1 Porcentajes de degradación del LDPE reportados
Se ha escogido esta prueba por ser fácil de realizar, entender, fácil de replicar y relativamente confiable, además de ser la prueba más directa indicadora de la biodegradación, por tanto a continuación se presenta una recopilación de los resultados reportados por algunos de los trabajos en los que se realizó esta prueba, considerando las condiciones de su realización y unificando la unidad de medida temporal a meses con el objetivo de entender a mayor profundidad tales resultados y hacer más fácil su comparación. En estos estudios teniendo en cuenta los resultados se puede conocer quiénes son mejores degradadores de polietileno los hongos o las bacterias, o específicamente cuales especies son mejores En el estudio realizado por Nayak Priyanka, Tiwari Archana [76], donde se incubaron hongos y bacterias durante un mes, en medio agar almidón, incubados a 35°C y se realizó un subcultivo cada 15 días y se determinó el peso perdido [76], se encontró que los hongos presentan más eficiencia degradando, y la diferencia era significativa, sin embargo tanto los hongos Aspergillium niger como los Proteus vulgaris presentaron el mayor porcentaje de biodegradación (12,5%), lo que significa que por lo menos durante el primer mes los hongos suelen degradar más rápido el LDPE que las bacterias. En un estudio realizado por Chatterjee, Suman Mukherjee y Shamba [135], se cultivó en un periodo de incubación a 25-30ºC el hongo (aspergillus niger) y las bacterias Bacillus weihenstephanensis, Bkholderia cepacia, Escherichia coli, durante 6 meses para probar sus respectivas habilidades para degradar el LDPE, se usó el análisis de pérdida de masa como prueba directa de la biodegradación, se encontró que todos lograron degradarlo, incluso las bacterias Escherichia coli, en los primeros dos y hasta los cuatro meses los hongos eran más rápidos, pero cuando pasaron los seis meses las bacterias Bkholderia cepacia eran las más rápidas, aunque no existía gran diferencia con los Bacillus weihenstephanensis, lo que significaría que las bacterias pueden ser a corto plazo más lentas degradando LDPE, mientras se adaptan a las condiciones y al uso del LDPE, pero durante largos periodos de tiempo pueden llegar a ser mejores o iguales degradando el LDPE como fuente de carbono.
En un trabajo hecho por Sonil Nanda, y Smiti Snigdha Sahu, titulado
Biodegradabilidad de polietileno por Brevibacillus, Pseudomonas, y Rhodococcus sp [138], en el cual estos microorganismos fueron Incubados a
dos temperaturas distintas por 21 días (0.75 meses), 50°C para los Brevibacillus, y 40°C para las Pseudomonas sp y los Rhodococcos sp, como única fuente de carbono se les proporciono LDPE finamente pulverizado (como pretratamiento) y con agitación a 150 rpm, los resultados arrojados fueron: Brevibacilus sp 37.5%, Pseudomonas sp 40.5% y Rhodococcos sp 33.0%, los tres valores son altos lo cual es obviamente explicado por el estado del LDPE, pero la temperatura debió influir de manera importante, por la degradación
61
térmica y porque la temperatura era óptima para las tres, como encontró [162] 37°C para las Pseudomonas sp y 55°C para los Brevibacilus borstelensis [136], por lo tanto estaban a sus temperaturas optimas, lo que podemos concluir es que la variable decisiva fue la habilidad intrínseca para degradar LDPE de las Pseudomonas sp. Las Pseudomonas sp., como degradadoras de LDPE, son reconocidas y muy
estudiadas por sus buenos resultados, siendo entre las bacterias con mayores
reportes obtenidos por su habilidad para degradar el LDPE. Por ejemplo el
trabajo titulado: Biodegradación de polietileno de baja densidad LDPE por
Pseudomonas sp, con un medio simple o basal, sin ningún pretratamiento, en
tubos incubados en un agitador rotatorio (120 rpm) a 37°C, la tapa fue
ligeramente abierta para permitir su aireación, durante un periodo de cuatro
meses las especies de pseudomonas aeruginosa ATCC 1569 lograron degradar
un 20%, habiendo degradado alrededor del primer mes un 18% [156],
Sin embargo no son las mejores en todos los casos, al menos eso es lo que encontraron Madhuri, Deepika S y Jaya, en un estudio denominado Biodegradación de polietileno de baja densidad por microrganismos de suelo de basurero, en este estudio se realizaron pruebas de biodegradación con Pseudomonas sps, Streptomyces sps A. flavus A. niger con medios de sales minerales a 30°C con agitación a 120rpm y con LDPE puro [270], durante un periodo de 6 meses, arrojando como resultados, que los Streptomices sp fueron los claros vencedores degradando LDPE con porcentajes a un nivel del 46.7%, degradando cerca del 6% cada mes, mientras que hongos como los aspergillus Niger lograron 26.17±0.05%, y las bacterias Pseudomonas sp consiguieron “solamente” degradar un 24.22±0.01% todos en condiciones iguales, sin tratamientos previos ni condiciones especiales [270].
5.4.2.5.10 Pruebas físicas de la biodegradación Existen también las pruebas indirectas de la biodegradación del polietileno, las cuales pueden ser: el cambio de la distribución del peso molecular, el cambio de la estructura cristalina y la modificación de sus propiedades mecánicas, la viabilidad, el crecimiento y la actividad de la biomasa.
5.4.2.5.10.1 Índice de fluidez
El Índice de fluidez MFI determina la temperatura de fusión del polímero, también indica indirectamente la viscosidad [208]. El índice de fluidez es un indicador de la longitud de las cadenas poliméricas del LDPE, debido a que mayor sean las cadenas poliméricas y menos ramificadas, por lo tanto más cristalizadas presentaran un mayor punto de fusión y una mayor viscosidad.
62
5.4.2.6 Pruebas de identificación microbiana
Las pruebas de dentificación microbiana son el proceso inicial y clave para conocer cuales microorganismos degradan el LDPE y que potencialidades presentan para usos biotecnológicos.
5.4.2.6.1 Viabilidad del biofilm microbiano
Se puede medir la actividad metabólica de las células del cultivo, con métodos como la hidrolisis con acetato fluoresceína FDA usado por [106], el cual es indirecto y mide la cantidad de proteína, la prueba con naranja de acridina o el kit de viabilidad bacteriana o BacLight [167], además del ensayo de ATP [96], también se ha reportado la prueba redox con el uso del cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio el directo monitoreo de la respiración directa de los microorganismos [177].
5.4.2.6.2 Pruebas de caracterización preliminar
Las bacterias aisladas seleccionadas se pueden identificar por una caracterización bioquímica y morfológica En una caracterización morfológica, se estudian las características macroscópicas como forma, tamaño, estructura, textura, apariencia, elevación y colores. características fenotípicas tales como caracterización microscópica de la reacción Gram, motilidad y pruebas bioquímicas incluyendo catalasa, oxidasa, indol, rojo de metilo, Voges-Proskauer, triple azúcar hierro, utilización de citrato, ureasa, reducción nitrato y la fermentación de carbohidratos y se realiza con protocolos estandarizados [48].
