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RFLP
Polimorfismo de Longitud de Fragmentos
de Restricción
Restriction Fragment Length Polymorphism
En 1980 Mark Skolnick, Ray White, David Bostein and Ronald Davis crearon polimorfismo de
longitud de fragmentos de restricción ( RFLP, pronunciado rif-lip) marcador molecular del
genoma humano. Un RFLP es definido por la existencia de una alelo alternativo asociado con
fragmentos de restricción que difiern en tamaño uno de otro.
RFLP´S son visualizados por la digestión de DNA de diferentes individuales con restricción de
endonucleasas, seguidos por el gel de electroforesis para separar fragmentos de acuerdo al
tamaño, entonces Southern blotting y la hibridación o una sonda marcada que indentifica el locus
bajo investigación. Un RFLP es demostrado cada vez que patrón obtenido del Southern blot con
uno individual es diferente del obtenido con otro individual. Esas regiones variables no
necesariamente ocurren en genes, y la función de más de estos en el genoma humano es
desconocido (1).
La información genética de todos los organismos está contenida en la secuencia de nucleótidos del
ADN de los cromosomas nucleares y el genoma de los organelos. A pesar de que el ADN es capaz
de replicarse con un alto grado de fidelidad, existen diversos mecanismos que introducen cambios
mutacionales a esta información. Es tal la cantidad de ADN en una célula eucariótica que dos
organismos nunca son idénticos en las secuencias de bases de ADN que conforman su genoma.
Existen por lo tanto un alto grado de variabilidad a este nivel en las poblaciones vegetales.
Una forma de determinar y de utilizar esta variación natural es mediante digestión del ADN
vegetal con ciertas nucleasas provenientes de microorganismos llamadas enzimas de restricción,
las cuales reconocen secuencias de nucleótidos específicos, llamadas sitios de restricción, en las
que introducen cortes para producir fragmentos. El número y el tamaño de los fragmentos
producidos por la digestión con una enzima particular reflejan la distribución de los sitios de
restricción en una molécula de ADN particular. Los fragmentos de restricción pueden ser
separados de acuerdo a su tamaño por electroforesis en gel de agarosa. Cuando la molécula de
ADN es pequeña, como en el caso del ADN de cloroplastos, la cantidad de fragmentos es pequeña,alrededor de 40 en caso de cloroplastos, y el patrón de restricción es fácilmente discernible. Los
ADN de cloroplastos que difieren en la secuencia de bases por substituciones de estas o por
arreglos causados por inserciones, deleciones o inversiones, producirán fragmentos de restricción
de diferentes tamaños, estas diferencias se conocen como polimorfismos en el largo de los
fragmentos de restricción o RFLP y pueden ser usados como una medida directa de la variabilidad
genética (2).
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RFLP´S y Polimorfismos
RFLP´s son las variaciones estructurales en el DNA entre alelos y puede ser usado como
marcadores genéticos para mapear genes y especificar lugares en un cromosoma, diagnosticar
enfermedades o como simulación de huellas dactilares. Los polimorfismos son las diferencias en
una secuencia de ADN debido a mutaciones. Los polimorfismos son utilizados por los científicos
como los marcadores de ADN.
Cuando el DNA es cortado en fragmentos por enzimas de restricción, los polimorfismos
provocaran que el DNA sea cortado en diferentes fragmentos. Cuando el DNA es eletroforetizado,
habrá un nuevo bandeado patrón. Todos los organismos vivos con polimorfismos sin cambios
hacen que su patrón de banda sea único (3).
Secuencia polimórficas.
Las secuencias polimórficas (también conocidas como secuencias anónimas, loci anónimoss, loci
polimórficos, marcadores anónimos o marcadores polimórficos) son secuencias de ADN que,
normalmente, no codifican para un producto génico, se distribuyen de forma más o menos
aleatoria a los largo del genoma y presentan como característica singular el hecho de ser
polimórficas. Esta último hecho es de suma importancia pues confiere a este tipo de secuencias, la
característica primordial del análisis genético, la variabilidad.
