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Research Collection

Doctoral Thesis

Präparative und kinetische Untersuchungen an micellartigenCobyrinsäurederivaten

Author(s): Munk, Wolfgang

Publication Date: 1994

Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-000971816

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Ofss. ETH fiX-3Dissertation ETH Nr. 10524

Praparative und kinetische

Untersuchungen an miceiiartigen

Cobyrinsäurederivaten

ABHANDLUNG

zur Erlangung des Titels eines

Doktors der Naturwissenschaften

der

EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE

ZÜRICH

vorgelegt von

WOLR3ANGMUNK

dipl. ehem. ETH

geboren am 3. Mai 1963

aus der

Bundesrepublik Deutschland

Angenommen auf Antrag von

Prof. Dr. B. Kräutler, Referent

Prof. Dr. St. Benner, Korreferent

Zürich 1994

Alle Rechte vorbehalten

© 1994, Redaktion: Wolfgang Munk

Druck: Stiftung Zentralstelle der Studentenschaft der Universität Zürich

Meinen Eltern und Claudia gewidmet

Gegenwind bringt Auftrieb

Bedanken mochte ich mich bei meinen Kollegen im Labor CHN F 61: Frau Yajing Feng, Dr.

Narla Gowriswari, Dr. Christian Lehmann, Dr. Maria Ngu, meinen anderen Kollegen im

Laboratorium für organische Chemie und all jenen ETH-Angehörigen, welche durch ihre

moralische Unterstützung und menschliche Atmosphäre zum Gelingen dieser Arbeit

beigetragen haben.

Danken möchte ich auch meinen Eltern für die finanzielle Unterstützung, ohne die diese

Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Diese Arbeit wurde teilweise durch einen

Forschungskredit der ETH Zürich gefördert.

I

INHALTSVERZEICHNIS

ZUSAMMENFASSUNG

SUMMARY

ALLGEMEINER TEIL

1. Einleitung

1.1 Bedeutung des Cobalamin

1.2 Die Kobalt-Alkyl-Bindung

1.3 Micellenmoleküle

1.4 Wirt-Gast-Komplexe

1.5 Der Käfigeffekt

1.6 Arbeitshypothese

2. Synthetische Arbeiten

2.1 Synthese des 1 ,N6-Ethenoadenosylcobalamin

2.2 Synthese micellartiger Cobyrinsäurederivate

2.2.1 Synthese der Cobyrinsäure

2.2.2 Synthese des miceiiartigen Cobyrinsäurederivates Heptakalium-

dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-

decyl-10'-carboxylat)

2.3 Alkylierungen

2.3.1 Methylierung

2.3.2 Adenosylierung

2.3.3 Alkylierungen mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat unter Natrium¬

borhydridreduktion

2.3.4 1 ,N6-Ethenoadenosylierung

2.4 Synthese der Gastmoleküle

Wirt-Gast Komplexe des miceiiartigen Cobyrinsäurederivates

3.1 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen

3.2 5'-0-Tosyladenosin

3.3 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat

Reduktionskinetik

Kinetik der Methylierung und Adenosylierung

EXPERIMENTELLER TEIL

6.1 Allgemeine Bemerkungen

6.1.1 Apparative Ausstattung

6.1.2 Standard-Arbeitsabläufe

6.1.3 Qualität der verwendeten Chemikalien

6.1.4 Verzeichnis der Abkürzungen

6.2 Synthese des 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin

6.3 Orientierende Experimente zur Synthese einiger Organocobalamine und

von Dicyanocobalamin

6.3.1 Methylcobalamin

6.3.2 Ethylcobalamin

6.3.3 Vinylcobalamin

6.3.4 Dicyanocobalamin

III


6.4.1 Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat

6.4.2 Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-c-lacton

6.4.3 Dicyano-Co(lll)-heptakalium-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(4-nitro-

phenyl)-cobyrinat

6.4.4 Dicyano-Co(lll)-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(10-tert.butyloxycar-

bonyl-n-decyl)-cobamid

6.4.5 Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-

(n-decyl-10'-carboxylat)

6.5 Praparative Alkylierungen von Co(l)-cobyrinat und Co(l)-cobamido-

N, N', N", N"', N"M, N,

N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)

6.5.1 Hexakalium-Coo-aquo-Coß-methyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -

hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)

6.5.2 Adenosylierungen

* Praparative Synthese

* Synthese via Komplex mit Alkylierungsagenz

6.5.3 Alkylierung mit 1,N6-Ethenoadenosinen unter Natriumborhydridreduktion

6.5.4 1 ,N6-Ethenoadenosylierungen

• Elektrochemische Synthese

• Synthesebeweis durch Dealkylierung


6.6.1 9,10-Dibrom-(4-butyloxy)-anthracen

6.6.2 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat: Synthese und ihre Kinetik

6.7 Orientierende Wirt/Gast-Assoziationsexperimente von Dicyano-

heptakalium-Co(lll)-cobyrinat und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-

cobamido-N, N\ N", N'", N"", N,

N -hepta-(n-decyl-10'-

carboxylat)

6.7.1 Die absoluten und relativen Löslichkeiten der Gastmoleküle in Wasser

6.7.2 Methoden zur Bestimmung des Assoziationsgrades

6.7.3 Bestimmung des Assoziationsverhaltens in wässriger Lösung

6.7.3.1 9,10-Dibrom-(4-butyloxy)-anthracen

• Assoziation in wässriger Lösung

* Phasentransfer Hexan/Wasser

IV

• Phasentransfer Methylenchlorid/Wasser

* Zerfallskinetik des Assoziates mit Heptakalium-dicyano-Co(lll)-

cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)

6.7.3.2 Assoziationsexperimente mit 5'-0-Tosyladenosin

6.7.3.3 Orientierende Experimente mit Methyltosylat

6.8 Wirt/Gast-Assoziationsexperimente von Dicyano-heptakalium-C o

(lll)-cobyrinat und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",

N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) mit 1,N6-

Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat in Deuteriumoxid

6.8.1 Lumineszenzexperimente

6.8.1.1 Totallumineszenzspektren von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat

6.8.1.2 Konzentrationsreihe des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat in D2O

6.8.1.3 Bestimmung der Löslichkeit von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat in D20

6.8.1.4 Hydrolyse und Stabilität von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat in D2O

6.8.1.5 Lumineszenzverhalten der Wirtverbindungen Dicyano-heptakalium-

Co(lll)-cobyrinat und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",

N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) sowie ihrer Coa-

aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-derivate

6.8.1.6 Verdünnungsreihe von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat und Hepta-

kalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-

decyl-10'-carboxylat) mit gesättigtem, wässrigen 1,N6-Ethenoadenosyl-

5'-0-tosylat

6.8.1.7 Sättigung einer Konzentrationsreihe von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-

cobyrinat und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",

N ,N' -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) mit 1,N6-Ethenoadenosyl-

5'-0-tosylat

6.8.2 UV/vis-Experimente

6.9 Reduktionskinetik von Co(ll)-cobyrinat und Co(ll)-cobamido-N,N',N",

N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)

V

6.10 Kinetik der Alkylierung von in situ hergestelltem Co(l)-cobyrinat und

Co(l)-cobamido-N,N\N",N"\N""1N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carb.

oxyiat) mit Methyltosylat und 5'-0-Tosyladenosin

7. LITERATURVERZEICHNIS

8. ANHANG

8.1 Nomenklatur der Corrine

8.2 Nomenklatur der Kohlenstoffatome kompletter Corrinoide

8.3 Nomenklatur der 1,N6-Ethenoadenosyle

9. LEBENSLAUF

1

ZUSAMMENFASSUNG

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese einiger Coenzym Bi2-analoger

Corrinderivate und untersucht in kinetischen, präparativen und spektroskopischen

Experimenten das Assoziationsverhalten des micellartig erweiterten Cobyrinsäurederivat

Cobamido-N,N\N",N"\N"",N""',N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) mit ausgewählten

Gastmolekülen (15,16, 22).

Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobamido-N,N',N",N,",N"",N ,

N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (19), das genauso wie die anderen in der

vorliegenden Arbeit synthetisierten Adenosylcorrine (Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-

adenosyl-cobyrinat (20), Hexanatrium-Coo-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)-adenosyl-

cobyrinat (21), Hexakalium-Coo-aquo-Coß-5,-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N""',

N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (18) und 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4)) ein

Derivat des Coenzym Bi2 darstellt, zeichnet sich durch sieben (n-Decyl-10'-carboxylat)-

Ketten an den Propyl- bzw. Acetylsäureamiden des Corrinringes aus. Die Cobamido-

verbindungen 18 & 19 besitzen somit tentakelartige Fortsätze, die die molekulare

Grundlage für die Entstehung eines Käfigeffektes bei Reaktionen im Zentrum des Moleküles,

z.B. am Kobalt, bilden.

Die Synthese des 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) erfolgte auf elektrochemischem Wege,

der allgemein für Cobalamin, die Cobyrinsäure sowie das micellartige Cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) durchführbar ist. Die

direkte Adenosylierung und 1,N6-Ethenoadenosylierung der Co(l)-cobyrinsäure und des

Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) sowie die

Synthese des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-

(n-decyl-10'-carboxylat) (17), welches ausgehend von Cyanocobalamin (10) in einer

bekannten fünfstufigen Synthese zugänglich ist, werden beschrieben.

Eine Assoziation konnte in vergleichenden Experimenten zwischen 5'-0-Tosyladenosin (15)

bzw. 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) auf der einen Seite und Dicyano-

heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) bzw. Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) auf der anderen Seite

nachgewiesen werden.

2

Heptakalium-dicyano-Co(lll) cobamido N,N',N",N"',N"",N ,N hepta-(n-decyl-10'

carboxylat) (17) zeigte bei Assoziationsexperimenten sowohl mit 5'-0-Tosyladenosin

(15) als auch dem 9,10-Di-(4 brombutyloxy)-anthracen (22) und 1,N6-

Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) ausgesprochene Assoziatbildung, wie sie beim Dicyano-

heptakalium-Co(lll)-cobynnat (24) nicht beobachtet wurde Die Assoziation zwischen 5'-

O-Tosyiadenosin (15) und Heptakahum-dicyano Co(lll) cobamido-N,N',N",N'",N"",N,

N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) konnte durch UV/vis-, 1H-NMR- und für das

1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) als Gast zusätzlich durch Totallumineszenz-

spektroskopie bewiesen werden

In Alkytierungsexpenmenten von Co(l)-cornnen mit 5'-0-Tosyladenosin (15) wurde eine

Beschleunigung der Geschwindigkeitskonstanten der Alkylierung für das Co(l) cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) festgestellt, wenn auch die

Bestimmungsfaktoren für dieses Verhalten nicht vollständig aufgeklärt werden konnten

Reduktionsexperimente der Co(ll)-corrtne mit Natriumborhydrid lassen u a einen

Detergenzeffekt der (n-Decyl-IO'-carboxylat)-Ketten als Ursache für die beobachteten

Unterschiede der Alkylierungsgeschwindigkeiten vermuten

S U M M A R Y

In this thesis the synthesis of vanous cornn derivatives analogous to coenzyme B12 (1) is

reported In kinetic, preparative and spectroscopic expenments the association of cobamtdo-

N,N',N",N"',N"",N""',N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylate), a micellular derivative of

cobyrinic acid, with selected potential guest molecules (15,16, 22) was analyzed

Hexasodium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",

N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylate) (19), which as the other adenosylcornnes

descnbed here (hexapotassium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobynnate (20), hexasodium-

Coa-aquo-Coß-5'-(1 ",N6-etheno)-adenosyl-cobynnate (21), hexapotassium-Coa-aquo-

Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl 10'-carboxylate)

(18) and 1,N6-ethenoadenosylcobalamine (4)) is a derivative of coenzyme B12 (1), bears

a (n-decyl-10'-carboxylate) unit on each of the seven side-chains of the cornn ring The

3

CONH2CN

1

KOOCm

KOOC-

(17)

preparative synthesis&

kinetic measurements

Hfi

R,: (20) ; R2:(21)

R,=

R,: (18) ; R2: (19) ; fy.- (30)

7 /

*+

ö (22)

N H—**—

">Ö (15)

CH.

0c)

4^»-^ (16)

uv/vis-spectroscopy

'H-nmr-spectroscopy

c. only:

total luminescence

spectroscopy

4

cobamido Compounds 18 & 19 thus possess tentacle-like structures which can be expected

to result in a cage effect in reactions taking place inside the corrin molelecule e.g. in the

direct vicinity of cobalt.

The synthesis of 1,N6-ethenoadenosylcobalamine (4) was carried out using an

electrochemical method which was shown to be a general method for cobalamine, the corrin

core structure and the micellular cobamido-N,N',N",N"',N"",N""',N -hepta-(n-decyl-

10'-carboxylate). The direct adenosylation and 1,N6-ethenoadenosylation of Co(l)-

cobyrinic acid and Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-

carboxylate) as well as the synthesis of heptapotassium-dicyano-Co(IM)-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylate) (17), the latter accessed

via an established five-step synthesis starting off from cyanocobalamin (10), are reported.

Association could be detected in Solutions in deuteriumoxide by comparison of the behaviour

of 5'-0-tosyladenosine (15) and 1,N6-ethenoadenosyl-5'-0-tosylate (16) with dicyano-

heptapotassium-Co(lll)-cobyrinate (24) and heptapotassium-dicyano-Co(lll)-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylate) (17).

Heptapotassium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-

10'-carboxylate) (17) exhibited a pronounced tendency towards association with 5'-0-

tosyladenosine (15), 9,10-di-(4-bromobutyloxy)-anthracene (22) and 1,N6-

ethenoadenosyl-5'-0-tosylate (16) undetectable with the dicyano-heptapotassium-

Co(lll)-cobyrinate (24). The association between 5'-0-tosyladenosine (15) and

heptapotassium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-

carboxylate) (17) could be verified by means of uv/vis- and 1H-nmr-spectroscopy. In

addition, for 1,N6-ethenoadenosyl-5'-0-tosylate (16) as the guest molecule luminescence-

spectroscopy was employed.

In experiments on the alkylation of Co(l)-corrins with 5'-0-tosyladenosine (15) an

increased rate-constant of alkylation of Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-

(n-decyl-10'-carboxylate) as compared to the cobyrinate analogue was observed. The factors

causing the observed behaviour could not be identified completely and unambigiously.

Experiments on the reduction of Co(l)-corrins with sodium borohydride suggested that the

detergent-like properties of the n-decyl-10'-carboxylates is one of the main sources of the

differences in the rate-constants of alkylation.

5

ALLGEMEINER TEIL

1. Einleitung

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Derivaten des Coenzym B-12 (Adenosylcobalamln,

1), die sich ebenso wie das Coenzym B12 durch eine stabile Kobalt-Alkylbindung

auszeichnen. Diese Adenosyl-Kobalt-Bindung stellt die Grundlage für die biologische

Funktion des Coenzym B12 dar.

Adenosylcobalamln (Coenzym B1Z, 1)

6

1.1 Bedeutung von Methyl- und Adenosylcobalamln

Adenosylcobalamin (Coenzym B12,1) und Methylcobalamin (2) sind für den menschlichen

Organismus essentielle Cofaktoren.

Methylcobalamin (2) katalysiert in vivo den Methyltransfer von N5-Methyltetrahydrofolat

auf Homocystein unter Bildung von Methionin [1, 2]. Methionin entsteht auch als Produkt

der direkten Umsetzung von Methylcobalamin mit Homocystein bei 65-95 °C

(H20/8h/95°C) [3]. Methylcobalamin mit modifizierten Basen (Pseudo Vitamin B12 bzw.

Factor III) ist als Methylquelle und Elektronendonor in der Methansynthese sowie zudem in

bakteriellen Anaerobiern an der Acetatbiosynthese (Acetyl-CoA-Weg) aus C02 beteiligt [1,

2].

Adenosylcobalamin (1) hingegen katalysiert eine Reihe von 1,2-Umlagerungen mit C-C-

Bindungsbrüchen (Glutamat-Mutase, Methylmalonyl-CoA-Mutase, ct-Methylenglutarat-

Mutase), C-O-Bindungsbrüchen (Dioldehydratase, Glyceroldehydratase, Ribonukleotid-

Reduktase) und C-N-Bindungsbrüchen (Ethanolamin-Ammonium-Lyase, L-ß-Lysin-

Mutase, D-a-Lysin-Mutase, Ornithine-Mutase, Leucin-2,3-Aminomutase) [4].

Eine Reihe Coenzym B12-Analoga mit modifiziertem Adenosinteil wurde bereits synthetisiert

[5-9] und einige davon auf ihre Eigenschaften in physiologischen Systemen getestet.

Informationen über die komplementären Apoproteine zu Methylcobalamin (2) und

Adenosylcobalamin (1) liegen nur wenige vor.

