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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE ODONTOLOGIA
AVALIAÇÃO HISTOMORFOMÉTRICA DO EFEITO DE
DIFERENTES TEMPERATURAS DE SÍNTESE NA
RESPOSTA BIOLÓGICA DE HIDROXIAPATITAS
CARBONATADAS NANOESTRUTURADAS CONTENDO
ALGINATO DE SÓDIO EM DEFEITOS CRÍTICOS DE
CALVÁRIAS DE RATOS
Niterói
2014
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FICHA CATALOGRÁFICA
U99 Uzeda, Marcelo José Pinheiro Guedes de
Avaliação histomorfométrica do efeito de diferentes temperaturas de síntese na resposta biológica de hidroxiapatitas carbonatadas contendo alginato de sódio em defeitos críticos de calvárias de ratos / Marcelo José Pinheiro Guedes de Uzeda ;orientador: Prof.ª Dr.ª Mônica Diuana Calazans Maia – Niterói: [s.n.], 2014. 50 f.: il. Inclui gráficos e tabelas Dissertação (Mestrado em Clínica Odontológica) – Universidade Federal Fluminense, 2014. Bibliografia: f. 39-43 1.Hidroxiapatita carbonatada 2.Reparo ósseo 3.Ratos I. Calasans-Maia, Mônica Diuana [orien.] III.Título CDD 617.695
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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE ODONTOLOGIA
AVALIAÇÃO HISTOMORFOMÉTRICA DO EFEITO DE
DIFERENTES TEMPERATURAS DE SÍNTESE NA
RESPOSTA BIOLÓGICA DE HIDROXIAPATITAS
CARBONATADAS NANOESTRUTURADAS CONTENDO
ALGINATO DE SÓDIO EM DEFEITOS CRÍTICOS DE
CALVÁRIAS DE RATOS
MARCELO JOSÉ PINHEIRO GUEDES DE UZEDA
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre, pelo Programa de Pós-Graduação em Odontologia. Área de Concentração: Clínica Odontológica. Orientador: Profa. Dra. Mônica Diuana Calasans Maia Co-orientador: Prof. José Mauro Granjeiro
Niterói
2014
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BANCA EXAMINADORA
Prof(a). Dr(a). Mônica Diuana Calasans Maia
Instituição: Universidade Federal Fluminense
Decisão: _________________________Assinatura: ________________________
Prof. Dr. Marcelo Henrique Prado da Silva
Instituição: Instituto Militar de Engenharia
Decisão: _________________________Assinatura: ________________________
Prof. Dr. José Mauro Granjeiro
Instituição: Universidade Federal Fluminense
Decisão: _________________________Assinatura: ________________________
APROVADO
APROVADO
APROVADO
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AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, quero agradecer a todos que de alguma forma
contribuíram para a realização deste trabalho e peço desculpas antecipadas por
alguma omissão.
Aos meus pais Conrado e Gilda pelo amor, carinho, exemplo,
educação e apoio logístico. Meus Mestres pela vida afora.
À minha esposa Cristiana por todo seu amor, dedicação, incentivo,
compreensão... por tudo. Minha genuína pesquisadora, sem você nada teria a
menor importância!
Aos meus filhos queridos e amados João e Clara, alegria no meu
cotidiano, motivação que me mantém sempre atento às minhas palavras e atitudes
na tentativa de tornar-me cada vez melhor.
Aos meus irmãos, sobrinhos e amigos. A toda família de um modo
geral, berço de paz, tranquilidade e apoio em todas as horas.
À querida professora Adriana Cury, minha colega e amiga, por abrir-
me as portas e dar o “pontapé” inicial. Sem isso, provavelmente eu não estaria aqui
agora.
Aos técnicos do LABA Marco Antônio e Welington pela competência
e boa vontade em todas as horas.
Aos funcionários da PPGO João e Lucí por sua presteza e simpatia.
Ao colega e “parceiraço” Rodrigo Resende pela colaboração e
orientação na experimentação animal. Sua ajuda foi fundamental. Agradeço também
pela amizade.
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À querida professora Adriana Terezinha por sua boa vontade,
amizade e disponibilidade na captura das imagens e na análise histológica.
A Silvia Albuquerque, Química do CBPF, por seu carinho em todos os
momentos, seus ensinamentos na síntese dos materiais e por estar sempre disposta
a ajudar e resolver prontamente nossos “problemas de última hora”.
Ao professor José Mauro Granjeiro, por sua enorme capacidade de
contagiar a todos com seu entusiasmo e conhecimento mesmo sobre os
supostamente mais áridos assuntos.
À minha querida orientadora, Mônica Calasans, faço aqui um
agradecimento especial por sua dedicação, disponibilidade e competência. Por sua
atenção e boa vontade em sempre ensinar e principalmente, por sua confiança em
meu trabalho. Muito obrigado por tudo.
.
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Se tu estás verdadeiramente comprometido com tua meta...O universo inteiro
conspira a teu favor para que apareçam os instrumentos e pessoas, que te
permitirão lográ-lo”
Goethe
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RESUMO
Uzeda MJPG. Avaliação histomorfométrica do efeito de diferentes temperaturas de
síntese na resposta biológica de hidroxiapatitas carbonatadas nanoestruturadas
contendo alginato de sódio em defeitos críticos de calvárias de ratos[dissertação].
Niterói: Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Odontologia; 2014.