Las variantes de un locus es lo que conocemos como alelos. Ya hemos utilizado este concepto
anteriormente al hablar de los alelos de loci implicados en enfermedades. Sin embargo, este tipo
de alelos son, afortunadamente, muy poco frecuentes y no nos serían útiles en los estudios de
ligamiento. Por el contrario las secuencias anónimas o loci polimórficos presentan por definición
varios alelos con una frecuencia significativamente alta en la población (superior al 1% para el
menos frecuente)
Si el locus a, que está implicado en una enfermedad hereditaria, esta ligado al locus b, que es una
secuencia anónima de ADN. Lo primero que necesitaremos será identificar las variantes de la
secuencia anónima en cada uno de los miembros de la familia y estudiar su segregación
juntamente con la de la enfermedad. La aplicación de diversos métodos estadísticos nos permitirá
establecer la existencia o no de ligamiento entre los dos loci investigados y estimar la distancia
que los separa.
En los estudios de ligamiento la distancia que separa a dos loci se mide en función de la frecuenciaen que ambos recombinan. La unidad de distancia es el centimorgan (cM) . Si dos loci recombinan
en el 1% de las meiosis, decimos que les separa una distancia de 1 cM. La frecuencia de
recombinación entre dos loci puede variar desde 0 (decimos entonces que dichos loci están
íntimamente ligados) hasta el 50% y decimos entonces que son independientes. Aunque no nos
podemos extender aquí sobre este aspecto, no existe siempre una relación lineal entre distancia
genética (frecuencia de recombinación medida en cM) y distancia física (número de nucleótidos
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que las separan, medida en pares de bases). Para frecuencias de recombinación inferiores al 20%
se puede establecer una relación de 106 pares de bases por cada 1% de recombinación (4).
El uso de los RFLPs en el genoma nuclear o mitocondrial puede ser muy útil para el aislamiento de
genes relacionados con la patogenicidad y la virulencia a través de chromosome walking y por
otro lado el polimorfismo en el ADN ribosomal (ADNr) logra ser informativo hasta el nivel de
especie para muchos hongos. Algunas de las extensivas aplicaciones de esta tecnología en los
hongos entomopatógenos, son los estudios de discriminación de especies, patotipos (razas),
grados de virulencia, estudio de orígenes geográficos, de población y mecanismos de
recombinación genética (5).
Beneficios de Análisis RFLP
A pesar del hecho de que es menos difundidas hoy, ha habido numerosos beneficios a los análisis
de RFLP. Desempeña un papel importante al permitir a los científicos a mapear el genoma
humano, así como proporcionar información sobre las enfermedades genéticas. RFLP es útil para
encontrar dónde un gen específico para una enfermedad se encuentra en un cromosoma. Esto se
logra observando el ADN de un conjunto de miembros de la familia que sufren de la enfermedad y
la búsqueda de alelos de RFLP que comparten el mismo tipo de patrón de herencia de la
enfermedad. Mediante el uso de análisis de RFLP, los científicos son capaces de determinar otros
que podrían estar en riesgo de la enfermedad o de un portador del gen mutado.
Además de sus beneficios para las pruebas de enfermedades genéticas, RFLP fue también uno de
los primeros métodos utilizados para la tipificación genética también conocida como la huella
genética, los perfiles o ensayos. Esta aplicación se utiliza para proporcionar un perfil genético de
una persona, que podría ser utilizado para comparar las muestras en la escena del crimen o para
averiguar la paternidad de una persona. No sólo eso, pero el análisis RFLP también tuvo papeles en
ayudar a nuestra comprensión de los aspectos genéticos de los patrones de reproducción de
varios animales diferentes.
Desafíos de Análisis RFLP
A pesar de sus muchos beneficios y útil solicitudes anteriores, el análisis de RFLP sigue siendo un
proceso lento y tedioso más en comparación con algunas de las técnicas de análisis más recientes
de ADN. No sólo eso, sino que requiere de mucho mayor tamaño de las muestras que otras formas
de análisis. En RFLP, la muestra general, tendría que ser aproximadamente del tamaño de una
moneda de una libra. Mientras que puede parecer pequeña, es grande en relación a otras técnicas
como el análisis de PCR que requieren sólo unas pocas células para la secuenciación de éxito. La
duración del proceso en sí es largo y tomar hasta un mes para llevar a cabo.
