1

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE “CAROL DAVILA” BUCUREȘTI

DISCIPLINA DE ORTOPEDIE ȘI TRAUMATOLOGIE

REZUMAT

AL TEZEI DE DOCTORAT

UTILIZAREA DE NOI MATERIALE BIODEGRADABILE (ALIAJE Mg-Ca), ÎN

CHIRURGIA ORTOPEDICĂ. BIOCOMPATIBILITATE.

COORDONATOR ȘTIINȚIFIC:

PROF. UNIV. DR. G-RAL(r) BARBILIAN ADRIAN GHEORGHE

DOCTORAND:

DR. RĂZVAN ADAM

MEDIC PRIMAR ORTOPEDIE-TRAUMATOLOGIE

BUCUREȘTI

2016

2

CUPRINS

A. PARTE GENERALĂ

1. Introducere

2. Consideraţii generale biomateriale

2.1. Generalităţi biomateriale neresorbabile

2.2. Cerinţe şi avantaje biomateriale resorbabile

3. Polimeri bioresorbabili

4. Magneziul ca biomaterial resorbabil

4.1. Istoric

4.2. Avantaje şi dezavantaje ale utilizării magneziului ca biomaterial

4.3. Magneziul – element natural al corpului uman

5. Proprietăţi mecanice magneziu

5.1. Modalităţi de îmbunătăţire a proprietăţilor mecanice

5.1.1. Prelucrarea mecanică a magneziului

5.1.2. Alierea magneziului

6. Coroziunea aliajelor de magneziu

6.1. Efectul compuşilor anorganici asupra procesului de coroziune

6.2. Efectul compuşilor organici (aminoacizi, proteine) asupra procesului de

coroziune

6.3. Potenţiale efecte biologice negative ale procesului de coroziune

6.4. Mecanisme de coroziune ale aliajelor de magneziu

6.5. Îmbunătăţire rata de coroziune

6.5.1. Prelucrare mecanică.

6.5.2. Procedee de aliere

6.5.3. Procedee de acoperire

7. Metode de evaluare în vitro coroziune şi biocompatibilitate

7.1. Teste de coroziune

7.1.1. Medii de coroziune

3

7.1.2. Teste de coroziune nepolarizate

7.1.3. Teste de coroziune polarizate

7.2. Teste de biocompatibilitate

7.2.1. Teste de citotoxicitate

7.2.2. Teste de adeziune celulară

7.2.3. Teste de hemocompatibilitate

7.2.4. Teste in vivo

8. Corelare rezultate în vitro vs in vivo

B. PARTE SPECIALĂ

9. Scopul lucrării

10. Generalităţi şi consideraţii din literatura asupra alegerii materialului de studiu (aliaj Mg-

1Ca) şi a reperelor biologice ca şi cadru de referinţă

10.1. Aliajele binare magneziu calciu 1%. Stadiul actual al cunoaşterii

10.1.1. Calciul ca bioelement

10.1.2. Aliajele magneziu - calciu

10.1.3. Aliaje Mg-1Ca. Date din literatură

10.1.4. Concluzii privind datele din literatură

11. Aplicaţii potenţiale aliaj Mg-1Ca

11.1. Elemente de anatomie şi biomecanica a piciorului

11.1.1. Elemente de anatomie picior

11.1.2. Biomecanica globală picior

11.2. Patologie picior

11.2.1. Afecţiuni traumatice

11.2.2. Piciorul complex

12. Studii în vitro

12.1. Introducere

12.2. Studii de determinare a ratei de coroziune în vitro

12.2.1. Determinarea ratei de coroziune prin determinarea pierderii de greutate

12.2.2. Determinarea ratei de coroziune prin măsurarea cantității de hidrogen eliberată în mediul de coroziune

4

12.2.3. Discuţii teste de măsurare rata de coroziune în vitro

12.2.4. Concluzii teste de măsurare rata de coroziune în vitro

12.3. Studii de biocompatibilitate în vitro

12.3.1. Determinarea efectului aliajului Mg-1Ca asupra viabilităţii celulare, în vitro

13. Studii în vivo

13.1. Introducere

13.1.1. Iepurele ca animal de laborator în studii de implantare osoasă

13.2. Analiza SWOT (Strengths/Weaknesses/Opportunities/Threats)

13.3. Obiective studiu în vivo

13.4. Ipoteze studiu în vivo

13.5. Materiale şi metoda (protocol de lucru)

13.5.1. Date generale

13.5.2. Animale de laborator utilizate

13.5.3. Date implanturi

13.5.4. Proceduri preoperatorii

13.5.5. Proceduri operatorii

13.5.6. Proceduri postoperatorii

13.5.7. Eutanasie şi proceduri post eutanasie

13.6. Rezultate

13.6.1. Follow up radiologic

13.6.2. Evoluţie clinică

13.6.3. Monitorizare teste sanguine

13.6.4. Rezultate histopatologice

13.6.5. Analize de material aliaj Mg-1Ca

13.7. Discuţii

13.8. Concluzii

14. Concluzii finale

15. Direcţii de continuare a cercetării

5

A. PARTE GENERALĂ

1. Introducere

Implanturile ortopedice folosite pentru realizarea procedurilor de osteosinteza,

artroplastie sau fixare ligamentara sunt realizate din materiale compatibile cu ţesuturile umane,

acestea fiind denumite biomateriale. Biomaterialele sunt reprezentate de o substanţă sau de un

amalgam de mai multe substanţe, produse natural sau de sinteză, care pot fi utilizate că întreg

sau ca o componentă a unui sistem, cu rol de a trata, sau înlocui orice ţesut sau organ al

corpului uman. Acestea sunt materiale nevii, produse pentru a interacţiona cu ţesuturile şi cu

sistemele biologice. Aceste biomateriale din care sunt produse materialele de osteosinteza pot

fi de două categorii: neresorbabile sau resorbabile.

Utilizarea materialelor resorbabile pentru execuţia implanturilor ortopedice reprezintă o

nouă direcţie, cu avantaje majore atât pentru pacient cât şi pentru medic. Scopul unui implant

bioresorbabil este acela de a sprijini regenerarea şi vindecarea ţesuturilor, resorbindu-se

complet atunci când scopul său este atins, fiind caracterizate prin capacitatea de biordegradare

şi biocompatibilitate. La ora actuală cele mai utilizate implanturi resorbabile sunt fabricate din

biopolimeri. Materialele resorbabile metalice sunt următorul pas în dezvoltarea implanturilor

ortopedice resorbabile, Magneziul (Mg) şi aliajele sale, în special aliajele cu calciu,

reprezentând o soluţie optimă pentru obţinerea de implanturi resorbabile, având în compoziţie

elemente prezente în mod natural în corpul uman. Acestea prezintă avantajul unor proprietăţi

mecanice superioare biopolimerilor. Densitatea şi modulul elastic sunt apropiate de cele ale

ţesutului osos uman, evitând astfel apariţia efectului de stress shielding. Principalele

dezavantaje al utilizării magneziului, este reprezentat în principal de o rată de coroziune rapidă,

şi de eliberarea de hidrogen sub formă de gaz, în timpul coroziunii. Acestea, în teorie, pot

induce fenomene toxice locale şi sistemice prin modificarea ph-ului, sau acumularea de gaz.

Pentru a îmbunătăţi comportamentul la coroziune, cu efect pozitiv şi asupra

biocompatibilitatii magneziului şi a aliajelor sale, există 2 metode principale, ajustarea

microstructurii prin aliere sau prelucrare mecanică şi efectuarea tratamentelor de suprafaţă şi

utilizarea de acoperiri.

În cadrul acestei teze de doctorat s-au efectuat studii in vitro şi in vivo având ca scop

demonstrarea biocompatibilitatii unui aliaj de magneziu cu conţinut de calciu în proporţie de

1%, Mg 1wt%Ca. Pentru a evidenţia cât mai bine calităţile biologice ale acestui aliaj, am ales

varianta turnată, neprocesata mecanic, obţinerea unor rezultate pozitive în această formă fiind

un indicator cert de biocompatibilitate pentru variantele superioare din punct de vedere al

prelucrării mecanice.

6

2. Consideraţii generale biomateriale

2.1. Generalităţi biomateriale neresorbabile

Implanturile ortopedice metalice neresorbabile sunt realizate mai ales din aliaje de oţel

inoxidabil austenitic, aliaje de Cobalt-Crom, Tantal, Titan sau aliaje pe bază de Titan.

Principalele avantaje ale acestora sunt rezistenta mecanică crescută, duritatea şi o rată de

coroziune foarte redusă. Principalele dezavantaje sunt, eliberarea lentă dar constantă a ionilor

din compoziţia lor, cu efecte toxice locale şi sistemice, duritatea crescută care induce fenomene

iritative locale şi fenomenul de stress shielding, şi necesitatea unei noi intervenţii chirurgicale

pentru ablaţia materialului.

2.2. Cerinţe şi avantaje biomateriale resorbabile

Materialele resorbabile trebuie să prezinte proprietăţi fizico-chimice în concordanţă cu

fiziologia ţesuturilor adiacente. Principalele cerinţe ale acestora sunt capacitatea de a fi

biocompatibil şi biodegradabil. Prin biocompatibil se înţelege capacitatea unui implant de a fi

compus din materiale care să nu inducă un răspuns biologic patologic din partea ţesuturilor

adiacente. Biodegradabil reprezintă capacitatea unui material de a fi descompus în mod chimic

sau a se degrada în compuşi sub acţiunea unor factori biologici.

În cazul unui implant ortopedic, ideal ar fi ca resorbţia să se producă prin biodegradare

şi remodelare osoasă. Acesta trebuie să prezinte proprietăţi osteoconductive, reprezentate prin

capacitatea unui material de a stimula creşterea ţesutului osos dinspre osul gazda spre implant

şi adeziune osoasă/osteointegrare, formarea de os nou, aderent, pe suprafaţa materialului.

Astfel un implant resorbabil ideal poate fi caracterizat prin capacitatea de biodegradare,

biocompatibilitate, bioactivitate (capacitatea de interacţiune între implant şi ţesutul adiacent) şi

prin proprietăţi mecanice cât mai apropiate de cele ale ţesutului osos uman, dar suficient de

rezistent pentru a susţine osul până la formarea calusului.

3. Polimeri bioresorbabili

Polimerii bioresorbabili au reprezentat pentru o lungă perioadă soluţia optimă în ceea

ce priveşte materialele de osteosinteza resorbabile. Acestea sunt folosite sub forma pinilor,

şuruburi simple sau de interferenţă, plăci, ancore sau scoabe.

Caracteristicile polimerului ideal sunt: absenţa toxicităţii locale sau sistemice, a reacţiilor

inflamatorii, să fie metabolizat de organism în totalitate după îndeplinirea scopului fără a lăsa

reziduuri restante, uşor de procesat şi de sterilizat.

Odată cu răspândirea utilizării acestor polimeri au început să fie remarcate şi o serie de

dezavantaje. Dintre acestea se remarcă rezistenta mecanică scăzută şi apariţia unor reacţii

7

locale adverse de tip “reacţie de corp străin”, produse prin resorbţia polimerilor şi a

copolimerilor, care se realizează printr-o reacţie de hidroliză enzimatică, descompunându-se în

produşi secundari care induc aceste reacţii. Reacţia de corp străin va duce la apariţia unor

modificări la nivelul ţesuturilor moi adiacente implantului, cum ar fi : exudat, chisturi, fistule,

sau la nivelul osului: chisturi osoase sau osteoliza la limita os implant implant.

4. Magneziul că biomaterial resorbabil

4.1. Istoric

Magneziul (Mg) ca element chimic a fost identificat în 1808 de chimistul britanic

Humphrey Davy şi a fost izolat de Michael Faraday în 1852 prin electroliză clorurii de magneziu,

MgCl2. Că dispozitiv medical resorbabil a fost utilizat pentru prima dată de Edward C. Huse în

1878 pentru ligatura vaselor sanguine. În ceea ce priveşte utilizarea magneziului ca material

pentru osteosinteza, aceasta a fost propusă de Payr în 1900, acesta descriind un cui fabricat din

magneziu folosit ca implant centromedular pentru stabilizarea fracturilor sau pentru cura

pseudartrozei. Din 1906 Lambotte a decis să folosească implanturile din Mg în cazul copiilor,

aceştia prezentând vindecare osoasă mai rapidă. Aceste a operat doi copii, în vârstă de 7 şi 8

ani, cu fracturi de humerus, utilizând placi şi şuruburi din magneziu. Ambele fracturi au

consolidat, magneziul s-a resorbit în totalitate la un an, singura complicaţie fiind acumularea de

gaz în părţile moi. Verbrugge în 1934 a îmbunătăţit calitatea implanturilor din magneziu prin

alierea cu aluminiu (Al), obţinând un aliaj Mg-8Al. acesta a observant că degradarea a fost mai

lentă decât în cazul magneziului pur, resorbţia a fost totală, iar hidrogenul eliberat nu a produs

efecte secundare notabile. Cu toate aceste rezultate promiţătoare cercetările privind folosirea

magneziului ca material de osteosinteza au cunoscut o stagnare de peste 50 ani, până la

începutul secolului 21, în acest moment magneziul fiind un subiect de cercetare în plină

dezvoltare.

4.2. Avantaje şi dezavantaje ale utilizării magneziului că biomaterial

Avantaje

Magneziul este un element natural al corpului uman, implantul din magneziu având

capacitatea de a fi resorbit în totalitate fără a induce efecte toxice locale sau sistemic. Magneziul

prezintă calităţi mecanice care îl recomandă ca un implant rezistent la forţele de încărcare, spre

deosebire de polimeri. Acesta prezintă o rezistenţă la tracţiune de 160 – 250 Mpa, în timp ce

implanturile realizate din polimeri înregistrează valori de 16 – 69 Mpa. Totodată prezintă valori

ale modulului elastic de 41 – 45 GPa apropriate de cele ale osului uman 10– 40 Gpa, reducând

astfel riscul de apariţie al efectului de stress shielding. Acest risc este crescut în cazul utilizării

implanturilor din titan sau oţel acestea înregistrând valori crescute ale modulului elastic, 110-

8

117 Gpa respectiv 193 Gpa. Un alt atu important al magneziului, menţionat în literatură, este

legat de stimularea formării osoase în focarul de fractură.

Dezavantaje:

Cu toate aceste calităţi mai sus menţionate, există câteva potenţiale aspecte negative

ale magneziului în utilizarea sa că biomaterial pentru implanturi ortopedice. Principalele

suspiciuni au fost legate în principal de următoarele aspecte. Rezistenţa mecanică redusă,

comparativ cu implanturile metalice neresorbabile. Rata de coroziune crescută, în cazul Mg pur,

rata de coroziune fiind mai rapidă decât rata de formare a osului. Eliberarea ionilor de hidrogen

(H2) în timpul degradării, sub formă de gaz, aceasta ducând la acumularea unor bule de gaz în

ţesuturile adiacente implantului. Acest fenomen a ridicat suspiciunea inducerii necrozei tisulare

locale şi a embolizarii gazoase în organele vitale. Eliminarea rapidă a magneziului în organism ,

datorită ratei crescute de coroziune aceasta putând influenţa valorile serice ale magneziului cu

posibile efecte negative asupra sistemelor şi aparatelor organismului uman. Efect hemolitic –

magneziul pur prezintă o rată de hemoliza uşor crescută valorile înregistrate variind între 25% şi

75%, standardul acceptat fiind de 30%.

4.3. Magneziul – element natural al corpului uman

Magneziul este prezent în mari cantităţi în corpul uman reprezentând al doilea cation

întâlnit intracelular, după potasiu. Acesta joacă un rol important în reglarea funcţiei

neuromusculare, fiind implicat în multe reacţii metabolice şi mecanisme biologice. Cantitatea

totală de magneziu în organism este de aproximativ 25 g (1000 mmoli)cu un nivel plasmatic

normal de 1,7 – 2,4 mg/dl (1,5 – 2,0 mEg/L). Marea majoritate a cantităţii de magneziu este

distribuită la nivel osos (60%) având un rol important în dezvoltarea acestuia. Restul este

distribuit în proporţie de 20% în muşchi şi 20% inrestul ţesuturilor. Ingestia alimentară zilnică

este în mod normal, de aproximativ 360 mg (15 mmol). La nivel intestinal absorbţia variază

între 25 şi 75 %, cantitatea absorbită la acest nivel fiind de aproximativ 120 mg. Excreţia

magneziului se realizează de către sistemul renal, dar 60 -70 % din Mg filtrat este resorbit la

nivelul anselor lui Henle, iar 5 – 10 % este absorbit în tubii colectori. Astfel excreţia renală a Mg

rămâne de aproximativ 25%. Principalul factor care reglează nivelul magneziului este nivelul

seric al acestuia. Astfel, hipomagnesiemia, va creşte absorbţia digestivă a magneziului şi

resorbţia tubulară a acestuia, în timp ce hipermagnesiemia va avea efect invers, inhibând

aceste procese.

5. Proprietăţi mecanice magneziu

În studiul mecanic al unui material, pentru determinarea rezistenţei sale trebuie să ne

referim la valorile modulului elastic Young, rezistenţei la tracţiune şi compresiune cât şi a

rezistenţei la încovoiere. Totodată importantă este şi valoarea densităţii metalului examinat.

9

Aceste valori trebuie să confere materialului o rezistenţă mecanică pentru a suporta forţele

mecanice din segmentul anatomic pe care acesta trebuie să-l susţină dar totodată este

recomandat ca valorile să fie cât mai apropiate posibil de cele ale osului uman.

Magneziul pur prezintă o densitate relativă de 1,74 g/cm3 , aceasta fiind apropiată de

cea a osului cortical, 1,8 g/cm3. Astfel această reprezintă aproximativ 40% din densitatea

titanului sau a aliajelor sale, care este de 4,47 g/cm3. Acest fapt recomanda magneziul ca un

metal din care se pot realiza materiale de osteosinteza uşoare, cu efect minim de stress

shielding asupra osului. Cu toate acestea valorile parametrilor mecanici ai magneziului pur,

obţinut prin turnare sunt relativ mici în raport cu forţele la care sunt supuse şi cu cele ale

materialelor metalice clasice.

Valorile comparative ale parametrilor mecanici ai magneziului , osului şi ale principalelor

materiale neresorbabile sunt expuse în tabelul de mai jos

Tabel 1.