Por sua bioatividade e capacidade de bioabsorção, as hidroxiapatitas carbonatadas
não cerâmicas contendo alginato de sódio (cHA) tem sido recomendadas como
substitutos ósseos alternativos às hidroxiapatitas cerâmicas. Com o objetivo de
estabelecer a melhor temperatura de síntese, este estudo avaliou a resposta
biológica às cHAs nanoestruturadas não cerâmicas sintetizadas sob três diferentes
temperaturas 5°C, 37°C e 90°C, comparadas à hidroxiapatita cerâmica (HA), em
defeitos críticos de calvária de ratos. Foram utilizados 72 ratos Wistar divididos em 4
grupos de 18 indivíduos para cada biomaterial, com 6 indivíduos por período
experimental de 30, 90 e 180 dias. Os defeitos críticos foram produzidos nas
calvárias dos ratos e preenchidos com os diferentes biomateriais. Após os
respectivos períodos experimentais os animais foram eutanasiados para obtenção
das amostras. As amostras foram clivadas e cada metade foi processada para
inclusão em parafina e em resina. As amostras descalcificadas, fixadas em solução
de formaldeído e incluídas em parafina, foram coradas com HE, analisadas
histologicamente e submetidas a avaliação histomorfométrica com análise
estatística através dos testes de Análise de Variância para comparação entre os
grupos e teste de Kruskal-Wallis (p<0,05) para comparação entre os períodos
experimentais. As amostras não descalcificadas, fixadas em solução alcoólica e
incluídas em resina, foram analisadas através de microscopia de luz polarizada. Os
resultados mostraram que a temperatura de síntese exerce influência sobre a
capacidade de bioabsorção do material assim como sobre sua capacidade de
osteocondução. O teste de Kruskal-Wallis mostrou diferença para os grupos de cHA
5°C e 90°C entre 30 e 180 dias em relação a quantidade de osso neoformado
(p<0,05). A análise de variância mostrou diferença significativa entre os grupos em
relação à bioabsorção dos materiais (p<0,05). Em um animal do grupo cHA 5ºC de
180 dias, houve o completo fechamento do defeito crítico por osso neoformado.
Concluímos que dentre todos os biomateriais comparados, a cHA 37ºC apresentou
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maior capacidade de bioabsorção enquanto que a cHA 5ºC, menos cristalina,
conduziu a maior quantidade de osso neoformado.
Palavras-chave: Hidroxiapatita carbonatada, Reparo ósseo, Bioabsorção,
Osteocondução, calvária, ratos.
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ABSTRACT
Uzeda MJPG . Histomorphometric evaluation of different synthesis temperatures
effect in organic response of nanostructured carbonated hydroxyapatites containing
calcium alginate in critical size defects in rat calvaria [dissertation]. Niterói:
Fluminense Federal University, College of Dentistry; 2014.
Because of its bioactivity and biosorption capacity, non-ceramic carbonated
hydroxyapatite containing calcium alginate (cHA) has been recommended as an
alternative bone substitute to ceramic hydroxyapatite. In order to establish the best
synthesis temperature, this study evaluated the biological response to non-ceramics
cHAs synthesized under three different temperatures: 5°C, 37°C and 90°C,
compared to ceramic hydroxyapatite (HA) in critical defects of rat calvaria. 72 Wistar
rats were divided into 4 groups of 18 individuals for each biomaterial and 6
individuals were used per experimental period of 30, 90 and 180 days. Critical size
defects were produced in rat calvaria and filled with various biomaterials. After the
respective experimental period, the animals were euthanized to obtain samples. The
samples were cleaved and each half was processed for embedded in paraffin and
resin. Decalcified samples, fixed in formaldehyde and embedded in paraffin, were
stained with HE and histologically analyzed and subjected to histomorphometric
assessment with Kruskal-Wallis test (p < 0.05) for comparison between experimental
periods. Non-decalcified samples, fixed in alcoholic solution and embedded in resin,
were analyzed by polarized light microscopy. The results showed that the synthesis
temperature influences the material biosorption capacity and its osteoconductive
ability. The Kruskal-Wallis test showed significant difference for groups cHA 5° C and
90° C between 30 and 180 days in amount of new bone formation (p <0.05). The
variance analysis showed significant difference between the groups regarding the
material biosorption (p < 0.05). In one animal in the group cHA 5ºC 180 days, there
was complete closure of the critical size defect by new bone. We conclude that,
among all biomaterials compared, cHA 37°C showed the highest biosorption capacity
while cHA 5°C , less crystalline, led to the largest amount of newly formed bone.
Keywords : Carbonate hydroxyapatite, Bone repair, Biosorption, Osteoconduction ,
Calvaria, Rat.
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1 - INTRODUÇÃO
Ao longo da história, a busca por materiais biomiméticos capazes de substituir
os tecidos orgânicos desempenhando de forma competente as suas funções, tem
sido uma grande obsessão para os pesquisadores. É consenso que os enxertos
ósseos autógenos, dentre todos os substitutos ósseos são o padrão ouro.
Entretanto, apresentam restrições que vão desde a sua limitada disponibilidade,
passando pelo maior custo devido à necessidade de um segundo sítio cirúrgico para
sua obtenção (área doadora), indo até ao aumento da morbidade pela necessidade
de um maior período de recuperação do paciente e pelo maior risco de infecções.
Associado a isto, há ainda a imprevisibilidade do seu grau de bioabsorção durante o
período cicatricial. Diante desta realidade, torna-se imperiosa a necessidade de se
desenvolver materiais osteosubstitutos que cumpram com eficiência o seu papel,
criando assim uma alternativa de excelência para o campo médico e odontológico.
Devido as suas características físico-químicas semelhantes às de tecidos
ósseos e dentários, as cerâmicas à base de fosfato de cálcio vêm sendo
intensamente estudadas nas últimas décadas. Dentre elas, a hidroxiapatita (HA -
Ca10(PO4)6(OH)2 ) tem sido a mais investigada e utilizada, desempenhando ótimo
papel como substituto ósseo em cirurgias ortopédicas e bucomaxilofaciais.
Biocompatibilidade e bioatividade são as principais características necessárias para
que esses materiais exerçam as funções desejadas. A HA, por ser o principal
constituinte da fase inorgânica do osso, guarda características químicas e estruturais
que possibilitam seu uso na área médica como material biocompatível em implantes
e próteses. Na área odontológica, a HA é utilizada tanto na preservação da
arquitetura alveolar após a extração de um ou vários elementos dentários, quanto
para recuperar áreas estruturalmente ósseo-deficientes, seja por reabsorções
fisiológicas ou mesmo por patologias destrutivas. No entanto, dependendo do
processo de fabricação utilizado para sua obtenção, as HAs poderão apresentar
características físico-químicas diferentes como acontece com as HAs na forma
comercial para o uso clínico. Após a sinterização, tratamento térmico que lhe confere
alta cristalinidade, as HAs perdem a característica de um material nanoestruturado,
diminuindo sua capacidade de bioabsorção. Lembramos aqui que sendo o osso
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humano um nanocompósito, a perda da característica nanoestruturada confere ao
material menor semelhança com o tecido que se deseja mimetizar.