Coffey beschäftigte sich zwar mit dem Tracing von Cobalamin in Leberzellextrakten von

Ratten [10], Kumar und Meyer isolierten Bi2-Transportproteine in menschlicher

Körperflüssigkeit [11], Ragsdale et al. reinigten ein zum Methylgruppentransfer befähigtes

Protein, das neben Corrin einen [4Fe-4S]1+/2+-Cluster enthielt [12]. Auch konnten die

corrinbindenden Enzyme aus Leberzellextrakten von Ratten als Apoenzyme der

Methioninsynthetase und S-Methylmalonyl-CoA Mutase identifiziert werden [13, 14], doch

blieb bis heute die Ausgestaltung der aktiven Bereiche des Apoenzyms zu Methylcobalamin

(2) selbst nach einer ersten Kristallisation und Röntgenstrukturanalyse der Cobalamin

bindenden Domäne der Methionin-Synthetase von E. coli [15] praktisch unaufgeklärt.

Ebenso sind die Kristallstrukturen der Apoenzyme zum Adenosylcobalamin (1) weiterhin

unbekannt, selbst nachdem bereits vor einigen Jahren die Kristallisation der

7

Adenosylcobalamin(1)-abhängigen Methylmalonyl-CoA-Mutase des Propionibacterium

shermanii von Marsh et al. [16] und McKie et al. [17] beschrieben wurden.

Da in vitro bei homolytischer Bindungsspaltung des Adenosylcobalamin (1) in

radikalfängerfreier Lösung Zyklisierung in bedeutendem Ausmass beobachtet wird (vgl.

Kapitel 1.2), ist anzunehmen, dass neben der obligaten Substraterkennung eine der

wesentlichen Aufgaben des Apoenzyms ist Stabilisierungsreaktionen, die für die entstehenden

freien Radikale in Lösung typisch wären, z.B. Rekombination und Zyklisierung, zu

verhindern [18]. Eine Reihe von Autoren sehen daneben eine wesentliche Enzymaufgabe in

der Erzeugung einer Deformation des Corrinmoleküles bzw. -ringes, die für die Spaltung der

Kobalt-Kohlenstoffbindung ausschlaggebend sein soll [4, 18-21).

1.2 Die Kobalt-Alkylbindung

Synthese

Die Alkylierung des Kobalts in Corrinen ist in den Oxidationsstufen Co(l), Co(ll) oder

Co(lll) möglich [22-24].

Die gängigste Methode zur Co-C-Bindungsbildung ist die Reduktion des Co(ll)- oder Co(lll)-

corrin zum Co(l)-corrin mit anschliessender Alkylierung des Co(l) unter nukleophilem

Angriff auf ein Alkylhalogenid oder ein anderes Substrat mit geeigneter Abgangsgruppe. Wie

der intermolekulare, radikalische Transfer von Methylgruppen, der in Äquilibrierungsex-

perimenten beobachtet wurde [3, 25, 26], nahelegt ist die Synthese von Alkylcobaltcorrinen

auch radikalisch durchführbar. Für die Cobalamine wurde durch Blaser und Halpern die

praparative Alkylierung des Co(ll)-cobalamin (B12r, 3) mit Alkyhalogeniden gemäss der

Gleichung

2 B12r + R-X = R-B12 + Bi2a + X"

beschrieben [23].

Die Synthese der Acetale der Formylmethylcobalt-cobalamin und -cobaloxim durch

Umsetzung des Co(lll)-cobalamin bzw. -cobaloxim mit Vinylethern in Gegenwart von

Alkoholen und Basen wurde von Silverman und Dolphin untersucht [24], wobei dieser

Syntheseweg allerdings in der Literatur nicht unangefochten blieb [27].

8

Cobalamine besitzen bei der Alkylierung eine ausgesprochene Seltenselektivität Co(l)-

cornne, die bedingt durch ihre äquatoriale 4fach-Koordination durch den Cornnliganden a-

und ß-seitig zugänglich sind, zeigen ß-seitig grosse Nukleophihe. Mechanistische Faktoren

können jedoch zur Bevorzugung der a-seitigen Alkylierung fuhren So entsteht bei der

Alkylierung von Cob(l)ynnsäure-heptamethylester mit Methyltosylat via eine SN2-

Reaktion überwiegend der Co-ß-Methylcob(lll)ynnsäure-heptamethylester während bei

der Alkylierung mit Methyhodid, vermutlich über eine zweistufige Radikaireaktion,

hauptsächlich die Co-oc-Methyl-Konfiguration erhalten wird [28] Den "kompletten"1

Cob(ll/lll)yrinsäuredenvaten wie z B den 5fach koordinierten Co(ll)-Formen ist die

Alkylierung bedingt durch die Blockierung der a Seite durch die Nukleotidkoordination nur

ß-seitig möglich und auch ß-Hydroxo-cob(lll)alamin reagiert aus demselben Grund,

wahrscheinlich über einen n-Komplex als Zwischenstufe [24], nur ß-seitig

Bmdungsdissoziationsenergie

Die Bmdungsdissoziationsenergie (BDE= AHi-AH 1t vgl Abbildung 1, [29]) für die

thermische Homolyse des Coenzym B12 (1) in wässriger Lösung wurde von Halpern et al

mit 26 ± 2 kcal/mol angegeben [20] Finke und Hay schätzten aufgrund kinetischer

Messungen in Ethylenglykol die Bmdungsdissoziationsenergie der Kobalt-Alkylbindung des

Coenzym B-|2 zwischen 30,1 und 34,5 kcal/mol und führten ihr unterschiedliches Ergebnis

auf die unter den Versuchsbedingungen von Halpern stattfindende Heterolyse zurück [30]

Die Bmdungsdissoziationsenergie des basenfreien Coenzym B12-Denvats Adenosylcobinamid,

bei dessen Thermolyse im wässrigen Phosphatpuffer, pH 7, im Umfang einiger Prozente

Heterolyse eintritt, bestimmten sie zu 34,5 ± 1,8 kcal/mol [31]

Die Stabilität der Kobalt-Kohlenstoffbindung eines freien Alkylcorrnns wird nicht nur

durch den Alkylliganden, sondern auch aufgrund des sogenannten trans-Effektes durch den

auf der gegenüberliegenden Seite koordinierenden axialen Liganden beeinflusst [32] So ist

zum Beispiel gemäss der durch Methylgruppentransferexpenmente bestimmen

Gleichgewichtskonstante zwischen Co(ll)cobalamin (3), Co(ll)cobester, Methylcobalamin

(2) und Methylcobester die Co-CH3-Bindung in Methylcobalamin durch die Koordination der

axialen Base bezüglich Homolyse um ca 0,3 kcal/mol gegenüber der base-off Form gestärkt

1 Als "komplett" werden Cornne bezeichnet, bei denen analog dem Adenosylcobalamin (1)

eine Base über weitere Bausteine an das C17 gebundenen ist [22]

9

, [M L]

/TSl äH-l(gis)

1 1

} 1

/ P^l(g»s)

i

M. + L.

M-L

t 1

/ 1

/ 1

1

BDE

+

Abbildung 1: Enthalpiediagramm einer Reaktion in der Gasphase dargestellt für die homo-

lytische Bindungspaltung; AHi: Aktivierungsenthalpie der Hinreaktion; AH.i: Aktivierungs¬

enthalpie der Rückreaktion; BDE: Bmdungsdissoziationsenergie

Die Nukleotidkoordination destabilisiert hingegen gegenüber der Übertragung als formales

Methylanion auf ein Elektrophil um ca. 7 kcal/mol, und stabilisiert um ca. 4,2 kcal/mol

gegenüber der Übertragung der Methylgruppe als formelles Kation auf Nukleophile. Nimmt

man die Korrelation zwischen Basizität und Bindungsstärke in Methylcobalamin als

Anhaltspunkt, so ist im Coenzym B12(1) die Kobalt-Kohlenstoffbindung durch

Basenkoordination gegenüber Homolyse um ca. 0,7 kcal/mol geschwächt.

Spekulationen über die Art und Bedeutung sterischer Faktoren auf die Kobalt-

Kohlenstoffbindung im enzymgebundenen Adenosylcobalamin sind in der Literatur immer

wieder anzutreffen [4, 6, 19, 33, 34]. Was den Einfluss des Nukleotids auf die

Bindungsenergie der Kobalt-Kohlenstoffbindung betrifft, so vermag er für sich allein

genommen nicht die Beschleunigung um mehr als zehn Grössenordnungen der durch das

Enzym katalysierten Reaktionen zu erklären, sodass wahrscheinlich das Nukleotid mehr für

die Bindung des Cofaktors von Bedeutung ist als es zum Co-C Bindungsbruch beiträgt [31].

10

Bindungsbruch

Der Bindungsbruch der Kobalt-Alkyl-Bindung ist homolytisch durch Photolyse und

Thermolyse sowie heterolytisch durch Einwirkung von Cyanid, bei Adenosylcobalamin (1)

und analogen protonierbaren Derivaten auch mit verdünnten Mineralsäuren, durchführbar.

Bei den "kompletten" Cobalaminen wird bei der Cyanolyse gemäss Hogenkamp et al. [35] in

einem ersten Schritt der Alkylrest ß-seitig durch ein Cyanid verdrängt während in den

basenfreien Corrinen ein Cyanid zuerst an der a-Seite koordiniert. Die Geschwindigkeit des

Bruches der Kobalt-Alkylbindung mit Cyanid wird somit durch Basenkoordination

in trans-Position zum Alkylrest beeinflussbar. Die meisten Alkylcobalamine dealkylieren

mit Cyanid in alkalischer Lösung nur sehr langsam, doch verläuft die Dealkylierung von

Corrinen, die a-seitig keine Base koordinieren, bedeutend schneller.

Auch die Natur des Alkylrestes spielt eine Rolle. Coenzym B12 (1) dealkyliert z.B. im

Vergleich zu Methylcobalamin (2) mit Cyanid schnell. Jacobson [7] berechnete für die

Cyanolyse von 1,Ne-Ethenoadenosylcobalamin (4) aus fluorometrischen und spektrophoto-

metrischen Messungen eine Geschwindigkeitskonstante pseudo-erster Ordnung von ca. 0,058

min"1 und für Coenzym B-|2(1), das aufgrund fehlender Fluoreszenzeigenschaften nur

spektrophotometrisch untersucht wurde, einen Wert von 0,050 min-1.

Die Photolyse von Alkylcorrinen erfolgt unter homolytischem Bindungsbruch und

generiert ein Radikalpaar, dessen Geschwindigkeiten von Rekombination, Abfangreaktion und

Abdiffusion in Abhängigkeit von der Grösse des Alkylrestes und der Temperatur in weiten

Grenzen variieren kann.

Abbildung 2 präsentiert eine phänomenologische Beschreibung des Metall-Kohlenstoff-

Bindungsbruches: k-\ stellt die Geschwindigkeitskonstante für die Bildung eines geminalen

Radikalpaares in Lösung und k^ die Geschwindigkeitskonstante für die Rekombination freier

Radikale zu einem geminalen Radikalpaar dar, kc bezeichnet die Rekombination geminaler

Radikale, kd die Abdiffusion der geminalen Radikale voneinander. KaW steht für die Reaktion

eines oder beider Radikale mit einem Radikalfänger [36].

Symons et al. [37] beispielsweise bestrahlten Methyl- (2) bzw. Adenosylcobalamin (1) in

Deuteriumoxid/Deuteromethanol-Glass bei 77 K. Aus dem ESR-Spektrum der

Photolyseprodukte des Methylcobalamin (2), Co(ll)-cobalamin (3) und ein Methylradikal,

11

leiteten sie einen mittleren Radikalabstand von cirka 8,3 A, für die analogen Produkte des

Ethylcobalamin (5), Co(ll)-cobalamin (3) und das Ethylradikal, weit schwächere

Wechselwirkungen und einen vergrösserten Abstand ab. Bei der analogen Photolyse des

Adenosylcobalamin (Coenzym B12,1) [37, 38] wurde erst ab ca. 200 K ein ESR-Spektrum

beobachtbar.

k k

[M-L] ^[M* •L]^M* -L -^rAbfangprodukte

Abbildung 2: Reaktionsmöglichkeiten bei homolytischem Bindungsbruch [36]

Die Quantenausbeuten der Photolyse von Alkylcobalaminen liegen für Wellenlängen zwischen

250 und 570 nm, bei 0,1 bis 0,5 [39]. Die Quantenausbeuten der base-off Form sind

wesentlich kleiner als die der base-on Form. So wurde die Quantenausbeute <D der

präparativen Photolyse für die base-off Form des Coenzym B12 (1) zu <D = 0,04 (pH 1, 470

nm) und für die base-on Form zu * = 0,13 {pH 7, 455 nm, vgl. auch Endicott [40] mit

*45S nm (Coenzym Bu, base-on) * 0,09 ± 0,035) bestimmt [39]. Untersuchungen im

Nanosekundenbereich hingegen lieferten mit *» 0,23 für base-on und <t>= 0,045 ± 0,015

für base-off viel höhere Werte [34].

Produkte des Bindungsbruches

Die anaerobe Thermolyse von Adenosylcobamid, das durch Hydrolyse mit Ce(lll)(OH)3 aus

Adenosylcobalamin (1) partiaisynthetisch zugänglich ist, in wässrigem Phosphatpuffer pH

7 ergibt 6% Adenin, 90% zyklisches 8,5'-Anhydroadenosin (6) sowie 4% 5'-

Deoxyadenosin. In Anwesenheit von 200 Äquivalenten 2,2,6,6-Tetramethyl-piperidinoxid

(TEMPO) verschieben sich die Verhältnisse zu 6% Adenin, 89% 5'-TEMPO-adenosin, < 5%

zyklischem 8,5'-Anhydroadenosin (6) und < 2% 5'-Deoxyadenosin [29]. Bei der anaeroben

Thermolyse von Adenosylcobalamin (1) in Ethylenglykol werden hingegen 60% 8,5'-

Anhydroadenosin (6) und 40% 5'-Deoxyadenosin, mit 2,2,6,6-Tetramethyl-piperidinoxid

im Überschuss praktisch quantitativ 5'-TEMPO-adenosin, erhalten [30].

12

Als Photoreaktionen in aprotischen Lösungsmitteln ist bei den Alkylcobalaminen neben

dem homolytischen Co-C-Bindungsbruch auch die Abspaltung des C(10) Protons möglich

[41].

Die Produkte der Photolyse sind eingehend untersucht worden. Mittels ESR konnten die durch

homolytische Bindungsspaltung aus den entsprechenden Alkyl-(pyridinato)-cobaloxim-

komplexen hervorgegangenen Isopropyl-, Isobutyl-, n-Pentyl- und Cyclohexylradikale in

entgastem Chloroform beobachtet [42] sowie Co(ll)-cobalamin (3) und Alkylradikale als

Photolyseprodukte von in Deuteriumoxid/Deuteromethanol gelösten Organocobalaminen

nachgewiesen werden [37, 43, 44].

Die Produkte der aeroben Photolyse von Adenosylcobalamin (1) sind neben dem Aquo-

Co(lll)-cobalamin (9) das zyklische 8,5'-Anhydroadenosin (6), der Adenosylaldehyd (7)

[45], sowie gemäss Johnson et al. [46] die Adenosin-5'-carbonsäure (8) (Abbildung 3).

Hay und Finke erhielten bei der anaeroben Photolyse von Adenosylcobinamid in Gegenwart

eines 200-fachen TEMPO-Überschusses 97% Tempo-Adenosin sowie 3% 5'-Deoxyadenosin,

in Abwesenheit von Radikalfängern 93% zyklisches 8,5'-Anhydroadenosin (6) und 7% 5'-

Deoxyadenosin [31].

N— N NH, NHj M/j

££1hv/02

OH OH

6

toi * toi*

wOH OH

7

OH OH

8

+ Co(III)- cobalamin 9

Abbildung 3: Produkte des Bindungsbruches von Adenosylcobalamin (1) in aerober Lösung

Anaerobe Photolyse von 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) lieferte 1,N6-Etheno-5',8-

cyclo-5'-deoxyadenosin, aerobe Photolyse den 1,N6-Ethenoadenosin-5'-aldehyd [7] wobei

Co(ll)-cobalamin (3) sofort zu Aquocobalamin (B12a, 9) oxidiert wird.

13

Als Produkte der Cyanolyse des Adenosylcobalamin (1), für die sie einen

Reaktionsmechanismus gemäss Abbildung 4 postulierten, wurden von Johnson und Shaw

[46] Cyanocobalamin (10), welches direkt nach der Cyanolyse in der Dicyanoform 11

vorliegt, Zuckercyanhydrin sowie Adenin isoliert.