Reacciones en cadena de polimerasa (PCR) se han convertido en un sustituto de muchas de las
aplicaciones anteriores de RFLP. Hoy en día, RFLP tiene variaciones como el polimorfismo de
longitud de fragmentos de restricción terminal (TRFLP), que tiende a tener aplicaciones
relacionadas con la caracterización de las bacterias y las comunidades relacionadas. Es algo así
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como una mezcla de PCR y RFLP. La técnica utiliza la amplificación por PCR del ADN con cebadores
que tienen una etiqueta fluorescente. Después de los productos de la PCR se digieren las enzimas
RFLP, los patrones que se producen se pueden ver con una secuencia de ADN, que luego son
analizados.
RFLP ya no puede ser ampliamente utilizado, pero todavía ha sido importante para establecer
nuestra comprensión del análisis de ADN, a la vez que estimular el desarrollo de técnicas nuevas y
más eficientes. Es probable que las técnicas actuales hagan lo mismo en el futuro por su
refinamiento y reemplazo con más tipos avanzados de análisis de ADN (6).
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RAPDS
Polimorfismo de ADN Amplificado al Azar
Random Amplified Polymorphic DNAs
La simplicidad y la aplicabilidad de la técnica RAPD han cautivado los intereses de muchos
cientificos. Tal vez la razón principal para el éxito del análisis de RAPD es la ganancia de un gran
número de marcadores genéticos que requieren pequeñas cantidades de ADN sin el requisito para
la clonación, la secuenciación o cualquier otra forma de la caracterización molecular del genoma
de la especie en cuestión (7).
La Técnica basada en PCR para DNA, es llamada RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA).
Marcadores RAPD son generados en una simple y estandarizada reacción de PCR donde el primer
del PCR consiste en secuencias la azar (típicamente 10-15 bp de longitud). Siempre que sea el
primer PCR tiene secuencia homologa con el DNA templado, estos se unen y los productos de PCR
de variable peso molecular serían generados. Ningún conocimiento de secuencias de organismos
es requerida para realizar un análisis RAPD; sin embargo las condiciones debe mantenerse
constante para obtener patrones de bandas reproducibles.
Esta técnica es útil cuando se sabe poco sobre el genoma del organismo que se analiza. RAPD
análisis se utilizan comúnmente en las cepas de bacterias, y para el análisis de la variación del
genoma en plantas entre múltiples otras aplicaciones (1).
Casi todos los marcadores RAPD son dominantes, es decir no es posible distinguir si un segmento
de ADN es amplificado de un locus que es heterocigoto ( 1 copia) o homocigoto ( 2 copias).
Marcadores codominantes observados de diferente tamaño de segmentos de DNA amplificado
del mismo locus, son detectados raramente.
PCR es una enzimática reacción por lo tanto la calidad y la concentración del templado de DNA, las
concentraciones de los componentes y las condiciones del PCR pueden influir en el resultado. Por
lo tanto, la técnica de protocolos de laboratorio al desarrollarse necesita de cuidado para que
pueda ser reproducible.
Desajustes entre el primer y el templado puede dar lugar a la ausencia total de los productos de
PCR, así como constituir una disminución en el producto. En este caso los resultados del RAPD
pueden ser difíciles de interpretar.
y Desarrollo de locus especifico, marcadores codominantes RAPDS.
y La banda del marcador polimórfico del RAPD está aislado del gel.
y Esta es amplificado en la reacción del PCR.
y El primer nuevo largo especifico es diseñado para la secuencia de ADN, el cual es llamado
Sequenced Characterized Amplified Region Marker (SCAR) (8).
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Técnica RAPD
La tecnología del RAPD estándar utiliza oligonucleoticos cotro sintenticos ( de 10 pb) de secuencias
al azar como primer a amplificar cantidades totales en nanogramos bajo ADN genómico a bajas
temperaturas reconocido por el PCR.