Devido a essas variações, diversas propriedades ainda precisam ser
determinadas para que se assegure seu adequado comportamento in vivo. O
controle de tais parâmetros é de extrema importância, pois variam de acordo com a
metodologia empregada na preparação da amostra e nos tratamentos durante e
após a sua síntese. Motivados por essas dificuldades e no intuito de ampliar a
capacidade terapêutica das HAs, a modificação de sua composição química através
da substituição do grupo fosfato (PO4) pelo grupo carbonato (CO3), levou os
pesquisadores à síntese de uma hidroxiapatita carbonatada, que se não tratada
termicamente permanece com as características nanométricas e não cerâmicas
superando as limitações anteriormente citadas. A síntese da cHA e sua associação a
polímeros bioabsorvíveis a torna mais similar ao osso natural, de maneira a
estimular suas propriedades como agente osteocondutor e facilitar seu
processamento no formato mais adequado à aplicação clínica. O objetivo desta
pesquisa foi, portanto, estabelecer a melhor temperatura de síntese, dentre as cHAs
estudadas, observando as propriedades de osteocondução e bioabsorção.
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2 - OBJETIVOS
2.1 - Objetivo Geral
Avaliar o reparo tecidual e absorção de biomaterial osteosubstituto constituído
de hidroxiapatita carbonatada nanoestruturada não cerâmica contendo alginato de
sódio sintetizada sob três diferentes temperaturas (5°C, 37°C e 90°C) comparadas
com a hidroxiapatita estequiométrica sinterizada (controle) após a implantação em
defeitos críticos em calvária de ratos.
2.2 - Objetivos Específicos
2.2.1- Caracterizar físico-quimicamente os biomateriais antes da sua
implantação através de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Difração de RX
(DRX) e Espectroscopia Vibracional no Infra Vermelho por Transformada de Fourier
(EVIF);
2.2.2- Avaliar quantitativamente, por histomorfometria, a área de osso
neoformado e de tecido conjuntivo nos diferentes grupos de acordo com os períodos
experimentais;
2.2.3- Avaliar quantitativamente, por histomorfometria, a área de biomaterial
remanescente nos diferentes grupos, de acordo com os períodos experimentais;
2.2.4- Avaliar a propriedade osteocondutora dos biomateriais;
2.2.5- Avaliar, através microscopia de luz polarizada, as amostras não
desmineralizadas.
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3 - METODOLOGIA
3.1 Biomateriais
As amostras de cHA compostas por partículas menores que 20nm com
estequiometria variando entre 1,6<Ca/P<2,0, e as amostras de hidroxiapatita
estequiométrica (Ca/P = 1,67), foram sintetizadas e caracterizadas no Laboratório de
Biomateriais (LABIOMAT) do Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas (CBPF) sob a
coordenação do pesquisador Dr. Alexandre Malta Rossi. As cHAs foram sintetizadas
em 3 diferentes temperaturas 5ºC, 37ºC e 90ºC e não receberam tratamento térmico
(não sinterizadas) sendo comparadas com a hidroxiapatita sintetizada a 90ºC com
tratamento térmico de sinterização a 1100ºC. Os biomateriais foram caracterizados
antes da implantação na calvária dos animais para definir características estruturais
e superficiais através das técnicas de microscopia eletrônica de varredura(MEV),
difração de RX(DRX) e espectroscopia vibracional no infravermelho por
transformada de Fourier(EVIF).
3.1.1 Confecção das Esferas
A preparação das cHA seguiu o método de precipitação por via úmida
contendo 6 wt% CO3 e razão Ca/P de 1,72, nas temperaturas de síntese de 5°C,
37°C, e 90°C pela adição de fosfato de amônio ((NH4)2HPO4), carbonato de amônio
((NH4)2CO3) e nitrato de cálcio (Ca(NO3)2.4H2O) (Figura 1). Utilizou-se uma taxa de
adição de 30mL/min, com agitação magnética de 240 rpm, tempo de digestão de
180 minutos e pH=12 (Figura 2).
Figura 1: Material da adição para confecção da cHA: (A) Fosfato de amônio; (B) Carbonato de amônio; (C) Nitrato de cálcio.
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Uma vez que a adição dos reagentes foi concluída, o sólido sintetizado foi
lavado com água ultrapura (MilliQ®, Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) até a
neutralização do pH ao nível de pH=7 sendo então filtrado sob vácuo para obtenção
de uma pasta (Figura 3).
O material pastoso foi seco por processo de liofilização e separado através de
peneiras de aço inox, para evitar a contaminação, segundo faixa de granulometria
entre 37 m e 74 m (Figuras 4A, 4B, 4C).
Figura 2: Processo da digestão da cHA. (A) Antes da adição; (B) Depois da adição.
Figura 3: (A) Neutralização do pH; (B) Pasta obtida após filtragem.
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Os materiais em forma de pó (de 37m a 74m) das respectivas cHAs foram
misturados a uma solução de alginato de sódio 1% na proporção de 15:1 com
agitação para a formação de uma pasta cerâmica. Por extrusão através de agulha
24G (BD), a pasta cerâmica foi gotejada em solução de cloreto de cálcio (CaCl2),
para a conversão do alginato de sódio em alginato de sódio, transformando-se em
esferas. As esferas ficaram na solução de cloreto de cálcio durante 24h e após este
período foram lavadas 5 vezes com 500mL de água ultrapura (MilliQ®). As esferas
obtidas foram liofilizadas e após 24h foram selecionadas através de peneiras
graduadas para a faixa de 425 a 600μm de tamanho. Uma amostra destas esferas
com dimensões de 425 μm à 600μm foi separada para a caracterização estrutural e
superficial através de MEV(FEI Quanta FEG 250 – Instituto Militar de Engenharia),
DRX(Zeiss HZG4; radiação de CuKa (= 1,5418 Å) e varredura angular de 10 – 100°
com passo de 0,05/s) e EVIF(Schimadzu, IR-Prestige 21 com detector DTGS KBr e
separador de feixes de KBr). A outra parte foi embalada e esterilizada em radiação
gama (15 kGy por amostra), através do Irradiador de Cobalto 60 numa taxa de
dose de19.72 Gy/min durante 760 minutos (COPPE – Instituto Alberto Luiz
Coimbra/UFRJ), sendo lacradas até o procedimento cirúrgico (Figura 5A, 5B, 5C).