Hogenkamp und Oikawa [9] cyanolysierten 2',5'-Dideoxyadenosylcobalamin bzw. 5'-

Deoxythymidylcobalamin unter analogen Bedingungen und erhielten nach Aufarbeitung

ebenfalls Cyanocobalamin (10), sowie Adenin bzw. Thymin.

Abbildung 4: Reaktionsmechanismus der Cyanolyse von Adenosylcobala¬

mln (1) unter Lichtausschluss nach Johnson und Shaw [46]

Kinetik der Reaktionen am Kobaltzentrum

Bei der Reduktion der Co(lll)-corrine Cobyrsäure, Pseudovitamin B12 sowie Faktor III mit

Natriumborhydrid in grossem Überschuss in wässriger Lösung (pH 8,8) zu Co(l) ändert die

Absorption bei 387 nm gemäss Moskophidis [47] mindestens für die halben Umsatz linear

mit der Zeit. Diese Beobachtung legt nahe, dass bei diesen Reduktionen die Lösung des

zugegebenen Natriumborhydrids geschwindigkeitsbestimmend ist.

Für die Umsetzung von Alkylhalogeniden mit Co(ll)-cobalamin (3) in methanolischer

Lösung sowie den Alkylchloriden und -bromiden in wässrigem Medium wurden

Geschwindigkeitsgesetze 2. Ordnung gefunden. Alkyliodide in wässriger Lösung gehorchen

einem Geschwindigkeitsgesetz 3. Ordnung [23]. Für die Seitenselektivität der Alkylierung

von Co(l)-cobalamin ist eine Abhängigkeit von der Abgangsgruppe des Alkylierungsmittels

zu erwarten, wie sie z.B. bei der Alkylierung von Co(l)-cobester mit Methyltosylat und

14

Methyiiodid gefunden wurde [28]. Die Geschwindigkeitsgesetze der Alkylierung von Co(l)-

cobyrinat und Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carb-

oxylat) in Wasser und Methanol und ihre Geschwindigkeitskonstanten sind Gegenstand der

vorliegenden Arbeit.

Die aerobe oder in Gegenwart von 2,2,6,6-Tetramethyl-piperidinoxid als Radikalfänger

durchgeführte thermolytische oder photolytische Homolyse der Kobalt-Kohlenstoff-Bindung

von Alkylcobalaminen folgt einer Kinetik erster Ordnung [20, 30, 39]. Die Photolyse unter

anaeroben Bedingungen ist in der Regel langsamer als in Gegenwart von Sauerstoff oder eines

anderen Radikalfängers und zeigt stärkere Abweichungen von einer Kinetik erster Ordnung

[39, 48]. Die anaerobe Photolyse des Coenzym B12 (1), bei der das bei der Homolyse

entstehende Adenosylradikal zu 8,5'-Anhydroadenosin (6) intramolekular zyklisieren kann,

bildet hiervon eine Ausnahme.

Aus Experimenten zur anaeroben Thermolyse von Adenosylcobalamin (1) in Ethylenglykol,

welche als Produkte 8,5'-Anhydroadenosin (6) und 5'-Deoxyadenosin lieferte, wurden die

Geschwindigkeitskonstanten kcyC|. für die Zyklisierung des Adenosylradikals zum 8,5'-

Anhydroadenosin (6), für die Abstraktion eines Wasserstoffes aus dem Lösungsmittel kabf

und für die Rekombination kcage des Adenosylradikales mit B12r (3) bestimmt zu kcyC|.(110

°C)= 5x105 s-\ kab(. (110 °C)= 7x103M"1s-1 und kcage= 3x108M-1s1 [30]. Diese Werte

entsprechen ziemlich genau der Abschätzung, welche von Chen und Chance [34] mit

Nanosekunden-Spektroskopie für die Photolyse (wässrige Lösung, N2-gesättigt) getroffen

wurde. Chen und Chance bestimmten nämlich kcyoi.(FiT) zu 104 s_1 oder weniger und k^ge zu

108-109M-1S"1.

Die Geschwindigkeitskonstanten der Thermolyse des Kobalt-Kohlenstoff-Bindungsbruches

des Coenzym B12 (1) wurden von Halpern et al. zu k^lOO °C)= (1,00 ± 0,04)x 10~4 s_1

bestimmt [20].

15

1.3 Micellenmoleküle

Als Micellenmoleküle werden nachfolgend Verbindungen bezeichnet, die aufgrund ihrer

Grösse und Eigenschaft andere Moleküle zu solubilisieren einer Micelle ähnlich sind jedoch

ihre micellaren Eigenschaften nicht erst durch das Zusammenwirken eines Ensembles

gleichartiger Moleküle entfalten [49, 50]. Sie wurden vorwiegend als Komplexbildner

hergestellt oder als synthetische Reaktionsräume, doch spielten bei ihrer Konzeption auch

potentielle Anwendungen in der Pharmazie, z.B. eine Reservoirfunktion für ein

Depotpräparat, eine Rolle [50].

Die von Tomalia et al. [51-55] konzipierten Dendrimere (Abbildung 5) unterscheiden sich

von klassischen Polymeren dadurch, dass sie aus drei strukturellen Einheiten bestehen:

einem Kern, nach einem einfachen und einheitlichen Verzweigungsmuster aufgebaute und

sich wiederholende Schichten, und terminalen Funktionen. Dieses Bauprinzip erlaubt eine

kontrollierte Raumerfüllung, Grösse und organische Funktionalität. Maciejewski [56] und

Gennes [57] leiteten aufgrund theoretischer statistischer Arbeiten entsprechende Formeln

her, die die Kettenlängen und Verzweigungsmultiplizitäten der Bauelemente mit diesen

Parametern in Beziehung setzen.

Arborole, ein Konzept von Newkome et al. [49, 58], basieren auf demselben Bauprinzip,

doch werden die Arborole ausgehend von einem "Stamm" synthetisiert und bilden eine

Baumstruktur mit sich regelmässig wiederholendem Verzweigungsmuster, z.B. 12. Die

durch die peripheren Endgruppen gebildete Oberfläche ist konkav gewölbt und kann im

Gegensatz zu den Dendrimeren keine geschlossene Kugel bilden.

Pedersen's Coranden [59] sind zyklische Polyether ("Kronenether") und besitzen im

Gegensatz zu den Kryptanden von Lehn et al. [60] nur eine einzige, brückenfreie

Ringstruktur (z.B. 13, Abbildung 6).

Die von Cram [61] beschriebenen Sphäranden (z.B. 14, Abbildung 6) und die Cyclophane

nach Diederich [62] sind in (poly)-Zyklen angeordnete, (poly)-zyklische aromatische

Kohlenwasserstoffe, die einen Hohlraum weitgehend vorbilden.

Für die Kraken/Tentakel-Moleküle von Vögtle und Weber [63] sowie die "Enzymmodelle"

von Murakami [64] und Suckling [65] sind mehrere an eine zentrale Ringstruktur

angefügte (aliphatische) Ketten charakteristisch.

Letztere synthetisierten Azaparazyklophane mit Alkylseitenketten bzw. Benzol-1,3,5-tris-

(11-pyrimidinium-undecanyl)-tricarboxylat-trichlorid, die in der Lage waren weitgehend

selektiv Gastmoleküle, z.B. 2,2,6,6-Tetramethylpiperidin-1-oxyl und Phenol, zu

inkorporieren.

16

in in in-N CH2CH2C NHCHjCH, N CH2CH2 C NHCHfH2 N CH2CH2 C NHCH2CH2NH2

'

« * >

Kern Wiedeiholungseinheit

vv

'

1 Generation 2 Generation

terminale Funktion

V

Y'

3 Generation

Abbildung 5 "Starburst Dendnmere" nach Tomalia [51-55], oben schematische Darstellung der

Topologie, unten Ausschnitt aus der Molekulstniktur eines Dendnmeren

C»j

£ONHC(CHfiH)3

V ^CONHC(CHfiH)3/° /CO,•ONHC(CHflH)3

ONHC(CHfiH)3

P CONHCiCHfiHhf ^CONHC(CHfiH)3^C\0NHC(CHfiH),

CONHC(CHfiH)3

[27]-Arborol

12

[18]-Krone-6

13 14

Abbildung 6 Em [27]-Arborol (12), [18]Krone-6 (13), ein Pedersen Corand, Beispiel eines

Sphäranden (14)

17

1.4 Wirt-Gast-Komplexe

Das Gebiet der Wirt-Gast-Komplexe wurde von Freudenberg und Meyer-Delius [66]

begründet, welche die Aduktbildung zwischen lod und Cyclodextrinen auf die Einlagerung des

lods in molekulare Hohlräume der Cyklodextrine zurückführten. Seither wurden Wirt-Gast-

Molekülkomplexe, wenn auch biologisch nicht funktionsfähige, synthetisiert, die mit

Enzymen vergleichbare Stabilitäten aufweisen, und Enzymmodelle als Wirt-Gast-Komplexe

hergestellt. Ziel der Wirt-Gast-Komplexierung ist die molekulare Erkennung, selektive

Substratbildung, Katalyse, Regulation und Transport.

Die Wirt-Gast-Komplexchemie ist durch zwei Prinzipien gekennzeichnet: dem Prinzip der

sterischen und elektronischen Komplementarität [61, 62] und dem Prinzip der

Präorganisation der Bindungsstelle vor der Komplexierung [67].

Das Prinzip der elektronischen und sterischen Übereinstimmung (Komplementarität) ist

das für die molekulare Ebene formulierte Schlüssel-Schloss-Prinzip von Emil Fischer

[68]. Das Prinzip der Präorganisation der Bindungsstelle besagt, dass wenn im

Komplexierungsschritt die Bindungsstellen erst durch den eintretenden Gast organisiert

werden müssen, die benötigte Energie auf Kosten der freien Energie für die Komplexbildung

geht und der Komplex als Ganzes destabilisiert wird. Im Extremfall bleibt die Komplexierung

aus.

Als treibende Kräfte bei der Wirt-Gast-Assoziation können je nach spezifischer Situation

der "hydrophobe Effekt", Elektronen-Donor-Akzeptor-Wechselwirkungen, Wasserstoff¬

brückenbindungen oder ionische Kräfte wirken [69].

Mit hydrophobem Effekt wird der, durch die starken Kohäsionskräfte der Wassermoleküle

bedingte, stark positive Entropiebeitrag bei der Freisetzung der Grenzflächen-

Wassermoleküle unpolarer Substrat- bzw. Wirtmoleküle bezeichnet. Bei der

Komplexbildung werden die Wassermoleküle dort von der Oberfläche verdrängt, wo der Gast

einlagert. Wässrige Lösungen können somit Voraussetzung für die Wirt-Gast-

Komplexbildung sein [70].

Unter der Bezeichnung Elektronen-Donor-Akzeptor-Wechselwirkungen versteht man

schwache intermolekulare Wechselwirkungen zwischen elektronenreichen Wirten und elek¬

tronenarmen Gästen bzw. umgekehrt. Diese Wechselwirkungen bestehen hauptsächlich aus

elektrostatischen Wechselwirkungen, Polarisations- und Charge-Transfer-

Wechselwirkungen sowie Dispersionskräften [62].

Den Einfluss von Wasserstoffbrückenbindungen auf die Bildung von Wirt-Gast-Komplexen

illustriert die von Rebek et al. [71] durchgeführte stöchiometrische Komplexierung von

18

Heteroarenen, unter anderem auch 9-Ethyl-adenin, durch nicht makrozyklische,

spaltförmige Rezeptoren.

Nicht bei allen Stoffklassen sind die Bedingungen für eine Wirt-Gast-Assoziation aber

gleichermassen klar. Für Zucker, Aliphaten und Heteroaliphaten fehlen bislang noch wirk¬

same synthetische Rezeptoren. In der vorliegenden Arbeit werden nun die Gasteigenschaften

von 5'-0-Tosyladenosin (15) und 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) untersucht.

Die Methoden zur Untersuchung von Wirt-Gast-Komplexen gliedern sich in vier Gruppen:

die Fest-flüssig- und Flüssig-flüssig-Extraktion, die Bestimmung der Stöchiometrie und

Stabilität der Komplexe durch 1H-NMR-Titration und optische Titration, die kompetitive

Hemmung der Komplexierung eines fluoreszierenden Gasts durch einen

nichtfluoreszierenden Inhibitor, sowie die 1H-NMR-spektroskopische Abschätzung der

Assoziation eines Wirt-Gast-Komplexes in unterschiedlichen Lösungsmitteln [62].

Bei jeder Analyse des Wirt-Gast-Verhaltens, insbesondere apolarer Gast- oder Wirtmole¬

küle ist, wenn aussagefähige Daten erzielt werden sollen, das Selbstaggregationsverhalten

der Wirt- und Gastmoleküle zu untersuchen. Abgesehen von schlecht definierten Wirt-Gast-

Komplexen wird bei manchen Wirten zudem oberhalb der kritischen Aggregationskon¬

stanten eine mit steigender Konzentration zunehmend stärker werdende Linienverbreiterung

der Signale gefunden [62].

Betreffend die a priori Abschätzung der Selbstaggregationstendenz liefern Arbeiten von Die-

derich [62] erste Hinweise darauf, dass Komplexe von Gastkomponenten mit aus dem Hohl¬

raum ragenden ionischen Gruppen eine beträchtlich niedrigere Aggregationstendenz haben.

Unter den analytischen Methoden zum Nachweis von Einschlusskomplexen hat sich die 1H-

NMR-Spektroskopie, vor allem bei den Cyklophanen, durchgesetzt [62, 72]. Sie bietet

neben Informationen zur Kinetik auch Information zur Struktur der gebildeten Komplexe. So

lassen z.B. Signalverbreiterungen auf innerhalb der 1H-NMR-Zeitskala ablaufende

Dekomplexierungsschritte oder Änderungen der chemischen Verschiebungen auf die relative

Lage im Wirt schliessen [72]. Die Fluoreszenzspektroskopie dagegen ermöglicht aufgrund

der Intensität und der Lage des Emissionsmaximums Aussagen über die Polarität der

Bindungsstelle [73, 74].

Als Wirt-Gast-Komplexe sind auch die synthetischen Enzymmodelle zu verstehen. Wie am

Beispiel von Proteasen durch Rebek et al. [75, 76] gezeigt werden konnte, kann die Katalyse

durch das Zusammenwirken der zum Substrat hin konvergierenden Gruppen im aktiven

Zentrum des Enzym bedingt sein. Trotz nur geringer Effekte der einzelnen isolierten

katalytisch aktiven Gruppen wird durch das Zusammenwirken mehrerer aktiver Gruppen die

Reaktion um Grössenordnungen beschleunigt.

19

1.5 Der Käfigeffekt

Die Interpretation chemischer Reaktionen wird in der Regel auf der Basis der aus der Gas¬

phase abgeleiteten Theorie des Übergangszustandes vorgenommen. Der Übergangszustand im

Kontinuum hat sich als Modell für die flüssige Phase jedoch schon lange als unzuverlässig

erwiesen [77]. In der flüssigen Phase werden Phänomene beobachtet, welche sich mit einer

einfachen Theorie des Übergangszustandes nicht mehr vereinbaren lassen. Das Phänomen

magnetischer Feldeffekte auf chemische Radikalreaktionen [78] und CIDNP lassen sich z.B.

ohne Käfigeffekt nicht erklären.

Der Begriff des Käfigeffekt wurde 1934 von Franck und Rabinovitch [79] eingeführt und ist

mittlerweile experimentell und theoretisch gut fundiert. Unter Käfigeffekt verstehen Franck

und Rabinovitch die zeitweise Fixierung eines Reaktandenpaares durch eine Solvenshülle.

Der Käfigeffekt wurde bis anhin in einer Reihe von Reaktionen nachgewiesen. Die ersten

experimentellen Arbeiten nach Franck und Rabinovitch wurden von Noyes für die Photo¬

dissoziation von I2 durchgeführt. 1952 und später untersuchten Williams, Hamill, Schwartz

and Burell unter Verwendung von Radikalfängern eine Reihe organischer und anorganischer

Systeme, welche sowohl thermisch als auch photolytisch initiiert werden. Szwarc et al. be¬

schäftigten sich ab 1954 mit dem thermischen Zerfall von Diacylperoxiden und der Photo¬

lyse von Azomethan und Perfluoroazomethan. Ab 1955 erscheinen Studien von Hammond und

Mitarbeitern über den thermischen Zerfall von Azonitrilen. Breitere Beachtung findet der

Käfigeffekt erst ab 1960 durch Untersuchungen über den Temperatureffekt, den Einfluss

von Viskosität, Radikalfängerkonzentration, Stereochemie, elektrostatischer Ladung bei

geminalen Radikalen, sowie der Entdeckung des Einflusses des Käfigeffekt auf die absoluten

Geschwindigkeitskonstanten. Das Interesse am Käfigeffekt steigerte sich noch durch die

Entdeckung von CIDNP (chemically induced dynamic nuclear p_olarization), einer

spektroskopischen Methodik bei der als Folge einer anormalen Verteilung der Spinzustände

im NMR Emissionssignale entstehen können und dessen Grundlage unter anderem der

Käfigeffekt ist.

