rflp - rapds

5/12/2018 RFLP - RAPDS - slidepdf.com

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RFLP

Polimorfismo de Longitud de Fragmentos

de Restricción

Restriction Fragment Length Polymorphism

En 1980 Mark Skolnick, Ray White, David Bostein and Ronald Davis crearon polimorfismo de

longitud de fragmentos de restricción ( RFLP, pronunciado rif-lip) marcador molecular del

genoma humano. Un RFLP es definido por la existencia de una alelo alternativo asociado con

fragmentos de restricción que difiern en tamaño uno de otro.

RFLP´S son visualizados por la digestión de DNA de diferentes individuales con restricción de

endonucleasas, seguidos por el gel de electroforesis para separar fragmentos de acuerdo al

tamaño, entonces Southern blotting y la hibridación o una sonda marcada que indentifica el locus

bajo investigación. Un RFLP es demostrado cada vez que patrón obtenido del Southern blot con

uno individual es diferente del obtenido con otro individual. Esas regiones variables no

necesariamente ocurren en genes, y la función de más de estos en el genoma humano es

desconocido (1).

La información genética de todos los organismos está contenida en la secuencia de nucleótidos del

ADN de los cromosomas nucleares y el genoma de los organelos. A pesar de que el ADN es capaz

de replicarse con un alto grado de fidelidad, existen diversos mecanismos que introducen cambios

mutacionales a esta información. Es tal la cantidad de ADN en una célula eucariótica que dos

organismos nunca son idénticos en las secuencias de bases de ADN que conforman su genoma.

Existen por lo tanto un alto grado de variabilidad a este nivel en las poblaciones vegetales.

Una forma de determinar y de utilizar esta variación natural es mediante digestión del ADN

vegetal con ciertas nucleasas provenientes de microorganismos llamadas enzimas de restricción,

las cuales reconocen secuencias de nucleótidos específicos, llamadas sitios de restricción, en las

que introducen cortes para producir fragmentos. El número y el tamaño de los fragmentos

producidos por la digestión con una enzima particular reflejan la distribución de los sitios de

restricción en una molécula de ADN particular. Los fragmentos de restricción pueden ser

separados de acuerdo a su tamaño por electroforesis en gel de agarosa. Cuando la molécula de

ADN es pequeña, como en el caso del ADN de cloroplastos, la cantidad de fragmentos es pequeña,alrededor de 40 en caso de cloroplastos, y el patrón de restricción es fácilmente discernible. Los

ADN de cloroplastos que difieren en la secuencia de bases por substituciones de estas o por

arreglos causados por inserciones, deleciones o inversiones, producirán fragmentos de restricción

de diferentes tamaños, estas diferencias se conocen como polimorfismos en el largo de los

fragmentos de restricción o RFLP y pueden ser usados como una medida directa de la variabilidad

genética (2).



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RFLP´S y Polimorfismos

RFLP´s son las variaciones estructurales en el DNA entre alelos y puede ser usado como

marcadores genéticos para mapear genes y especificar lugares en un cromosoma, diagnosticar

enfermedades o como simulación de huellas dactilares. Los polimorfismos son las diferencias en

una secuencia de ADN debido a mutaciones. Los polimorfismos son utilizados por los científicos

como los marcadores de ADN.

Cuando el DNA es cortado en fragmentos por enzimas de restricción, los polimorfismos

provocaran que el DNA sea cortado en diferentes fragmentos. Cuando el DNA es eletroforetizado,

habrá un nuevo bandeado patrón. Todos los organismos vivos con polimorfismos sin cambios

hacen que su patrón de banda sea único (3).

Secuencia polimórficas.

Las secuencias polimórficas (también conocidas como secuencias anónimas, loci anónimoss, loci

polimórficos, marcadores anónimos o marcadores polimórficos) son secuencias de ADN que,

normalmente, no codifican para un producto génico, se distribuyen de forma más o menos

aleatoria a los largo del genoma y presentan como característica singular el hecho de ser

polimórficas. Esta último hecho es de suma importancia pues confiere a este tipo de secuencias, la

característica primordial del análisis genético, la variabilidad.