Figura 4: (A) Material pastoso colocado nos potes para a liofilização; (B) Material sendo liofilizado; (C) Material liofilizado em peneiramento.
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3.2 Caracterização dos animais Este projeto foi submetido e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de
Animais da Universidade Federal Fluminense (CEUA/UFF) sob o nº 194/10 (Anexo
1) e os procedimentos realizados seguiram as Diretrizes da Prática de Eutanásia do
CONCEA, disponível em http://concea.mct.gov.br
Foram utilizados 72 ratos Wistar, de ambos os gêneros, com peso entre 300 a
400 gramas, fornecidos pelo Núcleo de Animais de Laboratório (NAL), da
Universidade Federal Fluminense localizada em Niterói, Rio de Janeiro. Antes e
durante o período experimental os animais foram mantidos em mini-isoladores (n=2)
sendo alimentados por ração peletizada e água à vontade. Seis animais foram
escolhidos aleatoriamente para cada grupo experimental (cHA 5°C, cHA 37°C, cHA
90°C e HA 90°C) nos períodos experimentais de 30, 90 e 180 dias, totalizando 24
animais por período experimental (Figura 9). Os animais foram privados de ração
seis horas antes do ato operatório sendo permitido o consumo de água. Os animais
foram operados sob anestesia geral, recebendo como medicação anestésica
20mg/kg de Quetamina (Francotar® – Virbac, São Paulo, SP, Brasil) associada a 1
mg/kg de Xilazina (Sedazine® – Fort Dodge, IA, USA), por via intraperitoneal. Após
observar ausência de reflexos à dor, foi realizada tricotomia das calvárias,
degermação e antissepsia com solução de Digliconato de Clorexidina 2% (Figura
10A). Os animais foram instalados na mesa operatória para colocação dos campos
cirúrgicos esterilizados. Uma incisão semilunar foi realizada sobre a calvaria de cada
Figura 5: (A) Gotejamento para formação das esferas; (B) Esferas selecionadas; (C) Esferas embaladas e esterilizadas para o procedimento cirúrgico.
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animal através do uso de cabo de bisturi n°3 (Bard Parker®, Caledonia, MI, USA)
com lâmina n°15 C (Becton- Dickinson®, Curitiba, PR, Brasil) (Figura 10B). Após a
incisão e o descolamento subperiostal com exposição da área óssea desejada, foi
realizada uma perfuração com broca trefina de diâmetro interno de 8mm (SIN®, São
Paulo, SP, Brasil) em rotação baixa e intermitente (1200 RPM) acoplada ao contra-
ângulo redutor 16:1 (Kavo®, Joinvile, SC, Brasil) e micro motor elétrico (BLM 600
Plus, V K Driller®, Jaguaré, SP, Brasil), com irrigação profusa de solução de cloreto
de sódio a 0,9% (Darrow Laboratórios S.A., Areal, RJ, Brasil) (Figura 10C). Os
defeitos críticos criados (Figura 10D), foram preenchidos com os biomateriais de
acordo com os respectivos grupos experimentais numa quantidade de
aproximadamente de 1g para cada calvária. Após a implantação das esferas de
cHA nos defeitos (Figura 10E), a pele foi suturada em um único plano com pontos
simples e separados de fio de sutura mononylon 5.0 (J&J Ethicon®, São Paulo, SP,
Brasil) (Figura 10F). As feridas operatórias foram deixadas descobertas e todos os
animais receberam medicação anti-inflamatória e analgésica por meio de injeção
intramuscular de Maxicam® (Ourofino Pet®, Cravinhos, SP, Brasil) 1mg/kg, em dose
única. Para a recuperação anestésica, os animais foram devolvidos aos mini
isoladores, recebendo ração e água à vontade.
Figura 6: Distribuição dos materiais e dos animais de acordo com os períodos experimentais.
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Figura 7: Procedimentos cirúrgicos realizados para implantação dos biomateriais. (A) Tricotomia e antissepsia da região; (B) Incisão e descolamento do periósteo para exposição do plano esquelético; (C) Fresa trefina de 8 mm de diâmetro posicionada no centro da calvária; (D) Defeito crítico realizado preservando as camadas da meninge; (E) Defeito preenchido com as microesferas do biomaterial; (F) Sutura realizada com pontos simples interrompidos.
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Decorridos os períodos experimentais de 30, 90 e 180 dias sem apresentarem
qualquer sinal inflamatório ou necrose nas regiões operadas, os animais foram
avaliados clinicamente e em seguida eutanasiados através de dose letal de
anestésico geral (150 mg/kg de Tiopental). Os blocos ósseos contendo os implantes
de HA e cHA foram removidos com discos diamantados montados em mandril (K. G.
Sorensen®, Cotia, SP, Brasil) para peça reta (Kavo®) acoplado a micro motor elétrico
(Driller BLM 600 Plus®), sob baixa e intermitente rotação, com irrigação constante de
solução salina fisiológica 0,9% (Figura 11A e 11B).
3.3 Processamento das amostras
Cada amostra obtida foi dividida em dois segmentos iguais contendo, cada um, a
metade do defeito. Setenta e duas metades das amostras foram fixadas em solução
de formol tamponado 4% e enviadas ao Laboratório Histotech Lâminas Didáticas
onde foram descalcificadas e incluídas em parafina (Quadro 1) recebendo cortes
seriados de 5μm de espessura, paralelo ao plano sagital e corados com
Hematoxilina e Eosina (HE) (Figura 12B). As outras setenta e duas metades das
amostras não descalcificadas e fixadas com álcool 70º foram incluídas em blocos de
resina acrílica (Quadro 2) no Laboratório de Biotecnologia Aplicada (LABA) da
Universidade Federal Fluminense, sendo cortados e polidos até a espessura de
cerca de 100 μm (Figura 12A).