Untersucht wurden auch die kompetitive radikalische Bromierung von Toluol [80], ESR-

Spektren bei geminalen Isopropyl-ketyl-Radikalen [81], Isotopenanreicherung bei der

Photolyse von Dibenzylketon [82], die Photolyse von H2O in Ar-Matrix [83] und die

Photolyse von l2, Hl sowie H202 [84]. Balk et al. berechneten das Photolyseverhalten von l2

20

in flüssigem CCI4 und Ethan auch theoretisch [85] Ein dynamischer Käfigeffekt wurde für

Cl2, ICI, CH3I in Edelgasmatizen gefunden Zudem liegen einige Untersuchungen über den

Käfigeffekt in Micellen (z B ESR [86], 13C Anreicherung [82]) und vergleichende

Messungen für Reaktionen in Micellen und freier Lösung vor [81] Jacobson und Bergmann

[87] entdeckten auch in Lösungen von Organoubergangsmetallverbindungen geringer

Viskosität bedeutsame Käfigeffekte

In Übereinstimmung mit der später von Chen et al [34] durch Nanosekunden Photolyse zu

108 109 M 1sec 1 bestimmten Rekombinationsgeschwindigkeit kc des durch die Photolyse

der Kobalt Kohlenstoff-Bindung generierten Radikalpaares in Adenosylcobalamin (1) bei

RT in wässriger Lösung konnten Endicott et al [40] für dieselbe Reaktion durch

Picosekunden Blitzphotolyse für die Rekombinationsgeschwindigkeit kc und die Diffusion kd

zeigen, dass kc= (1,3±1,1) x 109 sec1 und kd= (0,5±0,4) x 109 sec

1

In der flussigen Phase ist die Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation von Molekül

fragmenten geringer als in der Gasphase Die molekulare Grundlage dieses Effektes ist die

Umhüllung der Reaktanden durch Lösungsmittelmolekule, welche die sofortige Entfernung

der Partikel voneinander verhindern Das mittlere Kraftpotential zwischen Molekülen in

Lösung, Radikale eingeschlossen, ist nämlich gewöhnlich anziehend und weist ein relativ

tiefes Minimum beim Abstand der nahesten Annäherung auf [81]

Für die Beschreibung des Käfigs wurden mehrere Modelle entwickelt

Das einfachste mechanistische Modell einer Reaktion in der Gasphase (Abbildung 1)

postuliert, dass bei Überschreiten einer gewissen Energiebarriere (AH1) eine Reaktion

stattfindet, und dass sich die Reaktanden voneinander in die Unendlichkeit entfernen Die

Energiebarriere der Ruckreaktion (AH 1) bezeichnet dementsprechend die, von sich aus dem

unendlichen annähernden Reaktanden benötigte thermische Energie zur erfolgreichen

Ruckreaktion

Zahlreiche theoretische Arbeiten haben versucht, die Realität der flüssigen Phase

angemessen zu beschreiben

Wie am Beispiel der Photolysereaktionen, die sich im Picosekundenbereich abspielen,

besonders deutlich wird, beinhalten chemische Reaktionen in Lösung typischerweise schnelle

oder hochfrequente gelöste Partikeln in relativ langsamen Lösungsmittelmolekulen Die

21

Autokorrelationsfunktion (dx(t)/dt) beschreibt den über das Ensemble gemittelten Zerfall

einer Molekülgeschwindigkeit (v) von einem Ausgangswert v=1 bei t=0 zur Maxwell-

Boltzmann-Verteilung des Gleichgewichts von <v>= 0 bei t= ~.

Das Brownsche Bewegungsmodell, beschrieben durch die Autokorrelationsfunktion

dK(t)/dt= exp[-ßt],

mit ß gleich dem Reibungkoeffizient eines Lösungsmittelmoleküles sagt Dissipation ohne

Oszillation voraus.

Das Modell des starren Käfigs mit dem Ansatz für eine Autokorrelationsfunktion zu

dK(t)/dt= cos(cat)

mit (cot) der Oszillationsfrequenz im Käfig und t der Zeit steht für Oszillation ohne

Dissipation.

Die Realität spielt sich zwischen diesen beiden Extremen ab. Muro, Kubo und Zwanzig [88]

entwickelten daher erstmals ein Mischmodell mit erweitertem, frequenzabhängigem

Reibungskonzept. Kramer [89] leitete für eindimensionale parabolische Barrieren einen

sogenannten "Transmissionskoeffizienten" k ab mit Frequenz coD und £, der reduzierten

Masse des effektiv reagierenden Moleküles:

k= k/kTST= [1+(C/2cob)2]1/2-(C/2cob)

An der zu einer gegenüber der Gasphase (krsT) verringerten Geschwindigkeit wird deutlich,

dass die Anwesenheit eines Lösungsmittel automatisch zu einem Käfigeffekt führt.

Für Radikalreaktionen wurden noch eine Reihe weiterer Modelle entwickelt, um die

Geschwindigkeitskonstanten der Reaktionen zu berechnen. Das einfachste Modell für die

flüssige Phase ist die Smoluchowski-Gleichung für die diffusionskontrollierte Reaktion

sphärischer Reaktanden. Modelle unter Einbezug ionischer Kräfte, nichtsphärischer

Geometrie, statistischer Spinverteilungen und der Käfigeigenschaften von Micellen liegen

ebenfalls vor [84].

Während für sehr einfache Verhältnisse, wie z.B. die Photodissoziation von H20 in einer

Argonmatrix, die Mechanistik aufgeklärt werden konnte [83] ist momentan der Ansatz für

komplexere Systeme die thermodynamische Betrachtungsweise.

22

Die thermodynamische Betrachtungsweise des Käfigeffekts sei anhand des Diagrammes

der freien Energie (AG) (Abbildung 7) für die homolytische Bindungsspaltung (Reaktions¬

schema Abbildung 2) erläutert.

Nach Homolyse (k,) entfernen sich die Reaktionspartner nicht augenblicklich voneinander

sondern verbleiben in nächster Nähe. Die Radikale können nun entweder rekombinieren (kc)

oder den Lösungmittelkäfig verlassen (ka). Frei in der Lösung befindliche Radikale reagieren

endgültig zu Abfangproduken ab (kAbf.) oder treten wieder in eine, ein komplementäres

Radikal umgebende Lösungsmittelhülle ein (k.j).

Abbildung 7 stellt das Diagramm der freien Energie dieser Reaktionen in Lösung dar. Für

jeden der beschriebenen Schritte ist eine Aktivierungsbarriere zu überwinden. Dabei

können selbstverständlich die Summanden AH und TAS jeweils andere Einflussfaktoren und

Abhängigkeiten aufweisen, sodass für AS und AH unterschiedliche relative Barrieren und

Energien möglich sind und der Käfigeffekt keine einfache Temperaturabhängigkeit aufweist

[90].

[M L] [M L] [(M bz»L). R)

rr\ 'AGc

\ : s\—;' V j /A.GA 4 gm

AGl \ \ >>-v

i (M L) Freie Radikale \

; Käfig \

-1 Abfangprodukte

Reaktionskoordinate

Abbildung 7: Schema der freien Energie, AG, für die Bindungshomolyse in Lösung

Koenig und Finke [36] wandten die thermodynamische Betrachtung des Käfigeffektes bei

kobaltorganischen Verbindungen an und prägten dabei den Begriff der fraktionalen Käfig¬

effizienz Fe (Fc= kc/fkc+kd)). Sie stellten fest, dass ohne Kenntnis der Käfigeffizienz die

Reaktionskinetik nicht mit der beobachteten Bindungsenergie AHoi,s korreliert werden kann.

1

ML

Edukt

23

1.6 Arbeitshypothese

Die Geschwindigkeitskonstante für die Homolyse der Adenosyl-Kobalt-Bindung im Coenzym

B12 (1) bei 30 °C ist mit ca. 10"7 sec1 ungefähr 10"9 mal kleiner als die Geschwindig¬

keitskonstante enzymatischer Reaktionen mit Beteiligung des Coenzym B12 [4]. Die

Beschleunigung der enzymatisch katalysierten Umlagerungsreaktionen für Coenzym B12 (1)

um Grössenordnungen verglichen mit der Homolysegeschwindigkeit, die die Adenosyl-

Kobalt-Bindungsenergie erwarten lässt, sind noch unerklärt. Trotz aller Unsicherheiten

über die Konstitution des Reaktionsraumes Coenzym Bi2-katalysierter Reaktionen gilt

jedoch die Rolle des Coenzym B12 (1) als Quelle für ein 5'-Adenosylradikal als gesichert

[11-

Gesucht wurde nun eine Modellverbindung für das Coenzym B12 (1), die einen

Reaktionsraum zur Verfügung stellt, in dem das Adenosyl-Kobait-Radikalpaar möglichst eine

gegenüber dem homogen gelösten Coenzym B12 (1) verlängerte Lebensdauer aufweist.

Ein micellartig erweitertes, mit 2',3'-lsopropylidenadenosyl alkyliertes Cobyrinsäure-

derivat, Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-(2",3"-isopropyliden-adenosyl)-cobamido-N,N',

N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat), war bereits von Stepanek [91]

synthetisiert worden (Abbildung 8a).

KOOCICH^^INOC

CHi

KOOC(CH,)iSINOC

CONHICHJuPOOK

'ICH,

CONH<CH,)j:OOK

KOOC(CH1)U^NOC CONHiCHtlitCOOK

(16 b)

Abbildung 8 a:

24

Es bot sich daher an zu untersuchen, ob das Cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-

(n-decyl-10'-carboxylat) als Reaktionsraum für Reaktionen des Adenosylradikals dadurch

geeignet ist, dass die entstehende Adenosyleinheit mit den N-Hepta-(n-decyl-10'-

carboxylat)en tendenziell assoziiert und so zu einer Verlängerung der Lebensdauer eines

durch Homolyse entstehenden geminalen Radikalpaares führen könnte.

Vom Cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) waren

bereits einige Eigenschaften, die eine Behinderung der freien Abdiffusion der beiden

Fragmente eines Radikalpaares wahrscheinlich erscheinen Hessen, bekannt bzw. Hessen sich

aufgrund der Konstitution ableiten:

Die sieben n-Decyl-10'-carboxylat-Ketten geben dem Cobamido-N,N',N",N'",N"",

N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) eine micellartige Konstitution

(Abbildung 8b).

0%3^

CONHfCHJifiOOKV

- CH1 f-CONH(CH,)„fOOKKOOC(CH,),JmOC

KOOCfCH3)lcflNOC

CONHtCHJtfiOOi

VYKOOCiCHJxflliOC CONHICHJ^OOK

Q hydrophiler Teil

I lipophiler Teil

Schematische Darstellung einer Micelle Struktur des Heptakalium-dicyano-Co(III)-cobamido-N,N,,N",N'",N"",N,"",N -

hepta-(n-decyl-lO'-carboxylat) (17)

Abbildung 8 b

25

In Organoübergangsmetallverbindungen sind Käfigeffekte ein anscheinend

verbreitetes Phänomen [87] (Abbildung 8c).

[M-L] t~> [Ü #L] £. M L* ---->

Eduktkc k-l

Radikalpaar freie Radikale

kl = Homolyse

kc = Bindungsbildung

kd = Diffusion zu freien Radikalen

k-l= Rückbildung des Radikalpaares

M=Co,Wetc.

Abbildung 8 c

Die Kobalt-Kohlenstoff-Bindung in Alkylcobyrinaten und Alkylcobamido-N,N',N",

N'",N"",N ,N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)en [91] ist photolytisch unter

Homolyse spaltbar (Abbildung 8d).

Folge¬produkte

Abbildung 8 d

26

Das bei der Synthese von Hexakalium-2',3'-isopropylidenadenosyl-aquo-Co(lll)-

cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) eingesetzte

Alkylierungsmittel 2',3'-lsopropyliden-5'-tosyl-adenosin liess sich nur mit

Schwierigkeiten vom Produkt abtrennen [91] (Abbildung 8e)

Abbildung 8 e

Inwieweit das Cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n decyl-10'-carboxylat)

einen Reaktionsraum für durch Homolyse seiner Alkylderivate entstandene Radikalpaare

darstellt, sollte über das Assoziationsverhalten mit den abgespaltenen Fragmenten ähnlichen

Verbindungen untersucht werden können Dazu boten sich einerseits das 5'-0-Tosyladenosin

(15), andererseits das fluoreszierende l,Ne-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) als

Probemoleküle an Beide Verbindungen ermöglichen als Alkyherungsagenzien durch

Umsetzung mit Co(l)-cornnen die Synthese Coenzym B12-analoger Verbindungen Ein

eventuelles Assoziationsverhalten sollte sich über Konzentrationsbestimmung mit

verschiedenen spektroskopischen Methoden (UV/vis- & 1H-NMR-Spektroskopie)

bestimmen lassen Die Lumineszenzspektroskopie ermöglicht zudem eine Aussage zur

räumlichen Nähe von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) und Kobaltion (Abbildung 8f)

27

CONHICHJhPOOK^~i CH, f-CONH(CH,)„pOOK

KOOC(CH,),JINOC -\ /**^X~S*t£H,

CONHfCHJ^OOl

KOOQCH^nfmOC -y/^KOTN=\£H,

CH, ^^ y ^ CH,

S CVKOOCtCH^^mOC CONWCHJgPOOlC

COOK

--. CH, rCOOK

KOOC-\ /^A.^\CW

VYCOOKCOOK

«),

b) OH OH

UV/vIs-Spektroskople

'HNMRSpektroskoplc

Mr b. zudem :

Totallumineszenzspektroskopie

Abbildung 8 f

Ein eventuelles Assoziationsverhalten sollte sich auch in der Alkylierungsgeschwindigkeit

niederschlagen. Dazu ist die Alkylierungsgeschwindigkeit der Co(l)-corrine mit den bereits

auf das Assoziationsverhalten untersuchten Verbindungen zu untersuchen (Abbildung 8g).

28

jmattSBmL^S^^r

fV?l (15)

«jy-

KOOC

KOOC'

Abbildung 8 g

Zu Beginn der Arbeit waren die notwendigen Edukte und Vergleichsverbindungen zu

synthetisieren (Abbildung 8h). Dabei handelte es sich neben dem miceiiartigen Grundkörper

Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-

carboxylat) (17), für den bereits eine wenn auch in der Folge noch zu optimierende

Synthesevorschrift bestand, um seine Adenosyl- und 1,N6-Ethenoadenosylanalogen (18 &

19).

Um den Effekt der Hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)e zu isolieren, mussten zudem von

sämtlichen zu untersuchenden Cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-

carboxylat)en die entsprechenden Cobyrinsäurederivate (20&21) hergestellt werden.

29

> Hf,

CH, f-COOK

N-~S**f'

2 <NXX

0X°Xr(10)0 0- \»W

/

VYCOOK COOK

(24)

(29)

/(27)

/

KOOC(CHJJ1NOC

CH,

KOOCtCHJafWOC

CONHiCHJÔOK

CH, r-CONHICHjlÔOK

VYCOOK COOK

Ä,.(20) ,R2.(21)

'» V-liCNN—/ COHH(CH,)uf:OOK

> CYKOOC(CHJ,jmOC CONH(CHJ,fiOOK

KOOC(CH,),jmOC

__ KOOC(CH,)^mOC

COWCHJxPO

CH,/fCONHtCHtl^fiOOK

Ipffj

'CONHICHjlÔOl

VYKOOCtCHJatmOC CONH(CH,)„f:OOK

(17)

R.=

R,.(18) ;R2.(19)

R,=

Abbildung 8 h

30

Da noch keine vollständigen spektroskopischen Vergleichsdaten für base-off 1,N6-

Ethenoadenosylcorrine vorlagen, sollte ihr Strukturbeweis durch die Synthese auf zwei

unabhängigen Wegen erfolgen. Ein Syntheseweg sollte sich dabei der Methodik der

elektrochemischen Synthese bedienen, die für Alkylcobalamine bereits eingeführt wurde

[92], und ihre allgemeine Anwendbarkeit der elektrochemischen Synthese für basenfreie

Corrine, insbesondere Cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-

carboxylat), geprüft werden. Dabei war diese Methodik vorderhand durch die Synthese des

1 ,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4), das in seiner Charaktersierung analog einigen anderen

Organocobalaminverbindungen zu ergänzen war, zu verifizieren (Abbildung 8i).