Las variantes de un locus es lo que conocemos como alelos. Ya hemos utilizado este concepto

anteriormente al hablar de los alelos de loci implicados en enfermedades. Sin embargo, este tipo

de alelos son, afortunadamente, muy poco frecuentes y no nos serían útiles en los estudios de

ligamiento. Por el contrario las secuencias anónimas o loci polimórficos presentan por definición

varios alelos con una frecuencia significativamente alta en la población (superior al 1% para el

menos frecuente)

Si el locus a, que está implicado en una enfermedad hereditaria, esta ligado al locus b, que es una

secuencia anónima de ADN. Lo primero que necesitaremos será identificar las variantes de la

secuencia anónima en cada uno de los miembros de la familia y estudiar su segregación

juntamente con la de la enfermedad. La aplicación de diversos métodos estadísticos nos permitirá

establecer la existencia o no de ligamiento entre los dos loci investigados y estimar la distancia

que los separa.

En los estudios de ligamiento la distancia que separa a dos loci se mide en función de la frecuenciaen que ambos recombinan. La unidad de distancia es el centimorgan (cM) . Si dos loci recombinan

en el 1% de las meiosis, decimos que les separa una distancia de 1 cM. La frecuencia de

recombinación entre dos loci puede variar desde 0 (decimos entonces que dichos loci están

íntimamente ligados) hasta el 50% y decimos entonces que son independientes. Aunque no nos

podemos extender aquí sobre este aspecto, no existe siempre una relación lineal entre distancia

genética (frecuencia de recombinación medida en cM) y distancia física (número de nucleótidos



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que las separan, medida en pares de bases). Para frecuencias de recombinación inferiores al 20%

se puede establecer una relación de 106 pares de bases por cada 1% de recombinación (4).

El uso de los RFLPs en el genoma nuclear o mitocondrial puede ser muy útil para el aislamiento de

genes relacionados con la patogenicidad y la virulencia a través de chromosome walking y por

otro lado el polimorfismo en el ADN ribosomal (ADNr) logra ser informativo hasta el nivel de

especie para muchos hongos. Algunas de las extensivas aplicaciones de esta tecnología en los

hongos entomopatógenos, son los estudios de discriminación de especies, patotipos (razas),

grados de virulencia, estudio de orígenes geográficos, de población y mecanismos de

recombinación genética (5).

Beneficios de Análisis RFLP

A pesar del hecho de que es menos difundidas hoy, ha habido numerosos beneficios a los análisis

de RFLP. Desempeña un papel importante al permitir a los científicos a mapear el genoma

humano, así como proporcionar información sobre las enfermedades genéticas. RFLP es útil para

encontrar dónde un gen específico para una enfermedad se encuentra en un cromosoma. Esto se

logra observando el ADN de un conjunto de miembros de la familia que sufren de la enfermedad y

la búsqueda de alelos de RFLP que comparten el mismo tipo de patrón de herencia de la

enfermedad. Mediante el uso de análisis de RFLP, los científicos son capaces de determinar otros

que podrían estar en riesgo de la enfermedad o de un portador del gen mutado.

Además de sus beneficios para las pruebas de enfermedades genéticas, RFLP fue también uno de

los primeros métodos utilizados para la tipificación genética también conocida como la huella

genética, los perfiles o ensayos. Esta aplicación se utiliza para proporcionar un perfil genético de

una persona, que podría ser utilizado para comparar las muestras en la escena del crimen o para

averiguar la paternidad de una persona. No sólo eso, pero el análisis RFLP también tuvo papeles en

ayudar a nuestra comprensión de los aspectos genéticos de los patrones de reproducción de

varios animales diferentes.

Desafíos de Análisis RFLP

A pesar de sus muchos beneficios y útil solicitudes anteriores, el análisis de RFLP sigue siendo un

proceso lento y tedioso más en comparación con algunas de las técnicas de análisis más recientes

de ADN. No sólo eso, sino que requiere de mucho mayor tamaño de las muestras que otras formas

de análisis. En RFLP, la muestra general, tendría que ser aproximadamente del tamaño de una

moneda de una libra. Mientras que puede parecer pequeña, es grande en relación a otras técnicas

como el análisis de PCR que requieren sólo unas pocas células para la secuenciación de éxito. La

duración del proceso en sí es largo y tomar hasta un mes para llevar a cabo.