Figura 8: Procedimentos para obtenção das amostras. (A) Animal eutanasiado com as osteotomias realizadas na calvária mantendo uma margem em torno da árae da implantação; (B) o bloco ósseo contendo o biomaterial implantado que será dividido em duas metades iguais.
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Quadro 1. Seqüência de processamento da amostra descalcificada
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As lâminas obtidas dos blocos descalcificados foram observadas em um
microscópio optico em campo claro (Zeiss - AXIO) e as imagens selecionadas,
capturadas por uma câmera digital (AxioCam – MRC). A análise descritiva da
resposta tecidual aos biomateriais foi realizada em função da presença de tecido
conjuntivo e osso neoformado no defeito criado, além da bioabsorção dos
biomateriais. A histomorfometria foi realizada através do programa Image Pro Plus
6.0® (Media Cybernetics, Silver Spring, EUA) através do qual foi criada uma grade
de 156 cruzes que foi superposta as imagens. Em seguida foram estabelecidas as
classes de Osso Neoformado, Biomaterial, Tecido Conjuntivo, Osso pré-existente e
Figura 9: Amostra dicotomizada e cada metade recebeu um tipo de processamento histológico. (A) metade não descalcificada incluída em resina e (B) Metade descalcificada incluída em parafina.
Quadro 2: Seqüência de processamento da amostra não descalcificada
23
Outros (Figura 13). Os registros quantitativos dessas informações foram
armazenados em um banco de dados elaborado em planilha do software Microsoft
Excel® e transferidos para o software Prism® versão 6.0 utilizado para a realização
da análise estatística. A descrição quantitativa da área de tecido conjuntivo e da
área de osso neoformado foi representada através de descrição paramétrica com
médias e desvio padrão. As medidas de variabilidade foram avaliadas com
significância de 5% (α=0,05). Para comparar as variáveis da área de osso
neoformado, de tecido conjuntivo e biomateriais, foram utilizados o teste de Análise
de Variância e o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis*, indicando as diferenças
entre os períodos. A análise estatística entre os grupos experimentais e o controle foi
realizada através da comparação entre a quantidade de área de osso neoformado e
de tecido conjuntivo na área do defeito crítico além da presença do biomaterial
remanescente em cada período experimental.
As lâminas obtidas dos blocos não descalcificados com 100 µm de espessura
foram analisadas microscopicamente pela técnica de microscopia de Luz
polarizada, realizadas no Laboratório de Biomineralização da Universidade Federal
do Rio de Janeiro (Rio de Janeiro, RJ).
*Utilizado devido ao fato dos resultados do teste paramétrico não terem apresentado
normalidade
Figura 10: Imagem representativa da grade de 156 cruzes e os pontos considerados (Image ProPlus® 6.0).
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4 – ARTIGO (Formatado para a revista Journal of Biomedical Materials Research
Part B)
THE SYNTHESIS TEMPERATURES INTERFERE ON BIOLOGICAL RESPONSES
OF CARBONATED HYDROXYAPATITE/SODIUM ALGINATE
Marcelo José Uzeda – Student Graduate, Dentistry School, Fluminense Federal
University, Niteroi, RJ, Brazil.
Adriana T. N. Novelino Alves – MS, Student Graduate, Dentistry School,
Fluminense Federal University, Niteroi, RJ, Brazil.
Rodrigo F. B. Resende – MS, Student Graduate, Dentistry School, Fluminense
Federal University, Niteroi, RJ, Brazil.
Alexandre Malta Rossi – PhD, Senior researcher Brazilian Center for Physics
Research, CBPF, Rio de Janeiro Brazil, Coordinator LABIOMAT - Biomaterials
Laboratory from Brazilian Center for Physics Research.
José Mauro Granjeiro – PhD, Senior Researcher from Bioengineering Program,
National Institute of Metrology, Quality and Technology, Duque de Caxias, RJ, Brazil.
Associate Professor, Dentistry School, Fluminense Federal University, Niteroi, RJ,
Brazil.
Monica Diuana Calasans-Maia PhD, Associate Professor of Oral Surgery, Dental
Clinical Research Center, Oral Surgery Department, Dentistry School, Fluminense
Federal University, Niteroi, RJ, Brazil.
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Corresponding author:
Marcelo José Uzeda
R. Cel. Moreira César 229/1120 -
Niterói
24230-052 – Rio de Janeiro – Brazil
Tel.: 55 21 99884674
Reprint:
Marcelo José Uzeda
R. Cel. Moreira César 229/1120 -
Niterói
24230-052 – Rio de Janeiro – Brazil
Tel.: 55 21 99884674
26 ABSTRACT: With the goal of establishing the best temperature for synthesis, this
study evaluated the biological behavior of carbonated hydroxyapatite containing
sodium alginate (cHA) synthesized under three different temperatures (5°C, 37°C
and 90°C) and compared to stoichiometric sintered hydroxyapatite. Seventy-two
Wistar rats were divided into four groups of 18 animals each and distributed over
three experimental periods of 30, 90 and 180 days (n=6). Critical size defects were
produced in the rat calvaria and filled with biomaterials according to each
experimental group. Decalcified samples were histologically processed as follows;
after being embedded in paraffin, the samples were cut into 5 μm-thick sections and
stained with hematoxylin and eosin (HE) for light microscopy and histomorphometric
evaluation. Polarized light microscopy was used to evaluate newly formed bone in
the samples. The results showed that cHA synthesized at 37°C (p<0.05) had the
highest resorption capacity, while cHA synthesized at 5ºC led to greatest amount of
new bone formation (p<0.05). There was only one animal in the cHA 5ºC group after
180 days that showed complete closure of the critical-size defect with newly formed
bone. According to the results obtained, we conclude that the synthesis temperature
of biomaterials influences biological responses, resorption and bone repair.
KEY-WORDS: Carbonated hydroxyapatite, Bone repair, Osteoconduction, Critical-
size defect, Rats.
RUNNING HEAD: cHA Under Different Synthesis Temperatures in Rat Calvaria
27
INTRODUCTION:
To regenerate bone tissue lost from surgical removal due to trauma, cancer or
other pathologic conditions, autografts, or healthy bone from the host, have always
been the ideal choice to fill the defect site1. The consensus is that autogenous bone
grafts are the gold standard among all bone substitutes. However, there are
restrictions such as its limited availability (and higher cost) due to the need for a
second surgical site to obtain it (donor area) and increased morbidity with the need
for a longer period of patient recovery and the increased risk of infection1-4.