Los productos de amplificación son generalmente separados en geles de agarosa y teñidos con
bromuro de etidio. Primers decameros están disponibles comercialmente en varias compañías
(Operon technologies, Alameda, California). Welsh y McClelland independientemente
desarrollaron una tecnología independiente usando primers de 15 nucleótidos y condiciones de
electroforesis de RAPD llamada de forma arbitraria reacción en cadena de la polimerasa cebada
8AP-PCR). Amplificación por PCR con cebadores más cortos de 10 nucleótidos también se ha
utilizado en la producción de perfiles de DNA fingerprinting.
Aunque estos enfoques son diferentes con respecto a la longitud de los cebadores al azar, las
condiciones amplificación y métodos de visualización difieren de las condiciones del PCR estándaren que un solo nucleótido de secuencia aleatoria se emplea y sin conocimiento previo del genoma
objeto de análisis necesario (7).
Reproducibilidad de los marcadores RAPD
Aunque el método RAPD es relativamente rápido, barato y fácil de realizar en comparación con
otros métodos que han sido utilizados como marcadores de ADN, la cuestión de la
reproducibilidad se ha de una gran preocupación desde la publicación de la técnica. De hecho, la
PCR normal también es sensible a cambios en las condiciones de reacción, pero la reacción RAPD
es mucho más sensible que la convencional PCR debido a la longitud de una cartilla individual y
arbitrario utilizado para amplificar regiones desconocidas de un genoma determinado. Este
problema de la reproducibilidad es normalmente el caso de las bandas de menor intensidad. La
razón de bandas con una intensidad alta o más baja aún no se sabe. Tal vez algunos cebadores no
concuerdan perfectamente con la secuencia de cebado, la amplificación en algunos ciclos no
pueden reproducirse , y por lo tanto las bandas siguen siendo débiles.
El factor más importante para la reproducibilidad del perfil de RAPD ha sido encontrado siendo el
resultado de la inadecuada preparación de templados de DNA. Las diferencias entre la
concentración de DNA y de dos individuales DNA´s resultado de las muestras en el pérdida o
ganancia de algunas bandas . Dado que la amplificación de RAPD se dirige con un oligonucleótido
solo, el DNA de casi de todas las fuentes es susceptible de amplificación. Por lo tanto, el ADN del
genoma en cuestión puede incluir DNA contaminantes del material con el que el DNA se ha
aislado. Se requiere cuidado especial para mantener el ADN que se amplifique otros
contaminantes de DNA (7).
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Las ventajas del método son su simplicidad y bajo costo, aunque tiene el inconveniente de ser un
marcador de tipo dominante, es decir, no es posible discernir sobre la heterocigocidad de los loci
observados. Además, la reacción es muy sensible a las condiciones de amplificación y a la calidad y
concentración del ADN, las cuales influirían en la reproducibilidad del método (10).
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BIBLIOGRAFIA
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2. Seminario taller biotecnología ciencias agrícolas avances y aplicaciones. (1989)
Universidad del Valle CATIE-AID-REDCA, Guatemala.
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Cancer Research Center.
4. http://web.udl.es/usuaris/e4650869/docencia/segoncicle/genclin98/temes_teoria/diagos
tic_mol/diagno3.html
5. Ayra L., Cabrera I., Gómez M., Hernández D., Empleo de marcadores bioquímicos y de ADN
en la caracterización Molecular de hongos entomopatogenos. Instituto de Investigaciones
en Fruticultura Tropical (IIFT), Habana Cuba.6. http://www.exploredna.co.uk/rflp-analysis.html
7. Bardaki F. (2000) Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Markers. Cumhuriyet
University, Faculty of Arts and Science, Department of Biology. Sivas-TURKEY
8. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechRAPD.shtml
9. Narvaéz R. C., Valenzuela B. J., Muñoz Sch. C., Hinrichsen R. P. (2000) Comparison of RAPD
and AFLP as methods for genetic identification on Vitis based on the analysis of
anonymous genomic sequences. Agricultura Técnica (Chile)
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LINKS DE CONSULTA
DISEÑO DE PCR Y PCR-RFLP
http://insilico.ehu.es/edu/PCR_es/login.php
http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/RFLP.html