5.4.2.6.3 Pruebas de identificación especifica
Para identificar los microorganismos biodegradadores de LDPE se pueden utilizar las herramientas de ingeniería genética, en las que se incluyen: secuenciación de DNA de los genes ribosomales 16s o 18s, la secuenciación de proteínas, o la más rápida y avanzada la espectrometría MALDI ToF para análisis de proteínas [244].
5.4.2.7 Productos de la biodegradación
Algunos estudios demuestran que los microorganismos toman el LDPE y lo reducen a micro moléculas más fáciles de metabolizar y mineralizar los cuales se enlistan a continuación. Tabla 14 Posibles residuos de la biodegradación, tomados de [156, 29, 41, 80, 74]
Compuestos Compuestos
Benceno Ácido undecanóico
Metilo benceno Ácido docosanóico
Docosanoato de metilo propilo 1,3-dimetiloctadecano
Di-tert-butil-1-oxaspiro(4,5)deca-6,9-dieno 2,6,10,16 tetrametil heptadecano
Ácido hexadecanóico 2,3,6 trimetil decano
Hexadecanoáto de etilo 2,6,7 trimetil decano
63
Diisoostilo eicosano 6-etil ,2-metil decano
Ácido octadecanóico Dodecanol
Undecano Dodecanal
Octano Heneicosano
Eicosanol Heptacano
Docosano Heptacosano
Acido 3-cloropropiónico Heptadecano
7,9-Di-tert-butil-1-oxaspiro(4,5) deca-6,9-dieno-2,8-diona 2,6,10,14 tetrametil heptadecano
Octadecanoato de butilo 2,3,5,8 tetrametil decano
1- Nonadeceno 9 Hexil heptadecano
Tetracosano Hexadecano
Pentacosano 5-butil hexadecano
Acido 1,2-Benceno di carboxílico 2-fenil,etil,hexanoato
Ácido Oxano dodecanóico 3-metil,5-(2-teilbutil) octadecano
Hexacosano 3-etil (2-etilbutil) octadecano
Ciclo propano 6-metil octadecano
2-buteno,2-metil- tricloro eteno
Acetona Hexanal
Eteno, 1,2-dicloro-, Eteno 1,1-dicloro
Dicloro Metano Acetato de etilo
Ácido butanóico Ácido oleico
1- Tetradeceno Acido oxálico
Ácido acético Ácido octadecatrienóico
Tricosano Pentadecano
Ácido tetradecanóico Acido ftálico
Ergosta-5,22-dien-3-ol, acetato(3,22E) Acetato de Betametasona
1-Monanalinoeoglicerol trimetil silil éter Azafrin
2,3-bis [(trimetilsilil oxi] propil ester ácido 9,10,15-octadecatrienóico
5.5 METODOLOGÍA PROPUESTA
Se decidió proponer una metodología a partir de una revisión exhaustiva de la biodegradación del PE por el interés de impulsar a los investigadores colombianos a estudiar los microorganismos que habitan en las grandes ciudades del país o regiones naturales apartadas y contaminadas, también por la posibilidad de su utilización en compost o en lugares especializados en el tratamiento del material LDPE. El propósito específico de esta metodología es determinar la identidad y la eficiencia de los microorganismos que degradan el LDPE, tanto hongos como bacterias y determinar por métodos estadísticos si hay alguna diferencia significativa entre ambos.
64
El autor es consiente lo dispendioso y costoso que puede resultar hacer tantas pruebas, tanto las de identificación preliminar junto a la identificación especifica podrían durar meses enteros o quizá años. La estructura metodológica básica será la siguiente:
Figura 11 Esquema metodológico básico propuesto
5.5.1 Test de viabilidad cuenta de microorganismos viables por dilución
en placa
Se propone la prueba de viabilidad o dilución en placa y conteo de unidades formadoras de colonia por ser fácil y rápida además permite separar e individualizar las especies de microorganismos hidrocarbonoclastas (al menos los que pueden sobre vivir in vitro). (Ver ANEXO L2) Cálculos 1) Contar sólo aquellas cajas (diluciones) que contengan de 30 a 300 colonias. 2) Con la siguiente ecuación calcular las UFC/g s.s.
𝑈𝐹𝐶/𝑔 𝑝𝑒. = (𝑁𝐶 ∗ 1/𝐹𝐷 ∗ 1/ 𝑉) / (𝑃 ∗ 𝐹𝐻). Donde: UFC/ g pe. = unidades formadoras de colonias / g de PE. NC= número de colonias en una caja. FD = factor de dilución que corresponde a la dilución de donde se tomó la muestra con la que se inocula la caja (10-2 a 10-10). V= volumen inoculado en la caja = 0.1 ml. P = peso de la muestra húmeda = 1 g. FH = factor de corrección de humedad (1 − (%ℎ𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑/100)).
65
5.5.1.1 Obtención de muestra y selección de los microorganismos
degradadores de LDPE en medio líquido SM
Se propone la realización de un medio líquido SM selectivo por ser ideal para el desarrollo de los microorganismos biodegradadores de LDPE, además ha sido probado en múltiples estudios de biodegradación, lo cual genera confiabilidad. Recolección de la muestra Pre tratamiento de la muestra Adición al medio de cultivo líquido Incubación (ver ANEXO A 2).
5.5.1.2 Identificación preliminar
Para identificar los generos bacterianos se pueden realizar las siguientes pruebas bioquímicas y microbiologícas tales como catalasa, para bacterias (Ver ANEXO G1).
a. Caldo de Tioglicolato OF; b. Prueba de la oxidasa c. Prueba de la catalasa d. Prueba de malonato e. Prueba de citrato
f. Prueba de hipurato g. Prueba de Kligler h. Tsi hierro tres azucares i. Prueba de RM/VP
j. Prueba de fermentación, 2,3-butanodiol y acido mixta.
k. Agar lisina hierro l. Fenilalanina desminanasa agar
m. Moeller n. Descarboxilación de aminoácidos
66
Figura 12 Métodos preliminares de identificación metabólica
5.5.1.3 Pruebas preliminares de identificación de hongos
Para hongos se realizaran las siguientes pruebas: Para el aislamiento y cuenta de hongos degradadores de PE se utilizó la misma técnica y medio que para bacterias, con la diferencia de que al medio se le adiciona rosa de Bengala y estreptomicina y se ajusta el pH a 4.9 [187]. Para cultivarlos se puede usar Agar sabouraud, PDA, algodón azul de Lactofenol (LPCB) y para su identificación se utiliza la observación microscópica y macroscópica.