Additionally, the degree of their resorption during the healing period is unpredictable.
Given this reality, it is imperative to develop artificially prepared materials that work
efficiently as bone substitutes, thus creating an excellent alternative.
Because it has similar physicochemical characteristic to those of dental
tissues and bone, calcium phosphate ceramic has been intensively studied in recent
decades. Among them, hydroxyapatite (HA; Ca10(PO4)6(OH)2) has been widely
applied as a bone substitute for several decades, is the most widely investigated and
used bone substitute and plays a large role in orthopedic and maxillofacial surgery5-9.
Biocompatibility and bioactivity are key characteristics required for these
materials to perform the desired functions. HA is the main constituent of the inorganic
phase of bone and has chemical and structural features that allow its use in the
medical field as biocompatible implants and prostheses10,11. In maxillofacial surgery,
HA is used both in the preservation of alveolar bone after extraction and to augment
bone area that is deficient through either physiological resorption or even destructive
pathologies12-14. However, HA is scarcely resorbed and remains in the body for an
extended period of time, so replacement with new bone tissue is very minimal. After
sintering, HA loses the characteristics of a nanostructured material, which reduces its
28
ability to be resorbed15. Because human bone is a nanocomposite, the loss of these
nanostructural characteristics by HA leads to low similarity with the tissue that it is
meant to mimic16,17.
Due to these variations, several properties have yet to be determined to ensure
its appropriate behavior "in vivo”. The control of these parameters is of utmost
importance, as they will vary depending on the methodology used to prepare the
sample and the treatments performed after its synthesis. Motivated by these
difficulties and to broaden the therapeutic capacity of HA, modification of its chemical
composition by replacing either the phosphate group (PO4) and/or hydroxyl group
(OH) with carbonate (CO3) led researchers to the synthesis of a carbonated
hydroxyapatite. Without heat treatment, it remains a nanosized ceramic that
overcomes the limitations cited above. The synthesis of carbonated hydroxyapatite
and its association with resorbable polymers makes it more similar to natural bone in
order to encourage its properties as an osteoconductive agent and to facilitate its
processing in forms that can be used in clinical applications18,19. Therefore, the aim of
this study was to establish the best synthesis temperature for nanostructured
carbonated hydroxyapatite containing sodium alginate (cHA) by observing its
properties of osteoconduction and resorption and bone repair.
29
MATERIALS AND METHODS:
Biomaterial Processing
In this study, 425 to 600 μm microspheres composed of nanostructured
carbonated hydroxyapatite containing sodium alginate prepared by a wet
precipitation method and containing 6 wt % CO3, with stoichiometry ranging between
1.6 < Ca/P <2.0, as well as stoichiometric HA microspheres (Ca/P=1.67), were
synthesized and characterized in the Biomaterials Laboratory (LABIOMAT) of the
Brazilian Center for Physics Research (CBPF). The cHA was synthesized at 3
different temperatures (5ºC, 37ºC and 90ºC) without receiving heat treatment (not
sintered), thus maintaining their nanoscale features, while HA was synthesized at
90°C with thermal treatment (sintering at 1100°C). Prior to implantation in the rat
calvaria, the biomaterials were characterized by scanning electronic microscopy
(SEM – JEOL FEG 250) to examine the spheres’ morphology and their surface.
Vibrational spectroscopy with Fourier-transformed infrared (FTIR – Prestige 21,
Schimadzu) was performed to determine the chemical groups present, and the
crystalline mineral phases present in the samples and their crystallinity were
examined by X-ray diffraction (XRD – CuKa Radiation, ZeissHZG4). The biomaterials
were packaged and sterilized by gamma irradiation (15 kGy/sample – Cobalt 60
irradiator at a dose rate of 19.72 Gy/min for 760 minutes).
Animals and Protocol Design
This project was approved by the Ethics Committee on Animal Use of
Fluminense Federal University (CEUA / UFF) number 194/10, and the procedures
performed followed the CONCEA Guidelines of Euthanasia Practice20.
30
Seventy-two male Wistar rats of both genders and weighing between 300 and
400 grams were divided into four groups of 18 animals each distributed over
experimental periods of 30, 90 and 180 days. Each group was divided into 3
subgroups of 6 individuals for each biomaterial and experimental period. The animals
underwent general anesthesia with 20 mg/kg ketamine (Francotar®, Virbac, São
Paulo, Brazil) and 1 mg/kg Xylazine (Sedazine®, Fort Dodge, USA) intraperitoneally.
After noting the absence of pain reflexes, trichotomy and antisepsis of the calvaria
were performed. A semilunar incision was made on the calvaria of each animal. After
the incision and subperiosteal detachment, a surgical defect was created using an 8
mm internal diameter trephine drill at intermittent low speed (1200 rpm) coupled to a
16:1 handpiece and micro-electric motor with profuse irrigation with 0.9 % sodium
chloride. The critical-size defects created were filled with around 1g the biomaterials
according to their experimental groups. After filling the defect with cHA microspheres,
the skin was sutured in a single plane with simple interrupted sutures with mononylon
5.0 (J&J Ethicon®, São Paulo, Brazil). The wounds were left uncovered, and all
animals received anti-inflammatory medication by intramuscular injection of a single
dose of Maxicam® 1 mg/Kg (Ourofino Pet, Cravvinhos, SP, Brazil). For recovery from
anesthesia, the animals were returned to the isolators and received food and water
ad libitum. After 30, 90 and 180 days and without presenting any inflammatory signs
in the operated area, the animals were euthanized with an overdose of general
anesthetic (Thiopentax®, 150 mg/kg; Cristália, São Paulo, Brazil). Bone blocks
containing the cHA and HA implants were obtained and divided into two equal
segments, each containing half of the defect. Seventy-two halves of the samples
were decalcified and embedded in paraffin and were then sliced into serial sections
of 5 μm thickness transverse to the plane of the implant, then stained with
hematoxylin and eosin (HE). The slides obtained from the decalcified blocks were
31
observed with bright-field light microscopy, and images were captured with a digital
camera. A descriptive analysis of the tissue response to the biomaterials was
performed due to the presence of connective tissue and newly formed bone in the
defects beyond the resorption of the biomaterials. Histomorphometric evaluation was
performed using Image-Pro Plus® 6.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland,
USA). Quantitative records of this information were stored in a database developed in
Microsoft Excel® spreadsheet software and transferred to Prism® 6.0 software
(GraphPad Software, Inc., California, USA) for statistical analysis. A quantitative
description of the connective tissue area and the area of newly formed bone was
performed by parametric description with means and standard deviations. Variability
measures were evaluated with a significance level of 5 %. To compare the variables
in the areas of newly formed bone, connective tissue and biomaterials, analysis of
variance (ANOVA) and the Kruskal-Wallis test were used to investigate the
differences between periods. Statistical analysis between experimental and control
groups were performed by comparing the amount of area of newly formed bone and
connective tissue in the critical defect and the presence of the remaining biomaterial
for each experimental period. The other 72 halves of the samples were not
decalcified and were embedded in methylmethacrylate in the Laboratory of Applied
Biotechnology (LABA) at Fluminense Federal University; they were then cut and
polished to a thickness of approximately 100 µm. These halves were analyzed using
polarized light microscopy (Zeiss Axioplan) at the Biomineralization Laboratory,
Biologic Science Institute, Rio de Janeiro Federal University, Rio de Janeiro, Brazil.