Magneziu pur Aliaj Co-Cr Aliaje Titan Tesut osos

Rezistenta

la tractiune

(MPa)

86,9

951 – 1220

760

42 – 109

Modulul lui

Young

(GPa)

41

210

110

3 – 20

Densitate

(g/cm3)

1,74 9,2 4,5 1,8 – 2,1

5.1. Modalităţi de îmbunătăţire a proprietăţilor mecanice

5.1.1. Prelucrarea mecanică a magneziului

Turnarea reprezintă cea mai comună formă de producere a pieselor mecanice din

magneziu. Această metodă poate afecta calitatea produsului rezultat, datorită potențialului de

apariție a defectelor de turnare. Dintre procedeele de turnare amintim Turnarea în matriţa de

nisip şi Turnarea prin amestecare.

Aceste procedee primare vor duce la formarea unor materiale cu granulaţie mare, cu limita mare de grăunţe şi cu forţe scăzute de adeziune intermoleculare, toate acestea ducând la o rezistenţă mecanică scăzută şi la o rata crescută de coroziune. Pentru a corecta aceste deficienţe putem utiliza procedee mecanice secundare cum ar fi

10

Extrudarea la cald, care reprezintă un procedeu prin care un bloc de metal încălzit dar

sub temperatura de lichefiere, este forţat printr-un orificiu al unei matriţe sub acţiunea unor

forţe de compresiune foarte crescute, şi Laminarea la cald care reprezintă un procedeu prin

care lingoul de metal produs prin turnare, aflat la o temperatură sub temperatura de topire,

este deformat şi comprimat plastic prin trecerea sa prin role de strivire, acestea inducând forţe

crescute de compresie în toată masa materialului.

Aceste procedee secundare vor duce la diminuarea atât a spaţiilor dintra granule cât şi a

granulelor în sine, în acelaşi timp, eliminând microfisurile din material rezultate în urma

procesului primar de turnare. Astfel combinaţia diferitelor etape de procesare şi tratamentele

termo-mecanice aplicate vor influenţa relaţia dintre microstructură şi proprietăţi. Ca rezultat

vom înregistra diferenţe majore în ceea ce priveşte calităţile mecanice (duritatea, ductilitatea)

şi comportamentul la coroziune între aliajele de magneziu turnate și cele procesate secundar,

termo-mecanic. Astfel, rezistenta la tracţiune a unui aliaj Mg-1Ca, poate creşte de la 105 la 230

MPa, iar rezistenţa la rupere de la 71,38 MPa la 166,7 MPa prin laminare şi la 239,63 MPa prin

extrudare

5.1.2. Alierea magneziului

Alierea este o metodă generală utilizată pentru îmbunătăţirea proprietăților

magneziului pur. În funcţie de elementele de aliere selectate, se obțin modificări ale

caracteristicilor structurale ale aliajelor de magneziu, cum ar fi mărimea de grăunte şi

distribuţia mărimii de grăunte. Astfel se vor îmbunătăţi calităţile mecanice ale implanturilor

obţinute din aliajele de magneziu. Pentru aliere este necesară folosirea unor elemente cât mai

pure posibil, aceasta influenţând calităţile aliajului. Principalele impurităţi întâlnite în aliajele

de magneziu sunt reprezentate de fier (Fe), nichel (Ni), Cupru (Cu), unele elemente de aliere, de

exemplu manganul, având capacitatea de a curăţa aceste impurităţi din aliaj.

5.1.2.1. Elemente de aliere

Elementele utilizate în mod frecvent în industria metalurgică pentru obținerea aliajelor

de magneziu sunt Aluminiu (Al), Zinc (Zn), Mangan (Mn),Calciu (Ca), Litiu (Li), Zirconiu (Zr) și

pământuri rare (RE). Dintre acestea aluminiul şi zincul îmbunătăţesc cel mai mult calităţile

mecanice ale aliajelor. Manganul este un element de aliere secundar, utilizat pentru eliminarea

impurităţilor prin incorporarea în faze intermetalice. Calciul şi zirconiul au efect pozitiv asupra

calităţilor mecanice, la concentraţii reduse, 2 wt% respectiv, 0,42 wt%. Pământurile rare pot

forma faze intermetalice cu magneziul, îmbunătăţind rezistenta mecanică a aliajului.

5.1.2.2. Biocompatibilitate elemente de aliere

În cazul în care aliajele de magneziu sunt folosite în aplicaţii medicale, selecţia

elementelor de aliere nu trebuie făcută doar pe baza capacităţii acestora de a îmbunătăţi

calităţile mecanice şi rata de coroziune, ci trebuie luat în considerare gradul de

11

biocompatibilitate ale acestora. Elementele de aliere odată eliberate în organism prin procesul

de degradare al aliajului trebuie să poată fi resorbite în totalitate fără a produce efecte toxice

locale sau sistemice.

Din elementele menţionate observăm că aluminiul nu este compatibil cu utilizarea în

aplicaţii medicale, datorită efectelor toxice. Zincul, manganul, litiul şi pământurile rare, pot

induce efecte toxice la anumite concentraţii. Calciul prezintă cea mai bună biocompatibilitate,

fără efecte toxice, fiind, ca şi magneziul, un element prezent în mod natural în corpul uman.

6. Coroziunea aliajelor de magneziu

Coroziunea reprezintă procesul de degradare al unui material, proces care survine în

urma interacţiunii acestuia cu mediul înconjurător, sub acţiunea unor factori fizici, chimici sau

electrochimici.

Magneziul şi aliajele sale prezintă o rezistenţă scăzută la coroziune, comparativ cu alte

metale, procesul de coroziune fiind influenţat major de prezenţa apei şi a clorului. Coroziunea

magneziului în soluţiile apoase, ca şi organismul uman, la un ph fiziologic de 7,4 – 7,5, este

reprezentată prin următoarele reacţii chimice, având ca rezultat final producerea de hidrogen

sub formă de gaz şi de hidroxid de magneziu

Mg → Mg2+ + 2e- (reacție anodică) 2 H2O + 2e- → H2 + 2OH- (reacție catodică) Mg2+ + 2OH- → Mg(OH)2 (formarea produșilor)

Mg (s) + H2O (aq) → Mg(OH)2 (s) + H2 (s) (reacție generală)

6.1. Efectul compuşilor anorganici asupra procesului de coroziune

Stratul de hidroxid de magneziu format la suprafaţa aliajelor de magneziu, în

organismul uman îşi va pierde capacitatea de protecţie sub influenţa ionilor de clor aflaţi în

ţesuturile adiacente. Când concentraţia clorurilor din mediul înconjurător depăşeşte 30

mmoli/L, hidroxidul de magneziu Mg(OH)2, va reacţiona cu clorul formând o clorură de

magneziu, solubilă în apă, accelerând astfel procesul de coroziune. Aceste procese sunt

reprezentate prin reacţiile chimice prezentate mai jos.

Mg + 2H2O → Mg(OH)2 + H2

Mg + 2Cl- → MgCl2

Mg(OH)2 + 2Cl- → MgCl2

Totodata in tesuturile aflate in imediata vecinatate a implantului se ami intalnesc si alti

ioni anorganici cum ar fi Ca2+ , HPO42-, HCO3-,SO4

2- care pot influenta evolutia aliajului de

12

magneziu. Dintre acestia ionii de HCO3- si ionii de HPO42-, au efect protector, contribuind la

formarea temporara a unui strat de hidroxiapatita la suprafata aliajului.

6.2. Efectul compuşilor organici (aminoacizi, proteine) asupra procesului de

coroziune

Aminoacizii produc complexe cu efect inhibitor asupra sarurilor anorganice depuse la

suprafaţa aliajului de magneziu, accentuând astfel procesul de coroziune. Pe de altă parte, în

organismul uman aminoacizii se găsesc în cea mai mare parte legaţi în lanţuri proteice.

Proprietăţile de suprafaţă ale proteinelor fac ca acestea să adere la suprafaţa aliajelor de

magneziu, având şi un efect inhibitor catodic. Prin aceasta limitare a reacţiei catodice proteinele

vor duce la încetinirea ratei de coroziune. Totodată stratul proteic va creşte adeziunea celulară

la suprafaţa implantului având efect pozitiv asupra biocompatibilitatii acestuia.

6.3. Potenţiale efecte biologice negative ale procesului de coroziune

Procesul de biodegradare al magneziului şi al aliajelor sale va duce la creşterea ph-ului în

mediul/ţesuturile aflate în imediata vecinătate a implantului. În cazul în care ph-ul local

depăşeşte o valoare de 7,8 se poate produce o intoxicare alcalină, ducând la efecte toxice

locale. În cadrul procesului de biodegradare al magneziului este eliberat hidrogen sub formă de

bule de gaz, ridicând suspiciunea apariţiei unor zone de necroza tisulară, produse de disecţia

ţesuturilor prin distensia gazoasă, sau dehiscente de plaga. Totodată a fost emisă ipoteza

embolizarii gazoase în organele vitale. Eliberarea rapidă a ionilor din aliaj poate duce la

modificări patologice ale ionogramei, cu efecte negative sistemice şi cu influenţarea funcţiei

organelor vitale.

6.4. Mecanisme de coroziune ale aliajelor de magneziu

Cauza proceselor de coroziune a aliajelor metalice utilizate ca implanturi medicale

consta în instabilitatea metalelor din punct de vedere termodinamic, acestea având tendinţa să

revină la starea inițială de compuși metalici. Formele tipice de coroziune întâlnite în cazul

magneziului și aliajelor sale utilizate pentru aplicații medicale sunt prezentate în continuare,

cele mai frecvent întâlnite fiind coroziunea în puncte (pitting corrosion) şi coroziunea galvanică.

Astfel, putem întâlni: Coroziunea în puncte (pitting corrosion), coroziunea galvanică,

coroziunea fisurantă, coroziunea prin frecare şi coroziunea sub tensiune.

6.5. Îmbunătăţire rata de coroziune

6.5.1. Prelucrare mecanică.

Rata de coroziune a aliajelor de magneziu poate fi diminuată prin tratamente termice,

prelucrare mecanică şi tratamente de suprafaţă, acestea îmbunătăţind rezistenta la coroziune

atât prin procesul de rafinare al granulelor cât şi prin modificarea distribuţiei fazei secundare în

13

aliaj. Metodele de deformare plastică de mare presiune au fost utilizate cu succes pentru a

obţine rafinarea granulelor şi îmbunătăţirea proprietăţilor mecanice ale materialelor produse

din magneziu. Cele mai utilizate metode sunt ECAP (Equal Channel Angular Pressing) şi SC

(Screw Rolling), acestea fiind considerate cele mai eficiente metode de rafinare a granulelor în

cazul magneziului.

6.5.2. Procedee de aliere

Alierea joca un rol important în controlul ratei de coroziune, elementele de aliere

ducând la diminuarea spaţiilor intermoleculare şi la formarea de faze intermetalice care vor

diminua rata de coroziune. Aceasta reducere a ratei de coroziune prin aliere, este demonstrată

într-o multiudine de studii, cum ar fi cele conduse de Kirkland în 2010 sau Pil-Ryung Cha în

2013.

6.5.3. Procedee de acoperire

Procedeele de acoperire a aliajelor de magneziu reprezintă modificări ale suprafeţei acestora cu scopul de a împiedica contactului direct dintre substratul de aliaj de magneziu și mediul uman, astfel încât fenomenele de coroziune vor fi inhibate sau întârziate, acestea reprezentând o modalitate foarte atractivă de îmbunătăţire a rezistenţei la coroziune a aliajelor de magneziu. În general, acoperirile pot fi împărţite în două clase: acoperiri de conversie şi acoperiri depuse.

6.5.3.1. Acoperiri de conversie

Acoperirile de conversie sunt acoperiri crescute în situ care sunt formate din reacții

specifice între materialul de bază şi mediu, producându-se atunci când suprafaţa metalică a

aliajului este convertită într-un strat de oxid printr-un proces electrochimic produs între metal

şi mediul apos înconjurător. Dintre acestea enumeram: Acoperiri de conversie chimică cum ar

fi Acoperire cu fosfat de calciu (Ca-P), Acoperire cu Hidroxiapatita [Că10(PO4)6(OH)2], Acoperire

cu hidroxiapatita cu conţinut de fluoruri *Că10(PO4)6(OH)2-2x F2x] şi Anodizarea, care reprezintă

conversia electrochimică clasică. Dintre procedeele de anodizare folosite în mod uzual amintim

oxidarea electrolitică în plasmă, PEO şi oxidarea în microarc, MAO.

6.5.3.2. Acoperiri prin depunere. Pot fi împărţite în două subclase, depuneri organice şi

anorganice

Depuneri organice.

Se pot obţine prin imersia substratului metalic (aliaj magneziu) într-o soluţie organică.

Procedeele de acoperire organică cele mai utilizate sunt imersia substratului într-o soluţie

apoasă sau de solvent, sau prin depunere din faza de vapori. Polimerii organici reprezintă cele

mai utilizate acoperiri organice. Aceste acoperiri, pe lângă rolul de protecţie a substratului

împotriva coroziunii, acestea pot îndeplini şi alte funcţii cum ar fi eliberarea unor molecule de

14

medicament sau pot fi biofunctionalizate prin incorporarea de biomolecule organice care să

interacţioneze benefic cu ţesuturile adiacente.

Acoperiri anorganice.

Dintre acestea amintim Metodele de depunere fizică în stare de vapori (PVD),

Depunerea chimică în stare de vapori (CVD) şi Depunerea chimică în stare de vapori aplificată

cu plasmă (PECVD).

7. Metode de evaluare în vitro coroziune şi biocompatibilitate

Testele în vitro reprezintă un moment obligatoriu în studierea comportamentului

aliajelor biodegradabile de magneziu. Acestea trebuiesc realizate în condiţii cât mai fiziologice,

asemănătoare celor din organismul uman. Testele în vitro sunt clasificate în două categorii

principale, teste care evaluează rata şi modul de coroziune şi teste care evaluează

biocompatibilitatea şi gradul de toxicitate.

7.1. Teste de coroziune

Acestea la rândul lor se împart în două subgrupe, teste nepolarizate şi teste polarizate.

Testele nepolarizate sunt teste de evaluare a ratei de coroziune prin evaluarea calităţilor fizice

ale aliajelor de magneziu. Testele de tip polarizat, evalueza direct rata de coroziune , fiind

caracterizate de aplicarea sau măsurarea unei forțe motrice în formă de polarizare

electrochimică.

7.1.1. Medii de coroziune

Testele în vitro efectuate pentru a determina rata de coroziune a aliajelor de magneziu

se realizează prin imersia acestora în diferite medii. Acestea variază de la medii simple de tipul

serului fiziologic sau a soluţiei Ringer până la medii complexe, care simulează condiţiile

fiziologice ale corpului uman, având valori cât mai apropiate ale ph-ului, electroliţi, aminoacizi

sau proteine. Mediul ales şi condiţiile de mediu în care se desfăşoară experimental (incubator,

baie de apă) trebuie să imite cât mai exact condiţiile fiziologice umane. Evaluarea ratei de

coroziune trebuie să ţină cont întotdeauna de tipul de mediu folosit, acesta având o influenţă

majoră asupra coroziunii. De exemplu, dacă mediul conţine ioni de clorura, stratul protector,

Mg(OH)2, al aliajului de magneziu, va fi dizolvat rapid, înregistrând astfel o rata crescută de

coroziune. Pe de altă parte, dacă mediul conţine proteine, acestea vor forma un strat protector,

diminuând rata de coroziune.

Principalele medii de coroziune utilizate sunt cele simple, cum ar fi serul fiziologic,

Soluţia Ringer, fluidul fiziologic simulat (Simulated Body Fluid, SBF) sau Soluţia Hank sau mediile

mai complexe, care asociază şi compuşi organici de tipul aminoacizilor, sau molecule complexe

15

cum ar fi vitaminele. Dintre acestea amintim Modified Eagle’s medium—α(α-MEM) + 10 %

Fetal bovine serum (FBS) şi soluția Dulbecco (Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - DMEM).

7.1.2. Teste de coroziune nepolarizate

7.1.2.1. Evaluarea ratei de eliberare a hidrogenului

În timpul procesului de coroziune a aliajelor de magneziu, un atom de magneziu va

eliberă o moleculă de hidrogen, sub formă de gaz . Magneziul pur prezintă o rată de eliberare a

H2, la 37 0C, de 40 ml/cm2/zi, în timp ce rata de absorbţie a organismului uman este de 2,25

ml/cm2/zi, aceasta ducând la acumularea sub formă de bule de gaz în ţesuturi.

Testul se realizează la o temperatură de 37±1 °C, pentru a simula cât mai fidel condiţiile

fiziologice. Mediul de coroziune cel mai utilizat este SBF, dar pot fi utilizate şi alte medii cum ar

fi serul fiziologic, soluţia Ringer sau soluţii mai comlexe de tipul soluţiei Hank său mediu

Dulbecco. Volumul de hidrogen măsurat în timpul imersiei aliajulelor de magneziu este direct

proporţional cu cantitatea de aliaj dizolvata prin coroziune. Calculul ratei de coroziune (RC) în

funcţie de volumul de hidrogen emis se realizează conform ecuației

RC=(8.76∙104∙Δg)/(A∙t∙ρ)

unde:

RC - rata de coroziune;

Δg - schimbarea în greutate a probei (g);

A - aria suprafeței inițiale expusă la coroziune (cm2);

t - timpul de imersie (h);

ρ – densitatea aliajului (g/cm3)

Între volumul de hidrogen eliberat în 24 ore (vH), evaluat în ml/cm2/zi şi pierderea în

greutate Δw, evaluată în mg/cm2/zi, există o relaţie evidenţiată din ecuaţia Δw = 1,085 vH

aceasta însemnând că 1 ml de hidrogen degajat este egal cu 0,001085 g aliaj de magneziu

corodat.

7.1.2.2. Determinarea variaţiilor de ph

Eliberarea ionilor de hidroxid (OH-) în timpul procesului de coroziune va duce la

modificări ale ph-ului mediului de coroziune. Măsurarea pH-ului în mediul de coroziune este

important de realizat deoarece valoarea acestuiala rândul său influenţează rata de coroziune,

aceasta la rândul ei influenţând rata de eliberare a hidrogenului. Măsurătorile efectuate în

mediile de cultură au evidenţiat diferenţe între valorile înregistrate în imediata apropiere a

probei de aliaj şi valorile înregistrate la distanţă de probă.