67
5.5.1.4 Ensayo de biodegradación in vitro
Se debe cultivar las bacterias y hongos aislados en medio agar nutritivo
5.5.2 Prueba de pérdida de masa
Se propone la prueba de la pérdida de masa en medios de cultivo selectivo en Erlenmeyer (medio líquido) y en cajas Petri (medio solido) debido a que permiten unas condiciones controladas de pH y temperatura que aceleran el proceso de biodegradación y unifica las condiciones de crecimiento de tal manera que se puedan comparar sus respectivas eficiencias. Para conocer la metodología en detalle (ver ANEXO C). El cálculo de la pérdida de masa se puede realizar usando la siguiente ecuaciónEl tiempo de variación del porcentaje de peso ganado W t puede ser medido como:
(𝑊𝑡 =𝑊𝑜 − 𝑊(𝑡)
𝑊) ∗ 100; 𝐸𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 =
𝑊𝑡
𝑡(𝑚𝑒𝑠𝑒𝑠)
Donde Wt es el peso total después del tiempo t, W0 es el peso de referencia seco antes de la prueba. Para determinar si no hay diferencia significativa en la eficiencia entre hongos y bacterias Ho se propone usar la prueba de significación t. Y la prueba ANOVA en dos vías considerando el tipo de medio y de microorganismo.
5.5.3 Identificación especifica
Se propone la realización de la prueba genética de amplificación y secuenciación del gen 16S o 5,8S rRNA (para hongos) vía PCR de diferentes bacterias y hongos el porqué de la selección de ésta técnica es por ser capaz de detectar bacterias viables pero no cultivables, permite una identificación especifica del organismo objetivo. Principio: existen porciones de las secuencias génicas 16S rRNA o 5,8S rRNA dentro de las bacterias y hongos que son idénticas y entre estas regiones hay secuencias únicas de DNA asociadas con hongos y bacterias específicas [271]. Los llamados primers “universales” han sido diseñados para anillar con las secuencias conservadas de 16S rRNA permitiendo la amplificación de la secuencia única dentro de la región conservada [271]. Para conocer la metodología en detalle (ver ANEXO F).
68
Las alícuotas del gen amplificado que resultan de la PCR con estos primers universales pueden ser secuenciadas económicamente en los laboratorios comerciales o en muchos casos en laboratorios universitarios. Una vez se conoce la secuencia del gen rRNA, se pueden usar para identificar los microorganismos originales al nivel de género y especie [271]. Se han computarizado en bases de datos las secuencias de un vasto número de especies bacterianas [271]. Esto permite la comparación de una secuencia desconocida de rRNA con una secuencia bacteriana conocida [271]. Muchos programas de análisis de secuencias están disponibles para ayudar a identificar las secuencias. Uno de tales bases de datos es la BLAST (son las siglas en ingles de Basic local alignment search tool) que significa herramienta de búsqueda de alineaciones básicas locales, la cual la provee la (NCBI) National center for biotechnology information que está disponible en la web [271]. Primers universales 16S rRNA tomados de [271]. 8F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492R TACGGY*TACCTTGTTACGACTT
*Y puede ser C o T una posición de base degenerada.
Figura 13 Metodología a realizar para la identificacion específica
69
5.5.3.1 Técnica longitud de polimorfismos de los fragmentos de restricción
(RFLP)
También se propone realizar la prueba de identificación de microorganismos amplificando regiones que se conservan entre especies (genes), longitud de polimorfismos de los fragmentos de restricción (RFLP del ingles Restriction Fragment Lenght Polymorphisms) donde se amplifican regiones específicas y se cortan con endonucleasas para observar el patrón de bandas en una gel, por lo que se podría utilizar el gen 16S rRNA o 5,8S rRNA (para hongos) amplificado para correrlo en una electroforesis. Para conocer la metodología a seguir (ver ANEXO F).
5.5.4 Pruebas instrumentales
Se proponen solamente dos técnicas FTIR y GCMS por ubiquidad y costo pero obviamente también es recomendable usar otras técnicas como SEM y TGA, etc. esa decisión la tomaran los propios investigadores.
5.5.4.1 Aplicación del FTIR al estudio de la biodegradación del LDPE
La exposición prolongada al aire libre de los plásticos afecta la apariencia y las propiedades físicas de estos materiales, con algunos efectos comunes como descoloramiento y quebramiento, también los factores biológicos pueden afectar las características de los plásticos, la espectroscopia infrarroja podría usarse para elucidar los mecanismos de degradación de polímeros identificando y cuantificando los productos de degradación [272]. La espectroscopia infrarroja es una técnica sencilla y fiable utilizada ampliamente en la química orgánica e inorgánica, en la investigación y la industria [272]. Durante el proceso de la oxidación microbiológica del PE, se forma una gran proporción de compuestos que contienen carbonilo, lo cual es debido a la oxidación enzimática, (ver mecanismos de despolimerización) tales mecanismos generan productos carbonilados y carboxilados que se pueden estudiar mediante la espectroscopia FTIR.
5.5.4.1.1 Variantes de la técnica
5.5.4.1.1.1 La espectroscopia FT-IR (ATR)
Fue validada en los últimos años por brindar un análisis rápido y competitivo, En la técnica ATR, la muestra se presiona contra un diamante, un cristal de seleniuro de zinc o un cristal de germanio y se mide la absorción de la onda evanescente [272].
70
5.5.4.1.1.2 FT-IR Reflectancia Difusa (DRIFT)
Ha sido utilizada ampliamente en el pasado para el estudio de polímeros y permanece como una técnica muy útil en casos donde la muestra es muy grande para ser medida con ATR [272]. El Polietileno tiene una estructura molecular simple, semicristalina y alto peso molecular pero no se degrada por que no absorbe radiación UV [66, 55]; sin embargo, la presencia de impurezas como catalizadores remanentes, plastificantes, y antioxidantes induce la absorción radiación UV-B [66].
5.5.4.1.2 Índices de cuantificación de la oxidación
5.5.4.1.2.1 Índice de carbonilo (CI)
El índice de carbonilo es un indicador del grado de oxidación el PE, el cual mide las bandas de absorción del grupo carbonilo C=O a 1740 cm−1 ((1740)), producto de su estiramiento.
𝐼𝑐𝑜 = (𝐴1740 − 𝐴1835)
0,008 ∗ 𝑡
Donde t es igual al grosor de la muestra medido en mm, y la absorción a 1835 cm-1 es el valor de referencia [66]. Aunque también existen algunas otras variantes
𝑖𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝐶𝑒𝑡𝑜 − 𝑐𝑎𝑟𝑏𝑜𝑛𝑖𝑙 (𝐾𝐶𝐵𝐼) =𝐼1715
𝐼1465
𝑖𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝑒𝑠𝑡𝑒𝑟 − 𝑐𝑎𝑟𝑏𝑜𝑛𝑖𝑙 (𝐸𝐶𝐵𝐼) =𝐼1740
𝐼1465
5.5.4.1.2.2 Índice vinilo (𝐼V)
Índice vinilo (𝐼V) se calcula usando la razón de la absorbancia de la banda en 909
cm−1 (𝐴 (909)), vibración estiramiento del grupo vinilo (CH2=CH), y la absorbancia a 2020 cm−1 [27]:
𝑖𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝑣𝑖𝑛𝑖𝑙𝑜 (𝐼𝑉) =𝐼909
𝐼2020
𝑖𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝑡𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑑𝑜𝑏𝑙𝑒 (𝑇𝐷𝐵𝐼)
=𝐼1650
𝐼1465
𝑖𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑛𝑜 𝑑𝑜𝑏𝑙𝑒 (𝐼𝐷𝐵𝐼)
=𝐼908
𝐼1465.