32
RESULTS
SCANNING ELECTRON MICROSCOPY
The analysis of the biomaterials by SEM that was performed before
implantation showed that cHA synthesized at 5º C had denser and more amorphous
surface morphology when compared with the other cHAs and HA. HA had higher
surface roughness compared to all other materials (Figures 1 and 2).
X-RAY DIFFRACTION
The XRD patterns of the cHA showed peaks corresponding to a standard
hydroxyapatite (PCPDFWIN 09.0432 / CBPF). It was noted that as the synthesis
temperature decreased, there was a broadening of peaks characteristic of a
decrease in material crystallinity (Figure 3). This decrease in crystallinity has a direct
influence on the degree of dissolution of these materials.
VIBRATIONAL SPECTROSCOPY WITH FOURIER-TRANSFORM INFRARED
The vibrational spectra with Fourier-transform infrared spectroscopy of
samples prepared at different temperatures showed that the bands correspond to a
hydroxyapatite pattern (PCPDFWIN 09.0432 / CBPF). We observed intense and wide
water bands as well as carbonate ions, showing that replacement had occurred as
expected. We also observed bands characteristic of phosphate ions (Figure 4).
DESCRIPTIVE ANALYSIS BY LIGHT MICROSCOPY
Newly formed bone growing from the periphery toward the center of the critical
defect was observed in all samples from all groups and all experimental periods
(Figure 5).
33
After 30 days, all defects observed were filled with fibrous connective tissue with
dispersed moderate mononuclear inflammatory infiltrate in samples of cHA and
moderate to intense mononuclear inflammatory infiltrate in samples of HA. In
samples of cHA 5ºC, biomaterial islands surrounded by giant cells (MGCs) were
noted. In samples from the cHA 37ºC group, it was noted that the MGCs surrounding
the biomaterial were more dispersed and less concentrated. In addition, small islands
of newly formed bone covered with osteoblasts encompassing the biomaterial were
observed in the middle of the defects. Samples of cHA 90°C and HA showed the
biomaterial as dispersed particles surrounded by MGCs.
After 90 days, we observed sparse inflammatory infiltrate in cHA samples and
moderate inflammatory infiltrate in the HA group. In the cHA 5ºC group, we observed
the presence of the biomaterial surrounded by small MGC islands. The cHA 37°C
samples showed little residual biomaterial, and in only one specimen from this group,
the formation of a bridge of newly formed bone was observed. In the cHA 90ºC
group, the presence of abundant residual biomaterial surrounded by MGCs and
islands of new bone formation involving the biomaterial was noted. Small pieces of
biomaterial surrounded by MGCs were also observed in the samples of HA .
After 180 days, samples of cHA synthesized at 5ºC showed new bone formation in
the proximity of the defects involving the biomaterial, and thick connective tissue rich
in collagen fibers filling the centers of the defects. In samples from cHA 37º C, a
sparse presence of the biomaterial was observed as well as a small amount of newly
formed bone. Scarce fragments of biomaterial were also observed in samples of cHA
90° C, and as in the cHA 5ºC, we also observed peripheral hyalinization of the
biomaterial. In the HA samples, small particles of the biomaterial were observed
surrounded by many MGCs and moderate mononuclear inflammatory infiltrate
34
(Figure 6). In the cHA 5°C group, there was one animal that had complete closure of
the critical defect with newly formed bone involving the biomaterial islands (Figure 7).
STATISTICAL ANALYSIS
The ANOVA showed significant differences (P<0.05) when the presence of
newly formed bone, biomaterial and tissue were compared among the four groups at
their respective experimental periods. The nonparametric Kruskal-Wallis test,
performed to compare new bone formation between experimental periods, showed
P<0.05 for cHA 5°C and cHA 90°C between 30 and 180 days and for HA between 30
and 90 days. The other comparisons were not statistically significant. The volume
density analysis showed a gradual increase of new bone formation in the cHA 5°C
group after 180 days in greater proportions than in the other biomaterials in the same
time period. At 30 days, samples of cHA 37°C showed more new bone formation
than other biomaterials, peaking at 90 days and decreasing slightly at 180 days. Both
the cHA 90°C and the HA showed a pattern of increasing bone growth in consecutive
experimental periods but on a smaller scale than cHA 5°C and cHA 37°C (Figure 8).
Regarding the volume density of the remaining biomaterial samples, the cHA 5°C
showed little resorption at all experimental periods, as did the cHA 90°C and HA,
although to a lesser extent. However, the cHA 37°C had little remaining biomaterial
since the experimental period of 30 days (Figure 9).