Reacciones en cadena de polimerasa (PCR) se han convertido en un sustituto de muchas de las

aplicaciones anteriores de RFLP. Hoy en día, RFLP tiene variaciones como el polimorfismo de

longitud de fragmentos de restricción terminal (TRFLP), que tiende a tener aplicaciones

relacionadas con la caracterización de las bacterias y las comunidades relacionadas. Es algo así



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como una mezcla de PCR y RFLP. La técnica utiliza la amplificación por PCR del ADN con cebadores

que tienen una etiqueta fluorescente. Después de los productos de la PCR se digieren las enzimas

RFLP, los patrones que se producen se pueden ver con una secuencia de ADN, que luego son

analizados.

RFLP ya no puede ser ampliamente utilizado, pero todavía ha sido importante para establecer

nuestra comprensión del análisis de ADN, a la vez que estimular el desarrollo de técnicas nuevas y

más eficientes. Es probable que las técnicas actuales hagan lo mismo en el futuro por su

refinamiento y reemplazo con más tipos avanzados de análisis de ADN (6).



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RAPDS

Polimorfismo de ADN Amplificado al Azar

Random Amplified Polymorphic DNAs

La simplicidad y la aplicabilidad de la técnica RAPD han cautivado los intereses de muchos

cientificos. Tal vez la razón principal para el éxito del análisis de RAPD es la ganancia de un gran

número de marcadores genéticos que requieren pequeñas cantidades de ADN sin el requisito para

la clonación, la secuenciación o cualquier otra forma de la caracterización molecular del genoma

de la especie en cuestión (7).

La Técnica basada en PCR para DNA, es llamada RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA).

Marcadores RAPD son generados en una simple y estandarizada reacción de PCR donde el primer

del PCR consiste en secuencias la azar (típicamente 10-15 bp de longitud). Siempre que sea el

primer PCR tiene secuencia homologa con el DNA templado, estos se unen y los productos de PCR

de variable peso molecular serían generados. Ningún conocimiento de secuencias de organismos

es requerida para realizar un análisis RAPD; sin embargo las condiciones debe mantenerse

constante para obtener patrones de bandas reproducibles.

Esta técnica es útil cuando se sabe poco sobre el genoma del organismo que se analiza. RAPD

análisis se utilizan comúnmente en las cepas de bacterias, y para el análisis de la variación del

genoma en plantas entre múltiples otras aplicaciones (1).

Casi todos los marcadores RAPD son dominantes, es decir no es posible distinguir si un segmento

de ADN es amplificado de un locus que es heterocigoto ( 1 copia) o homocigoto ( 2 copias).

Marcadores codominantes observados de diferente tamaño de segmentos de DNA amplificado

del mismo locus, son detectados raramente.

PCR es una enzimática reacción por lo tanto la calidad y la concentración del templado de DNA, las

concentraciones de los componentes y las condiciones del PCR pueden influir en el resultado. Por

lo tanto, la técnica de protocolos de laboratorio al desarrollarse necesita de cuidado para que

pueda ser reproducible.

Desajustes entre el primer y el templado puede dar lugar a la ausencia total de los productos de

PCR, así como constituir una disminución en el producto. En este caso los resultados del RAPD

pueden ser difíciles de interpretar.

y Desarrollo de locus especifico, marcadores codominantes RAPDS.

y La banda del marcador polimórfico del RAPD está aislado del gel.

y Esta es amplificado en la reacción del PCR.

y El primer nuevo largo especifico es diseñado para la secuencia de ADN, el cual es llamado

Sequenced Characterized Amplified Region Marker (SCAR) (8).



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Técnica RAPD

La tecnología del RAPD estándar utiliza oligonucleoticos cotro sintenticos ( de 10 pb) de secuencias

al azar como primer a amplificar cantidades totales en nanogramos bajo ADN genómico a bajas

temperaturas reconocido por el PCR.