5.5.4.1.2.3 Porcentaje (%) de cristalinidad Del PE
% 𝑜𝑓 𝑐𝑟𝑖𝑠𝑡𝑎𝑙𝑖𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑 =
71
𝑎 100 − [{1 −(
𝐼𝑎
1.233𝐼𝑏)
1+ (
𝐼𝑎
𝐼𝑏)} × 100]
Donde Ia y Ib son los valores de la absorbancia de las bandas a 1,474 y 1,464 cm−1 o a 730 y 720 cm−1, respectivamente.
5.5.4.2 Cromatografía de gases acoplada con espectroscopia de masas
GCMS
Se propone la utilización de esta técnica por ser muy versátil y rápida Se puede utilizar para analizar los ácidos grasos (AG) y obtener el perfil de AG de los microorganismos y así identificarlos. También para analizar otros metabolitos producidos en la biodegradación. Para detallar la metodología (ver ANEXO L).
5.5.4.2.1 Para cuantificar la producción de CO2
En esta técnica se podría medir el CO2 producido por los microorganismos durante la incubación del cultivo degradador del polietileno en un sistema cerrado y a determinadas condiciones, se cuantifica por cromatografía de gases con head space y/o con un detector de conductividad térmica. Para detallar la metodología (ver ANEXO K). Para calcular la concentración de CO2 se emplea la ecuación de los gases ideales:
𝑃𝑉 = 𝑛𝑅𝑇.
Despejando 𝑛 = ( 𝑃𝑉 )
( 𝑅𝑇)
El resultado en mol CO2 / g del PE en el sistema, se calcula de la siguiente forma: 𝑀𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝐶𝑂2
𝑔 𝑝𝑒 =
𝑃 𝑉 ∗ (%𝐶𝑂2
100))
𝑅𝑇 ∗ 𝑔 𝑝𝑒 Dónde: %CO2 = área del pico de CO2 en porcentaje. P = presión atmosférica (atm). V = volumen de la atmósfera de los sistemas a medir (L). R = constante de los gases (0.082205 L * atm / mol * K). T = temperatura del sistema (° K). g pe. = gramos de PE. La gráfica de CO2 vs el tiempo deberá construirse de forma acumulativa (Sumando las producciones de CO2). Para conocer la metodología (ver ANEXO L).
72
Nota: Con este mismo método o cuantificación se puede determinar al mismo tiempo el O2 y N2 del sistema. Esto permite conocer la cantidad de oxígeno consumido en los sistemas, dato que se utiliza para calcular su coeficiente respiratorio (QR). Este parámetro biológico determina la actividad biológica (estado fisiológico) que ocurre en un sistema y refleja la relación entre el CO2 producido y el O2 consumido [273].
𝑄𝑅 = 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝐶𝑂2 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑖𝑑𝑜
𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑂2 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑖𝑑𝑜
6 ANÁLISIS
La biorremediacion ha cambiado su concepción, de ser un simple uso de seres vivos como agentes de limpieza, (lo cual no es nada nuevo y en la realidad no es necesaria la intervención humana para que cumplan estas funciones), a otra en la que implica la degradación de contaminantes mediante el uso de seres vivos que están inmersos en un medio físico con determinadas condiciones, y dependiendo de éstas la biodegradación se relentiza e incluso se detiene o se acelera, tales como la temperatura, la luz, la humedad, etc,. Por lo tanto la biodegradación actualmente es vista como una acción conjunta de factores abióticos y bióticos, en este caso microorganismos, demostrando la amplitud de aspectos que los investigadores ambientalistas deben tener en cuenta al momento del control de estos xenobióticos. Tambien nos ayuda a entender como los cambios físicos como temperatura, pH, luz, etc que ocasionamos al planeta, pueden afectar tanto negativa como positivamente esta labor, y su control o estudio es de vital importancia. Como producto de esta investigación se encontró que el LDPE es degradado por lo menos por un total 63 géneros de microorganismos entre hongos y bacterias (ver Tabla 15), de éstos como mínimo existen 148 especies, lo que no es un numero sorprendente considerando la diversidad de climas, hábitats y organismos que hay en el planeta, adicionalmente es muy probable que en poco tiempo este listado quede incompleto o inclusive ya lo esté, cabe mencionar que Amal Hussein y colaboradores afirman que hay 90 géneros entre hongos y bacterias que degradan todo tipo de plásticos [274], lo que significaría que por lo menos dos tercios de todos los géneros de microrganismos degradadores de plásticos, degradarían el polietileno de baja densidad LDPE, algo entendible considerando lo simple de la estructura del polímero, de tal forma que solo se requerirían unas pocas enzimas como: lipasas, lignina peroxidasas, para degradarlo, además es impulsado por su gran ubicuidad y su gran riqueza energética, que lo hacen muy valioso como fuente de energía y de carbono, todo esto finalmente conduciría a una intensa presión evolutiva o selección artificial para degradarlo.
73
En ciertas condiciones extremas y propicias ”óptimas”, un elevado número de géneros de microrganismos puede lograr degradar el polietileno de baja densidad, por las características antes mensionadas, sin embargo el interés está en conocer cuáles de éstas biológicamente han logrado obtener los mejores atributos para realizar el proceso al máximo ritmo posible, se encontró que las bacterias que presentan el mayor grado de eficiencia biodegradadora son los Streptomyces sp, seguidos por las Pseudomonas sp, y entre los hongos están los Aspergillus sp, especialmente los Aspergillus níger. Estos resultados no pretenden ser definitivos en lo absoluto, quizá existan mejores o quizá el orden mencionado no sea el correcto. ¿Cuáles son las condiciones que permiten una mejor biodegradación del LDPE? Un estudio realizado por Nayak Priyanka y Tiwari Archana comparó [76], la biodegradación del polietileno por la pérdida de peso considerando el tipo de disposición del material que fue de tres formas distintas, enterrada, expuesta al aire libre y en medios de cultivo a condiciones del laboratorio encontrando que las condiciones de laboratorio fueron las que arrojaron una mayor pérdida de peso. En cuanto a la cantidad de aditivo pro-degradable Obasi [190], encontró que la pérdida de peso era mayor cuanto mas biopolímero se le adicione. Los estudios demuestran que los microorganismos pueden iniciar la degradación del LDPE, aun cuando no haya sufrido una degradación físico química previa, o sea de elevado peso molecular, sin embargo cuando sufre una degradación ambiental que oxida el material y le disminuye su peso molecular la biodegradación se acelera, también si el LDPE a estudiar posee un bajo peso molecular como lo demostró Tsuchii [275]. ¿Qué microorganismos son mejores degradando polietileno de baja densidad los hongos o las bacterias?: Los hongos en principio pueden ser mejores degradando el LDPE, probablemente por su mayor tolerancia a las condiciones extremas de pH, temperatura y humedad, pero las bacterias pueden llegar a mejorar los niveles de degradación de LDPE a largo plazo, cuando se adaptan bien a las condiciones del entorno y llegan a su máximo nivel de crecimiento o son las bacterias más evolucionadas o adaptadas para degradar este tipo de materiales. De acuerdo al número de géneros de hongos y bacterias obtenido en este estudio, lo que se puede concluir es que son numéricamente iguales, (por lo menos con los trabajos revisados), ¿coincidencia o algo razonable?, podría significar que el LDPE es un material nutritivo para ambos reinos. Tabla 15 resultados en cifras de los elementos estudiados
Elementos estudiados N° reportados
Géneros Hongos 32
Bacterias 31
Numero de especies >148 especies
Especies mayormente Aspergillius sp 81
Penicillium
74
Los géneros de microorganismos más utilizados o reportados corresponden a las Pseudomonas sp como degradadoras de LDPE, son las bacterias con mayores reportes y cantidad de trabajos obtenidos por su habilidad para degradar el LDPE con 47 trabajos, seguidas por los Bacillus sp con 43 trabajos y streptomices 17. Puede significar que estos organismos tienen condiciones adecuadas para esta labor, por lo que un estudio molecular y bioquímico sobre estos microorganismos podrían arrojar luces sobre estas capacidades especiales, aun poco conocidas y podrían ser los perfectos candidatos para ser mejorados genéticamente. Finalmente ya sean bacterias o hongos, la utilización de consorcios microbianos
ofrece considerables ventajas sobre el uso de cultivos puros en la degradación de
LDPE, como ocurre naturalmente, donde todos hacen parte de una cadena en la
cual existen funciones interdependientes y cooperativas, lo cual ofrece una
habilidad multifuncional y su mayor robusteza a las fluctuaciones ambientales.