HjNOCH^OC

. OHOH HjNOC

Hfi,

MeOTos

EtOTos

O O- OH

Methylcobalamin

Ethylcobalamin

Vinylcohalamin

(2)

(S)

(23)

Abbildung 8 i

31

2. Synthetische Arbeiten

Zusammenfassung

Die Synthese des 1,Nß-Ethenoadenosylcobalamin (4) auf neuem elektrochemischem Wege,

der allgemein für Cobalamin, die Cobyrinsäure sowie das micellartige Cobamido-

N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) durchführbar ist, die

direkte Adenosylierung und 1,NP-Ethenoadenosylierung der Co(l)-cobyrinsäure und des

Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) sowie eine

modifizierte Synthese des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",

N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17), welches ausgehend von Cyanocobalamin

(10) in einer fünfstufigen Synthese zugänglich ist, werden beschrieben.

Im Hinblick auf ihre tentativen Eigenschaften als Gäste für das Heptakalium-dicyano-

Co(lll)-cobamido-N,N,,N",N",,N"",N ,N '-hepta-(n-decyl-10 '-carboxylat) (17)

wurden das 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22) und das 1.hfi-Ethenoadenosyl-

5'-0-tosylat (16) hergestellt.

2.1 Synthese des l,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4)

1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) wurde als Vergleichssubstanz für die analogen

Cobyrinat- und Cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)-

verbindungen synthetisiert, da der Versuch der Synthese von 1,N6-Ethenoadenosyl-aquo-

hexakalium-Co(lll)-cobyrinat (21) bzw. 1,N6-Ethenoadenosyl-aquo-hexakalium-

Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"">N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (19)

durch Alkylierung von mit NaBH4 erzeugtem Co(l)-cobyrinat bzw. Co(l)-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) mit 5'-Chloro-5'-deoxy-

1 ,N6-etheno-adenosin zu Verbindungen führte, bei der die 1 ,N6-Ethenobrücke anscheinend

nicht mehr intakt war.

Die Produkte der versuchten Alkylierung von Co(ll)-cobyrinat bzw. Co(ll)-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) unter Reduktion mit

Natriumborhydrid mit 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-ethenoadenosin wiesen im 1H-NMR-Spek-

32

*^*Ä (4)

o 0 *OH

Methylcobalamin (2)

Etbylcobalamin (5)

Vinylcobalamin (23)

Dicyanocobalamin (11)

> CY (24)

ff 1 )—HCNN—/

CH3

COT?

>H3

S °YCOfl COR

i

(29)

1= —NH(CHJ 10CO

(27)

R= o^^-«

Ä;.(20) ; Ä2.(21) Ä,.(18) ; Ä2(19), R3:(30)R.=

CH

IAbbildung 9:

Obersichtsschema der synthetisierten Organocobalamine

33

trum die erwarteten Hochfeldsignale der Ethenobrücke, d.h. vier Singlets der Intensität je 1

H nicht mehr auf, hingegen zeigte sich ein Singlet der Intensität von ca. drei H bei 7,13 ppm

und ein Singlet der Intensität ca. 1 H bei 7,30 ppm (in CD3OD). Literaturwerte zur

Zuordnung der Signale lagen nicht vor, da entsprechende basenfreie Verbindungen bislang

nicht synthetisiert worden waren und für das 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) nur 1H-

NMR-Daten der base-on Form existierten. Das elektrochemisch synthetisierte 1,N6-

Ethenoadenosylcobalamin (4) kann über seine spektroskopischen Eigenschaften mit

Literaturangaben verglichen und identifiziert werden. Die base-off-Form ist durch

Säurezugabe leicht herstellbar, sodass die ungefähren Signallagen der 1,N6-

Ethenoadenosyleinheit der basenfreien 1 ,N6-Ethenoadenosylcorrine auf unabhängige Weise

zugänglich werden.

Die früher beschriebenen Synthesemethoden für 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) sind

die folgenden:

1.

Umsetzung von 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-ethenoadenosin mit Co(l)-cobalamin, reduziert

aus Co-(ll)- oder Co(lll)-cobalamin mit Zn/NH4CI [93-96] oder in alkalischem Milieu

mit Natriumborhydrid [93, 97].

2.

Alkylierung analog 1., jedoch via das 2',3'-isopropylidengeschützte 1,N6-Ethenoadenosyl-

tosylat [5, 98], mit anschliessender Säurehydrolyse und Aufarbeitung.

3.

Die Ethenobrücke ist auch direkt im Adenosylcobalamin (Coenzym B12,1) einführbar. Bei

der erstmaligen Synthese des 1 ,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) wurde dieser Weg 1974

von Rudakova et al. [99] gewählt, die Adenosylcobalamin (1) mit dreifachem Uberschuss

1,2-Dibromethylacetat in wässriger, bei pH 4,0-4,5 gepufferter Lösung unter

Lichtausschluss während sieben Tagen umsetzten.

4.

Dieselben Autoren synthetisierten, um durch einen zweiten Syntheseweg den Struktur¬

nachweis führen zu können, 1 ,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) durch Alkylierung des

Co(l)-cobalamins mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat-2',3'-borsäurephenylester. Die

entsprechende Publikation enthält leider keine Angaben über die genaue Reaktionsführung

des Alkylierungschrittes.

34

Moskophidis und Friedrich [5] sowie Smith et al [98] führten die Alkylierung des Co(l)-

cobalamin deshalb mit 2',3'-isopropylidengeschutzem 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat

durch, weil sie die von Clark et al [100] beobachtete thermische Zyklisierung des 1,N6-

Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) zum 8,5'-Anhydroadenosin (6) verhindern wollten

Rudakova et al. geben für die Verwendung des Phenylborsäureesters als Schutzgruppe der

2',3'-Positionen keine Begründung an [99]

Die beschriebenen Syntheseverfahren bedingen vor der Kristallisation eine aufwendige

Reinigung des Produktes, in der Regel Phenolextraktion und Chromatographie an (Phospho)-

Cellulose Die vorliegende Arbeit zeigt, dass bei entsprechender Reaktionsfuhrung auf diese

Operationen vollständig verzichtet werden kann Im Vergleich zu den bisherigen Methoden

führte die in dieser Arbeit ausgearbeitete, elektrochemische Synthese zu einer deutlichen

Erhöhung der Ausbeute (75%) an kristallinem Material und ist zudem einfacher in der

Durchfuhrung. Dabei wird deutlich, dass das Schützen der 2' und 3' Hydroxylgruppen nicht

notwendig ist

Die elektrochemische Reduktion zu Co(l) cobalamin wurde bislang neben der indirekten

organische Synthese, in der das Cobalamin als Katalysator wirkte [z B 92, 101, 102], in

der präparativen Synthese alkylierter Cobalamine erfolgreich eingesetzt [z B 101d, 103,

104]

In einer Elektrolyseapparatur [105] und unter Inertgas wurde eine methanohsche Lösung

von Aquocobalaminchlorid (9) mit 0,1 M Tetrabutylammoniumperchlorat als Leitelektrolyt

bei -0,6 V (vs Kalomel) zu Co(ll)-cobalamin (3), dann bei -1,00 V zu Co(l)-cobalamm

reduziert und zu der von nunan lichtgeschützten Co(l)-cornn-Lösung ca vier Äquivalente

5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-ethenoadenosm gegeben. Während sechs Stunden wurde das

Potential beibehalten Alkylierungsmittel und Leitelektrolyt Hessen sich durch Fällung mit

Aceton aus methanolischer Lösung abtrennen Die Kristallisation nach der üblichen Methode

im Wasser/Aceton-System lieferte 75 % kristalline Substanz

Die Substanz ist in Übereinstimmung mit Shushin [81] unter Lichtausschluss unterhalb

minus 20 °C in kristalliner oder pulverisierter Form stabil

Die Kobalt-Kohlenstoffverbindung von Alkylcobalaminen ist lichtempfindlich Erste

orientierende Versuche zur Photolysestabilität stammen von Moskophidis et al [5] und

bestimmten die relative Stabilität von 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) zu 85 %

derjenigen des Adenosylcobalamin (1)

35

Obwohl mehrere Autoren auf verschiedensten Synthesewegen zu Produkten mit identischen

UV/vis-Spektren gelangten, wurde eine genaue Charakterisierung des erhaltenen Produktes

(4) bislang nicht durchgeführt. Das Kristallisat wurde daher umfassend charakterisiert.

Die UV/vis- [5, 95, 97, 99] und CD-Spektren [8, 97] sind t 2 nm bezüglich der

Maximallagen identisch mit den Literaturwerten.

f ccc

o b- OH

(4)

Abbildung 10: CD-Spektrum (fyO) von 1,N?-Ethenoadenosylcobalamin (4), c= 2,00-10-5 M

Die UV/vis-Maxima der base-on Form liegen, in Wasser, bei 524, 375 und 275 nm mit

Schultern bei 438 und 498 nm, während die base-off Form die typische Struktur mit

Maxima bei 455 und 285 nm sowie Schultern bei 324, 344, und 378 nm aufweist. Die

UV/vis-Spektren in Methanol und Wasser unterscheiden sich kaum.

Die CD-Spektren der base-on Form in Wasser (Abbildung 10) und Methanol unterscheiden

sich im Bereich 250 bis 300 nm, indikativ für eine unterschiedliche Konformationen des

Moleküles. Die CD-Spektren der base-off Form besitzen eine völlig andere Struktur als die

der base-on Form. Abgesehen von Abweichungen des A e in der Grössenordnung einiger

Prozente unterscheiden sich die CD-Spektren der base-off-Form in Wasser und Methanol

jedoch kaum.

36

Die spektroskopischen Daten unterscheiden sich in Bezug auf die molare Elliptizität von den

Literaturwerten des CD der wässrigen Lösung, wobei die Werte, welche ohne

Konzentrationsangabe publiziert sind [8], um max. 20 % von den experimentell bestimmten

abweichen.

Im FAB-MS(+) treten die Signale des Molekülions (M+, m/z 1603,6) sowie des

dealkylierten Fragmentes, ((M-Ado)+, m/z 1328,5), deutlich hervor.

Die Fluoreszenz der 1,N6-Ethenoadenosyleinheit (Bereich von 250 bis 700 nm) ist im

1 ,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) vollständig gequencht. Nach photolytischer Abspaltung

des 1 ,N6-Ethenoadenosin lag das Emissionsmaximum der erhaltenen Lösung bei 415 nm.

Die 1H-und 13C-NMR-Spektren des 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) in Deuteriumoxid

(Abbildungen 11 & 12) zeigten gute Übereinstimmung mit jenen des Adenosylcobalamin (1)

[106-108]. Analog Summers et al. [108] ist in wässriger Lösung im 13C-NMR-Spektrum

bei 27,3 ppm die direkt an das Kobalt gebundene Methylengruppe zu beobachten.

Im 1H-NMR-Spektrum in Methanol (Abbildungen 13 & 14) treten verglichen mit

Deuteriumoxid als Lösungsmittel grössere Verschiebungen der Signallagen ein, wiederum

indikativ für Konformationsänderungen. Die aromatischen Protonen der 1,N6-

Ethenoadenosyleinheit zum Beispiel sind in Deuteromethanol um +0,07 bis +0,17 ppm

verschoben, die des Dimethylbenzimidazol bis +0,25 ppm. Die Unterschiede waren in

saurer Lösung ohne a-seitige Basenkoordination (base-off) noch ausgeprägter; hier betrug

die Verschiebung der Signale in Deuteromethanol verglichen mit Deuteriumoxid für die

Protonen der 1 ,N6-Ethenoadenosyleinheit und der Dimethylbenzimidazols bis +0,61 ppm.

Unabhängig von der Basenkoordination bewirkte ein Lösungsmittelwechsel eine wesentliche

Änderung der chemischen Verschiebung der A5-gebundenen Protonen. Die Signale der A5-

gebunden Protonen im 1H-NMR-Spektrum lagen für die base-on Form in Deuteriumoxid bei

0,54 ppm (1H, die Lage des zweiten Protons konnte nicht identifiziert werden), in

Deuteromethanol bei 0,55 und 1,08 ppm (je 1H), in der base-off Form in D2O bei -0,25

und 0,35 ppm (je 1H). Bei der base-off Form in Deuteromethanol konnte nur ein Proton bei

0,33 ppm beobachtet werden.

Aus den Spektren der base-off Form des 1 ,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) bestimmen sich

die Vergleichswerte der 1H-NMR-Signale der 1 ,N6-Ethenoadenosyleinheit zu: 9,42 ppm (s,

A-2 oder 8), 9,31 ppm (s, A-2 oder 8), 8,35 ppm (s, A-10 oder A-11), 7,99 ppm (s, A-

10 oder A-11) in Deuteromethanol und 8,89 ppm (s, A-2 oder 8), 8,71 ppm (s, A-2 oder

8), 7,84 ppm (s, A-10 oder A-11), 7,51 ppm (s, A-10 oder A-11) in Deuteriumoxid

[106-108].

37

....Jt

ppm 8 6 1

Abbildung 11: 'H-NMR-Spektrum von I^-Ethenoadenosylcobalamin (4) in

Deuteriumoxid, c- 8,42-10'3 M, 300,13 MHz

.drhzJJ[AüJjß^ppm 8

Abbildung 12: 'H-NMR-Spektrum von 1.^-Ethenoadenosylcobalamin (4) in

Deuteriumoxid + 10% CF3COOD, c= 7,58-W3 M, 300,13 MHz

38

. . ^

1 0 ppm

Abbildung 13: ' H-NMR-Spektrum von 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) in

Deuteromethanol, c= 9,36-1 fr3 M, 300,13 MHz

10 1 0 ppm

Abbildung 14: 1 H-NMR-Spektrum von 1,Ne-Ethenoadenosylcobalamin (4) in

Deuteromethanol + 10% CF3COOD, c= 8,42-1Cr3 M, 300,13 MHz

39

Erstaunlicherweise konnte von Gani et al. [97] bei der Reaktion von 5'-Chloro-5'-deoxy-

1,N6-etheno-adenosin mit Co(l)-cobalamin, welches mit Natriumborhydrid aus Co(ll)-

cobalamin reduziert wurde, entgegen den Beobachtungen der vorliegenden Arbeit eine

Substanz isoliert werden, deren UV/vis-Spektrum dem des hier synthetisierten 1,N6-

Ethenoadenosylcobalamin (4) entspricht.

Dicyanocobalamin (11) und einige Organocobalamine (2, 5, 23)

Zur systematischen Anwendung der Elektrochemie für präparativen Alkylierungen analog

dem 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) wurden Methyl- (2), Ethyl- (5) sowie

Vinylcobalamin (23), deren spektroskopische Eigenschaften zum Teil in der Literatur

beschrieben sind, nach derselben elektrochemischen Methodik synthetisiert und umfassend

charakterisiert (UV/vis, CD, IR, ^H-NMR, 13C-NMR, FAB(+)-MS).

Vinylcobalamin (23) konnte durch Reduktion des Cobalamin zu Co(l)-cobalamin in

Acetylenatmosphäre, nach Fällung und Kristallisation im klassischen Wasser/Aceton-

System, als Kristallisat in 85%iger Ausbeute erhalten werden.

Der Vergleich der spektroskopischen Daten der erhaltenen Produkte (UV/vis; CD; 1H-NMR)

mit Literaturwerten bestätigte die Strukturen. In den FAB(+)-Massenspektren waren

jeweils die erwarteten Signale des Molekülions und der dealkylierten Verbindung deutlich

ausgeprägt.

Im Rahmen der Photolyse der Alkylcorrine (Kapitel 6) erfolgte die Identifikation der

Photolyseprodukte über ihre Dicyanoformen. Aquocobalamin (9) kann bei nicht exakter

Dosierung des Cyanid Gemische der Mono- und Dicyanokomplexe bilden. Um einheitliche

Verbindungen zu erhalten, wurden daher nach der Photolyse durch einen grossen Uberschuss

an Kaliumcyanid die Dicyanoverbindungen hergestellt. Die für die Identifikation der

Photolyseprodukte notwendige Vergleichsverbindung Dicyanocobalamin (11), dessen 1H-

NMR-Spektrum in der Literatur nicht beschrieben war, wurde durch Versetzen einer

wässrigen Lösung von Cyanocobalamin (10) mit einem dreifachen Uberschuss KCN

synthetisiert und das langsam entstehende 11 UV/vis- und 1H-NMR-spektroskopiert. Die

UV/vis-Spektren in Wasser von Dicyanocobalamin (11) und Dicyano-heptakalium-

Co(lll)-cobyrinat (24) sind erwartungsgemäss fast identisch (Abbildungen 15 & 16). Das

Dicyanocobalamin (11) zeigt aufgrund des Basenteiles bei 285 nm ein Maximum, das in 24

nicht auftritt. Zudem sind unterhalb 300 nm die Absorptionskoeffizienten unterschiedlich.