16

7.1.2.3. Evaluarea ratei de coroziune prin determinarea pierderii în greutate

Pentru determinarea ratei de coroziune, acesta reprezintă testul cel mai simplu de

realizat, necesitând o probă de magneziu, mediu de coroziune şi un cântar cu unităţi micronice.

Mediile de coroziune pot varia de la cele simple Ringer, SBF la soluţii mai complexe de tipul

Hank, Dulbecco. Condiţiile în care se desfăşoară experimentele treubuie să fie cât mai apropiate

de cele fiziologice, temperatura 37 OC, ph 7,4 şi o atmosferă cu concentraţie de CO2 de 5%. .

Această metodă nu oferă date despre modul în care se petrece coroziunea aliajului, putând însă

furniza informaţii despre viteza cu care se petrece coroziunea. Relaţia dintre rata pierderii de

masă (ΔW) exprimată în mg/cm2/24h şi rata medie de coroziune (Pw) exprimată în mm/an este

redată de următoarea ecuaţie: Pw = 2,10 X ΔW

Rata de coroziune poate fi evaluată în funcţie de pierderea de masă a probei , prin urmatorea

R = W / A x t x ρ

Unde

- R – rata de coroziune

- W – pierderea de masa

- A – aria expusa coroziunii a probei initiale

- t – timpul de expunere

- ρ – densitatea aliajului expus

7.1.3. Teste de coroziune polarizate

7.1.3.1. Studii de polarizare potentiodinamica (PDP)

Este cea mai utilizată metoda electrochimică de evaluare in vitro a procesului de

coroziune al aliajelor de magneziu. Acesta metoda furnizează date despre modul în care se

produce procesul de coroziune al magneziului şi al aliajelor sale. Aceste studii reprezintă

caracterizarea unui material prin prisma relaţiei curent – potenţial. Oferă informaţii asupra

potenţialului de coroziune (Ecorr) şi al reacţiilor anodica şi catodica, care au loc la suprafaţa

aliajului de magneziu, acestea din urmă stând la baza procesului de coroziune. Totodată PDP

oferă în orice moment informaţii cinetice despre modul în care coroziunea are loc, informaţii

extrase din intensitatea curentului de coroziune (Icorr). O valoare scăzută a Icorr reprezintă o rată

scăzută de coroziune sau o rezistenţă crescută la coroziune a aliajului de magneziu. Principalul

dezavantaj al PDP este acela că este un test care poate fi realizat o singură dată, în timpul

acestuia distrugându-se suprafaţa probei. Pentru a realiza un nou test cu aceeaşi probă de aliaj

este necesară îndepărtarea stratului de coroziune de la suprafaţa acestuia.

17

7.1.3.2. Electrochemical impedance spectroscopy (EIS)

Utilizarea EIS ne poate oferi informaţii depre procesele de transfer de sarcină din timpul

procesului de coroziune, conducerea electronică sau ionică în mediu de electroliţi, sau

încărcarea dintre două straturi. EIS furnizează informaţii despre impedanţa suprafeţei unei

probe, cu o polarizare minimă. Valoarea impedanţei este invers proporţional cu rata de

coroziune, astfel putând realiza o evaluare a procesului de coroziune. EIS este un procedeu

nedistructiv, permiţând repetarea experimentului pe aceeaşi probă, fără a opri experimentul

pentru îndepărtarea stratului distrus. Astfel, furnizează informaţii în timp real, putând totodată

identifica în mod individual, straturile formate la suprafaţa aliajelor.

7.2. Teste de biocompatibilitate

7.2.1. Teste de citotoxicitate

Citotoxicitatea este definită prin gradul de distructie produs de materialul studiat, la

nivelul celulelor adiacente. În conformitate cu ISO 10993-5: 2009, o reducere a viabilității

celulare mai mult de 30% este considerat un efect citotoxic. Citotoxicitatea poate fi studiată

atât prin teste în vivo, evaluând modificările produse în ţesuturile adiacente implantului sau

prin teste în vitro realizate pe linii celulare de cultură. Liniile celulare utilizate trebuie să fie cât

mai asemănătoare cu celulele cu care va interacţiona implantul în organismul uman. Pentru a

obţine rezultate cât mai exacte şi mai reproductibile în testele in vivo, acestea trebuie aleasă

ţinând cont de utilizarea implantului din aliaj de magneziu. Testele necesită culturi celulare

menţinute în condiţii cât mai apropiate de cele fiziologice. Culturile vor fi preparate şi

menţinute într-un mediu umed, la 37 OC şi o atmosferă cu concentraţie de CO2 de 5% şi

umiditate de 95%. Pentru a obţine aceste condiţii poate fi utilizat un bioreactor. În funcţie de

modul în care sunt realizate, testele de citotoxicitate pot fi de două tipuri directe sau indirecte.

În cazul testelor directe, culturile celulare sunt puse în contact direct cu proba de aliaj de

magneziu, aceasta fiind scufundată în mediul de cultură al celulelor. Pentru testele indirect,

este necesară obţinerea unui extract din proba de aliaj, extract care va fi pus în contact cu linia

celulară, acestea fiind cele mai utilizate teste. Factorii care influenţează eficienta unui test

indirect de evaluare a citotoxicitatii aliajelor de magneziu, sunt reprezentaţi de mediul de

extracţie, timpul de imersie a probei în mediu şi raportul între volumul lichidului de extracţie şi

suprafaţa probei de aliaj, raport care poate influenţa concentraţia ionilor din extract. În practică

curentă, cele mai utilizate teste de citotoxicitate sunt testele colorimetrice MTT care utilizează

(3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazoliu) şi XTT care utilizează (2,3-bis-(2-methoxy-4-

nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide). Cele două teste se bazează pe reacţia de

reducere a sarurilor de tetrazoliu la formazan, colorat, sub acţiunea metabolismului celular.

18

7.2.2. Teste de adeziune celulară

Testele de adeziune, realizate pe linii celulare, indica capacitatea aliajelor de magneziu

de a stimula creşterea osoasă şi formarea de os nou aderent la suprafaţa implantului, stimulând

vindecarea fracturilor prin formarea calusului.

7.2.3. Teste de hemocompatibilitate

O bună hemocompatibilitate in vitro, este reprezentată de o rată de hemoliza mai mică

de 5%, conform datelor furnizate de American Society for Testing and Materials. Pentru

calcularea ratei de hemoliza în vitro, proba de magneziu sau un extract al acesteia va fi pusă în

contact cu o anumită cantitate de sânge. Pentru a calcula rata de hemoliză avem nevoie de o

probă de control negativ, ser fiziologic şi o probă de control pozitiv, apa distilată. Hemoliza se

calculează conform ecuaţiei

Hemoliza= DO (test) – DO (control negativ) / DO (control pozitiv) – DO (control negativ) x 100

În ceea ce priveşte efectul asupra capacităţii de coagulare a sângelui , este necesară

evaluarea parametrilor de coagulare (APTT, TT, INR). În teorie, magneziul se combină

competitiv cu receptorii extracelulari ai calciului, blocând canalele de calciu şi întârziind

procesul de agregare plachetara.

7.2.4. Teste in vivo

Pentru a putea fi utilizat în chirurgia ortopedică umană, un implant trebuie să se

dovedească sigur şi eficient. Testele in vivo, pe animale de laborator, sunt nivelul care urmează

testelor in vitro, supunând rezultatele obţinute, validării în contextul activităţilor biologice ale

unui organism viu. Pentru testele in vivo pot fi folosite animale mici, cum ar fi şoareci, porcuşori

de guinea sau iepuri, aceştia din urmă fiind cel mai frecvent utilizaţi, sau animale de dimensiuni

mari câini, pisici, oi. Pentru testele osoase este recomandată folosirea unor animale mature la

care creşterea osoasă a fost încheiată.

7.2.4.1. Biocompatibilitate aliaje in vivo

Implanturile sunt recunoscute în organism ca un corp străin. În cazul implanturilor

resorbabile, acestea trebuie să respecte cerinţe speciale deoarece substanţele din care este

alcătuit implantul vor fie eliberate prin degradare în organismul uman, iar ulterior trebuiesc

eliminate sau asimilate prin procese fiziologice. Biocompatibilitatea unui implant depinde de o

multitudine de factori, cum ar fi compoziţia sa, tipul de degradare, proprietăţile suprafeţei

acestuia care influenţează interfaţa dintre implant şi ţesuturile adiacente, situsul de implantare

şi tehnica chirurgicală folosită. Un rol important în procesul de coroziune şi biofunctionalitatea

în vivo a implanturilor din aliaje de magneziu îl joacă interfaţa dintre implant şi ţesuturile

adiacente. Aceasta este reprezentată de procese biochimice cum ar fi eliberarea de ioni,

valoarea ph-ului, absorbţia de proteine sau morfologia suprafeţei implantului. Produşii de

degradare ai aliajelor de magneziu in vivo sunt reprezentaţi în special de hidroxid de magneziu

19

Mg (OH)2, oxid de magneziu MgO, clorura de magneziu MgCl2, şi produşi tip hidroxiapatita.

Acest strat se va depune la suprafaţa implantului şi va oferi un grad de protecţie împotriva

coroziunii, mai ales prin depunerea hidroxiapatitei.

7.2.4.2. Rolul locului de implantare

Conform recomandărilor Organizaţiei Internaţionale de Standardizare (ISO) 10990-

6:2009, sunt recomandate trei metode de testare a biocompatibilitatii: teste cutatnate,

implanturi în masă muscular şi teste osoase. Conform ISO 10993-6:2007 este important ca în

cadrul testelor de biocompatibilitate implantul să nu fie supus solicitărilor mecanice. Deoarece

aplicaţiile medicale ale aliajelor de magneziu se referă mai ales la chirurugia ortopedica,

implantarea în ţesut osos la animalele de laborator este cea mai recomandată. Dar, deoarece o

mare parte a implanturilor ortopedice se afla parţial în afară osului (şuruburi, placi), în contact

cu masele musculare, cea de a 2-a zona de interes pentru implantarea în testele în vivo, este

ţesutul muscular. Locul de implantare poate influenţa procesul de formare cât şi dimensiunea

bulelor de hidrogen, deoarece hidrogenul prezintă coeficienţi diferiţi de solubilitate şi difuzie, în

funcţie de ţesutul în care este eliberat.

7.2.4.3. Metode de evaluare in vivo a coroziunii şi a biocompatibilitatii.

7.2.4.3.1 Investigaţii radiologice

Radiografiile, realizate în două incidente pot furniza multe date. Acestea pot evalua

modul incare s-a făcut implantarea, putând identifica locaţia implantului, dacă au fost incidente

intra operatorii sau complicaţii la distanţă. O radiografie de calitate poate oferi informaţii

despre calitatea osului din jurul implantului din aliaj de magneziu, putând identifica posibile

zone osteolitice (resorbţie osoasă) sau osteocondensante (formare de os nou) sau poate oferi

informaţii despre evoluţia degradării aliajului şi despre evoluţia bulelor de gaz.

7.2.4.3.2. Tomografie computerizată (CT) şi micro tomografie computerizată (µCT)

Acestea sunt proceduri non invazive care pot evalua evoluţia implantului, modificările

de forma şi volum produse prin resorbţie putând determina astfel rata de coroziune.

Examinarea µCT prezintă o rezoluţie superioară celei CT clasice, putând ajunge la 10-20 µm.

Prin µCT se poate evalua structura osului adiacent implantului, gradul de adeziune osoasă la

implant şi dacă există os nou format la acest nivel.

7.2.4.3.3. Determinarea pierderii de greutate

Evalueza gradul de coroziune al implantului într-un mod similar determinării în vitro.

Implantul este cântărit pre implantare şi post ablaţie, din diferenţă de greutate calculându-se

rata de coroziune.

20

7.2.4.3.4. Scanare prin microscopie electronică (SEM)

Aceasta este o metodă eficientă de evaluare a modului în care se degradează implantul

din aliaj de magneziu, şi a caracterizării structurii suprafeţei acestuia atât pre cât mai ales post

implantare. Totodată, poate evalua şi stratul produşilor de coroziune, SEM putând fi utilizată

atât înaintea cât şi după îndepărtarea acestora.

7.2.4.3.5 Energy dispersive spectrometer (EDS)

Această metodă de analiza foloseşte radiaţia electromagnetică pentru a evalua

implantul, suprafaţa acestuia şi interferenta sa cu ţesuturile adiacente. EDS furnizează date

despre elementele prezente la suprafaţa implantului, apărute în urma coroziunii dar şi în urma

biointeferentei implantului.

7.2.4.3.6. Examinare histopatologică

Metoda cea mai uzuală şi cu sensibilitatea cea mai crescută în evaluarea răspunsurilor

tisulare la acţiunea implantului, astfel evaluând biocompatibilitatea acestuia. Recoltarea

pieselor se va realiza din ţesuturile adiacente implantului, sau chiar în bloc, de exemplu

segment osos, împreună cu implantul de magneziu în interiorul său. Alegerea metodei de

colorare joacă un rol important în furnizarea informaţiilor din cadrul analizei histopatologice,

fiecare metodă de colorare având un scop precis. Cea mai uzuală metodă de colorare este

Hematoxilina-Eozina.

7.2.4.3.7 Hemocompatibilitate

Aşa cum am menţionat în cazul testelor în vitro, o bună hemocompatibilitate este

reprezentată de o rată de hemoliza mai mică de 5%. În cazul testelor în vivo rata de hemoliza

va fi evaluată prin evaluarea modificărilor numărului de eritrocite, a valorii hemoglobinei şi a

hematocritului. Hemocompatibilitatea aliajelor de magneziu poate fi evaluată şi prin

determinarea valorilor probelor de coagulare. Rezultatele trebuie interpretate în funcţie de

valorile normale, fiziologice, specifice fiecărei specii de animal, supus experimentelor

7.2.4.3.8. Determinări serologice

În teorie, eliberarea rapidă şi în cantităţi crescute a ionilor din implant, va duce la

creşterea valorilor plasmatice ale acestora cu afectarea organelor vitale de excreţie sau

metabolizare a compuşilor (rinichi, ficat). Pentru obiectivarea acestor ipoteze, vom efectua

determinări la distant de momentul implantării ale valorilor serice ale magneziului şi ale

celorlalte elemente de aliere şi probe funcţionale renale şi hepatice.

7.2.4.3.9. Studii clinice

Pentru că un implant fabricat din aliaje de magneziu, dedicat interventiior chirurgicale

ortopedice, să poate fi supus studiilor clinice, acesta trebuie să dovedească o bună

21

biocompatibilitate în studiile în vitro şi în vivo. Studiile clinice reprezintă etapa superioară, finală

de testare a calităţilor unui implant.

8. Corelare rezultate in vitro vs in vivo

În urma procesului de coroziune al aliajelor de magneziu, la suprafaţă acestora se va

forma un strat de produşi oxidativi, cu rol parţial de protecţie împotriva coroziunii. Acest strat

este însă stabil doar într-un mediu alcalin, menţinerea ph-ului la valori neutre sau fiziologice

(7,4) ducând la degradarea acestui strat, şi astfel la accelerarea ratei de coroziune. Deoarece în

organismul uman ph-ul fiziologic este menţinut stabil la 7,4, iniţial s-a crezut că rata de

coroziune în vivo, va fi mai mare decât rata in vitro. Observaţiile ulterioare au demonstrat un

efect contrar, procesul de coroziune fiind mai lent in vivo. Diminuarea ratei de coroziune

obsevata în studiile in vivo, poate fi datorată protecţiei oferite de adeziunea celulară sau a

proteinelor la suprafaţa implanturilor din aliaje de magneziu, acestea formând un strat

protector. Astfel, concordanţa între valorile obţinute la testele in vitro cu cele in vivo este

redusă, testele in vitro neavând o bună predictibilitate pentru testele in vivo.

A. PARTE SPECIALĂ

9. Scopul lucrării

Obiectivul principal al tezei de doctorat este reprezentat de realizarea unor modele

experimentale pentru testarea biocompatibilitatii unui aliaj de magneziu din sistemul binar

magneziu-calciu, respectiv Mg-Ca 1% wt, forma turnată. Pentru îndeplinirea obiectivului propus

au fost realizate teste in vitro cât şi teste in vivo, realizându-se corelaţii între rezultatele

obţinute prin cele două modalităţi de testare.

10. Generalităţi şi consideraţii din literatura asupra alegerii materialului de

studiu (aliaj Mg-1Ca) şi a reperelor biologice ca şi cadru de referinţă

10.1 . Aliajele binare magneziu calciu 1%. Stadiul actual al cunoaşterii

10.1.1. Calciul ca bioelement

Calciul (Ca), reprezintă un cation prezent, ca şi magneziul, în mod natural în organismul

uman. Este cel mai abundent mineral din corp, cantitatea fiziologică fiind de aproximativ 1 -1,1

kg. Cea mai mare parte a calciului din organism este depozitată în ţesutul osos (99%).

22

Restul calciului, localizat la nivel celular sau extra celular, este divizat în trei forme, legat

de proteine, forma ionizata şi complex de legătură cu anioni. Calciul formează cea mai mare

parte a structurii anorganice a ţesutului osos şi a dinţilor, având totodată un rol important în

reglarea unor funcţii importante ale organismului uman. Nivelul normal al calciului plasmatic,

calcemia, are valori de 0,919 – 0,993 mg/L. Valorile calcemiei sunt reglate direct de nivelul

calciului, cât şi de sistemul endocrin prin intermediul unor hormone, parathormonul şi vitamina

D. Calciul este absorbit la nivelul tubului digestiv şi este eliminat într-o mică măsură prin

secreţie la acest nivel. Pricipala cale de excreţie este reprezentată de sistemul urinar.