Las consecuencias de la utilización del material LDPE y todos sus aditivos y sustitutos: vale mencionar que la inercia del polietileno de baja densidad LDPE puro es una cualidad que per se que no lo hace axiológicamente malo o peligroso, de hecho, muchas de sus cualidades son muy utiles, y que han contribuido con el progreso de la humanidad, por lo que sería un error no darle la importancia y valor que merece, el verdadero problema es el de abusar de su “servicios”, de forma desorganizada y descontrolada, y tambien no tener en cuenta su impacto ambiental, sus efectos a escala local y global, en esencia la solución real es utilizarlo de forma sabia y responsable, lo cual exige una educación ambiental masificada, una conciencia colectiva y todos los esfuerzos estatales y empresariales para su minimización y control hasta que llegue el dia de su competa sustitución, por otro lado aunque es un material que por sus cualidades es difícil de igualar, en la actualidad existen cuantiosas opciones de aditivos comerciales y no comerciales,que permiten acelerar su mineralización, todas novedosas y que poco alteran sus cualidades originales, acelerando su proceso de biodegradación, siendo positivo para el ambiente y la economía de las empresas basadas en estas poli olefinas, además es posible encontrar una gran cantidad de muy buenos sustitutos altamente biodegradables y biocompatibles, que son un impulso para el avance de la humanidad sin agredir al planeta, pero como se ha mencionado antes existen aún inconvenientes por solucionar: Casi todos los aditivos del polietileno de baja densidad LDPE y los biopolímeros alternativos en desarrollo son 2.5–10 veces más caros, lo que implica que los esfuerzos se dirijan a la búsqueda de sustratos de menor costo [6, 67]. Las propiedades físico químicas de los biopolímeros alternativos frecuentemente
encontradas
(numero de artículos que los
reportaron)
21
Pseudomonas sp 17
Streptomyces 17
Bacillus 13
Rhodococcus sp 11
75
restringen su uso [67] siendo necesario una mejora aun en éstos. Cuando se logren superar todas estas barreras, seguamente pronto, quizá se solucione el problema definitivamente, o quizá surjan otros problemas nuevos, esto solo el tiempo lo dirá, pero el abuso la irresponsabilidad y la inconciencia de nuestros actos como sociedad aún serán y deben ser los problemas a erradicar de las mentes de la sociedad. Lo cierto es que a pesar de que sean los más reportados no implica que sean los mejores realizando esta labor, simplemente que son los más ubicuos hasta la
fecha. Sin lugar a dudas los
Aspergillus sp. Son los
microrganismos
degradadores de
polietileno más
ubicuos encontrados
hasta la fecha,
estando muy lejos de
los demás géneros
con 81 especies, lo
que demuestra que
los hongos son muy
versátiles y poco
exigentes con el
entorno, los alimentos
y las condiciones,
además de ser muy
populares entre los
investigadores.
Gráfica 2 número de referencias obtenidas por genero de hongos y bacterias que están vinculadas con la biodegradación de (LDPE).
76
Gráfica 3 tecnicas más utilizadas para estudiar la biodegradación de LDPE.
En lo que respecta a las técnicas actuales que permiten analizar la biodegradación del LDPE se encontraron entre 34 técnicas y 28 métodos o pruebas, desarrolladas y utilizadas, lo que demuestra el ingénio de los investigadores, el esfuerzo y el interés al respecto, la amplitud de aspectos que abarcan estos estudios y la gran importancia para la ciencia y para la humanidad, en fin para toda la vida del planeta, aunque todavía no ha sido ni suficiente ni lo necesario, porque el problema sigue tan fuerte como antes o incluso mucho más, se requiere que se continúe investigando y con mas intensidad, desde todas las áreas (incluyendo las ciencias humanas), este problema requiere el esfuerzo de múltiples disciplinas científicas, para solucionar la tragedia ambiental que acontece, todos los investigadores son pertenecientes a las más diversas y remotas partes del mundo, lo cual no es de extrañar considerando que el problema de la contaminación con LDPE es igual de global. Como criterios de selección de las técnicas para el estudio de la biodegradación del LDPE, se eligieron las siguientes virtudes: tienen que ser razonablemente económicas, sencillas de utilizar, y de resultados confiables, alta versatilidad y gran ubicuidad. Todos estos requisitos perfectamente son cumplidos por las técnicas siguientes: La espectroscopia infrarrojo o FTIR, la cromatografía de gases GCMS o liquida HPLC, la micro balanza, por lo que su uso es más que recomendado.
77
Sin lugar a duda, la técnica más utilizada en el estudio de la degradación del LDPE es la espectroscopia Infrarroja con transformada de fourier FTIR, la cual ha sido usada en por lo menos en 70 trabajos, la siguiente técnica de análisis más utilizada es la microscopia SEM o microscopía electrónica. Seguramente existen múltiples técnicas que escapan de mención muy interesantes también, que proporcionan información muy valiosa sobre el material, y que cumplan algunas o quizá todas las condiciones de selección, sin embargo solo se proponen por cuestiones de interes las anteriores técnicas, los investigadores tendrán sus propios intereses que harán otros criterios de selección y por ende la selección de otras técnicas, también es seguro es que no todas las técnicas son adsequibles por todas las universidades, por lo tanto estas seran poco o remotamente utilizadas.