40

Abbildung 15: UV/vis-Spektrum von Dicyanocobalamin (11) in Wasser, c=

1,17-10* M, dx= 0,100 cm, 10 mM KCN

Abbildung 16: UV/vis-Spektrum von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-

cobyrinat (24) in Wasser, c= 4,51- 70'5 M, dx= 0,100 cm,

0,16 g KCN t1

41


Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war die Synthese des bereits von Stepanek [91]

hergestellten Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-

(n-decyl-10'-carboxylat) (17), das für die nachfolgenden Assoziationsexperimente und als

Ausgangssubstanz für die Alkylierungen benötigt wurde, in ausreichender Menge und unter

Erweiterung der spektroskopischen Charakterisierung des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-

cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) sowie

seiner Synthesezwischenprodukte.

Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-c-lacton (25) wurde als Vergleichssubstanz

eines der bei der Cobesterhydrolyse entstehenden Nebenprodukte synthetisiert.

2.2.1 Synthese des Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat

Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24)

Bereits 1953 konnte als Nebenprodukt der salzsauren Hydrolyse von Vitamin B12(10) eine

als Cobyrinsäure vermutete Heptasäure nachgewiesen werden [109]. Friedrich [110]

hydrolysierte als erster Cobyrsäure und Cyanocobalamin (10) an dem lonentauscherharz

Dowex 50W. In neuester Zeit entwickelte Kreppelt [111] eine Methode zur sauberen

chromatographischen Trennung des vom Dowex 50W eluierten hydrolysierten Cobesters

(26), die allerdings mit einem beträchtlichen Substanzverlust (Ausbeute 65%) verbunden

ist. In der hier beschriebenen Synthesesequenz erfolgt die chromatographische Trennung an

Kieselgel zu einem einheitlichen Produkt nach dem Syntheseschritt zum Dicyano-Co(lll)-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(10-tert.butyloxycarbonyl-n-decyl)-cobamid (27).

Die Hydrolyse des Cobester (26) an Dowex 50 WX2, einem Sulfonsäureharz, liefert

praktisch quantitativ Cobyrinsäure, die je nach Methode der Elution vom Dowex-Harz

(NH2OH [112], Ammoniak [113]) zu Nebenprodukten weiterreagiert. In der vorliegenden

Arbeit konnte in Anlehnung an [91] eine sehr einfache wässrig neutrale Aufarbeitung

entwickelt werden, die in mit UV/vis-Spektroskopie bestimmter 99%iger Ausbeute eine

gemäss 1 H-NMR-Spektrum mit ca. 5% Nebenprodukten verunreinigte Probe von Dicyano-

heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) lieferte, das sich nicht kristallisieren Hess [109].

42

cgocH,--. CH, f-COOCH,

CHiH2S04IMeOH c»,

ch, 7

'

K CH>

VYCOOCHSOOCH,

(26)

VYCOOK COOK

(24)

CI04~H3N*(CH2)ioCOOC(CH3)31 EtsN

THF

(CH,)fiOfi(CH,),J{NOC

CH,

ICH,)fiOfi(CH,),JINOC

COmCHJ^OfilCH,),

~% CH, f-COHmCH,),fOiCH,),

N0,-£j-0OCCF,

ayv

Methylenchlond

COO-Q-NO,^—i ch, r-oo-^ym,

no, -Q-<wc-yJ^yk^\rH,CH'*Y-w-/ ~^"x^cyno2

y-vCH'L f\ _/

m,-(_y-ooc-* /~-»rcw>=\ CH,

CH, ^A^*^/CHiS CY

(29)

COHH(CH,),fiOf(CH,),

VY(CH,)fiO£(CHH„flNOC COHH<CH,),fiOfi(CH,),

(27)

CF3COOHI HCl I CHCI3

KOOC(CH,)jmOC

CH,"

KOOCICHJxflNOC

CONmCHjkifiOOK

CH, f~CONH(CH,),£OOK

CONH(CH,),fiO0K

VYKOOC<CH,),JINOC CONHfCHtlxPOOK

(17)

Abbildung 17: Synthese des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',

N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) aus Cobester (26)

43

Die bisherige Identifikation der Cobyrinsäure in einer Reihe von Arbeiten über

Cobyrinsäure als hypothetisches Biosynthese-Zwischenprodukt von Vitamin B12(10) aus

5-Aminolävulinat über Uroporphyrinogen III erfolgte über das Derivat Cobester (26)

[114-116].

Das Produkt 24 wurde mit DC-, IR-, UV/vis-, CD-, 13C-NMR- und 1H-NMR-

Spektroskopie sowie FAB(+)-Massenspektroskopie charakterisiert. Die Identität der

isolierten Substanz mit Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) ergibt sich aus dem

einheitlichen DC und dem 13C-NMR-Spektrum in Deuteriumoxid, das innerhalb ± 0,4 ppm

mit jenem von Stepanek [91] identisch ist. Das 1 H-NMR-Spektrum der im Rahmen dieser

Arbeit durchgeführten Synthese war verglichen mit dem aus [91] identisch, wenn man von

der relativen Verschiebung des Gesamtspektrums um 0,13 ppm, die höchstwahrscheinlich

durch unterschiedliche Referenzierung bedingt ist, absieht. Das bei Kreppelt [111]

publizierte 1 H-NMR-Spektrum von 24 ist innerhalb einiger Hunderstel ppm ebenfalls

identisch, weist jedoch für das C-13-Signal eine um 0,13 ppm abweichende chemische

Verschiebung auf, die wahrscheinlich durch Konzentrationseffekte hervorgerufen ist. Die

UV/vis- und das 13C-NMR-Spektren zeigten keine wesentlichen Unterschiede zu jenen bei

Stepanek und Kreppelt.

Das IR-Spektrum in KBr der aus dem Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) durch

Entsalzung an XAD-Harz hergestellten Säure war identisch mit dem bei Kreppelt [111]

beschriebenen IR-Spektrum der Cobyrinsäure.

Im FAB(+)-Massenspektrum treten bis m/z 500 praktisch nur NOBA-Signale auf. Oberhalb

m/z 500 überragen nur wenige Signale das Rauschen. Sie lassen sich praktisch sämtlich als

Signale des gleichen Corrins interpretieren, an dem in wechselndem Ausmass Kalium durch

Natrium und/oder Protonen ausgetauscht, Wasser mitgerissen bzw. Cyanidliganden

abgespalten wurden. Das Molekülion (M+H+) bei m/z 1258 ist zwar nur schwach aber

signifikant. Oberhalb m/z 1'200 Hessen sich alle Signale durch die Zielsubstanz 24

erklären.

Mithilfe des 1H-13C-COSY-Spektrums (Abbildung 18) liess sich eine weitreichende

Zuordnung der Signale der NMR-Spektren erreichen.

Im 1 H-NMR-Spektrum befinden sich neben dem C-(10)-Signal des Cobyrinat 24 (5,74

ppm) bei 5,79 und 5,69 ppm Signale ungefähr identischer Intensität (insgesamt ca. 5 %

bezogen auf das Signal bei 5,74 ppm). Eines der beiden Produkte ist Dicyano-heptakalium-

Co(lll)-cobyrinat-c-lacton (25), identifizierbar im 1 H-NMR-Spektrum z.B. durch das

Signal bei 5,80 ppm. Gemäss 1 H-NMR-Spektrum und DC war der als Edukt eingesetzte Cob-

44

>W«»«^»^<imJ'^I»^W^'^"'*i^¥WN>»»^> UwWJiiJviWww

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f

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v i i i i i'

Abbildung 18: H-C-COSY von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobynnat (24)

in Deuteriumoxid, c= 3,68-W2 M, 0,5 g KCN t1

45

ester 26 frei von Cobester-c-lacton (28). Bei dem zweiten Nebenprodukt (C-(IO)-Signal

bei 5,69 ppm) könnte es sich um die Neocobyrinsäure handeln, die als Nebenprodukt der

Hydrolyse von Cobester auf Dowex-Harz von Lee [112] aufgrund des Verhaltens bei lonen-

austauscherpapierchromatographie und einer elektrophoretischen Analyse postuliert wurde.

Eine kritische Einflussgrösse der Synthese war der rigorose Sauerstoffausschluss sowohl

während der Reaktion, als auch während des Abkühlens der Suspension vor der Aufarbeitung.

Unkritisch hingegen ist die Verlängerung der Reaktionszeit über die für quantitativen

Umsatz notwendigen 20 Stunden hinaus; selbst nach insgesamt 48 Stunden wies das 1H-

NMR-Spektrum der isolierten Cobyrinsäure die gleichen Signallagen auf wie das 1 H-NMR-

Spektrum des Beschreibungsansatzes.

In einem separaten Versuch wurden 954,6 mg Cobester (26) mit 0,5 ml Trifluor-

essigsäure in 10 ml MeCI2 gelöst und am Rotationsverdampfer das Lösungsmittel abgezogen.

Der hellrote Rückstand wurde in 20 ml Essigsäure auf 200 ml Dowex-Harz aufgetragen und

ohne Rühren der Harzsuspension in 500 ml Wasser unter Argon während 20 Stunden bei

70°C hydrolysiert. Das Produkt wurde mit Natriumhydrogencarbonat vollständig vom Dowex

eluiert, zog mit Phosphorsäure vollständig auf 100 ml XAD auf und wurde mit 30 ml

Methanol/Aceton (1:1) eluiert. Nach Trocknung und Zugabe von 0,01g KCN Hess sich das

Produkt aus 15 ml Methanol mit 5 ml Aceton nur unvollständig fällen. Das 1 H-NMR-

Spektrum (200 MHz, CD3OD) der in der Mutterlauge verbliebenen Substanz (464 mg) Hess

auf partiell hydrolysierten Cobester schliessen, denn es waren die für die Dicyanocobyrin-

säure 24 erwarteten Signale vorhanden, doch traten im Bereich des H-(C10) drei Signale

zwischen 5,76 und 5,81 auf, während bei 3,67 ppm ein Single« beobachtbar war. Die Sub¬

stanz konnte nach Entfernung der Cyanidliganden mit Essigsäure/Trifluoressigsäure durch

eine analog der Cobyrinsäuresynthese durchgeführte Nachhydrolyse in 98% Ausbeute in ein

Produkt Oberführt werden, das das 1 H-NMR-Spektrum der Dicyanocobyrinsäure 24 zeigte.

Eine maximale Ausbeute bedingte eine Mindestmenge an Dowex-Harz, und zwar 100 g (ca.

120 ml) pro 0,5 g Cobester (26). Der Verlust durch unerwünschtes Ablösen der Substanz

vom Dowex-Trägerharz ist dann praktisch bedeutungslos. Durch Elution mit Natriumhydro¬

gencarbonat Hess sich das Produkt jedoch nicht quantitativ vom Harz lösen. Auf XAD verblie¬

ben ebenfalls geringe Mengen an Produkt. Diese auf dem Träger haftenden Anteile können nur

mit stark basischer Lösung eluiert werden und reagieren dabei in nicht unbeträchtlichem

Ausmasse zu Nebenprodukten. Die Ausbeute reduzierte sich durch diese Elutionsverluste um

ein bis zwei Prozent. Die Fällung aus methanolischer Lösung hingegen erfolgte bei

genügendem Uberschuss an Ether quantitativ. Der Versuch, das Kaliumcobyrinat 24 zu

kristallisieren, blieb wie schon bei der Cobyrinsäure bei Armitage et al. [109] erfolglos.

46

Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-c-lacton (25)

Ausgehend von Cobester-c-lacton (28) wurde erstmalig die Hydrolyse zum Dicyano-

heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-c-lacton (25) analog der Synthese der Cobyrinsäure

durchgeführt und das Produkt umfassend charakterisiert (Abbildung 19).

Wie erwartet fehlt im Vergleich zum Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24)

(Abbildung 20) im 1 H-NMR-Spektrum das H-(8)-Signal (D20: 3,45 ppm; CD3OD: 3,57

ppm) (Abbildung 21). Mit Entkopplungsexperimenten der in Deuteromethanol gelösten

Substanz konnten das C-(18), 3,02 ppm, und das C-(19), 3,79 ppm, zugeordnet werden.

Das 13C-NMR-Spektrum in Deuteriumoxid ist ähnlich dem des Dicyanocobyrinat 24 bis auf

folgende Ausnahmen: das Signal des C-(8) befindet sich statt bei 57,3 nun bei 88,2 ppm.

Des weiteren treten die tentativ C-7A, C-71, C-81 und C-7 zugeordneten Signale bei 20,13

ppm, 35,52 ppm, 38,10 ppm und 55,24 ppm statt 21,43 ppm, 32,9 ppm, 37,45 ppm und

51,46 ppm auf. Die Abweichungen der übrigen Signale sind bezogen auf das Dicyano-

heptaka!ium-Co(lll)-cobyrinat (24) minimal, in der Regel geringer als 1 ppm.

Die Maxima im UV/vis-Spektrum des Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-c-lactons

(25) sind verglichen mit dem Dicyanocobyrinat 24 in methanolischer Lösung oberhalb 400

nm um 2-3 nm zu höheren Wellenlängen verschoben und die Absorptionskoeffizienten sind

etwas unterschiedlich.

Die CD-Spektren von 24 & 25 in methanolischer Lösung unterscheiden sich hingegen

teilweise deutlich voneinander; so bleibt zum Beispiel unterhalb 372 nm das CD-Spektrum

des Dicyanocobyrinates 24 im negativen Bereich [91]. Bei Cobyrinat-c-lacton 28 treten

eine Reihe zusätzlicher Nulldurchgänge (238, 272 und 279 nm) auf.

Das Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-c-lacton (25) ist anscheinend ein

Nebenprodukt der Hydrolyse des Cobesters (26) zur Cobyrinsäure. Im 1 H-NMR-Spektrum

des Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) in Deuteriumoxid traten neben dem

Signal des C-10 der Säure 24 bei 5,74 ppm zwei Singletts mit einer relativen Intensität

von maximal fünf Prozent bei 5,80 ppm und 5,66 ppm auf. Die chemische Verschiebung des

C-10 Signal des Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-c-lacton beträgt ebenfalls 5,80

ppm. Da die Verunreinigungen jedoch minimal sind, sind sie praktisch nur über die gut

identifizierbaren Singletts der C-10 Signale nachweisbar.

47

com, CN

/ Hfil f-CONH,

com,

CHfiOC

CHfiOC

CONH,

(10)

H^Ot I MeOH I Rückfluss

COOCH,

VYHfiOOC COOCH,

"

(26)VY

HfiOOC COOCH,

(28)

Dowex 50WX21H20170 "C 120 h

> ( (24) ^CH,(COOK COOK

Abbildung 19: Hydrolyse der Produkte der Cobestersynthese aus Cyanocobalamin (10)

48

6,05

8 1 ppm

Abbildung 20: 1 H-NMR-Spektrum von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) in

Deuteriumoxid, c= 1,12-W2 M, 300,13 MHz, 1,4 g KCN t1

(25)

^J

X

vi VM

9 8765432 1 ppm

Abbildung 21: 1 H-NMR-Spektrum von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-c-lac-ton (25) in Deuteriumoxid, 300,13 MHz, c= 7,96-103 M, 1,0 g KCN r1,

die mit einem Kreuz bezeichneten Signale stammen von Methylacetat

49

2.2.2 Synthese des miceiiartigen Cobyrinsäurederivates Heptakalium-

dicyano-Co(lll)-cobamido-N1N,,N",N'"1N,,"1N ,N -hepta-

(n-decyl-10'-carboxylat) (17)

Dicyano-Co(lll)-heptakalium-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(4-nit-

rophenyl)-cobyrinat (29)

Dicyano- Co(lll)- heptakalium- N, N', N", N'", N"", N,N - hepta-(4-nitrophenyl)-

cobyrinat (29) wurde bereits von Stepanek [91] synthetisiert. Die Analytik wurde in der

vorliegenden Arbeit um das CD- und das FAB(+)-Massenspektrum erweitert.

Zur Synthese des Dicyano-Co(lll)-heptakalium-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(4-

nitrophenyl)-cobyrinat (29) wurde aus dem Kaliumsalz 24 frisch bereitete Dicyano-

cobyrinsäure in Methylenchlorid gelöst und mit Trifluoressigsäure-4-nitrophenylester

zum Nitrophenylester 29 umgesetzt.