10.1.2. Aliajele magneziu - calciu

Calciul a fost selectat ca element de aliere cu magneziul în vederea producerii implanturilor ortopedice, datorită următoarelor considerente

- Calciul este un element natural, având un rol esenţial în structura osului

- Magneziul are rolul de a încorpora calciul în ţesutul osos, eliberarea concomitentă de ioni de magneziu şi calciu din aliaj în timpul resorbţiei, având un efect benefic în vindecarea osoasă

- Calciul are o densitate redusă (1,55 g/cm3),aceasta permiţând aliajelor de Mg-Ca să ajungă la o densitate similară cu cea a osului

Aliajele Mg-Ca pezinta o microstructură binară, alcătuită dintr-o fază primară α Mg şi o

fază secundară eutectica, cu structură lamelară, compusă din Mg2Ca. Procesul de coroziune a

aliajelor Mg-Ca este rezultatul formării unui circuit galvanic, datorat diferenţei de potenţial

electrochimic dintre faza primară α Mg şi cea secundară Mg2Ca. Cantitatea de calciu din aliaj va

influenţa microstructura acestuia şi implicit şi calităţile mecanice şi rezistenţa la coroziune a

acestuia, rata de coroziune a aliajelor Mg-Ca putând fi controlată prin controlarea concentraţiei

de calciu din aliaj. Testele efectuate au arătat că aliajele cu concentraţii de 5, 10 şi 20% au fost

fragile şi cu o rată de coroziune crescută. Rezultatele obţinute pe aliaje cu concentraţii scăzute

de calciu, 1, 2 şi 3% au fost superioare atât din punctul de vedere al proprietăţilor mecanice cât

şi din cel al ratei de coroziune. Rezultatele încurajatoare obţinute, au dus la recomandarea

aliajelor Mg-Ca1% ca fiind optime pentru realizarea implanturilor ortopedice.

10.1.3. Aliaje Mg-1Ca. Date din literatură

Microstructura aliajelor Mg-1Ca joacă un rol important în determinarea calităţilor

mecanice şi a rezistenţei la coroziune a acestora. Aşa cum am arătat în capitolele anterioare, pe

lângă ajustarea cantităţii de calciu din aliaj, procedeele de procesare mecanică secundară,

extrudare sau laminare la cald, pot juca un rol important în determinarea calităţilor aliajelor

Mg-1Ca. Această ipoteză este susţinută de date din literatură, aşa cum reiese din studiile

realizate de Harandi în 2011, Koleini în 2012, de Kamman şi Raman sau Li şi colaboratorii în

2008.

23

10.1.4. Concluzii privind datele din literatură

Calciul, ca element de aliere cu magneziul, are capacitatea de a produce implanturi

uşoare, cu densităţi apropriate de cele ale osului uman. Adiţia de calciu în aliajul de magneziu

va duce la formarea unui aliaj binar, alcătuit din două faze metalice stabile termic, Mg şi Mg2Că,

care vor produce rafinarea granulelor, îmbunătăţind calităţile mecanice şi rezistenţa la

coroziune a aliajului. Controlul concentraţiei de calciu din aliaj, raportată în procente de

greutate wt%, joacă un rol important în determinarea calităţilor mecanice şi a ratei de

coroziune. Rezultatele obţinute până în acest moment în urma testelor în vitro şi în vivo, indica

aliajele Mg-1Ca că având potenţialul de a fi folosite ca material pentru fabricarea implanturilor

bioresorbabile, utilizate că materiale de osteosinteza în chirurgia ortopedică.

11. Aplicaţii potenţiale aliaj Mg-1Ca

În acest moment, magneziul şi aliajele sale îşi pot găsi aplicabilitate în chirurgia ortopedică a oaselor mici, segmentul optim fiind piciorul, patologia scheletului fiind mai amplă la acest nivel. Deoarece aliajele Mg-1Ca prezintă încă o rată de resorbţie relativ rapidă, acestea pot fi indicate ca materiale de osteosinteza pentru segmentele osoase cu vindecare rapidă, 6-8 săptămâni, şi care nu sunt supuse încărcării în această perioadă.Un astfel de segment anatomic este reprezentat de picior, aliajele Mg-1Ca putând reprezenta o soluţie pentru chirurgia ortopedică adresată patologiei acestui segment. Aşa cum am menţionat mai sus, principalele motive pentru care considerăm patologia piciorului ca element ţinta pentru utilizarea implanturilor din magneziu sunt

- Fixarea chirurgicală a fracturilor sau osteotomiilor de la acest nivel necesită implanturi de dimensiuni mici, acestea fiind mai uşor de procesat mecanic

- Perioda de consolidare a fracturilor sau a osteotomiilor este de 6 până la 12 săptămâni, implanturile pe bază de magneziu putându-şi menţine calităţile mecanice necesare susţinerii osului în această perioadă de timp.

- Imobilizarea postoperatorie (aparat gipsat / orteze) şi mobilizarea fără sprijin recomandată pentru 6 până la 12 săptămâni, diminuează solicitările mecanice şi în acelaşi timp scad cerinţele de rezistenţă mecanică ale acestor implanturi

12. Studii în vitro

12.1. Introducere

În funcţie de scopul urmărit am realizat două tipuri de studii in vitro. Studii care

evaluează rata de coroziune şi studii care evaluează biocompatibilitatea, prin testarea

citotoxicitatii aliajului Mg-1Ca, pe linii celulare. Studiile de evaluare a ratei de coroziune au fost

reprezentate de studiul de determinare a ratei de coroziune prin metoda pierderii în greutate,

şi studiul de determinare a ratei de coroziune prin determinarea eliberării de hidrogen

24

12.2. Studii de determinare a ratei de coroziune în vitro

12.2.1. Determinarea ratei de coroziune prin determinarea pierderii de greutate

12.2.1.1 Obiective studiu

Evaluarea caracterului degradabil şi calcularea ratei de coroziune in vitro al aliajului

Mg-1Ca. Compararea cu ratele de coroziune obţinute in vivo.

12.2.1.2 Ipoteze studiu

Aliajul Mg-1Ca are un caracter resorbabil, degradându-se treptat, sub acţiunea mediului

de coroziune, acestea generând o rată de coroziune mai mare decât cea in vivo

12.2.1.3 Material şi metoda

Experimentul a fost realizat prin imersia probelor de aliaj Mg-1Ca într-o soluţie, fluid biologic simulat, SBF, şi menţinerea lor în soluţie pentru perioade determinate de timp. Probele au fost cântărite înainte de imersie şi după scoaterea lor din soluţie şi curăţarea de produşi de coroziune. Din datele rezultate am calculat rata de coroziune în vitro. Pierderea de masă s-a calculat utilizând următoarea formulă:

P.M.=((m0-mt)/m0)x100 unde: m0 – masa probei înainte de imersie; mt – masa probei, la diferite intervale de timp, după îndepărtarea produşilor de coroziune

Rata de coroziune, derivată din pierderea de greutate poate fi determinată prin aplicarea următoarei formule de calcul

RC = (8.76∙104∙ΔW)/A∙t∙ρ

unde:

RC - rata de coroziune [mm/ani], ΔW - diferența de greutate, înainte și după imersie *g+, A - aria suprafeței inițiale expusă la coroziune *cm2], t - timpul de imersie [h] ρ - densitatea aliajului [g/cm3].

Ph-ul mediilor de coroziune joacă un rol important în evoluţia procesului de coroziune, acesta ducând la alcalinizarea mediului, iar în acelaşi timp, stratul de protecţie de la suprafaţa aliajului fiind stabil la ph alcalin.

12.2.1.4 Rezultate

În graficul numărul 1, se remarcă o creştere accentuată a pierderii de masă către ziua a

7-a, 168 ore de imersie, cu o stabilizare, pierdere de masă mai lentă către ziua a 12-a,

25

Grafic nr. 1. Pierderea procentuala de masa

In graficul numarul 2, se remarca o crestere constanta a ratei de coroziune in prima

saptamana. Dupa aceasta perioada inregistram o scadere a ratei de coroziune catre 288 ore de

imersie, ajungand la valori asemanatoare cu rata inregistrata in ziua a 7-a.

Grafic 2. Evolutia ratei de coroziune

In graficul 3 este prezentata evolutia ph-ului, inregistrand o alcalinizare rapida in primele

72 ore.

Grafic 3. Evolutia ph

18.56

37.14

73.58 76.21 80.55

0

20

40

60

80

100

72 120 168 240 288

Pie

rder

ea d

e m

asa

(%)

Timp de imersie (ore)

Mg1Ca

16.9 20.328.71

20.83 18.35

0 10 20 30 40

72 120 168 240 288

Rat

a d

e co

rozi

un

e (m

m/a

n)

Timp de imersie (ore)

Mg1Ca

7.47.437.667.797.897.988.048.25

8.859.2

9.69.929.849.819.869.939.9610.1210.2210.36

7

8

9

10

11

0 1 2 3 4 5 6 12 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288

Val

ori

le p

H-u

lui

Timp de imersie (ore)

26

12.2.2 Determinarea ratei de coroziune prin măsurarea cantității de hidrogen eliberată

în mediul de coroziune

12.2.2.1 Obiective studiu

Evaluarea gradului de eliberare a hidrogenului din aliajul Mg-1Ca, forma turnata, în

timpul procesului de coroziune. Determinarea ratei de coroziune a aliajului Mg-1Ca şi

compararea cu cea obţinută în studiul anterior şi in cel în vivo.

12.2.2.2 Ipoteze studiu

Aliajul Mg-1Ca, în formă turnata, eliberează hidrogen sub formă de gaz, în mediul de

coroziune. Mediul de coroziune complex, Dulbecco, , va duce la o rată de coroziune mai scăzută

decât SBF, dar mai mare decât cea rezultată în testele în vivo.

12.2.2.3 Material şi metoda

Testul se bazează pe un principiu relativ simplu. Volumul de hidrogen eliberat din aliaj în

timpul procesului de coroziune, este proporţional cu cantitatea de aliaj descompus. Astfel,

volumul de hidrogen colectat este convertit în pierdere de material, conform raportului

următor, 1 ml hidrogen degajat = 0,001083 g aliaj descompus. Ulterior rata de coroziune se va

calcula după aceeaşi metodă ca în testul pierderii de greutate. Pentru efectuarea testului am

utilizat 3 probe de aliaj, identice cu cele din testul precedent. S-a calculat şi evoluţia ph-ului,

deoarece acesta influenţează rata de coroziune.

12.2.2.4. Rezultate

În primele 24 de ore se înregistrează creştere accelerată a ratei de coroziune, aceasta

diminuând treptat către ziua a 7-a. După acesta perioadă se înregistrează o creştere lentă a

raţei, până în ziua a 12-a.

Grafic 4. Evolutia ratei de coroziune

Evolutia in dinamica a ratei de eliberare a hidrogenului pe zi, prezentata in graficul

urmator, are o evolutie asemanatoare cu evolutia ratei de coroziune

6.93987

2.7952252.139793 1.98282

3.238606 3.614516

0

2

4

6

8

24 h 72 h 120 h 168 h 240 h 288 h

Rata de coroziune Linear (Rata de coroziune)

27

Grafic 5. Evolutia ratei de eliberare a hidrogenului pe zi

In graficul 6, se observa o alcalinizare rapida a mediului produsă de procesul de

coroziune in primele 24 de ore, atingand o valoare de 8,4, urmand o evolutie lent progresivă

catre ziua a 12-a

Grafic 6. Evolutia Ph in mediu Dulbecco

12.2.3. Discuţii teste de măsurare rata de coroziune în vitro

Cele două metode de calculare a ratei de coroziune in vitro, prin pierderea de greutate

şi prin eliberarea de hidrogen, asemănătoare în final ca modalitate de calcul, au fost realizate în

medii de coroziune diferite, pentru a putea evalua efectul compoziţiei mediului asupra

procesului de coroziune

În cadrul testului de determinare a ratei de coroziune prin pierderea de greutate,

efectuat în SBF, am observant o pierdere constantă de masă a probelor, cu o evoluţie rapidă

către primele 168 ore de imersie. În continuare, procesul de pierdere de masă a fost mai lent,

dar totuşi semnificativ, la 288 ore de imersie, 12 zile, proba fiind practic dezintegrată.

Rata de coroziune înregistrează o creştere iniţială rapidă, către un maxim la 168 ore de

imersie, 28,71 mm/an. După această perioadă am înregistrat o scădere lentă a ratei de

00.5

11.5

22.5

33.5

4

24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288

3.0547

0.35460.32720.4590.57740.58340.7314

1.8036

2.672

3.7617

2.26242.3693R

ata

de

elib

erar

e a

hid

roge

nu

lui p

e zi

(m

l/cm

2 /zi

)

Timp de imersie (ore)

7.3

8.4 8.45 8.47 8.5 8.56 8.59 8.66 8.78 8.82 9.02 9.09 9.12

7

8

9

10

0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288

Val

ori

le p

H-u

lui

Timp de imersie (ore)

Mg-1Ca

28

coroziune până la 18,35 mm/an. Aceste date sunt în concordantă cu datele din pierderea de

masă, indicând că procesul de coroziune continuă, dar este mai lent

Alcalinizarea rapidă a mediului, în primele 168 de ore indică un proces de coroziune

accelerat, în conformitate cu datele obţinute din pierderea de masă şi rata de coroziune. După

acest interval, nivelul de alcalinizare al mediului va duce la stabilizarea stratului protector de

Mg(OH)2, de la suprafaţa aliajului şi va permite depunerea de HA. Pentru o perioadă limitată de

timp aceste straturi vor oferi protecţie aliajului, diminuând rata de coroziune. Ph-ul maxim a

fost de 10,36

Testul de măsurare a ratei de coroziune prin evaluarea emisiei de hidrogen confirmă în

primul rând faptul că aliajul Mg-1Ca produce hidrogen sub formă de gaz în timpul procesului de

coroziune. Rata maximă de eliberare a hidrogenului, calculată în ml/cm2/zi atinge o valoare

maximă de 3,76. Aceasta este mai mare decât rata fiziologică de adsorbţie a hidrogenului, în

organismul uman, 2,25 ml/cm2/zi.

Rata de coroziune are o evoluţie sinuoasă, cu un trend descendent. La 24h atinge un

maxim de de 6,939 mm/an, după care urmează o scădere rapidă către o valoare minimă de

1,982 mm/an, la 168 ore de imersie, recrescând uşor către o valoare de 3,614 mm/an la 288 ore

de imersie. Totodată, observăm o alcalinizare rapidă a mediului în primele 24 ore, aceasta

indicând o accelerare a ratei de coroziune. Ulterior alcalinizarea este lent crescătoare, către o

valoare de 9,12 la 288 ore de imersie, indicând o diminuare a ratei de coroziune, în concordanţă

cu datele înregistrate.

Mediul complex Dulbecco oferă o protectie suplimentară. La un Ph alcalin, proteinele

din mediul complex de coroziune, se vor fixa la suprafaţa stratului de hidroxiapatită format în

timpul procesului de coroziune al aliajului Mg-1Ca, formând astfel un film suplimentar de

protecţie împotriva procesului de coroziune. Acest fapt este confirmat de raţă de coroziune

înregistrată, mult diminuată faţă de cea înregistrată în SBF.

12.2.4 Concluzii teste de măsurare rata de coroziune în vitro

Mediile complexe, tip Dulbecco, oferă o mai bună protecţie aliajului Mg-1Ca,

înregistrând o rată de coroziune mult diminuată comparativ cu SBF. Acest fapt ridică ipoteza

unei rate de coroziune în vivo, mai mică decât cea în vitro

Mediul de coroziune Simulated Body Fluid, SBF, cu toate că permite formarea stratului

de HA la suprafaţa aliajului, va induce un proces de coroziune rapid, agresiv cu materialul, şi un

nivel al Ph-ului, prea mare pentru a oferi siguranţă într-un organism viu.

Ph-ul soluţiei SBF, dar şi al soluţiei Dulbecco, ajunge la valori prea mari pentru procesele

fiziologice, ridicând ipoteza apariţiei fenomenelor de citotoxicitate în organismele vii, prin

blocarea unor mecanisme biologice dependente de ph. Această ipoteză necesită testare prin

studii in vitro

29

Aliajul Mg-1Ca, forma turnata, produce hidrogen în timpul procesului de coroziune, la o

rata mai mare decât capacitatea de adsorbţie a organismului uman. Aceasta predispune la

formarea de bule de gaz în ţesuturile adiacente implanturilor fabricate din acest aliaj de

magneziu.

Mediul de coroziune, joacă un rol important în dinamica corodării aliajului Mg-1Ca. Cu

cât mediul este mai similar mediului fiziologic din organismele vii, cu atât comportamentul

aliajului la corodare este mai controlat. Aceste observaţii ne indică că aliajul Mg-1Ca oferă un

grad de siguranţă, putând fi utilizat în studii în vivo

12.3. Studii de biocompatibilitate in vitro

12.3.1 Determinarea efectului aliajului Mg-1Ca asupra viabilităţii celulare, in vitro

12.3.1.1 Obiective studiu

Stabilirea nivelului de toxicitate indus unor linii celulare (osteoblaste), în timpul

procesului de coroziune al aliajului resorbabil Mg-1Ca. Verificarea ipotezelor din studiile de

coroziune, privind posibilele efecte toxice celulare ale aliajului Mg-1Ca

12.3.1.2 Ipoteze Studiu

Aliajul Mg-1Ca poate induce fenomene de citotoxicitate în linii celulare de cultură, prin

fenomene secundare din timpul procesului de coroziune, alcalinizarea mediului şi emisia de

hidrogen sub formă de gaz. Gradul de citotoxicitate al aliajului Mg-1Ca nu este crescut,

permiţând evoluţia cercetării către studii in vivo

12.3.1.3 Material şi metoda

Pentru a determina efectul citotoxic al aliajului Mg-1Ca asupra viabilităţii celulare am

utilizat metodă de testare AlamarBlue® (CellTiter-Blue Cell Viability Assay, Promega). Culturile

celulare utilizate în testul de citotoxicitate au fost reprezentate de linii de osteoblaste, SaOs-2 –

P15, linii celulare umane de origine malignă, osteosarcom. Testul a fost de tip indirect, în

mediul de cultură celular fiind adăugat un extract realizat din aliajul Mg-1Ca pe mediu de

cultură Dulbecco +10% FBS, similar cu mediul de cultură cellular. Am utilizat 2 extracte, de 24 şi

de 72 ore. Pentru acuratețea rezultatelor am analizat doua probe din fiecare extract şi am

folosit un control negativ, polietilenă de înaltă densitate (HDPE) și un control pozitiv, latex.