7 CONCLUSIONES
La biorremediacion es una alternativa para el control de la catástrofe ambiental
ocasionada por nuestros actos, no puede verse como una solución integral y
definitiva, cuando la causa es la irresponsabilidad e inconciencia humana. Debe verse la biorremediacion como una interrelacion entre lo vivo y las condiciones del entorno o factores abióticos, por lo tanto deben tenerse en cuenta los efectos o cambios en el entorno causados por la acción humana en todos los estudios sobre la biodegradación del LDPE y otros tipos de PE. La investigación sobre la biodegradación del polietileno ha avanzado a pasos agigantados, lo cual se refleja en la multitud de trabajos publicados, en los cuales los investigadores han utilizado una gran cantidad de técnicas con sus respectivos métodos específicos, son (34 técnicas y 28 métodos o pruebas), seguramente aún hay muchas más desarrolladas y utilizadas que faltaron mencionar, estos estudios sobre la biodegradación se enfocan en múltiples e importantes aspectos, lo cual demuestran el ingenio de los investigadores, el esfuerzo y el interés al respecto, y en la actualidad es un progreso que escapa de la esfera netamente ambiental, por toda su potencialidad como fuente de desarrollo industrial y económico. Lo que es natural considerando su gran importancia para la ciencia y para la humanidad. Sin embargo deben continuarse las investigaciones sobre la biodegradación del LDPE por su condición actual de inconcluso, (y aun muy lejos de serlo), además teniendo encuenta que deben ser aislados e identificados todos los microorganismos responsables de la degradación del polietileno de baja densidad o LDPE, incluyendose aquellos que no pueden ser cultivados in vitro, por lo que todos los microorganismos eficaces deben ser caracterizados a nivel molecular, y debe determinase su eficiencia degradadora en todos los entornos aun no estudiados que han sido afectados por estos contaminantes, con todas sus condiciones, variables o factores ambientales, teniendo encuenta que estas actitudes tienen que ver con características fenotipicas clave, como su
78
hidofobicidad, capacidad de producion de multiples y especializadas enzimas capaces de atacar el LDPE, etc. Los estudios posteriores deben ser sobre las enzimas extracelulares microbianas que son responsables de la biodegradación del polietileno y la formación de los ácidos orgánicos presentes. Estas enzimas necesitan ser caracterizadas y los genes responsables de esas enzimas deberían ser trabajados. Una vez los genes responsables de la degradación del polietileno se conozcan, se podrían usar para reforzar la capacidad degradadora de aquellos microbios que demuestran capacidades excepcionales, en la cual los atributos naturales se potencien, claro está que también cumplan estrictamente con todos los criterios bioéticos relacionados con este tipo de organismos, e incluso podría pensarse en el desarrollo de tratamientos enzimáticos a escala industrial o comercial para su degradacion, y finalmente se deben esclarecer completamente los posibles mecanismos de biodegradación, si aún no han sido esclarecidos. Y no siendo menos importante deben desarrollarse aditivos o sustitutos económicamente rentables, que aceleren su proceso de biodegradación y cuyas propiedades físico químicas sean lo más cercanamente parecidas al LDPE puro, además que se pueda masificar universalmente y que no demuestren ningún efecto adverso a el medio ambiente o al ser humano. Las técnicas que permiten cumplir el objetivo metodológico propuesto son la espectroscopia infrarrojo o FTIR, la cromatografía de gases GCMS y la balanza analítica, siendo su uso recomendado. Por último la metodología prospuesta se puede concluir que es viable, relativamente fácil y rápida, puede servir como primer un paso a posteriores estudios más profundos.
8. RECOMENDACIONES
Se recomienda a los investigadores locales o de cualquier parte del mundo que utilicen esta revisión como una ayuda conceptual o metodológica, que prueben los métodos propuestos y lo califiquen constructivamente, que tengan en cuenta que la intencion original era ralizarlo o ponerlo aprueba pero por dificultades no se logró, y que su objetivo va mas haya de ser un simple estudio de unos meses en el laboratorio en los que se prueben o no los métodos, lo que busca principalmente es que aumenten los estudios relacionados o enfocados a este tema, también que todos los trabajos venideros tengan en cuenta las necesidades aún faltantes, y que se interesen en el desarrollo de nuevos materiales como bioplasticos, ya sean Biofragmentables o totalmente bioegradables, o también nuevas aplicaciones.
79
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100
ANEXO A1 Aislamiento y cuenta de microorganismos degradadores de LDPE
Figura 14 procedimiento para el aislamiento de los microorganismos biodegradadores de LDPE adaptados de [187, 94] Para el aislamiento y cuenta de hongos degradadores de PE se utilizó la misma técnica y medio que para bacterias, con la diferencia de que al medio se le adiciona rosa de Bengala y estreptomicina y se ajusta el pH a 4.9.
101
ANEXO A2
Aislamiento e identificación de Microorganismos degradadores de LDPE
Figura 15 procedimiento para el cultivo, el aislamiento y la identificación de los microorganismos degradadores de LDPE.
102
Figura 16 Procedimiento para aislar los microorganismos degradadores de LDPE y su posterior propagación para realizar la extracción del DNA. Para extraer el ADN fúngico no se debe sembrar en agar porque el raspado deja trazas de medio los cuales interfieren en la extracción de DNA, el método propuesto es el registrado por Rojas Triviño [276]
ANEXO B Purificación y aislamiento de microorganismos degradadores LDPE
103
ANEXO C Prueba de biodegradación de LDPE
Figura 17 Ensayo de biodegradación in vitro adaptado de [237, 126]
104
ANEXO D Extracción de DNA de hongos
Figura 18 Método propuesto es el registrado por Mahaku modificado por [203].
105
ANEXO E Extracción de DNA de bacterias
Figura 19 Método para extraer ADN es la registrada por El centro internacional de agricultura Tropical-CIAT usando buffer de extracción (CTAB)
Tabla 16 reactivos requeridos con sus respectvas concentraciones, tomadas de [276]
Reactivo Concentración Cantidad
NaCl 5M 14mL
EDTA pH 8,0 0,5M 2,0 mL
Tris-HCl pH8,0 1M 5mL
SDS - 0,5g
Agua destilada esteril Aforar a 50mL
Figura 20 Cuantificación del DNA microbiano
Reactivo Concentración Cantidad
NaCl 1,4M 8,18mL
EDTA pH 8,0 20mM 4,0 mL
Tris-HCl pH8,0 100mM 10mL
CTAB 2% 2g
PVP 40 1% 1g
106
ANEXO F
PCR Discriminación entre grupos microbianos utilizando Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
Figura 21 propuesta metodológica realizar técnica RFLP tomada y adaptada de [277].
107
ANEXO G1 Pruebas de identificación bacteriana
Figura 22 identificacion bacteriana utilizando, prueba de agar LIA, Kligler, tioglicolato y triptófano.
108
ANEXO G2.
Pruebas de identificación bacteriana
Figura 23 pruebas de identificación microbiana, bruebas de almidon, TCI, catalasa oxidasa
109
ANEXO G3 Pruebas de identificación bacteriana
Figura 24 pruebas de descarboxilacion de lisina ornitina, fenilalanina deaminasa
110
ANEXO G4
Figura 25 pruebas RM VP, OF y fermentación de glucosa
111
ANEXO H Tabla 17 Listado de sustancias para los medios y pruebas
Dilución agua destilada L Cajas de Petri.