POLARIZED LIGHT MICROSCOPY
The samples examined by polarized light microscopy confirmed the results observed
previously. All biomaterials showed potential osteoconductive capacity. However, we
observed that the largest birefringence in the cHA groups suggested greater
osteoconductive capacity when compared to the HA group (Figure 10). Once again,
35
this calls attention to the greater resorption capacity of cHA 37° C in the three
experimental periods compared to that of the other cHAs and HA.
36
DISCUSSION
The animal model used was adequate, relatively simple to perform and
supported previous studies21,22. Only critical-size defects allow the determination of
biomaterial efficacy. According to our results and those of others, critical-size defects
of 8 mm in rat calvaria were unable to spontaneously self-regenerate even after 6
months23.
Sintering temperature influences crystallinity24, and together with the chemical
composition and particle size, crystallinity affects the solubility of ceramics25.
Following these principles, the tested biomaterials received no heat treatment,
causing low levels of crystallinity that were confirmed in the XRD spectra. We
emphasize that these materials were not pressed during processing, and their
resulting low crystallinity had a direct relationship with the rates of resorption
observed when compared to those of the control group. The presence of pores in the
granules of biomaterials favors osteoconduction and allows bone growth in the
pores26,27. The polymer, sodium alginate, was associated with the biomaterial
because of its biological inertness, porosity and biodegradation capacity, which
permits easy dissolution in a biological environment and allows synthesis with
spherical morphology28,29.
Nanostructured carbonated hydroxyapatite containing sodium alginate (cHA)
was shown to be an alternative bone substitute biomaterial to stoichiometric
hydroxyapatites, confirming results from studies of calcium phosphates30-31. Recent
studies concluded that the reaction temperature is the key parameter for both the
initial decomposition of calcium carbonate particles and the formation of carbonated
hydroxyapatite32. Their combination of biocompatibility and low crystallinity (due to
the absence of sintering during synthesis) gives cHAs the ability to maintain their
37
nanoscale structural dimensions, which are similar to those of the apatite found in
bones and teeth, and thereby increases their solubility33. Similarly to other authors,
we observed in this study that the lower the synthesis temperature was, the more
amorphous the biomaterial became, which directly affected its ability to dissolve in
biological environments15. In agreement with a study that compared sintered and
non-sintered nanoHA, we also observed the better capacity of non-sintered,
nanostructured biomaterials to repair bone34.
Although all of the biomaterials showed osteoconductive capacity, the cHA
5°C, more amorphous and less crystalline, and the cHA 37°C showed a higher
capacity for bone formation than the others. However, the cHA 5°C had the worst
resorption capacity, in contrast to studies in mice that compared subcutaneous cHA
5°C and sintered HA 90°C 35. Despite the complete closure of the critical-size defect
in one animal, which has not been observed in any similar studies, the abundant
presence of the biomaterial among the newly formed bone in all samples even after
180 days leads us to question the potential clinical indications for this biomaterial.
However, the cHA prepared at a temperature of 37°C, less amorphous and more
crystalline than cHA synthesized at 5°C; showed a higher resorption capacity, and
the observations at 90 days suggesting its almost complete degradation indicate that
it was the most balanced bioactive material among all the materials studied, with a
more efficient ratio of bone formation to bone resorption. We also note the decreased
amount of inflammatory infiltrate in the cHA samples compared to that in the HA
samples, which is similar to observations from another study36.
The samples examined by polarized light microscopy confirmed the histological
analysis by light microscopy showing the high osteoconductive potential of cHAs37.
The collagen fibrils of the new bone around the spheres had a different organization
38
from the collagen fibrils in the native bone. The histological findings were not similar
between groups 90 days after implantation. This technique was performed to further
characterize the regions around the spheres.
Based on this study, we conclude that the nanostructured carbonated
hydroxyapatites/sodium alginate are bioactive materials presenting optimal
osteoconductivity and biocompatibility and can be used as bone substitutes in clinical
applications. We also conclude that the synthesis temperature and subsequent heat
treatment (sintering) are directly related to the resorption and osteoconductive
properties of these biomaterials.
39
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44
FIGURES AND LEGENDS:
Figure 1: Micrographs of the materials characterizing the surface
morphology of the samples according to the experimental groups
(magnification 3000X).
Figure 2: Micrographs of the materials characterizing the surface
morphology of the samples according to the experimental groups
(magnification 100X).
45
Figure 3: XRD patterns of implanted materials; note that the lower the
temperature of synthesis is, the lower the peak intensity and the wider the base
are.
Figure 4: FTIR spectra showing the presence of bands of water, CO3 and PO4
in biomaterials synthesized at the three temperatures.
46
Figure 5: Presence of newly formed bone from the periphery to the center
of the defect in 4 groups after 30 days. Arrows - direction of growth.
Traces - boundary between native and newly formed bone. A. cHA 5°C;
B. cHA 37°C; C. cHA 90°C and D. HA
Figure 6: After 180 days. A. cHA 5°C - collagenized tissue surrounding the
biomaterial; B. cHA 37°C - rare presence of biomaterial; C. cHA 90°C - peripheral
biomaterial hyalinization; D. HA - moderate mononuclear inflammatory infiltrate
involving the biomaterial and CGM (magnification 20X).
47
Figure 7: Complete filling of critical defect by new bone formation
in a sample of cHA 5°C after 180 days. Dotted line - limits the
periphery of the defect (mounting on magnification 10x).
Figure 8: Volume density of Newly formed bone at 30,90 and 180 days
48
Figure 9: Volume density of remaining biomaterial at 30, 90 and
180 days
Figure 10: Polarized light microscopy after 90 days. A. cHA 5°C; B. cHA 37°C; C. cHA 90°C and D. HA
49
5- CONCLUSÕES
Concluímos que as hidroxiapatitas carbonatadas nanoestruturadas são
biomateriais bioativos apresentando ótima osteocondutividade e biocompatibilidade
podendo ser usados como substituto ósseo de excelência. Concluímos também que
a temperatura de síntese bem como o tratamento térmico posterior (sinterização)
tem direta relação com as propriedades de bioabsorção e osteocondução desses
biomateriais. As cHA sintetizadas a 5°C e 37°C são mais osteocondutoras que as
demais, enquanto que as cHA sintetizadas a 37°C são mais bioabsorvíveis.
50
6 - ANEXO 1 – CEUA/NAL