Evolutia osteoblastelor este prezentata in figura urmatoare:

30

Figura 1. Evolutie osteoblaste

12.3.1.4. Rezultate

Grafic 7. Viabiltate celulara medie extract aliaj 24h vs latex

Se remarca o viabilitate celulara net superioara fata de proba control, inregistrand o

viabilitate medie globala de 77.14003%.

85.63357

74.05783 70.3647678.50398

-9.91815-0.61947

10.99488

-1.28729-20.00

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

Ziua 1 Ziua 2 Ziua 3 Ziua 7

Viabiliate medie 24h Latex

31

Grafic 7. Viabiltate celulara medie extract aliaj 72h vs latex

Si in acest caz se remarca o viabilitate celulara net superioara fata de proba control.

Viabilitatea celulara medie este insa diminuata fata de extractul de 24h, fiind 47.11804%.

Extractul de 72 ore prezinta o evolutie sinusoidala a viabilitatii celulare, cu o diferenta crescuta

intre valoarea maxima si cea minima, 39.52374%.

12.3.1.5 Discuţii

Pentru testul realizat în cadrul acestei teze de doctorat, am utilizat linii celulare de

osteoblaste, deoarece liniile celulare trebuie să fie cât mai asemănătoare celulelor cu care va

interacţiona implantul în utilizarea sa finală, în vivo.

Am preferat un test indirect, deoarece beneficiem de distribuţia uniformă a compuşilor

aliajului în masă celulară, putând evidenţia efectele acestora în toată cultura celulară. În

evaluarea rezultatelor am ţinut cont de ISO 10993-5: 2009, conform căreia, o reducere a

viabilității celulare mai mult de 30% este considerată un efect citotoxic.

Viabilitatea celulară înregistrată in cazul ambelor tipuri de extract este net superioară

controlului pozitiv, latex, în toate intervalele de timp, aceasta demonstrând că viabilitatea

celulară se menţine în prezenţa extractului de aliaj Mg-1Ca. În comparaţia directă, 24 ore versus

72 ore, am remarcat o viabilitate celulară superioară în cazul extractului de 24 ore, în toate

perioadele de timp, cu excepţia zilei 3, în care sunt egale. Aceasta viabilitate redusă, comparativ

cu extractul de 24 ore, poate fi atribuită unei concentraţii crecuta de ioni de magneziu, calciu şi

produşi de coroziune, în extractul de aliaj de 72 ore. Cu toate acestea, datele obţinute despre

viabilitatea celulară în extractul de 72 ore nu sunt concludente, având o variabilitate mare, între

valoarea minimă şi cea maximă înregistrând o diferenţă de 39.56893 %.

12.3.1.6 Concluzii

Concentraţia ionilor din mediul de cultură, magneziu, calciu, produşi de coroziune,

influenţează rata de viabilitate celulară, fapt indicat de diferenţele înregistrate între cele două

tipuri de extract.

38.02534

49.19585

70.40995

30.84102

-4.49442-0.08133

-7.27743

0.470728

-20.00

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

Ziua 1 Ziua 2 Ziua 3 Ziua 7

Viabilitate medie 72h Latex

32

La o concentraţie redusă de ioni în mediul de cultură, aliajul Mg-1Ca se înscrie în

standardul internaţional privind gradul de citotoxicitate, putând oferi o bună viabilitate

celulară, cu efecte citotoxice reduse, şi cu influenţă redusă asupra procesului de proliferare

celulară.

Rezultatele obţinute utilizând extractul de 72 ore, duc la ipoteza conform căreia ionii

eliberaţi într-o concentraţie crescută din aliaj, echivalentul unei rate crescute de coroziune, pot

induce efecte toxice celulare, locale sau sistemice

Datele obţinute în studiul în vitro, privind efectul procesului de degradare al aliajului

Mg-1Ca asupra viabilităţii celulare, sunt încurajatoare, justificând continuarea cercetării prin

studii în vivo.

13. Studii in vivo

13.1. Introducere

Studiile in vivo reprezintă un nivel superior de cercetare, al studiilor în vivo, în acelaşi

timp fiind pasul premergător al studiilor clinice de faza 1. Studiile in vitro, indiferent de calitatea

lor, nu pot oferi date concrete privind capacitatea de biocompatibilitate sau gradul de siguranţă

pe care îl prezintă un biomaterial atunci când este implantat într-un organism viu. Studiul

prezent, realizat in vivo pe animale de laborator, iepuri, are ca scop certificarea rezultatelor

obţinute în urma experimentelor în vitro, în acelaşi timp urmărind realizarea unei corelaţii între

datele şi ipotezele rezultate în urma studiilor in vitro, cu cele obţinute prin studiul în vivo.

13.1.1. Iepurele ca animal de laborator în studii de implantare osoasă

Astfel, conform standardului internaţional pentru evaluarea biologică a dispozitivelor

medicale, ISO 10993-6:2007, studiile experimentale pe animale sunt necesare pentru evaluarea

efectelor locale ale unui implant, după implantarea sa în ţesutul ţinta. Iepurele este cel mai

utilizat animal în studiile musculo-scheletale, aproximativ 35% dintre acestea utilizând iepuri.

Acesta prezintă avantajul de a fi un animal docil, uşor de manipulat şi îngrijit. Totodată este un

animal ieftin,uşor de obţinut, care se reproduce rapid. Un alt avantaj este faptul ca iepurii ating

maturitatea osoasă rapid, la 28 săptămâni, acest lucru fiind important deoarece studiile

scheletale se realizează pe animale care au atins maturitatea osoasă. Dezavantajele sunt

reprezentate de o structură osoasă primară, fragilă, predispusă la fracturi. Iepurele prezintă un

turn-over osos rapid, o remodelare semnificativă intracorticala, haversiana, comparativ cu osul

uman vindecarea fracturilor oaselor lungi, femur, tibie, necesitând doar 6 săptămâni. Conform

ISO 10993-6:2007, numărul maxim de implanturi care poate fi folosit în cazul unui iepure

experimental este de 6, 3 teste şi 3 control.

13.2 Analiza SWAT

33

13.3 Obiective studiu in vivo

13.3.1. Obiective principale / 13.3.2. Obiective secundare

Evaluarea biocompatibilitatii unui aliaj Mg-1Ca, forma turnata prin evaluarea

citotoxicitatii directe şi evaluarea efectelor sistemice produse în timpul procesului de coroziune.

Evaluarea evoluţiei eliberării de hidrogen şi efectele bulelor de hidrogen intratisulare.

Evaluarea ratei de coroziune în vivo şi corelarea datelor obţinute în vivo cu datele obţinute prin

studiile în vitro.

13.4 Ipoteze studiu în vivo

13.4.1. Ipoteza principală / 13.4.2 Ipoteza secundară

Implanturile metalice fabricate din aliaj Mg-1Ca, au capacitatea de a fi bioresorbabile.

Aliajul Mg-1Ca, forma turnată, prezintă o bună biocompatibilitate, fără a înregistra efecte toxice

locale sau sistemice. Aliajul Mg-1Ca prezintă capacitate de osteointegrare şi osteoconductivă.

Mediul complex din organismele vii influenţează rata de coroziune în mod diferit

comparativ cu mediile din testele în vitro, înregistrând o rată de coroziune diminuată

comparativ cu testele în vitro.

13.5.Materiale şi metoda (protocol de lucru)

13.5.1 Date generale

Studiul prezentat în teza de doctorat este un studiu experimental, in vivo, de tip

explorator. Din punctul de vedere al temporalităţii, este un studiu prospectiv, desfăşurat pe o

perioadă de 2 ani. Studiul a fost realizat în conformitate cu legislaţia europeană, Convenţia

Europeană pentru Protecţia Animalelor Vertebrate Utilizate în Experimente şi în alte Scopuri

Ştiinţifice, adoptată în 1986 la Strasbourg, ratificată în România prin legea nr 305/2006,

modificată şi completată prin legea nr 9/2008. Studiul s-a desfăşurat cu avizul Comisiei de Etică

a Cercetării Ştiinţifice, nr 92/20.04.2016, cod PO-35-F-03.

13.5.2 Animale de laborator utilizate:

Zece exemplare iepure domestic rasa “Oryctologus Cuniculus”, în raport mascul /

femela: 1/1. Criteriile de includere au fost: vârsta 12-18 luni, animal adult, cu creşterea osoasă

încheiată. Greutate minimă 3,5 kg. Criteriile de excludere au fost: prezenţa unor patologii

cunoscute sau evidenţiate în timpul examinării clinice a animalului. Examinarea clinică a fost

realizată conform recomandărilor FELASA (Federation of European Laboratory Animal Science

Associations). Evoluţia greutăţii a fost urmărită pre şi post operator, aceasta reprezentând un

indicator al stării de sănătate a animalului

Cele 10 animale au fost împărţite în trei loturi, diferenţiate de procedurile care vor fi

aplicate.

34

- lotul 1 – trei iepuri, numerotaţi de la 1 la 3. Implantare aliaj Mg-1Ca în ţesut osos

(mare trohanter femural) şi în ţesut muscular (musculatură coapsă). Follow up 6 săptămâni.

- lotul 2 – patru iepuri, numerotaţi 4,5,6 şi 7. Acest lot a fost împărţit în două subloturi,

în funcţie de perioada de follow-up. Sublot A iepure 4 şi 5, follow-up 6 săptămâni. Sublot B,

iepure 6 şi 7, follow-up 12 săptămâni. În ambele subloturi se va practica implantare în ţesut

osos (centromedular tibie), aliaj Mg-1Ca şi contralateral, oţel austenitic.

- lotul 3 – trei iepuri, numerotaţi 8, 9 şi 10. Implantare aliaj Mg-1Ca în ţesut osos

(centromedular tibie) la nivelul căruia s-a practicat o fractură experimentală. Follow-up 6

săptămâni (perioada fiziologică de consolidare a fracturii)

13.5.3 Date implanturi

Implanturi fabricate din aliaj Mg-1Ca, forma turnata, produse în Laboratorul de

elaborare aliaje speciale, Facultatea de ştiinţă şi inginerie a materialelor, Universitatea

Politehnică Bucureşti. Aliajul prezintă în compoziţia să magneziu 99 % wt şi calciu 1 % wt.

densitatea aliajului este de 1,78 g/cm3. Au fost utilizate două tipuri de implanturi,

paralelipipedice şi implanturi cilindrice ascuţite la un capăt, tip pini. Că probe martor am utilizat

implanturi fabricate din aliaj oţel austenitic, produs de Raajratna, Metal Industries India.

13.5.4 Proceduri preoperatorii:

Pentru a diminua stresul animalului în timpul procedurilor preoperatorii, acesta este

sedat utilizând DormitorR, în concentraţie de 1 mg/ml. Subiecţii au fost evaluati radiologic,

pentru fiecare animal fiind realizate radiografii ale membrelor inferioare, în două incidente,

antero-posterioară şi lateral. Radiografiile preoperatorii sunt necesare pentru evaluarea

situsurilor osoase de implantare cât şi ca punct de plecare pentru follow up-ul radiologic.

Au fost recoltate probe sanguine, testele sanguine fiind necesare pentru evaluarea

posibilului efect hemolitic al aliajului Mg-1Ca, posibilele interferenţe cu procesele de coagulare,

modificările probelor inflamatorii şi ale ionogramei, afectarea funcţiei organelor vitale, rinichi,

ficat.

Pentru profilaxia infecţioasă am utilizat antibioterapie preoperatorie care a constat în

administrarea unei doze de Enrofloxacin (Boytril 5%), în doză de 10 mg/kgC. Calea de

administrare a fost subcutanată.

13.5.5 Proceduri operatorii

Implanturile au fost sterilizate chimic prin metoda sterilizării cu oxid de etilenă. Metoda

a fost aleasă deoarece sterilizarea la autoclav, vapori sub presiune, va duce la oxidarea aliajului

Mg-1Ca, iar metodele de sterilizare termică tip etuva cu aer cald (Pupinel), pot induce

combustia aliajului. Am utilizat instrumentar specific ortopedic. Instrumente pentru disecţie

părţi moi şi instrumentar adresat ţesutului osos.

35

Tipul de anestezie ales a fost anestezie inhalatorie pe masca de uz veterinar, utilizând un

aparat de anestezie AEON-7400A. Agentul anestezic utilizat a fost reprezentat de Sevofluran.

Inducţia a fost realizată prin administrarea de Ketamină 20mg/KgC/SC.

Intervenţia chirurgicală a constat în proceduri diferite pentru fiecare lor în parte. Lot 1 –

implantare implant paralelipipedic Mg-1Ca, în ţesut osos (femur) şi în ţesut muscular

(musculatura coapsă) aşa cum reiese din figura 2 şi 3.

Figura 2. Implant osos Figura 3. Implant muscular

Lot 2 – implantare centromedulara, tibie proximala, implant cilindric aliaj Mg-1Ca, controlateral implant cilindric, otel austenitic, figura 4.

Lot 3 – Implantare centromedulara tibie proximala, implant cilindric aliaj Mg-1Ca.

Fractura experimentala diafiza tibiala, distal de tuberozitatea tibiala anterioara, figura 5.

Figura 4. Implant cilindric centromedular. Figura 5. Fractura experimentala

36

13.5.6 Proceduri postoperatorii

13.5.6.1 Antibioterapie şi terapie antalgică

Antibioterapia profilactică, a fost utilizată pe o perioadă de două zile post operator. Am

utilizat Enrofloxacin (Boytril 5 %), în doza de 5 mg/KgC/12 ore / SC. Durererea post operatorie a

fost controlată utilizând Meloxicam, în doza de 0,2 mg/KgC/24 ore/SC, pentru 3 zile.

13.5.6.2 Evaluare clinică

Au fost evaluate săptămânal starea generală (răspuns la stimuli) a iepurilor, curba

ponderala, mobilizarea, evoluţia locală inciziei operatorii. Semnele clinice au fost atent

monitorizate, conform recomandărilor FELASA. În acelaşi timp au fost urmărite zgomotele

emise de animal (vocalizare), mobilitatea animalului, postură şi evoluţia locală a inciziei

operatorii. Fiecare semn clinic a a primit un scor de gravitate conform recomandări FELASA,

astfel stabilind obiectivele umane ale studiului. Astfel o pierdere în greutate de 20 %,

echivalentul a 20 puncte, a fost considerat o degradare severă a stării animalului, fiind o

indicaţie pentru eutanasierea precoce a acestuia. Totodată, un scor cumulat al semnelor clinice,

cuprins între 35 şi 40 puncte, a fost considerat o degradare severă a stării animalului, fiind o

indicaţie pentru eutanasierea precoce a acestuia.

13.5.6.3 Evaluare paraclinică

Follow up-ul radiologic a fost de 6 săptămâni cu excepţia lotului 2, sublot B, la care a

fost de 12 săptămâni. Follow up-ul radiologic este necesar pentru a evidenţia resorbţia

implanturilor fabricate din aliaj Mg-1Ca, calitatea şi integritatea osului în care s-a făcut

implantarea şi evoluţia bulelor de gaz.

La 6 săptămâni post operator au fost recoltate probe sanguine. Parametrii sanguini cât

şi condiţiile de recoltare au fost similare cu cele realizate pre operator. Acest follow up este

necesar pentru a observa dacă în cadrul procesului de resorbţie al aliajului Mg-1Ca se produc

modificări ale hemoleucogramei (efect hemolitic sau inflamator cronic), ale ionogramei, ale

procesului de coagulare sau ale funcţiei organelor vitale (ficat, rinichi).

13.5.7 Eutanasie şi proceduri post eutanasie

13.5.7.1 Eutanasie

Eutanasia iepurilor s-a realizat la 6 săptămâni de la implantare cu excepţia lotului 2

sublot B, la care eutanasia a avut loc la 12 săptămâni. Animalele au fost iniţial anesteziate,

utilizând Ketamină, 20 mg/KgC. Eutanasia în sine, care a fost realizată prin injectarea de T61

(Etambutramida + Mebezonium Iodid + Tetracaina clorhidrica), în doza de 1 ml/IV.

37

13.5.7.2 Proceduri post eutanasie

Lot 1 - Ablaţie implanturi paralelipipedice aliaj Mg-1Ca, pentru analize de material.

Recoltare probe bioptice din ţesuturile adiacente implanturilor şi a bulelor de gaz pentru analiza

histopatologica. Ca proba martor a fost utilizat ţesut osos recoltat de la distanţă de implant.

Lot 2 - Recoltare în bloc jumătate proximala tibie, cu implantul inclus în piesa osoasă,

pentru examinare histopatologică. Analiza a fost realizată comparativ cu proba de ţesut osos în

care a fost implantat aliaj oţel austenitic

Lot 3 - recoltare în bloc jumătate proximala tibie, incluzând zona de formare a calusului

osos, cu implantul inclus în piesa osoasă, pentru examinare histopatologică.

Examinare histopatologică - a fost realizată cu ajutorul Clinicii de Anatomie Patologică,

Spitalul Universitar de Urgenţă Bucureşti si Laboratorul de Cercetare Institutul National de

Endocrinologie “C.I. Parhon”. Metoda de colorare pentru ţesutul muscular a fost Hematoxilina-

Eozina, iar pentru ţesutul osos Hematoxilina-Eozina, Van Gieson si Tricrome Masson. În cazul

probelor recoltate de la lotul 2 şi 3, examinarea s-a realizat cu implantul inclus în blocul osos

pentru implanturile din aliaj Mg-1Ca. Implantul din oţel austenitic a fost extras înaintea

examinării.

Analize structurale ale materialului - Testele de material au fost realizate în laboratorul

Fenomene de Interfață, Departamentul Știința Materialelor Metalice și Metalurgie Fizică,

Facultatea de Știința și Ingineria Materialelor, Universitatea Politehnică din București. Acestea

au constat în morfologia suprafeţelor, compoziţia elementelor, şi determinarea ratei de

coroziune în vivo. Morfologia suprafeţelor a fost obţinută prin microscopie electronică de

baleiaj (SEM). Analiza componentelor din aliajul Mg-1Ca a fost realizată prin metoda de

spectroscopie de raze X cu dispersie după energie (EDS - Energy Dispersive X-ray Spectroscopy),

aceasta permiţând să aflăm compoziţia chimică a suprafeţei probei de aliaj.