M M B Fosfato de potasio monobasico 0,4g Matraces
Fosfato de potasio dibasico 1,6g Espátula.
Cloruro de amonio 1,5g Balanza analítica.
Cloruro de magnesio sexta hidratado 0,17g Agitador magnético.
Sulfato de sodio Hepta hidratado 1,5g Varilla para muestra.
Cloruro de calcio Di hidratado 0,045 Papel filtro estéril.
Agar noble (libre de impurezas). 15g Autoclave.
solución salina 0.85% esteril 99mL Campana de flujo laminar.
etanol tubos de vidrio de 15mL
polietileno esteril vórtex
streptomicina 1ml Varilla de vidrio
SM Cloruro de calcio monohidratado 5,11g papel aluminio esteril
Cloruro de Manganeso monohidratado 0,66g potenciómetro
Cloruro de sodio 1g
Cloruro ferrico sexta hidratado 1g
Cloruro de calcio Di hidratado 0,1g
Cloruro de cobre 0,01g
Cloruro de zinc 0,08g
Cloruro de aluminio 0,05g
Ácido Bórico 0,01g
Molibdato de sodio di hidratado 0,04g
Ácido láctico 10% 10mL
catalasa, Peróxido de hidrogeno 3% 1mL
oxidasa Dimetil-p- Fenilendiamina 1% 1mL Papel filtro estéril.
(OF) peptona 2g
Hugh-leifson Glucosa 10g
NaCL 5g
fosfato ácido de sodio 0.3g
agar-agar 3g
Azul de bromotimol 0,03g
fermentación proteasa de peptona 10g
glucosa Glucosa 10g
caldo glucosa púrpura de bromocresol 0,015
NaCl 5g
agua destilada 1L
agar TSI extracto de carne 3g
112
Extracto de levadura 3g
peptona 10g
sulfato ferroso 0,2g
Tiosulfato de sodio
agar agar
NaCL 5g
Glucosa 1g
proteasa de peptona 5g
rojo fenol 0,024g
agua destilada 1L
lactosa 10g
sacarosa 10g
tioglicolato Tripteína 17g Mechero bunsen
Extracto de levadura 5g
resazurina 0,001g
Peptona de soya 3g Asas de platino
Glucosa 6g Cotonetes
Cloruro de sodio 2,5g tubo eppendorf
Tioglicolato de sodio 0,5g
Agar 0,75g
L-cistina 0,25g
Sulfito de sodio 0,1g
rojo de metilo, Gradilla
RM-VP a-naftol 5% 0.6 ml tubos de cultivo
KOH 40% 0.2 ml
peptona 7g
Glucosa 5g
agua destilada 200mL
etanol 95%
Fosfato dipotásico 5g
UREASA Urea 20
Fosfato monopotásico 9,1
Fosfato disódico 9,5
Extracto de levadura 0,1
p- Dimetilbenzaldehido 0,1mL
agua destiada 1L
agar agar
Rojo fenol 0,01g
l SIM Triptofano 20mg
Peptona 6,1g
Sulfato de hierro y amonio 0,2g
Tiosulfato de sodio 0,2g
Agar 3,5g
113
reactivo de Erlich
Kligler Peptona de carne 13g
Cloruro de sodio 5g
Lactosa 10g
Triptona 10g
Glucosa 1g
Citrato de hierro y amonio 0,5g
Tiosulfato de sodio 0,3g
Rojo de fenol 0,025
Agar 15g
Moeller Peptona de carne 5g
Extracto de carne 5g
Glucosa 0,5g
Piridoxal 0,005g
Rojo de cresol 0,005g
Púrpura de bromocresol 0,01g
simmons Citrato de sodio 2g
Cloruro de sodio 5g
Fosfato dipotásico 1g
Fosfato monoamónico 1g
Sulfato de magnesio 0,2g
Azul de bromotimol 0,08g
Agar 15g
fenilalanina Extracto de levadura 3g
DL-Fenilalanina 2g
Fosfato disódico 1g
Cloruro de sodio 5g
Agar 12g
LIA peptona 5g
Extracto de levadura 3g
Glucosa 1g
L-lisina HCl 10g
citrato ferrico amónico 0,5g
tiosulfato de sodio 0,04g
agar agar 15g
purpura de bromocresol 0,02g
agar almidon extracto de carne 3g
almidón 10g
agar 12g
tinción Cristal violeta. 0,05 Microscopio óptico
Lugol de Gram. 0,005 Portaobjetos
Alcohol-acetona. 0,005 Asa de platino
Safranina. Agar macconkey 0,005 mechero
114
ANEXO I Tabla 18 Procedimiento sugeridos para la siembra tomada de [276]. Prueba medio /reactivo Procedimiento para la siembra
producción de sulfúro
Agar SIM siembra por punción
producción de indol
Agar SIM siembra por punción
movilidad (motilidad)
Agar SIM siembra por punción
fermentacion de carbohidratos
Agar TSI + caldo rojo de fenol y carbohidrato
siembra mixta, inoculación del medio con asa de argolla
Citrato Agar citrato de Simmons
siembra mixta
Rojo de metilo-Voges Proskauer
Caldo RM-VP inoculación del medio con asa de argolla
Ureasa Caldo urea inoculación del medio con asa de argolla
Descarboxilación de lisina
Agar LIA Siembra Mixta
Reducción de Nitratos
Caldo Nitrato inoculación del medio con asa de argolla
Catalasa Peróxido de Hidrogeno, 3%
Sobre un portaobjetos limpio realice el frotis de una colónia del microorganismo adicione 2 gotas del reactivo
Oxidasa tiras prueba de oxidasa Frote una colonia del microorganismo sobre el reactivo y realice las observaciones
Hidrólisis de Gelatina
Gelatina siembra por punción
Coagulasa Caldo BHI plasma de conejo
inocule el microorganismo en 0,5mL de caldo BHI e inocule a 37°C/24h concluída la incubación, adicione 0,5mL de plasma e incube a 37°C /4h (observe hasta las 1824h)
Hidrólisis del Almidón
Agar almidón o lugol de Gram
Realice una siembra por agotamiento e incube a 37° C /2h, Concluida la incubación, inunde las cajas con lugol de gram
Hemólisis Agar sangre Siembre el microorganismo por Agotamiento e incube a 37°C/24h
Caseína Agar nutritivo adicionado con skin milk
Realice una siembra por agotamiento e incube a 37° C /2h,
Desóxiribonucleasa
Agar DNAsa Realice una siembra por agotamiento e incube a 37° C /2h, Concluida la incubación, inunde las cajas con HCl 1M
Antibiograma Agar Moeller Hinton sensidiscos antibiótico
Siembre masivamente con hisopo estéril el microorganismo. Impregne cada sensidisco con un antibiotico diferente y repartalos equitativamente en la superficie de la caja, señalando en la parte posterior el antibiótico utilizado incube a 37°C /24h
115
ANEXO J1 Características preliminares bacterianas
Tabla 19 relación entre género y resultados obtenidos en las pruebas bioquímicas tomada de [276].