Los productos de amplificación son generalmente separados en geles de agarosa y teñidos con

bromuro de etidio. Primers decameros están disponibles comercialmente en varias compañías

(Operon technologies, Alameda, California). Welsh y McClelland independientemente

desarrollaron una tecnología independiente usando primers de 15 nucleótidos y condiciones de

electroforesis de RAPD llamada de forma arbitraria reacción en cadena de la polimerasa cebada

8AP-PCR). Amplificación por PCR con cebadores más cortos de 10 nucleótidos también se ha

utilizado en la producción de perfiles de DNA fingerprinting.

Aunque estos enfoques son diferentes con respecto a la longitud de los cebadores al azar, las

condiciones amplificación y métodos de visualización difieren de las condiciones del PCR estándaren que un solo nucleótido de secuencia aleatoria se emplea y sin conocimiento previo del genoma

objeto de análisis necesario (7).

Reproducibilidad de los marcadores RAPD

Aunque el método RAPD es relativamente rápido, barato y fácil de realizar en comparación con

otros métodos que han sido utilizados como marcadores de ADN, la cuestión de la

reproducibilidad se ha de una gran preocupación desde la publicación de la técnica. De hecho, la

PCR normal también es sensible a cambios en las condiciones de reacción, pero la reacción RAPD

es mucho más sensible que la convencional PCR debido a la longitud de una cartilla individual y

arbitrario utilizado para amplificar regiones desconocidas de un genoma determinado. Este

problema de la reproducibilidad es normalmente el caso de las bandas de menor intensidad. La

razón de bandas con una intensidad alta o más baja aún no se sabe. Tal vez algunos cebadores no

concuerdan perfectamente con la secuencia de cebado, la amplificación en algunos ciclos no

pueden reproducirse , y por lo tanto las bandas siguen siendo débiles.

El factor más importante para la reproducibilidad del perfil de RAPD ha sido encontrado siendo el

resultado de la inadecuada preparación de templados de DNA. Las diferencias entre la

concentración de DNA y de dos individuales DNA´s resultado de las muestras en el pérdida o

ganancia de algunas bandas . Dado que la amplificación de RAPD se dirige con un oligonucleótido

solo, el DNA de casi de todas las fuentes es susceptible de amplificación. Por lo tanto, el ADN del

genoma en cuestión puede incluir DNA contaminantes del material con el que el DNA se ha

aislado. Se requiere cuidado especial para mantener el ADN que se amplifique otros

contaminantes de DNA (7).



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Las ventajas del método son su simplicidad y bajo costo, aunque tiene el inconveniente de ser un

marcador de tipo dominante, es decir, no es posible discernir sobre la heterocigocidad de los loci

observados. Además, la reacción es muy sensible a las condiciones de amplificación y a la calidad y

concentración del ADN, las cuales influirían en la reproducibilidad del método (10).



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BIBLIOGRAFIA

1. Allison, L . (2007) Fundamental molecular biology. Blackwell Publishing Ltd.

2. Seminario taller biotecnología ciencias agrícolas avances y aplicaciones. (1989)

Universidad del Valle CATIE-AID-REDCA, Guatemala.

3. Science Education Partnership. PAPER RFLP TEACHER GUIDE (2002) Fred Hutchinson

Cancer Research Center.

4. http://web.udl.es/usuaris/e4650869/docencia/segoncicle/genclin98/temes_teoria/diagos

tic_mol/diagno3.html

5. Ayra L., Cabrera I., Gómez M., Hernández D., Empleo de marcadores bioquímicos y de ADN

en la caracterización Molecular de hongos entomopatogenos. Instituto de Investigaciones

en Fruticultura Tropical (IIFT), Habana Cuba.6. http://www.exploredna.co.uk/rflp-analysis.html

7. Bardaki F. (2000) Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Markers. Cumhuriyet

University, Faculty of Arts and Science, Department of Biology. Sivas-TURKEY

8. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechRAPD.shtml

9. Narvaéz R. C., Valenzuela B. J., Muñoz Sch. C., Hinrichsen R. P. (2000) Comparison of RAPD

and AFLP as methods for genetic identification on Vitis based on the analysis of

anonymous genomic sequences. Agricultura Técnica (Chile)



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LINKS DE CONSULTA

DISEÑO DE PCR Y PCR-RFLP

http://insilico.ehu.es/edu/PCR_es/login.php

http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/RFLP.html

rflp - rapds

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