Determinarea ratei de coroziune in vivo am realizat-o prin metoda determinării pierderii

de greutate, utilizând probele paralelipipedice extrase de la lotul 1. Rata de coroziune şi

pierderea procentuală de masă au fost calculate după aceeaşi formulă ca şi în cazul testelor in

vitro.

38

13.4 Rezultate

13.6.1 Follow up radiologic

13.6.1.1 Lot 1

In figura 6 si 7, sunt prezentate imagini radiologice postoperatorii, implantul muscular si cel

osos fiind marcate cu cifra 1 respectiv 2.

Figura 6 Figura 7

Iepurele numărul 1, la care a fost implantat şi diafizar aliaj paralelipipedic a suferit o

fractură la 7 zile, implantul diafizar fiind extras pentru teste de material. Fractura a fost tratată

prin osteosinteză, figura 8 şi 9. Pentru ceilalţi subiecţi, la 6 săptămâni post op, se observă

resorbţia parţială a aliajului şi bule de gaz restante, muscular, figura 10.

39

Figura 8 Figura 9 Figura 10

13.6.1.2 Lot 2 A

Figurile 11 şi 12 prezintă implantul cilindric fabricat din aliaj Mg-1Ca, implantat centromedular la nivelul tibiei, iar figurile 13 şi 14 prezintă implantul cilindric fabricat din aliaj oţel austenitic, implantat centromedular la nivelul tibiei contralatelară, postoperator.

Figura 11 Figura 12 Figura 13 Figura 14

40

Figura 15 Figura 16 Figura 17 Figura 18

La 6 săptămâni se observă resorbţia parţială a implantului, pneumartroză redusă, şi zone

de condensare, mineralizare osoasă în jurul implantului din aliaj Mg-1Ca, figura 15 şi 16.

Implantul din oţel austenitic are aspect inert, în jurul său apărând zone transparente, posibil

osteoliză.

13.6.1.3 Lot 2 B

În cadrul lotului 2, până la 6 săptămâni, sublotul B prezintă o evoluţie asemănătoare cu

sublotul A. Diferenţele între cele două subloturi se observă odată cu evaluarea realizată la 8

săptămâni postoperator, când pneumartroza este resorbita iar implantul este degradat în

proporţie mai mare, figura 19 şi 20. La 12 săptămâni implantul este practic dezintegrat,

observându-se largi zone osoase condensate, de mineralizare, figura 21 şi 22.

Figura 19 Figura 20 Figura 21 Figura 22

41

13.6.1.4. Lot 3

În cadrul lotului 3 am practicat o fractură experimentală, parţială, distal de

tuberozitatea tibială anterioară, figura 23. Implantul cilindric fabricat din aliaj Mg-1Ca, a fost

introdus centromedular, având contact cu zona de fractură. La 6 săptămâni, implantul, este

parţial resorbit, dar forma se păstrează, bine definită. Se observă formarea calusului osos, la

nivelul fracturii experimentale, fig 24. Bulele de gaz, sunt prezente, dar cu un volum redus.

Figura 23 Figura 24 Figura 24 Detaliu

13.6.2 Evolutie clinică

13.6.2.1 Monitorizare greutate

Grafic 8. Lot 1 Grafic 9. Lot 2A

0

1000

2000

3000

4000

5000

Preop 2 Spt 4 Spt 6 Spt

Iepure 2 Iepure 1 Iepure 3

4000

4500

5000

5500

6000

Preop 2 Spt 4 Spt 6 Spt

Iepure 4 Iepure 5

42

Grafic 10. Lot 2B Grafic 11. Lot 3

Pierderea maximă admisă a fost de 20% din greutatea iniţială. În cadrul lotului 1 pierderea maximă de greutate, a fost de 9,75%, înregistrată în cazul iepurelui cu nr 1, la 4 săptămâni post operator. În cadrul lotului 2A pierderea maximă de greutate, a fost de 13,15 %, în cazul iepurelui cu nr 4, la 4 săptămâni. În cadrul lotului 2B pierderea maximă de greutate, a fost de 10 %, în cazul iepurelui cu nr 6, la 2 şi la 4 săptămâni. În cadrul lotului 3 pierderea maximă de greutate, a fost de 10,52 %, înregistrată în cazul iepurelui cu nr 10, la 2 săptămâni post operator.

13.6.2.2 Monitorizare scor clinic

Valoarea maximă admisă a scorului, cumulat al semnelor clinice, a fost între 35 şi 40

puncte. În cadrul lotului 1, scorul maxim înregistrat, a fost de 15 puncte, în cazul iepurelui nr 1.

În cadrul lotului 2A, scorul maxim înregistrat, a fost de 15 puncte, în cazul iepurelui 4 la 2

săptămâni. În cadrul lotului 2B, scorul maxim înregistrat, a fost de 15 puncte, în cazul iepurelui

6 la 2 săptămâni. Valorile maxime ale scorurilor clinice, calculate pentru toţi subiecţii, au

reprezentat maxim 43 % din valorile maxim admise (35 – 40 puncte). Nu am înregistrat

dehiscentă de plagă, în nici un caz.

13.6.3 Monitorizare teste sanguine

Evoluţia valorilor medii ale magneziului şi calciului seric preoperator şi la 6 săptămâni,

sunt prezentate în graficele următoare. Nu se înregistrează diferenţe semnificative statistic,

p – 0,285 respectiv p-0,799.

5800

6000

6200

6400

6600

6800

7000

7200

Preop 2 Spt 4 Spt 6 Spt 9 Spt 12 SptIepure 6 Iepure 7

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Preop 2 Spt 4 Spt 6 Spt

Iepure 8 Iepure 9 Iepure 10

43

Grafic 12. Evolutie magneziu Grafic 13. Evolutie calciu

Grafic 14. Evolutie numar eritrocite Grafic 15. Evolutie hematocrit

Graficul 14, prezintă evoluţia numărului hematiilor, înregistrând o uşoară creştere, de

2,7 % între valorile medii preoperatorii şi cele la 6 săptămâni. Hematocritul înregistrează o

creştere de 1,34 %, grafic 15. În ambele valorile se încadrează în valorile normale caracteristice

speciei.

În cazul studierii evoluţiei probelor funcţionale renale am înregistrat în cazul ureei, o

valoare medie preoperator uşor crescută faţă de valoarea normală, 24,09 mg/dL comparativ cu

23,50 mg/dL, dar la 6 săptămâni am înregistrat o valoare medie de 23,35 mg/dL, valoare care se

încadrează în limitele normale, fiziologice ale speciei. Creatinina înregistreaza o valoare medie

preoperator de 0,73 mg/dL şi de 0,74 mg/dL la 6 săptămâni, ambele valori fiind încadrate în

intervalul valorilor normale.

În cazul probelor funcţionale hepatice, ALT cât şi AST înregistrează valori medii

preoperator şi la 6 săptămâni, în intervalul valorilor normale, fiind de 25,8 UI la 23,2 UI pentru

ALT şi de 23, 3 UI la 24,8 pentru AST.

44

În cazul evaluării probelor de coagulare remarcăm atât pentru numărul trombocitelor, grafic 16 cât şi pentru valoarea timpului de protrombina, grafic 17, o creştere minoră, în limitele normale ale speciei.

Grafic 16. Numar trombocite Grafic 17. Valori timp protrombina

În cazul evoluţiei numărului de leucocite şi a valorilor fibrinogenului, valorile medii

înregistrate pre operator cât şi cele de la 6 săptămâni se încadrează în valorile normale speciei,

indicând absenţa fenomenelor inflamator infecţioase.

13.6.4 Rezultate histopatologice

4.6.4.1 Lot 1.

Figura 25. Figura 26.

Figura 25 prezintă ţesut muscular aflat în contact cu implantul din aliaj Mg-1Ca,

secţiunea înglobând şi bule de hidrogen. Fibrele musculare au aspect viabil cu formă şi coloraţie

normal şi cu nuclei vizibili în secţiune. Figura 26 prezintă ţesut osos şi produşi de coroziune

restanţi, aflaţi în contact direct cu suprafaţa osoasă. Ţesutul osos are aspect normal, cu celule

45

viabile, nuclei celulari fiind vizibili în secţiune, aspectul fiind similar cu cel al probei martor de

ţesut osos, recoltat de la distant de implant, figura 27

Figura 27

13.6.4.2 Lot 2 A

Figura 27 Figura 28

Figura 27 şi 28 prezintă secţiuni de ţesut osos cu aspect normal, în relaţie directă cu

aliajul Mg-1Ca. Se observă celule osoase viabile, interfaţa os-aliaj fără ţesuturi interpuse,

aderenta fiind aşa de mare încât la tăierea secţiunii aliajul s-a rupt în srtuctura sa şi nu la

interfaţa cu osul. Se observă şi linii osoase paralele cu interfaţa, linii de mineralizare, semn de

activitate osoasă.

46

Lot 2 B

Figura 29 Figura 30

Secţiunile prezentate în figură 29, coloraţie hematoxilina-eozina şi figura 30, coloraţie

van Gieson, prezintă aliajul într-o stare mai avansată de degradare, dar aderent în mod direct

de suprafaţa osului. Acesta are structură normală, cu dispoziţie în osteoni circulari şi celule

viabile. Se remarcă şi în acest caz liniile de mineralizare, semn de activitate osoasă.

Pentru a evidenţia activitatea celulară şi viabilitatea ţesutului osos din proximitatea

implantului de aliaj Mg-1Ca, am realizat secţiuni colorate Tricrome Masson, aşa cum este

prezentat în figură 31, realizată la magnitudine 20X40. Se evidenţiază celulele osoase viabile, cu

nucleu intracitoplasmatic. În secţiune se observă fibre de colagen, colorate în albastru, dispuse

atât pericelular cât şi în masă osoasă, semn de activitate osteoblastica. În imediata apropiere a

implantului, ţesutul osos este dispus în linii paralele, în timp ce la distanţă, prezintă dispoziţie

normală, circulară, în osteoni, aceasta demonstrând formarea de os nou la interfaţa cu aliajul

Mg-1Ca.

Figura 31. Tesut osos si aliaj Mg- 1Ca 12 saptamani, Tricrome Masson

47

Figura 32 prezintă ţesutul osos, viabil, după extragerea implantului din oţel austenitic. La

interfaţa cu implantul se remarcă celule de tip condroblast, semnificând, lipsa osteointegrării

implantului.

Figura 32. Tesut osos – implant otel austenitic

13.6.4.4 Lot 3

În cadrul lotului 3, la 6 săptămâni postoperator, după observarea radiologică a formării

calusului în focarul de fractură experimentală, am recoltat probe bioptice de la nivelul calusului.

Examinarea histopatologică confirma existenţa procesului de reparare osoasă, căluş, la nivelul

fracturii produse în imediata apropiere a implantului de aliaj Mg-1Ca. Figurile 33 şi 34 prezintă,

în coloraţie Hematoxilina-Eozina, o imagine de ansamblu a calusului osos, respectiv o imagine

de detaliu, în care se observă ţesutul osos cu dispoziţie neuniformă, zone de remodelare,

osteoblaste viabile, cu nucleu prezent intracitoplasmatic şi zone cartilaginoase cu condroblaste

cu nuclei vizibili intracitoplasmatic.

Figura 33. Calus osos Figura 34. Calus osos, remodelare

48

13.6.4.5 Organe vitale

Organele vitale, plaman (figura 35), rinichi (Figura 36), ficat (figura 37), au aspect si structura normal, la examinarea histopatologica

Figura 35 Figura 36 Figura 37

13.6.5 Analize de material aliaj Mg-1Ca

13.6.5.1 Determinarea ratei de coroziune in vivo prin metoda pierderii in greutate

Tabel 2. Valorile ratei de coroziune obtinute din probele extrase din lotul 1

Nr crt. implant

Tesut de implantare

Greutate initiala (g)

Greutate finala (g)

Diferenta greutate

(g)

Arie proba expusa (cm2)

Rata de coroziune (mm/an)

1 Os 0,1318 0,0978 0,0340 1,22 1,36

2* Os 0,1627 0,1622 0,0005 1,29 0,113

3 Muschi 0,1468 0,1240 0,0228 1,26 0,883

4 Os 0,1301 0,0949 0,0352 1,26 1,35

5 Muschi 0,1402 0,1282 0,0120 1,24 0,472

6 Os 0,1305 0,0985 0,0320 1,17 1,33

7 Muschi 0,1319 O,1129 0,0190 1,22 0,755

49

13.6.5.2. Comparare rata de coroziune în vitro – în vivo

Analiza statistică a diferenţelor dintre rata de coroziune în vitro, SBF şi Dulbecco şi rata

de coroziune in vivo ţesut osos şi muscular, arata o diferenţă majoră, semnificativă statistic,

p - 0,025 respectiv p - 0,020

Grafic 18. Diferente rată coroziune in vitro vs in vivo

Test Statisticsa

rata de coroziune

Mann-Whitney U ,000

Wilcoxon W 6,000

Z -2,236

Asymp. Sig. (2-tailed) 0,025

Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] ,036b

a. Grouping Variable: categorii rata coroziune (1=rata coroziunesbf; 2=rata coroziunedulbecco;

3=rata coroziune in vivo os; 4=rata coroziune in vivo muschi)

b. Not corrected for ties.

13.6.5.3 Caracterizare structurală probe aliaj Mg-1Ca

Caracterizarea structurală prin SEM, a evidenţiat caracterul degradabil al aliajului şi

formarea produşilor de coroziune la suprafata acestuia. Analiza EDS, a evidenţiat compoziţia

aliajului, cât şi a identificat compuşi din structura fosfaţilor de calciu şi ai hidroxiapatitei,

confirmând formarea acestora la suprafaţa aliajului

50

.

Figura 38. SEM aliaj Mg-1Ca Figura 39. EDS aliaj Mg-1Ca

13.7. Discuţii

Studiul prezent, in vivo, a urmărit evaluarea biocompatibilitatii unui aliaj binar Mg-1Ca.

Am investigat efectele locale asupra viabilităţii celulare şi efectele sistemice produse în timpul

resorbţiei aliajului. Totodată am investigat capacitatea de osteointegrare a implantului. Pentru

aceasta am urmărit radiologic evoluţia implantului şi a osului adiacent, am realizat teste

sanguine şi secţiuni histologice.

Imaginile radiologice au evidenţiat degradarea treptată a implantului fabricat din aliaj

Mg-1Ca, până la 12 săptămâni când aliajul este dezintegrat. Ţesutul osos prezintă zone opace,

de osteocondensare în regiunea adiacenta implantului, asociate unui proces de mineralizare.

Nu s-au identificat linii radiotransparente la interfaţa os implant, care să sugereze un proces

osteolitic local sau dezvoltarea de ţesut fibro-cartilaginos la interfaţa os implant.

Bulele de gaz sunt vizibile în jurul implantului, în special în jurul celor implantate

intramuscular. Acumularea hidrogenului la nivelul ţesutului osos este limitată, eliberarea

făcându-se preponderent către articulaţie, pneumartroza. În imaginile radiologice obţinute în

cadrul lotului 3, observăm formarea calusului osos, la nivelul fracturii experimentale, încă de la

3 săptămâni postoperator, la 6 saptamani fractura fiind vindecată.

În timpul studiului am realizat o monitorizare atentă a stării de sănătate a animalului

pentru a evalua dacă procesul de resorbţie al aliajului Mg-1Ca are răsunet asupra stării clinice a

animalului. Pierderea de greutate maxim admisă de obectivele umane ale studiului, a fost de

20%. În cadrul lotului 1, unde au fost introduse implanturi de dimensiuni mici, se observă o

diminuare redusă a greutăţii, cu excepţia subiectului 1, scădere indusă de stresul fracturii şi a

reintervenţiei chirurgicale. Lotul 2 şi 3 prezintă scădere maximă, la 2 săptămâni, aceasta fiind în

51

concordanţă cu dezvoltarea pneumartrozei. Monitorizarea scorului clinic FELASA are o evoluţie

asemănătoare cu cea a greutăţii. Valoarea maxim admisă a fost de 35 puncte. Scorul maxim

atins a reprezentat 43% din scorul maxim admis Valorile crescute sunt în relaţie cu dezvoltarea

pneumartrozei sursa de discomfort fizic. Plăgile operatorii au prezentat o evoluţie bună,

neînregistrând dehiscente de plagă.

Eliberarea de magneziu şi calciu din aliaj în timpul procesului de coroziune nu a dus la

modificări patologice ale valorilor serice ale celor doi ioni. Potenţialul efect hemolitic produs în

timpul coroziunii aliajului Mg-1Ca nu este confirmat de datele obţinute în urma analizei

hemogramei. Nivelul hematiilor înregistrează o valoare medie la 6 săptămâni post implantare în

creştere faţă de valoarea medie iniţială, în toate cazurile studiate. Hemoglobina şi hematocritul

se încadrează la 6 săptămâni în valorile normale, specifice speciei. Funcţia renală şi hepatica nu

sunt influenţate în timpul procesului de coroziune, fapt susţinut de evoluţia valorilor ureei,

creatininei şi ale transaminazelor, încadrate la 6 săptămâni, în limitele normale. În mod similar,

ipoteza inhibării procesului de coagulare în timpul coroziunii aliajului Mg-1Ca, nu a fost

confirmată de datele obţinute prin analiza coagulogramei.

Examinarea histologică reprezintă un important element în determinarea

biocompatibilitatii aliajului Mg-1Ca. Ţesutul muscular din vecinătatea bulelor de gaz şi a

implantului din aliaj Mg-1Ca are aspect normal, viabil. În mod similar, probele de ţesut osos, în

contact cu implantul din aliaj de magneziu, prezintă un aspect normal, cu celule viabile, şi

dispoziţie în osteoni. Liniile de mineralizare de la interfaţa cu implantul sunt un indicator de

activitate osoasă.

În ceea ce priveşte capacitatea de osteointegrare şi osteoconductivitate a implantului

considerăm că rezultatele obţinute sunt pozitive. La interfaţa os aliaj Mg-1Ca sau chiar şi la

interfaţa os produşi de coroziune (lot 1), se observă aderenta directă a osului la suprafaţa

aliajului. Nu se identifica ţesut fibros sau cartilaginos interpus, osul neprezentând modificări

condroblastice la interfaţa. Liniile de mineralizare osoasă prezente în apropierea interfatei os

aliaj, sugerează faptul că procesul de formare osoasă nu este interupt, demonstrând caracterul

osteoconductiv al aliajului Mg-1Ca.