reacción de Gram (cultivo fresco)
₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₋ ₋ ₋ ₋ ₋
Forma Coco Coco Coco Coco Bacilo
Bacilo
Bacilo
Bacilo
Bacilo
Bacilo
Bacilo
Bacilo
coco
Agrupación Racimos
Racimos
Cadenas
Tetradas
pares
Crecimiento aerobio ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₋ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊
Crecimiento anaerobio
₋ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₋ ₋ ₋ ₊ ₊ ₋
Esporas ₋ ₋ ₋ ₋ ₋ ₊ ₊ ₊ ₋ ₋ ₋ ₋ ₋
Movilidad ₋ ₋ ₋ ₋ ₋ ± ± ± ± ± ± ₊ ₋
Catalasa ₊ ₊ ₋ ₋ ₋ ₋ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊
Oxidasa ₊ ₊ ₋ ₊ ₊
fermentar glucosa a ácido y gas
₋ ₊ ₊ ₊ ₊ ± ₊ ₋ ₋ ₋ ₊ ₊ ₋
O/F ₋ O F F O
Micrococcus X
Staphylococcus X
Streptococcus X
Lactococcus X
Enterococcus X
Leuconostoc X
Pediococcus X X
Aerococcus X
Lactobacillus X
Clostridium X
Bacillum X X
Alcaligenes X
Pseudomonas X
Enterobacterias X
Aeromonas X
Chromobacterium X
Neisseria X
116
ANEXO J2 Tabla 20 algunas características preliminares bacterianas, +positivo, -negativo.
Genero Especie forma Gram Catalas Oxidas Movi aerobi Estrict/Facul espor
Achromobacte denitrificans Bacilo - + + Si Si F no
Acinetobacter baumannii Bacilo - + - No Si E No
Actinomicetes spp Bacilo + - - Si/no si F Si
Arthrobacter paraffineus Bacilo + + - Si/no Si E Si
Arthrobacter viscosus Bacilo + + - Si/no Si E No
Bacillus amyloliquefa Bacilo + + - Si Si F Si
Bacillus subtilis Bacilo + + - Si Si F Si
Bacillus megaterium Bacilo + + - Si Si F Si
Bacillus sphericus Bacilo + + - Si Si F Si
Bacillus pumilus Bacilo + + - Si Si F Si
Bacillus mycoides Bacilo + + - Si Si F Si
Bacillus thuringiensis Bacilo + + - Si Si F Si
Bacillus Circulans Bacilo + + - Si Si F Si
Bacillus brevies Bacilo + + - Si Si F Si
Bacillus cereus Bacilo + + - Si Si F Si
Bacillus halodenitrific Bacilo + + - Si Si F Si
Brevibacillus borstelensis Bacilo + + - Si Si F Si
Delftia acidovorans Bacilo - + + Si Si F No
Microbacteriu paraoxydans Bacilo + + - No Si F No
Micrococcus lylae Cocos + + - No Si F No
Micrococcus luteu Cocos + + - No Si F No
Moraxella rouxii Cocos - + + No Si F No
Nocardia steroids Bacilo + + + Si Si E No
Paenibacillus macerans Bacilo -/+ + - Si No F Si
Proteus vulgaris Bacilo - + - Si No F No
117
ANEXO J3 Tabla 21 algunas características preliminares bacterianas
Genero Especie form Gram Catalas Oxidas Mó Aerobi Estri/Fac espor
Pseudomonas aeruginosa Bacilo - + + Si Si E No
Pseudomonas putida Bacilo - + + Si Si E No
Pseudomonas syringae Bacilo - + + Si Si E No
Pseudomonas stutzeri Bacilo - + + Si Si E No
Pseudomonas mycoides Bacilo - + + Si Si E No
Pseudomonas fluorescens Bacilo - + + Si Si E No
Rahnella aquatilis Bacilo - + - Si No F No
Ralstonia eutropha Bacilo - + + Si Si F No
Rhodococcus ruber C208 Coco + + - Si Si E No
Rhodococcus erythropolis Coco + + - Si Si E No
Rhodococcus rhodochrous Coco + + - Si Si E No
Serratia marcescen Bacilo - + - Si No F No
Staphylococcu epidermidis Coco + + - No No F No
Staphylococcu aureus Coco + + - No No F No
Staphylococcu epidermidis Coco + + - No No F No
Stenotrophom
onas
spp Bacilo + - - Si Si F No
Streptococcus lactis Coco + - - No No F No
Streptococcus aureus Coco + - - No No F No
Streptomyces setonii Bacilo + - - No No F No
Streptomyces viridosporus Bacilo + - - No No F No
118
Figura 26 medidas a tener en cuenta para la preparación de la muestra cuenta una muestra blanco, de PE no tratado en las pruebas, y un control
negativo adaptado de [287].
ANEXO K1
Procedimiento para el análisis del polietileno usando FTIR
Preparación de las muestras
Para obtener una alta calidad en los espectros infrarrojos, el método apropiado para la preparación de la prueba debería ser seleccionado según las características de la muestra.Las siguientes observaciones deberían ser tenidas en cuenta a la hora de la preparación de la muestra:
119
Figura 27 Método propuesto para analizar el PE degradado
ANEXO K2
Procedimiento para el análisis del polietileno usando FTIR
Tabla 22 Técnicas de muestreo de FT-IR para el análisis del LDPE tomada de [272]
Forma de la muestra técnicas sugeridas
polvo fino (< 2 μm) ATR; DRIFT; Transmission (KBr)
Forma Irregular, pelets
ATR, DRIFT (abrasive sampling)
Flat, reflective surfaces
ATR, DRIFT (abrasive sampling); Specular reflectance
Single fibers ATR (diamond); FT-IR microscope
Polymer soluble in volatile solvents
Transmission (cast film)
Capas finas (< 25 μm) Transmission Large items DRIFT (abrasive sampling)
120
Figura 28 metodología para el análisis dde la evolución de CO2 usando GCMS
ANEXO L Cuantificación de la producción de CO2 y metabolitos
Tabla 23 condiciones óptimas de corrida cromatográfica
Figura 29 Cromatograma donde se muestran los gases cuantificados por CG-DCT.
Condición
Columna
control 1
Temperatura ambiente
25°C
Inyector 40°C
Detector 100°C
Gas acarreador Helio Flujo 55ml/min
Corriente 125mAmp
Tiempo de
corrida
5 min
121
ANEXO L2
Cuantificación de la producción de co2
E Identificación de metabolitos
El primer pico que sale es de inyección, el segundo corresponde a CO2, el tercero a O2, el cuarto a N2 y el quinto a CH4 (Fig. 4.3). Cuando se hace la integración de los datos, eliminar el primer pico de dicha integración, porque el resultado del área de cada pico se toma en porcentaje. Tomar la lectura del área del pico de CO2 en porcentaje.
Figura 30 metodología Adaptada de Bhone Myint kyaw [156]. Para ver los metabolitos reportados en la literatura (Ver la tabla 11)