Als entscheidender Schritt dieses in Analogie zu Stepanek [91] durchgeführten Synthese¬

schrittes erwies sich das Lösen der Dicyanocobyrinsäure in Methylenchlorid. Dazu wurde am

XAD entsalztes 24 mit zwei Äquivalenten Triethylamin in methanolischem HCN gelöst und am

Rotationsverdampfer das Lösungsmittel entfernt. Der derart erhaltene Lack löst sich

augenblicklich in Methylenchlorid, auch ohne Kühlung der Vorlage. Wird auf die

Triethylaminzugabe verzichtet, ist der Lösungsprozess sehr langsam (ca. 60 Minuten) und

oft auch unvollständig. Die dabei nicht in Methylenchlorid gelöste Substanz reagiert nicht

und kann bei der Aufarbeitung mit Wasser von einer Fraktion vollständig verestertem

Cobyrinates abgetrennt und zum Produkt 29 nachverestert werden. Das Dicyano-

heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) selbst Hess sich in Methylenchlorid nicht lösen2.

Das erhaltene Produkt, dessen spektroskopische Daten (IR-, 1H-NMR- und 13C-NMR-

Spektrum (jeweils in CDCI3)) mit denen von Stepanek [91] übereinstimmen, konnte nicht

kristallisiert werden.

Verglichen mit der in Methanol gelösten Substanz [91] beobachtet man im UV/vis-Spektrum

in Methylenchiorid oberhalb 400 nm eine bathochrome Bandenverschiebung von 2 bis 7 nm.

2 entgegen der Beschreibung von Stepanek [91]

50

Das CD-Spektrum in Methylenchlorid zeigt oberhalb 360 nm einen positiven CD-Effekt und

ähnelt in diesem Bereich sehr stark dem des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) in Wasser. Auch die

Struktur des CD-Spektrum dieser beiden Messlösungen ist im Bereich 210-360 nm sehr

ähnlich.

Im FAB(+)-MS tritt das Signal des Molekülions (m/z 1837,6) nicht auf, das Signal des

Monocyano-Co(lll)-heptakalium-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(4-nitrophenyl)cob-

yrinat (m/z 1809,5) hingegen ist deutlich ausgeprägt.

Die Amid- bzw. Esterfunktionen der Propion- und Essigsäureseitenketten in Cyanocobalamin

[109] bzw. Cobester [117] weisen bei der Hydrolyse unterschiedliche Reaktivitäten auf.

Scheinbar liegen auch bei der Veresterung der Cobyrinsäure zum Dicyano-Co(lll)-

heptakalium-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(4-nitrophenyl)-cobyrinat (29) unter¬

schiedliche Reaktivitäten der Propion- und Essigsäureseitenketten vor. Wird nämlich die

Reaktion bereits 1,5 Stunden statt nach 22 Stunden nach Zugabe des Trifluoressigsäure-

nitrophenylesters aufgearbeitet, so färbt sich die Wasserphase stark ein. Das DC der aus der

Wasserphase isolierten Substanz war einheitlich. Das 1 H-NMR-Spektrum (D20) zeigte der

Cobyrinsäure 24 sehr ähnliche Signallagen, die jedoch verglichen mit der Cobyrinsäure um

+0,15 bis +0,18 ppm verschoben waren; so kam z.B. das H(C-10) bei 5,95 ppm statt bei

5,74 ppm. Zudem traten die Signale von vier Äquivalenten Nitrophenylat auf. Möglicher¬

weise war das aus der Wasserphase isolierte Produkt nur an den vier Propionseitenketten

verestert.

Dicyano-Co(lll)-N,N\N",N,",N"",N ,N -hepta-(10-tert.butyloxy-car-

bonyl-n-decyl)-cobamid (27)

Im nächsten Syntheseschritt wurde der Nitrophenylester 29 in THF mit 10-tert.Butyloxy-

carbonyl-n-decyl-ammonium-perchlorat zum Dicyano-Co(lll)-N,N',N",N'",N"",N ,

N -hepta-(10-tert.butyloxycarbonyl-n-decyl)-cobamid (27) umgesetzt3. Die

Synthese folgte hier ebenfalls dem Syntheseweg von Stepanek [91], der die Verbindung 27

erstmalig synthetisierte.

3 Synthese analog Stepanek [91] mit veränderter Aufarbeitung

51

Die Synthese des zur Kopplung eingesetzten 10-tert.Butyloxy-carbonyl-n-decyl-

ammonium-perchlorat erfolgte mit Standardmethoden ausgehend von der 11-

Aminoundecansäure [91]. Dabei erwies sich die Debenzyloxycarbonylierung des als

Zwischenprodukt erhaltenen 11 -Amino-N-benzyloxycarbonyl-undecansäure-tert.-butyl-

ester besonders kritisch bezüglich der Reinheit der Edukte. Wurde zur Hydrogenolyse nicht

frisch durch Säulenchromatographie gereiniger 11 -Amino-N-benzyloxycarbonyl-undecan-

säure-tert.butylester eingesetzt, konnte nach der Aufarbeitung das Perchlorat nicht

kristallisiert werden.

Ein dem Beschreibungansatz analoger jedoch mit doppelter Reaktionsdauer durchgeführter

Ansatz lieferte gemäss UV/vis- und 1H-NMR-Spektroskopie in identischer Reinheit

ebenfalls das Cobamid 27.

Die Substanzmenge (1546 mg 29) bedingte einen Wechsel von der bereits beschriebenen

dünnschichtchromatographischen Trennung [91] zur Säulenchromatographie. Als besonders

günstig erwies sich dabei das Laufmittelsystem Methylenchlorid/Methanol, 1%HCN dessen

Methanolanteil während des Trennungsprozesses sukzessive von 4 auf 20% erhöht wird.

Eine alternative Reinigung durch Phasenverteilung in Methanol/Hexan war nicht

erfolgreich.

Die Möglichkeit der Reinigung durch Fällung wurde ebenfalls untersucht. Das Cobamid 27,

das eine erstaunliche Löslichkeitsspannweite aufwies, konnte jedoch aus keinem der

getesteten Lösungsmittelsysteme gefällt werden. Einzig beim Abziehen des Lösungsmittels

einer Lösung von einigen Milligramm 27 in 0,5 ml Chloroform und 10 ml Hexan am

Rotationsverdampfer wurde ein metastabiler Niederschlag beobachtet, der bei Temperatur¬

anstieg rasch wieder in Lösung ging und nicht isoliert werden konnte.

Die Ausbeute, 84%, konnte gegenüber vorhergehenden Synthesen (71% [91]) wesentlich

gesteigert werden.

Von dem erhaltenen Produkt, dessen spektroskopische Daten (IR-, 1H-NMR- und 13C-NMR-

Spektren (jeweils in CDCI3)) mit denen von Stepanek [91] übereinstimmten, wurde noch

das FAB(+)-MS sowie das UV/vis- und CD-Spektrum in Methylenchlorid gemessen.

Im Gegensatz zu den wässrigen Lösungen der Cobyrinate (24 & 25) und des Heptakalium-

dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)

52

(17) zeigten Lösungen der Substanz in Methylenchlond innerhalb einiger Stunden

unverändert das UV/vis Spektrum der Dicyanoform

Das FAB(+)-Massenspektrum zeigte praktisch nur die beiden Signale des Monocyano

cobamides (m/z 2639,5) und des Cobamides 27 ohne Cyamdliganden (m/z 2613,3)

Die UV/vis-Spektren in Methanol/1% HCN4 und Methylenchlond unterscheiden sich nicht

voneinander Die entsprechenden CD-Spektren jedoch sind deutlich unterschiedlich

Oberhalb 460 nm bleibt das CD der Lösung in Methylenchlond im negativen Bereich,

während in methanolischer Lösung mehrere Nulldurchgänge stattfinden Unterhalb 460 nm

sind die Maxima um bis zu drei nm verschoben und die Werte der Elliptizität unterscheiden

sich bis zu 50%

Diese Beobachtungen bei den UV/vis und CD Spektren sowie das beschriebene

Löshchkeitsverhalten könnten Anzeichen für ein konformationelles Expansions- und

Kontraktionspotential der modifizierten Seitenketten sein, d h je nach Lösungsmittel können

die Seitenketten durch Änderung ihrer Konformation die Löslichkeit des Molekules

verändern

Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N -hep-

ta-(n-decyl-lO'-carboxylat) (17)

Heptakalium-dicyano Co(lll)-cobamido N, N', N", N'", N"", N,N -hepta-(n decyl

10'-carboxylat) wurde bereits 1987 von Stepanek [91] aus Dicyano-Co(lll)

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta (10 tert butyloxycarbonyl-n decyl)-cobamid (27)

hergestellt Die hier beschriebene Synthese lehnt sich an seine Vorschrift an

Durch eine Lösung des Dicyanocobamid 27 in Chloroform wurde trockenes HCl geleitet und

anschliessend mit Trifluoressigsäure hydrolysiert Chloroform als Lösungsmittel war bei

diesem Syntheseschritt nicht durch Methylenchlond substituierbar Die in Methylenchlond

gelöste Substanz ölte während der Durchleitung von HCl aus sogar nur 0,001 molarer

Lösung aus

4 vgl Stepanek [91]

53

Von dem nach Zugabe von Trifluoressigsäure und Aufarbeitung ohne Trennungstufe

erhaltenen Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N -hepta-

(n-decyl-10'-carboxylat) (17), dessen spektroskopische Daten (IR-, 1H-NMR- (in D20)

und 13C-NMR-Spektrum (in CD3OD)) mit denen von Stepanek [91] übereinstimmten,

wurden die UV/vis- und CD-Spektren in Deuteriumoxid sowie die 1H-NMR- (Abbildung 22)

und 13C-NMR-Spektren in CD3OD bzw. D20 gemessen, um das Verhalten in wässriger und

methanolischer Lösungen vergleichen zu können.

Die UV/vis-Spektren von 17 in Wasser/KCN und Methanol/HCN waren identisch. Die CD-

Spektren in Methanol und Wasser jedoch waren nur im kurzwelligen Bereich deckungsgleich

und wichen oberhalb 460 nm in ihren relativen Intensitäten um bis zu 100% voneinander

ab. Dagegen kontrastiert das Fehlen jeglicher Unterschiede zwischen den CD-Spektren

wässriger und methanolischer Lösungen von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24).

Um festzustellen inwieweit Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,

N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) sein CD-Spektrum in detergenzhaltiger

Lösung ändert, wurde 17 in einer wässrigen Lösung von Natriumdodecylsulfat (SDS), die

mit 2,0-10"2 M an SDS unterhalb der kritischen Micellbildungskonstante von 8,1-10"2 M

blieb, gelöst und die Veränderung des CD-Spektrums untersucht. Eine signifikante

Veränderung des CD-Spektrums war nur bei 555 nm und im Bereich um 595 nm zu

beobachten, wo die jeweilige Elliptizität um wenige Prozent, maximal ca. 5%, reduziert

wurde.

Rossi et al. [118] stellten bei 1H-NMR-spektroskopischen Experimenten mit

Methylcobalamin (2) eine für die einzelnen Protonen unterschiedlich ausgeprägte

Konzentrationsabhängigkeit der chemischen Verschiebungen fest. Die bei unterschiedlichen

Konzentrationen in Deuteriumoxid aufgenommenen 1H-NMR-Spektren von 17 zeigten

ebenfalls eine wenn auch hier nicht systematisch untersuchte Sensitivität der Signale auf

Konzentrationsänderungen, sodass eine Selbstassoziationstendenz des Heptakalium-dicyano-

Co(lll)-cobamido-N,N,,N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) zu

vermuten ist.

Der orientierende Vergleich einiger 13C-NMR-Spektren in Deuteriumoxid wies analog den

Beobachtungen beim 1 H-NMR-Spektrum auf einen signifikanten Einfluss der Konzentration

auf die Signallagen hin. Allgemein war die Auflösung des 13C-NMR-Spektrum in

Deuteriumoxid bedeutend geringer als in Deuteromethanol.

54

Die 13C-NMR-Spektren von 17 in Deuteromethanol und Deuteriumoxid wiesen signifikante

Unterschiede der chemischen Verschiebungen auf. Die durchschnittliche Abweichung der

chemischen Verschiebungen der Deuteriumoxidprobe im Vergleich zur Probe in Deutero¬

methanol lag bei 1,8 ppm zu tieferem Feld. Im 13C-NMR-Spektrum der in Deuteromethanol

gelösten Substanz fielen sämtliche Carboxylatsignale bei 183,1 ppm zusammen, in

Deuteriumoxid hingegen Hessen sich drei Gruppen, 186,2 ppm, 186,3 ppm und 186,4

ppm, unterscheiden. Die Signale der Undecanoatketten verbreiterten sich in Deuteriumoxid

zu strukturlosen Signalgruppen.

Diese ausgeprägten Unterschiede der chemischen Verschiebungen in den 13C-NMR-Spektren

in Deuteriumoxid und Deuteromethanol deuten wiederum auf einen, dem Cobamid 27

analogen Konformationsunterschied der Undecanoathülle in wässriger und methanolischer

Lösung hin.

CONH(CH,),fiOOK

^—-. CH, f-CONH<CH,),fiOOKKOOC(CH,)1CHKOC

KOOCICHJioHNOC

CONH(CH,)l(£OOf

VYKOOC(CH,),jmOC CONH(CH,)l(f:OOK

7 6 5 4 3 2 10 PPm

Abbildung 22: 1 H-NMR-Spektrum von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",

N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) in Deutero¬

methanol, c= 5,43-10'3 M, 0,13 g KCN r1, 300,13 MHz

55

2.3 Alkylierungen

2.3.1 Methylierung

Hexakalium-Coa-aquo-Coß-methyl-cobamido-NIN',N"1N,"1N"",N ,N"""-

hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (30)

Zur Synthese des Hexakalium-Coa-aquo-Coß-methyl-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,

N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (30) wurde analog Stepanek [91] Heptakalium-

dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)

(17) platinkatalysiert mit Wasserstoff zu Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -

hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) und mit Natriumborhydid weiter zum Co(l)-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) reduziert und anschliessend

das Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N',",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) mit

Methyltosylat alkyliert. Abweichend von [91] war unter den Versuchsbedingungen (3 ppm

O2) eine einmalige Zugabe von 60 Äquivalenten Natriumborhydrid zur quantitativen

Reduktion des Co(ll)-cobamido-N,N,,N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carb-

oxylat) zum Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxy-

lat) ausreichend 5.

Die Aufarbeitung erfolgte nicht wie bei dem bisher beschriebenen Verfahren [91] mit XAD

als Adsorptionsharz sondern mit C-18 Kieselgelkartuschen, auf die der Chromophor direkt

aus der Reaktionslösung quantitativ aufzog. Die Carboxylatfunktionen wurden durch Benetzen

des C-18-Kieselgels mit wässriger KHC03 in das Kaliumsalz überführt und nach Elution mit

Methanol überschüssiges Methyltosylat durch Fällung mit Aceton entfernt.

Die Aufarbeitung der Reaktionslösung einer analog durchgeführten Synthese durch

Adsorption an XAD führte zu beträchtlichem Substanzverlust, da der Chromophor sich trotz

Verwendung genügender Harzmengen nicht quantitativ auf das Harz aufbringen Hess. Eine

weitere Quelle für den Verlust an Produkt 30 war bei der XAD-Methode die Elution des

Alkylierungsmittels mit 0,01 H3P04, die zwar erstaunlich selektiv möglich war doch grosse

Mengen an Lösungsmittel benötigte. Diese Verlustquelle konnte jedoch eliminiert werden, in-

5 Die Menge des eingesetzten Natriumborhydrids hängt stark von der Güte der Inertgasatmo¬

sphäre ab. Bei einem Sauerstoffgehalt von 10 ppm ist ein 10-facher Uberschuss ausreich¬

end wenn die Reaktion hinreichend schnell, d.h. innerhalb einer Stunde abläuft.

56

a) CFfiOOH

b)Pt02IH2

c) Variante 1

NaBH4lTosR24

Variante 2

e I Tos R4

VYCOOK COOK

R2 (20) R3 (31), R4 (21)

CONHiCH^fiOOK

CHS m-CONH(CH2),<lCOOK

KOOCfCH^^NOC

KOOCfCH^aHNOC

CONH(CH2),<iCOOK

(17)

a) CFfiOOH

\ YKOOCfCH^gHNOC CONHfCH^oCOOK £j pjQ , ff

R1,2,3,4

CONH(CH2l fiOOKk

CH3 § m-COfiH(CH2)}fOOK

KOOC(CHt) „HNOC

» KOOC(CH2) „HNOC

CONHfCHiftgCOOK

vyKOOQCHJ JiNOC CONHtCHJjoCOOK

R, (30) R2 (18) , Rs (32) R4 (19)c) Variante 1

NaBH4 I Tos R12 4

Variante 2

e I Tos R4

R,=

7 ?\»

Äö/ o \-asJV

^^•jJTi/Y

R,=

Abbildung 23 Alkylierungen von Cobyrinat und Cobamido-

N,N',N",N'",N',",N"'",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)

57

dem das adsorbierte Coa-aquo-Coß-methyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-

(n-decyl-10'-carboxylat) (30) mit Methanol zusammen mit dem Alkylierungsmittel vom

Harz eluiert und durch dreimalige Fällung aus Methanol/Ether das Alkylierungsmittel

abgetrennt wurde.