Viabilitatea ţesutului osos şi activitatea celulară, osrteoblastica este confirmată şi de

secţiunile colorate Tricrome Masson, care prezintă fibre de colagen în jurul celulelor osoase, dar

şi în masa osoasă, acestea fiind semne de activitate osteoblastică.

Secţiunile histologice realizate din probele recoltate din zona de fractură adiacentă

implantului din aliaj Mg-1Ca, confirmă formarea calusului osos, fiind evidenţiate zone de

osificare encondrală, os nou format cu dispoziţie dezordonată, zone de remodelare osoasă, în

care sunt identificate multe osteoclaste şi osteoblaste viabile.

52

La nivelul parenchimului organelor examinate, plămân, rinichi, ficat, nu se identifică

modificări patologice toate structurile identificate având aspect normal.

În ceea ce priveşte calculul ratei de coroziune în vivo, prin metoda pierderii în greutate,

am remarcat o rată de coroziune mai lentă în cazul aliajului implantat în ţesut muscular, valori

comparativ cu aliajul implantat în ţesutul osos, fapt care poate fi explicat prin prezenta lamei de

ţesut fibros la interfaţa cu aliajul şi prin metabolismul mai acid al ţesutului muscular. Rata de

coroziune în vivo, este mult mai lentă decât rata de coroziune în vitro. Analiza statistică a

decelat diferenţe semnificative statistic atât la compararea ratelor de coroziune în vivo cu SBF,

p – 0,025 cât şi cu Dulbecco, p – 0,020.

13.7. Concluzii studiu în vivo

Aliajul Mg-1Ca prezintă capacitatea de biodegradare, dezintegrându-se odată cu

trecerea timpului în compuşi care sunt resorbiţi de organism.

În timpul resorbţiei nu induce fenomene toxice locale sau sistemice. Nu modifica

structura sau viabilitatea ţesuturilor în care este implantat, muşchi sau os. Procesul de

biodegradare al aliajului Mg-1Ca nu interfera cu procesul biologic de formare a ţesutului osos,

permiţând formarea calusului osos în focarul de fractură, într-o perioadă de timp normală.

Procesul de resorbţie al aliajului Mg-1Ca nu are efect hemolitic sau de blocare a

procesului de coagulare. Eliberarea de magneziu şi calciu din aliaj nu produce modificări

patologice ale valorilor serice ale acestor ioni.

Procesul de resorbţie nu afectează major starea clinică generală a animalelor studiate.

Stresul temporar este legat de intervenţia chirurgicală şi de dezvoltarea bulelor de gaz în

ţesuturi, în special de formarea pneumartrozei, dar care este un fenomen temporar.

Metabolismul tisular local influenţează procesul de coagulare, ipoteza sugerată de

diferenţa înregistrată între rata de coroziune a implantului intramuscular şi a celui intraosos.

Rata de coroziune in vivo este semnificativ mai redusă decât rata in vitro, indiferent de mediul

utilizat.

Aliajul bioresorbabil Mg-1Ca prezintă capacitatea de osteointegrare, osul adiacent fiind

direct aderent la suprafaţa aliajului. Totodată prezintă capacitatea de osteoconductivitate, osul

dezvoltându-se pe suprafaţa implantului

14. Concluzii finale

Aliajul Mg-1Ca studiat respecta cerinţele de biocompatibilitate, fiind alcătuit din două

elemente netoxice, prezente în mod natural în corpul uman, cu rol important în metabolismul

osos.

53

Rata de coroziune crescută şi emisia de hidrogen în timpul resorbţiei reprezintă

principalele motive de îngrijorare atunci când luăm în considerare utilizarea aliajului Mg-1Ca în

aplicaţii medicale ortopedice. Elementele de aliere, tratamentele secundare termice sau

mecanice influenţează major relaţia dintre microstructură şi proprietăţi ducând la modificări

semnificative ale proprietăţilor mecanice, rezistenţei la coroziune şi ale emisiei de hidrogen.

Luând în considerare cele menţionate mai sus, în studiul doctoral am utilizat un aliaj

binar Mg-1Ca în formă turnata, scopul principal fiind observarea modului în care răspunde un

organism viu în contact cu materialul de bază. Menţionez că acest studiu reprezintă o noutate

în cercetarea materialelor resorbabile din clasa aliajelor binare magneziu calciu, în acest

moment în ţara noastră neexistând date despre comportamentul în vivo al acestor aliaje.

Aliajul Mg-1Ca induce alcalinizarea mediului de cultura în timpul resorbţiei, iar ph-ul

alcalin influenţează direct procesul de coroziune, la valori crescute permiţând formarea şi

stabilizarea straturilor protectoare. Alcalinizarea mediului de cultură până la valori de

9,12-10,36 poate induce fenomene de citotoxicitate prin blocarea unor mecanisme metabolice

dependente de Ph.

Aliajul Mg-1Ca poate forma bule de gaz în ţesuturile adiacente, rata de emisie a

hidrogenului în mediul de coroziune în vitro fiind mai mare decât rata fiziologică de adsorbţie a

organismului uman.

Mediile complexe cu conţinut proteic, tip Dulbecco, oferă o rată de coroziune şi o emisie

de hidrogen redusă comparativ cu mediile simple tip SBF, susţinând astfel ipoteza formării

filmului proteic protector la suprafaţa aliajului.

Viabilitatea celulară poate fi influenţată de concentraţia ionilor rezultaţi în urma

procesului de coroziune al aliajului Mg-1Ca.

Aliajul Mg-1Ca este un material cu proprietatea de bioresorbtie, aceasta producându-se

în ţesuturile vii prin biodegradare.

Aliajul Mg-1Ca nu induce în vivo, fenomene de citotoxicitate locală, viabilitatea

ţesuturilor adiacente implantului fiind normală.

Aliajul Mg-1Ca, prin produşii eliberaţi sistemic în timpul procesului de coroziune, nu

induce fenomene de toxice sistemice (hemoliză, inhibare proces coagulare, modificări

ionogramă) sau modificări patologice ale funcţiei organelor vitale

Bulele de gaz rezultate în urma eliberării de hidrogen au un caracter temporar, emisia

de hidrogen sub formă de gaz, putând fi o sursă de discomfort şi durere, în special în cazul

eliberării intraarticulare. Hidrogenul eliberat intratisular nu are efect toxic local, neinducand

necroza tisulară, disecţia planurilor anatomice sau vindecarea tardivă a plăgilor operatorii şi nici

nu produce fenomene de embolie gazoasă, în organele vitale.

54

Studiul în vivo demonstrează capacitatea de osteointegrare a aliajului Mg-1Ca, osul

adiacent fiind aderent la suprafaţa implantului, fără a exista ţesut fibrocartilaginos la intefata os

aliaj. Aliajul Mg-1Ca prezintă capacitatea de osteoconductivitate, ţesutul osos dezvoltându-se

pe suprafaţa implantului, la interfaţa os aliaj avad loc procese de mineralizare, cu osteocite

viabile incluse în zone de mineralizare.

Aliajul Mg-1Ca, nu inhiba procesul de formarea a ţesutului osos, permiţând formarea

calusului într-o perioadă de timp normală.

Consider că implanturile fabricate din aliaj bioresorbabil Mg-1Ca îşi pot găsi

aplicabilitate în patologia piciorului, rata de vindecare osoasă şi cerinţele biomecanice ale

acestui segment facilitând utilizarea implanturilor fabricate din acest aliaj.

Astfel că o concluzie finală a studiului doctoral pot spune că aliajul Mg-1Ca s-a dovedit a fi

- Sigur, având un grad crescut de biocompatibilitate

- Prezintă capacitate de osteointegrare şi osteoconductivitate

- Fără efecte toxice locale sau la distanţă

- Toate ipotezele privind efectele toxice ridicate de studiile în vitro din

literatură au fost infirmate

- Cu o rezistenţă la coroziune in vivo net superioară celei in vitro

- O soluţie promiţătoare, de viitor, pentru chirurgia ortopedică

15, Direcţii de continuare a cercetării

Dezvoltarea viitoare a cercetării se va realiza în două direcţii principale

A) Dezvoltarea şi testarea unor aliaje Mg-1Ca superioare din punct de vedere tehnologic

B) Utilizarea unor noi metode de evaluare a biocompatibilitatii

A . Dezvoltarea şi testarea unor aliaje Mg-1Ca superioare din punct de vedere

tehnologic

Pentru o mai buna corelare a datelor obţinute în urma studiilor cu cerinţele reale ale

implanturilor ortopedice este necesară testarea unor aliaje prelucrate secundar termic sau

mecanic. Prin aceste procedee putem obţine rafinarea granulelor aliajului aceasta ducând la

obţinerea unor proprietăţi mecanice superioare, rezistenta la tracţiune putând fi îmbunătăţită

cu până la 300 %.

55

Totodată procesul de rafinare al granulelor poate duce la o rata diminuată de coroziune

cu menţinerea proprietăţilor mecanice mai mult timp, şi la o eliberare minimă de hidrogen

O altă metodă de dezvoltare tehnologică a aliajelor Mg-1Ca este reprezentată de

modificările de suprafaţă, în această direcţie putând studia acoperiri cu hidroxiapatita sau cu

biosticla. Acestea vor duce la îmbunătăţirea rezistenţei la coroziune şi a biocompatibilitatii

B . Utilizarea unor noi metode de evaluare a biocompatibilitatii

Una din metodele de evaluare a probelor histologice pe către dorim să le utilizăm în

studiile viitoare, este analiza µCT. Aceasta realizează o analiză tridimensională a specimenului.

Astfel vom pute obţine informaţii despre distribuţia spaţială a osului nou format şi relaţia

acestuia cu implantul, imaginile obţinute având o rezoluţie de 1-10 µm.

Histomorfometria osoasă computerizată reprezintă o altă opţiune viitoare de studiu.

Aceasta reprezintă o metodă de cuantificare a viabilităţii celulare şi a formării de os nou la

interfaţa os aliaj, utilizând probe osoase nedecalcifiate.

Formarea osoasă la interfaţa os implant poate fi determinată prin metoda de marcare

fluorescenta cu tetraciclina, analiza realizându-se tot pe probe osoase nedecalcifiate

Scopul final al acestei dezvoltări a cercetării caracteristicilor biomaterialelor

reprezentate de aliajul resorbabil Mg-1Ca, este obţinerea aprobărilor Agenţiei Naţionale a

Medicamentului pentru evoluarea către studii clinice , pe subiecţi umani.

56

Bibliografie

1) Adrian Barbilian; Note de Curs ORTOPEDIE-TRAUMATOLOGIE; Editura ANAMAROL, Bucureşti, 2015, pg 243-250

2) Manoj Gupta and Ganesh Kumar Meenashisundaram; Insight into Designing Biocompatible

Magnesium Alloys and Composites Processing, Mechanical and Corrosion Characteristics;

Springer Singapore Heidelberg New York Dordrecht London Library of Congress, 2015, pg 4-5,

77-79, 38-45, 90-105

3) K. Chang, M.-L. Guo, R. Kong, C.Y. Tsao, J. Huang, J. Jang; Mg–Cu–Gd layered composite plate

synthesized via the spray forming process; Mater. Sci. Eng. A 477 , pg 58–62

4) H.Z. Ye, X.Y. Liu; Review of recent studies in magnesium matrix composites; J. Mater. Sci. 39, pg

6153–6171

5) Yuan, H., De Groot, K., NATO Science Series II: Mathematics, Physics and Chemistry,Springer

Netherlands, 171, 2005, pg 37-57

6) F. Witte, F. Feyerabend, P. Maier, J. Fischer, M. Störmer, C. Blawert, W. Dietzel, N. Hort;

Biodegradable magnesium–hydroxyapatite metal matrix composites; Biomaterials 28 , 2007, pg

2163–2174

7) Gérrard Eddy, Jai Poinern, Sridevi Brundavanam, Derek Fawcett; Biomedical Magnesium Alloys: A Review of Material Properties, Surface Modifications and Potential as a Biodegradable Orthopaedic Implant; American Journal of Biomedical Engineering 2(6), 2012, pg 218-240

8) Catherine G. Ambrose, T. Clanton; Bioabsorbable Implants: Review of Clinical Experience in Orthopedic Surgery; Annals of Biomedical Engineering, Vol. 32, No. 1, January 2004 , pg 171–

177

9) Rongchang Zeng, Frank Witte, Norbert Hort; Progress and Challenge for Magnesium Alloys as Biomaterials; ADVANCED ENGINEERING MATERIALS, August 2008

10) Bostman, O. M., and H. K. Pihlajamaki; Adverse tissue reactions to bioabsorbable fixation

devices; Clin. Orthop., 2000, pg 216–227

11) Tuompo, P., E. K. Partio, H. Patiala, K. Jukkala-Partio, E. Hirvensalo, and P. Rokkanen; Causes

of the clinical tissue response to polyglycolide and polylactide implants with an emphasis on the

knee; Arch. Orthop. Trauma Surg. 121, 2001, pg 261–264

12) Burkart, A., A. B. Imhoff, and E. Roscher; Foreign-body reaction to the bioabsorbable suretac device; Arthroscopy 16, 2000 pg 91–95

13) Bach, F. D., R.Y. Carlier, J. B. Elis, D. M. Mompoint, A. Feyday, O. Judet, P. Beaufils, and C.

Vallee; Anterior cruciate ligament reconstruction with bioabsorbable polyglycolic acid

interference screws: MR imaging follow-up; Radiology 225, 2002, pg 541–550

14) Cummings, C. A., S. Strickland, R. C. Appleyard, Z. L. Szomor, J. Marshall, and G. A. C. Murrell;

Rotator cuff repair with bioabsorbable screws; an in vivo and ex vivo investigation; Arthroscopy

19, 2003, pg 239–248

15) Ellerman, A., R. Siebold, J. U. Buelow, and C. Sobau; Clinical evaluation of meniscus repair with a bioabsorbable arrow: A2- to 3-year followup study; Knee. Surg. Sports Traumatol. Arthrosc. 10,2002, pg 289–293

57

16) M. Gupta, W. Wong; Enhancing overall mechanical performance of metallic materials using two-

directional microwave assisted rapid sintering; Scripta Mater. 52, 2005, pg 479–483

17) Seelig MG; A study of magnesium wire as an absorbable suture and ligature material; Arch Surg;8(2), 1924, pg 669–80

18) Lambotte A; L’utilisation du magnesium comme materiel perdu dans l’osteosynthese; Bull Me´m

Soc Nat Chir, 28, 1932 pg 1325–34.

19) D. McBride; Magnesium screw and nail transfixion in fractures; Southern Medical Journal, 1938,

pg 508-514

20) F. Witte; The history of biodegradable magnesium implants: A review ; Acta Biomaterialia 6, 2010, pg 1680–1692

21) P. Trumbo, S. Schlicker, A.A. Yates, M. Poos; Dietary reference intakes for energy, carbohydrate, fiber, fat, fatty acids, cholesterol, protein and amino acids; J. Am. Diet. Assoc. 102, 2002, pg 1621–1630

22) K.F. Farraro, K.E. Kim, S.L. Woo, J.R. Flowers, M.B. McCullough; Revolutionizing orthopaedic

biomaterials: the potential of biodegradable and bioresorbable magnesium-based materials for

functional tissue engineering; J. Biomech. 47 , 2014, pg 1979–1986

23) Mehdi Razavi, MohamadHosseinFathi,OmidSavabi and Mansour Boroni; A Review of degradation properties of Mg based biodegradable implants; Research and Reviews in Materials Science and Chemistry, Vol. 1, Issue 1, 2012, pg 15-58.

24) Okuma T; Magnesium and bone strength; Nutrition 17, 2001, pg 679–680 25) Davis KG, Marras WS et al; Evaluation of spinal loading during lowering and lifting; Clin Biomech

13(3), 1998, pg 141–152 26) X.N. Gu, Y.F. Zheng, Y. Cheng, S.P. Zhong, T.F. Xi; A study of alkaline heat treated Mg-Ca Alloy

for the control of the biocorrosion rate; Biomaterials 30, 2009, pg 484-498 27) Amit K Ghosh, Shashank R Joshi; Disorders of Calcium, Phosphorus and Magnesium

Metabolism; JAPI, VOL. 56, August 2008, pg 618 – 620

28) Da Silva, M. H. P., Lemos, A. F., da Fonte Fereira, J. M., Santos, J. D., Mat.Research, 6(3), 2003, pg 321-325

29) Oonishi, H., Clarke, I. C., Good, V., Amino, H., Ueno, M., Masuda, S., Oomamiuda,K., Ishimaru, H., Yamamoto, M., Tsuji, E.; Needs of bioceramics to longevity of total joint arthroplasty; Bioceramics 15, Trans Tech. Publications, Uetikon-Zurich, 2003, pg 735

30) Staiger M.P, Pietak A.M, Huadmai J, Dias G; Magnesium and its alloys as orthopedic biomaterials: a review; Biomaterials 27, 2006, pg 1728–1734.

31) Sankara Narayanan, Il-Song Park, Min-Ho Lee; Surface Modification of Magnesium and its Alloys for Biomedical Applications: Biological Interactions, Mechanical Properties and Testing; Elsevier 2015, pg 281-283; 222-239, 288-295, 160-165

32) Oprea F., Bacinschi Z; Magneziul și aliajele sale; In Tratat de Ştiinţa şi Ingineria Materialelor, volum 3, Saban R., Dumitrescu C., Editura AGIR, 2009, pg 834-852

33) Z. Li, X. Gu, S. Lou, Y. Zheng; The development of binary Mg–Ca alloys for use as biodegradable materials within bone; Biomaterials 29 , 2008, pg 1329–1344

34) McNulty RE, Hanawalt JD; Some corrosion characteristics of high purity magnesium alloys; J Electrochem Soc 81(1), 1942, pg 423

35) Nicholas Travis Kirkland and Nick; Magnesium Biomaterials Design, Testing, and Best Practice; Birbilis Springer Briefs in Materials, 2014, pg 74 – 82

36) Makar GL, Kruger J ; Corrosion of magnesium; Int Mater Rev 38(3), 1993, pg 138–153

58

37) Hui Zhang, Shun-Li Shang, Yi Wang, Long-Qing Chen, Zi-Kui Liu; Thermodynamic properties of Laves phases in the Mg-Al-Ca system at finite temperature from first-principles; Intermetallics 22, 2012, pg 17-23

38) Callister WD; Materials science and engineering, 7th ed.. Hoboken, NJ: John Wiley & Sons Inc., 2006

39) Zhang C, Huang X et al ; Electrochemical characterization of the corrosion of a Mg-Li alloy; Mater Lett 62(14), 2008, pg 2181–2184

40) Polmear IJ ; Light alloys: metallurgy of the light metals; 2nd edn. Hodder & Stoughton, Melbourne, 1989

41) Friedrich HE, Mordike BL; Magnesium technology–metallurgy, design data, applications; Berlin: Springer, 2006

42) Song L., Atrens A; Corrosion mechanisms of magnesium alloys; Adv. Eng. Mater. 1, 1999, pg 11-33.

43) Layrolle P, Daculsi G; Physiochemistry of apatite and its related calcium phosphates; In: Leon B, Jansen JA (eds) Thin calcium phosphate coatings for medical implants. Springer, New York, 2009

44) Yin G, Liu Z et al ; Impacts of the surface charge property on protein adsorption on hydroxyapatite; Chem Eng J 87(2), 2002, pg 181–186

45) Xiu Y C, Huo F, Tao H; Influence of aggressive ions on the degradation behavior of biomedical magnesium alloy in physiological environment; Acta Biomaterialia 4 (6); 2008, pg 15

46) Yamamoto A, Hiromoto S.; Effect of inorganic salts, amino acids and proteins on the degradation of pure magnesium in vitro; Materials Science and Engineering: C, 29, 2009, pg 1559–1568

47) Mueller WD, Lucia Nascimento M et al; Critical discussion of the results from different corrosion studies of Mg and Mg alloys for biomaterial applications; Acta Biomater, 6(5), 2010, pg 1749–1755

48) Seal CK, Vince K et al ; Biodegradable surgical implants based on magnesium alloys: a review of current research; In: IOP conference series: materials science and engineering: 01.2011

49) Zeng R, Dietzel W et al; Progress and challenge for magnesium alloys as biomaterials; Adv Eng Mater 10(8), 2008, pg B3–B14

50) Ohsawa, I., M. Ishikawa, K. Takahashi et al; Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals; Nature Medicine; 13 (6), 2007, pg 688–94

51) Ohno, K., M. Ito, M. Ichihara, and M. Ito; Molecular hydrogen as an emerging therapeutic medical gas for neurodegenerative and other diseases; Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2012, pg 353

52) Friedrich C. ; Reliable light weight fastening of magnesium components in automotive applications; Light Weight Magnesium Alloy Technology, 2001-2005, 2006, pp. 191-196

53) W. Yuan, S.K. Panigrahi, J.-Q. Su and R.S. Mishra ; Influence of grain size and texture on Hall–Petch relationship for a magnesium alloy; Scripta Materialia 65, 2011, pg 994–997

54) Zamfir S; Coroziunea materialelor metalice; E.D.P., Bucureşti, 1981 55) Yuan ZX, Jia J, Guo AM, Shen DD, Song SH; Cooling-induced tin segregation to grain

boundaries in a low-carbon steel; Scripta Mater, 48, 2003, pg 203–6 56) M.G. Fontana, N.D. Greene; Corrosion engineering; McGraw-Hill, New York, 1987 57) N. Winzer, A. Atrens, G. Song, E. Ghali, W. Dietzel, K.U. Kainer, N. Hort, C. Blawert; Stress

Corrosion Cracking of Magnesium; Advance Engineering Materials, Vol. 7, 2005, pg 659-693 58) T. Valente; Grain boundary effects on the behavior of WE43 magnesium castings in

simulated marine environment; Journal of Materials Scien ce Letters, Vol. 20, 2001, pg 67-69

59

59) Coy A.E. , Viejo F., Garcia-Garcia F.J., Liu Z., Skeldon P., Thompson G.E.; Effect of eximer laser surface melting on the microstructure and corrosion performance of die cast AZ91D magnesium alloy; Corros. Sci. 52 ,2010, pg 387-397

60) Fan, G. D., M. Y. Zheng, X. S. Hu, C. Xu, K. Wu, and I. S. Golovin; Improved mechanical property and internal friction of pure Mg processed by ECAP; Materials Science and Engineering, A 556, 2012 pg 588–94.

61) Yamashita, A., Z. Horita, and T. G. Langdo; Improving the mechanical properties of magnesium and a magnesium alloy through severe plastic deformation; Materials Science and Engineering, A 300 (1), 2001, pg 142–7.

62) Kaese V; Beitragzum korrosionsschützenden Legieren von Magnesiumwerkstoffen; Düsseldorf: VDI, 2002

63) Denkena, B., and A. Lucas; Biocompatible magnesium alloys as absorbable implant materials—Adjusted surface and subsurface properties by machining processes; CIRP Annals Manufacturing Technology 56 (1), 2007, pg 113–16

64) H. Wang, Y. Estrin, H. Fu, G. Song and Z. Zúberová;The effect of pre processing and grain structure on the bio corrosion and fatigue resistance of magnesium alloy AZ31; Adv. Eng. Mater., No 9, 2007, pg 967-972

65) Kirkland NT, Lespagnol J et al; A survey of bio-corrosion rates of magnesium alloys; Corros Sci

52(2), 2010, pg 287–291

66) Pil-Ryung Cha, Hyung-Seop Han, Gui-Fu Yang, Hyun-KwangSeok; Biodegradability engineering

of biodegradable Mg alloys: Tailoring the electrochemical properties and microstructure of

constituent phases; SCIENTIFIC REPORTS | 3 : 2367 | DOI: 10.1038/srep02367. Published

6 August 2013

67) Hornberger H., Virtanen S., Boccaccini A.R.; Biomedical coatings on magnesium alloys – A review; Acta Biomaterialia 8 , 2012, pg 2442–2455

68) Gray JE, Luan B; Protective coatings on magnesium and its alloys – a critical review; J Alloys Compd 336, 2002, pg 88–113

69) L. Xu, F. Pan, G. Yu, L. Yang, E. Zhang and K. Yang; In vitro and in vivo evaluation of the surface

bioactivity of a calcium phosphate coated magnesium alloy; Biomater. No 30, 2009, pg 1512-

1523.

70) Hiromoto S, Yamamoto A; High corrosion resistance of magnesium coated with hydroxyapatite directly synthesized in an aqueous solution; Electrochim Acta, 54, 2009, pg 7085–93

71) Müller L, Müller FA; Preparation of SBF with different HCO3 content and its influence on the composition of biomimetic apatites; Acta Biomater, 2, 2006, pg 181–9

72) Rettig R, Virtanen S; Composition of corrosion layers on magnesium rare earth alloy in simulated body fluids; J Biomed Mater Res Part A, 85(2), 2009, pg 359–69

73) Gray-Munro JE, Strong M; The mechanism of deposition of calcium phosphate coatings from solution onto magnesium alloy AZ31; J Biomed Mater Res Part A, 90(2), 2009, pg 339–50

74) Chiu KY, Wong MH, Cheng FT, Man HC; Characterization and corrosion studies of fluoride conversion coating on degradable Mg implants; Surf Coat Technol, 202, 2007, pg 590–8.

75) Carboneras M, Garcia-Alonso MC, Escudero ML.; Biodegradation kinetics of modified magnesium-based materials in cell culture medium; Corros Sci, 53, 2011, pg 1433–9

76) J. Li, Y. Song, S. Zhang, C. Zhao, F. Zhang, X. Zhang, L. Cao, Q. Fan and T. Tang; In vitro

responses of human bone marrow stromal cells to a fluoridated hydroxyapatite coated

biodegradable Mg-Zn alloy; Biomater. 31, 2010, pg 5782-5788.

60

77) F. Witte, J. Fischer, J. Nellesen et al.; In vivo corrosion and corrosion protection of magnesium alloy LAE442; Acta Biomaterialia, vol. 6, no. 5, 2010, pg 1792–1799

78) Blawert C, Dietzel W, Ghali E, Song G.; Anodizing treatments for magnesium alloys and their effect on corrosion resistance in various environments; Adv Eng Mater;8(6), 2006, pg 511–33

79) Schultze JW, Lohrengel MM; Stability, reactivity and breakdown of passive films: problems of recent and future research; Electrochim Acta, 45, 2000, pg 2499–513

80) Ismail KM, Virtanen S.; Electrochemical behavior of magnesium alloy AZ31 in 0.5 M KOH solution; Electrochem Solid-State Lett;10(3), 2007, pg C9–C11

81) Blawert C., Dietzel W., Ghali E., Song G.; Anodizing treatments for magnesium alloys and their effect on corrosion resistance in various environments; Adv Eng Mater, 8(6) 2006, pg 511–533

82) Li J N, Cao P, Zhang XN, Zhang SX, He YH.; In vitro degradation and cell attachment of a PLGA coated biodegradable Mg–6Zn based alloy; J Mater Sci, 45, 2010, pg 6038–45

83) Li L, Gao J, Wang Y.; Evaluation of cyto-toxicity and corrosion behavior of alkali-heat-treated magnesium in simulated body fluid; Surface and Coatings Technology, 185, 2004, pg 92–98

84) Lu P, Cao L, Liu Y, Xu X, Wu X. ; Evaluation of magnesium ions release, biocorrosion, and hemocompatibility of MAO/PLLA-modified magnesium alloy WE42.; Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials , 96B2011 pg 101–109

85) Jo J.H, Kang B.G, Shin K.S, Kim H.E, Hahn B.D, Park D.S, et al; Hydroxyapatite coating on magnesium with MgF(2) interlayer for enhanced corrosion resistance and biocompatibility; Journal of Material Science: Materials in Medicine , 22, 2011, pg 2437–2447

86) Witte F, Fischer J, Nellesen J, Crostackl H.A, Kaese V, Pisch A, et al; In vitro and in vivo corrosion measurements of magnesium alloys; Biomaterials ,27, 2006, pg 1013–1018

87) Allen D.M., Simpkins M., Almond H.; A novel photochemical machining process for magnesium aerospace and biomedical microengineering applications; Journal of Micromechanics and Microengineering, , Volume 20, Number 10, 2010, pg 501-510

88) Yufeng Zheng; Magnesium Alloys as Degradable Biomaterials; by Taylor & Francis Group, International Standard Book Number-13: 978-1-4987-6663-0 (EPUB); 2015, pg 37 – 51, 424-438

89) Nicholas Travis Kirkland and Nick Birbilis; Magnesium Biomaterials Design, Testing, and Best Practice; SpringerBriefs in Materials, 2014, pg 14 – 33

90) Z. Shi, A. Atrens; An innovative specimen configuration for the study of Mg corrosion; Corros. Sci. 53 , 2011, pg 226–246

91) Lorenz C, Brunner JG et al; Effect of surface pre-treatments on biocompatibility of magnesium; Acta Biomater 5(7), 2009, pg 2783–2789

92) Kirkland, N. Birbilis, J. Walker, T. Woodfield, G.J. Dias, M.P. Staiger; In-vitro dissolution of magnesium–calcium binary alloys: clarifying the unique role of calcium additions in bioresorbable magnesium implant alloys; J. Biomed. Mater. Res. B Appl. Biomater. 95 , 2010, pg 91–100

93) Ghali E ; Conventional and electrochemical methods of investigation. In: Corrosion resistance of aluminium and magnesium alloys: understanding, performance and testing; Wiley, Hoboken, 2010

94) Fischer, J., D. Pröfrock, N. Hort, R. Willumeit, and F. Feyerabend; Reprint of: Improved cytotoxicity testing of magnesium materials; Materials Science and Engineering: B 176 (20), 2011, pg 1773–7

95) Guan R.-G, Johnson I, Cui T, Zhao T, Zhao Z.-Y, Li X, et al. ; Electrodeposition of hydroxyapatite coating on Mg-4.0Zn-1.0Ca-0.6Zr alloy and in vitro evaluation of degradation, hemolysis, and cytotoxicity; Journal of Biomedical Materials Research Part A , 100A, 2012, pg 999–1015

96) American Society for Testing and Materials. ; Standard practice for assessment of hemolytic properties of materials ; ASTM F 756–00

61

97) Science Council of Japan; Guidelines for Proper Conduct of Animal Experiments; June 1, 2006,

pg 5-6

98) Erdmann, N., N. Angrisani, J. Reifenrath et al.; Biomechanical testing and degradation analysis of MgCa0.8 alloy screws: A comparative in vivo study in rabbits; Acta Biomaterialia 7 (3), 2011, pg 1421–8

99) Remennik, S., I. Bartsch, E. Willbold, F. Witte, and D. Shechtman.; New, fast corroding high ductility Mg-Bi-Ca and Mg-Bi-Si alloys, with no clinically observable gas formation in bone implants; Materials Science and Engineering B-Advanced Functional Solid-State Materials 176 (20), 2011, pg 1653–9

100) Willbold, E., K. Kalla, I. Bartsch et al.; Biocompatibility of rapidly solidified magnesium alloy RS66 as a temporary biodegradable metal.; Acta Biomaterialia 9 (10), 2013, pg 8509–17

101) Meisam Salahshoor and Yuebin Guo; Biodegradable Orthopedic Magnesium-Calcium (MgCa) Alloys, Processing, and Corrosion Performance; Materials, 5, 2012, pg 135-155

102) L.J. Liu, M. Schlesinger; Corrosion of magnesium and its alloys; Corrosion Science, Vol. 51, 2009, pg 1733-1737

103) Kim W.C., Kim J.G., Lee J.I.; Influence of calcium on the corrosion properties of magnesium for biomaterials; Materials Letters, 62 (25), pg 4146-4148

104) Nan Li, Yufeng Zheng; Novel Magnesium Alloys Developed for Biomedical Application: A Review; J. Mater. Sci. Technol., 29(6), 2013, pg 489-502

105) Witte, F., Kaese, V., Haferkamp, H., Switzer, E., Linderberg, A.M., Wirth, C.J. & Windhagen, H.; In vivo corrosion of four magnesium alloys and the associated bone response; Biomaterials, 26, 2005, pg 3557

106) Harandi S.E., Idris M.H, Jafari H.; Effect of forging process on microstructure, mechanical and corrosion properties of Mg-1Ca alloy; Materials and Design 32 (5), 2011, pg 2596-2603

107) Koleini S., Idris M.H, Jafari H; Influence of hot rolling parameters on microstructure and biodegradability of Mg-1Ca alloy in simulated body fluid; Materials and Design 33, 2012pg 20-25

108) Kannan, M.B.; Raman, R.K.S; In vitro degradation and mechanical integrity of calcium containing magnesium alloys in modified simulated body fluid; Biomaterials, 29, 2008, pg 2306–2314

109) Zreiqat H, Howlett CR, Zannettino A, Evans P, Schulze-Tanzil G,Knabe C, et al. ; Mechanisms of magnesium-stimulated adhesion of osteoblastic cells to commonly used orthopaedic implants; J Biomed MaterRes, A62, 2002, pg 175-84.

110) Richard Harrison, Diana Maradze, Simon Lyons, Yufeng Zheng, Yang Liu; Corrosion of magnesium and magnesium–calcium alloy in biologically-simulated environment; Progress in Natural Science: Materials International, 24, 2014, pg 539–546

111) Feser, K.; Kietzmann, M.; Baumer, W.; Krause, C.; Bach, F.W. ; Effects of degradable Mg-Ca alloys on dendritic cell function; J. Biomater. Appl., 25, 2011, pg 685–697

112) A. Gefen, M. Megido-Ravid, Y. Itzchak, M. Arcan; Biomechanical analysis of the three-dimensional foot structure during gait: a basic tool for clinical applications; JOURNAL OF BIOMECHANICAL ENGINEERING, Vol. 122, 2000

113) Emmanuelle Stellet, Juliana Côrtes, Joyce Costa, Adriana Linhares, Gutemberg Alves;

Evaluation of Commercial Latex as a Positive Control for In VitroTesting of Bioceramics;

Key Engineering Materials (Volume 631), November 2014, pg 357-362.

114) AI Pearce, RG Richards, S Milz, E Schneider and SG Pearce; ANIMAL MODELS FOR

IMPLANT BIOMATERIAL RESEARCH IN BONE: A REVIEW; European cells and Materials ; Vol. 13.

2007, pg 1-10

62

115) Martiniaková, M., Omelka, R., Chrenek, P., Ryban, L., Parkányi, V., Grosskopf, B., Vondráková, M., Bauerová, M. ; Changes if femoral bone tissue microstructure in transgenic rabbits; Folia Biol (Praha), 51(5), 2005, pg 140-4

116) Struillou X, Boutigny H, Soueidan A, Layrolle P. ; Experimental animal models in

periodontology: A review; Open Dent J., 4, 2010, pg 37–47

117) Muschler, G. F., Raut, V. P., Patterson, T. E., Wenke, J. C. & Hollinger, J. O. ;The Design

and Use of Animal Models for Translational Research in Bone Tissue Engineering and

Regenerative Medicine; Tissue Engineering Part B-Reviews, 16, 2010, pg 123-145

118) Cho, L. R., Kim, D. G., Kim, J. H., Byon, E. S., Jeong, Y. S. & Park, C. J. ; Bone response of Mg ion-implanted clinical implants with the plasma source ion implantation method; Clin Oral Implants Res, 21, 2010, pg 848-56

119) Dyce, K.M., Wensing, C.J.G.; Textbook of veterinary anatom; 4. s.l. : Saunders Elsevier,

2010, pg 70-98

120) Crabb, E.D. ; Principles of funcţional anatomy of the rabbit; Philadelphia : P. Blakiston's son & co., 1931, pg 54-60, 70-81

121) Javier Guillen; FELASA Guidelines and Recommendations; Journal of the American

Association for Laboratory Animal Science, , Vol 51, No 3, May 2012, pg 311–321

122) JM Fentener van Vlissingen, M Borrens, A Girod, P Lelovas,F Morrison and Y Saavedra

Torres; The reporting of clinical signs in laboratory animals; FELASA Working Group Report; Lab

Anim OnlineFirst, published on May 8, 2015

123) Marian Popa; Statistica pentru psihologie ,teorie si aplicatii SPSS; Editura Polirom 2008,

pg 196-203