Alternativ wurde mit dem Produkt eines weiteren, analog hergestellten Ansatzes die

Reinigung durch Fällung mit Phosphorsäure aus wässriger Lösung untersucht. Der sich

bildende Niederschlag war äusserst fein und Hess sich erst durch Zentrifugation (4'000

Upm, 30 min) abtrennen. Die Reinigungswirkung war, wie die 1H-NMR-spektroskopische

Analyse zeigte, minimal.

Das (a/ß)-lsomerenverhältnis der Produkte der Methylierung mit Methyltosylat wurde

durch Auswertung der Intensitäten im 1 H-NMR-Spektrum der am Kobalt gebundenen

Methylgruppe bestimmt. Es entsprach mit einem Wert von a/ß= ca. 4/1 ungefähr dem, das

Stepanek [91] nach Alkylierung von Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-

(n-decyl-10'-carboxylat) mit Methyltosylat erhielt. Die Zuordnung der (a/ß)-lsomeren

stützte sich dabei auf die von Kräutler und Caderas [28] getroffene Zuordnung bei durch

Alkylierung von Co(l)-cobester in Toluol/THF erhaltenen Methylcobestern (Coa-Methyl: -

0,21 ppm; Coß-Methyl: -0,10 ppm).

Die UV/vis- (CH3OH), 1H-NMR- (CD3OD) und IR-Spektren des Produktes entsprachen

jenen des Produktes, das Stepanek [91] nach Alkylierung von Co(l)-cobamido-N,N',N",

N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) mit Methyltosylat charakterisierte.

Die Charakterisierung wurde um die FAB(+)- & FAB(-)-Massenspektren sowie die CD-

und UV/vis-Spektren in Wasser erweitert.

Analog der Beobachtung beim Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",

N ,N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (17) waren die UV/vis-Spektren in Wasser

und Methanol praktisch identisch, die CD-Spektren hingegen unterschieden sich deutlich

voneinander. Das 13C-NMR-Spektrum von 30 in Deuteromethanol bei Raumtemperatur wies

erstaunlicherweise nur eine geringe Auflösung auf, ein Effekt der für die Analoga

Hexakalium-Coa-aquo-Coß-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-

10'-carboxylat) (18) und Hexanatrium-Coct-aquo-Coß-1,N6-ethenoadenosyl-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (19), für die erst bei

Temperaturen unterhalb -1,0 °C vollständige 13C-NMR-Spektren erhalten wurden, noch

ausgeprägter war.

58

2.3.2 Adenosylierung

Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobyrinat (20)

Die Adenosylierung von Co(l)-cornnen wurde von Hogenkamp [9], Stepanek [91] sowie

Bernhauer und anderen Autoren [119] mit 2',3'-0-lsopropyliden-5'-0-Tosyladenosin

durchgeführt und anschliessend Isopropyliden säurekatalysiert entfernt [98, 119]. Im

Rahmen dieser Arbeit wurde die Adenosylierung von Co(l) cobyrinat zum Hexakalium-Cotx-

aquo-Coß-5'-adenosyl-cobynnat (20) direkt durchgeführt, analog der Umsetzung von

Co(l)-cobalamm mit 2',3'-Dideoxyadenosyl 5'-tosylat zum 2',3'-Dideoxyadenosyl-5'

cobalamin [104]

Die direkte Umsetzung von B12s mit 5'-0-Tosyladenosin (15) brachte nach Friedrich [5]

bescheidene Ausbeuten und auch Jacobson [96] bezeichnete diesen Syntheseweg als nicht

empfehlenswert

Die hier beschriebene Synthese jedoch verlief trotz ungeschützter Adenosyleinheit mit

befriedigenden isolierten Ausbeuten (76%), wobei die nicht quantitative Ausbeute in

Elutionsverlusten während des Waschens mit 0,1 M H3PO4 des am C-18 Kieselgel

adsorbierten Rohproduktes begründet lag

Zur Synthese des Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl cobyrinat (20) wurde in einer

Glove-box Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrmat (24) platinkatalysiert mit Wasserstoff

zu Co(ll)-cobynnat reduziert, mit Natriumborhydrid Co(l)-cobynnat hergestellt und

dieses mit 5'-lodo-5'-desoxyadenosin alkyliert Die von Siefert [120] beschriebene

Methode der Reinigung durch Adsorption an XAD war für das Adenosylcobynnat 20 nicht

erfolgreich Es liess sich aber aus saurer Lösung an C-18-modifiziertem Kieselgel

adsorbieren Das Rohprodukt wurde daher aus leicht saurer Lösung direkt auf C-18

Kieselgel aufgezogen, durch Zugabe von KHCO3 in das Kaliumsalz überfuhrt und mit Aceton

aus Methanol gefällt

Zur Reinigung des Rohproduktes von überschüssigem Alkylierungsmittel war zweimalige

Fällung ausreichend, wobei der Niederschlag stets sehr fein ausfiel und durch Zentnfugation

von der Mutterlauge getrennt werden musste, doch konnte im Gegenzug vor der Fällung auf

eine Entfernung der Reste des Alkylierungsmittels durch Ausschütteln mit Methylenchlond

verzichtet werden

59

(20)

aiAaJ v«Vj ÜJu1 0 ppm

Abbildung 24: 'H-NMR-Spektrum von Hexakalium-Coa-aquo-CoßS'-adenosyl-

cobyrinat (20) in Deuteriumoxid, c= 2,40-10'2 M, 300,13 MHz

E f f

Abbildung 25: CD-Spektrum von Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobyrinat

(20) in Wasser, c- 2,17-10's M

J 1 1 I L

ppm8 7 6 5 4 3 2 1 0

Abbildung 26: 'H-NMR-Spektrum von Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-

cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carbox-

ylat) (18) in Deuteromethanol, c= 8.26-1Q-3 M, 300,13 MHz

Die Identität der synthetisierten Verbindung mit Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-

cobyrinat (20) wurde durch Vergleich der 1H-NMR- (D20) (Abbildung 24), 13C-NMR-

(D20) und UV/vis-spektroskopischen Daten mit dem analogen Isopropylidenadenosyl-

cobyrinat [91] hergeleitet. Die Signale in den 1H-NMR- und 13C-NMR-Spektren waren

zudem dem Adenosylcobinamid [107] vergleichbar. Die Riboseprotonen konnten mit

Entkopplungsexperimenten zugeordnet werden.

Die Unterschiede des CD-Spektrums beim Wechsel von Methanol als Lösungsmittel zu

Wasser waren ausgeprägter (vgl. [91] und Abbildung 25) als beim 1,N6-Ethenoadenosyl-

analogen 21.

Die Herstellung des reinen Kaliumsalzes war gemäss FAB-Massenspektrum nicht

erfolgreich, vielmehr beobachtete man neben protonierten Carboxylaten Natriumsalze. Das

Natrium wurde dabei wahrscheinlich über ubiquitär vorhandene Natriumionen und

Verunreinigungen des eingesetzten Kaliumsalzes eingeschleppt.

Bei den Synthesen der 1,N6-Ethenoadenosylcorrine wurden daher direkt die

Natriumverbindungen hergestellt.

61

Hexakalium-Co a-aquo- Co ß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,

N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (18)

Zur Synthese des Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N",,N"",N ,

N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (18) wurde in einer Glove-box Heptakalium-

dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)

(17) platinkatalysiert mit Wasserstoff zu Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N"""-

hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) reduziert, mit Natriumborhydrid Co(l)-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) hergestellt und mit 5'-lodo-

5'-desoxyadenosyl alkyliert6. Das Rohprodukt wurde direkt aus der Reaktionslösung an C-

18 Kieselgel adsorbiert, durch Zugabe von KHCO3 in das Kaliumsalz überführt und mit

Aceton aus Methanol gefällt.

In orientierenden Syntheseversuchen wurde deutlich, dass bei der Alkylierung mit 5'-0-

Tosyladenosin (15) das Alkylierungsmittel sich nicht durch Fällung des Rohproduktes aus

Methanol mit Aceton entfernen Hess und gleichzeitig bedingt durch Substanzverlust während

der Fällung die Ausbeute stark reduziert wird. Der Reinigungsfaktor der Fällung war mit

cirka zwei sehr gering. 5'-lodo-5'-desoxyadenosyl hingegen Hess sich vom Corrin durch

einfache Fällung aus Methanol mit Aceton quantitativ abtrennen.

Die Hydrolyse überschüssigen Natriumborhydrids mit H3PO4 war nicht notwendig, da das

Hexakalium-Coot-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-

decyMO'-carboxylat) (18) direkt aus der Reaktionslösung und quantitativ auf C-18

Kieselgel aufgezog und die adsorbierte Substanz sofort mit Wasser gewaschen wurde. Das

Natriumborhydrid Hess sich dabei problemlos entfernen. Unerwartet war, dass entgegen den

Verhältnissen beim Adenosylcobyrinat 20, das Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",

N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) 18 nur aus basischer Lösung und nicht

aus leicht saurer Lösung auf C-18 Kieselgel aufgetragen werden konnte.

Die C-18-Methode der Aufarbeitung vereinfacht die Synthese im Vergleich zu den bisherigen

Methoden wesentlich. Nicht alkyliertes Corrin blieb beim nachfolgenden Elutionsprozess auf

dem C18-Träger zurück.

6 Synthese analog Stepanek [91] mit modifiziertem Alkylierungsagenz und veränderter

Aufarbeitung.

62

Die Identität der synthetisieren Verbindung mit Hexakalium-Coot-aquo-Coß-5'-adenosyl-

cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (18) wurde

durch die 1H-NMR- (D20), IR- und 13C-NMR-(Ü20) spektrokopischen Daten belegt, die

sich von jenen des Isopropylidenanalogen [91] in Deuteromethanol kaum unterscheiden und

bezüglich des Adenosylrestes die beim Adenosylcobinamid [107] beobachtete Signalstruktur

aufwiesen.

Im 1 H-NMR-Spektrum in Deuteromethanol (Abbildung 26) konnten die Ribosesignale des

Adenosylrestes wiederum mit Entkopplungsexperimenten zugeordnet werden.

Das 13C-NMR-Spektrum in Deuteriumoxid zeigte erst bei einer Messtemperatur von unter

1,0 °C sämtliche erwarteten Signale. Das Fehlen einer Isopropylidenschutzgruppe am

Adenosin wirkte sich im 13C-NMR-Spektrum in der Hochfeldverschiebung der

Adenosylsignale verglichen mit der Signallage im isopropylidengeschützten Derivat [91]

aus.

Das FAB(-)-Massenspektrum zeigte nicht den erwarteten Molekularpeak, hingegen trat als

Signal grösster Intensität ein Peak bei m/z 2349,5 auf, der dem Molekulargewicht eines

Tetrakalium-tricarbonsäure-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-

carboxylat) ohne Adenosylteil entspricht.

2.3.3 Alkylierungen mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)

unter Natriumborhydridreduktion

Die Synthese von Hexanatrium-Co<x-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat

(21) und Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobamido-N,N',N",

N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (19) wurde bislang noch nicht

beschrieben.

Es lag nahe, in Analogie zu den Adenosylierungen von in situ aus den Co(ll)-corrinen mit

Natriumborhydrid hergestelltem Co(l)-cobyrinat und Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",

N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)7, die Synthese des 1,N6-Ethenoadenosyl-

aquo-hexakalium-cobyrinat (21) über eine Reduktion in Methanol Natriumborhydrid und

7 vgl. 2.3.2

63

Alkylierung mit dem entsprechenden Tosylat, 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16), zu

probieren.

In einer Glove-box wurde Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) platinkatalysiert

mit Wasserstoff zu Co(ll)-cobyrinat reduziert, das Co(ll)-cobyrinat mit 404 Äquivalenten

Natriumborhydrid zum Co(l)-cobyrinat umgesetzt und mit 14 Äquivalenten 1,N6-

Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) alkyliert. Das UV/vis-Spektrum der wässrigen Lösung

bestätigte den Erfolg der Alkylierung und zeigte die für basenfreie Alkylcorrine typische

Struktur mit einem Maximum bei 454, 301 und 263 nm.

Das Produkt der Umsetzung von Co(l)-cobyrinat mit 1,Ne-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat

(16) wurde nach Elution von der C-18-Kartusche direkt mit Ether aus der methanolischen

Lösung gefällt und war anschliessend frei von Alkylierungsmittel oder seinen

Hydrolyseprodukten. Diese Synthese lieferte aber, wie die später durchgeführte

elektrochemische Synthese8 von 21 zeigte, nicht das gewünschte Produkt sondern ein

alkyliertes Cobyrinat 31 mit unbekannter Struktur des Alkylrestes.

Es bestand Grund zu der Annahme, dass das Cobyrinatgerüst unverändert vorlag, denn unter

dealkylierenden Bedingungen, wässrigem KCN und Sonnenlicht, wurde das UV/vis-Spektrum

der Dicyanocobyrinsäure (24) zurückerhalten. Zudem konnten die Signale des Corrinringes

im 13C-NMR-Spektrum weitestgehend zugeordnet werden und im FAB(-)-Massenspektrum

war das Signal des dealkylierten Cobyrinsäuregerüstes (m/z 1155,6) zu beobachten.

Bei dem direkt an das Kobalt gebundenen Verbindungsteil handelt es sich höchst¬

wahrscheinlich um Ribose. Das 1 H-NMR-Spektrum der Produkte in Deuteromethanol zeigte

nämlich deutlich ein Triplett bei 0,20 sowie ein Dublett bei 0,50 ppm, der chemischen

Verschiebung des C5' der kobaltgebundenen Ribose. Mit Entkopplungsexperimenten Hessen

sich im 1 H-NMR-Spektrum analog dem Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobyrinat

(20) mit diesem Proton gekoppelte Protonen identifizieren, deren chemische

Verschiebungen, 5,36 ppm, 4,05 ppm und 3,48 ppm, mit einem Ribosering kompatibel

sind. Das Signal des Ribose-C4' wurde allerdings nicht gefunden, wahrscheinlich weil es mit

einer wenig aufgelösten Signalgruppe zusammenfällt.

Der 1 ,N6-Ethenoadenin-Teil des Alkylierungsmittels war in der Reaktionslösung auf jeden

Fall einer Reaktion unterworfen. Die Signale im 1 H-NMR-Spektrum einer Lösung von 31 in

8 vgl. 2.3.4

64

Deuteromethanol bei 7,33 ppm, 7,16 ppm und 6,82 ppm entsprachen nicht den

entsprechenden Signallagen der base-off Form des 1,Ne-Ethenoadenosylcobalamin (4) bei

9,42 ppm, 9,31 ppm, 8,35 ppm und 7,99 ppm und unterschieden sich auch von jenen des

später elektrochemisch synthetisierten Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)-

adenosyl-cobyrinat (21 )9.

Eine Reaktion des 1,N6-Ethenoadenins im durch den grossen Natriumborhydridüberschuss

stark basische Milieu entspricht den bereits in der Literatur gemachten Beobachtungen.

Inoue [121] schlägt als Reaktion für das 1 ,N6-Ethenoadenin in stark basischem, wässrigen

Milieu die Öffnung des mittleren Ringes unter Formamidbildung vor (31 a).

7,16 ppm7,16 ppm

h ca. 7,70 ppm [122]

7,16 ppm-

ca. 13,4 ppm [112] mc.»^^ H^com,.0

7,33 ppm

ca. 8,2-8,7 ppm [122] / »Tl H

I OH OH

ca. 7,5-9,5 ppm [122]

31a

7,16 ppm

31 b

Abbildung 27: Produkte der Umsetzung von 1.NP-Ethenoadenosin mit NaBH4

Die kohlenstoffgebundenen Protonen des endständigen Pyrrols müssten dann eine praktisch

identische chemische Verschiebung aufweisen. Es wird auch tatsächlich ein Signal einer

mindestens zwei Protonen entsprechenden Intensität bei 7,16 ppm beobachtet. Das Signal bei

7,33 ppm ist mit dem einzigen Proton des anderen Pyrrolringes kompatibel. Die für die

Struktur 31 a gemäss [122] bei 8,2-8,7 ppm (HN-COtU, sowie in der Region von 7,5-

9,5 ppm (HN-COH) zu erwartenden Signale wurden aber nicht beobachtet. Das H(N-Pyrrol)

sollte bei ca. 13,4 ppm erscheinen. Es lag jedoch ausserhalb des Messbereiches (10 bis -1

ppm).

9 vgl. 2.3.4

65

Ist die Struktur 31a nicht mit dem experimentell beobachteten 1H-NMR-Spektrum

kompatibel, so lässt es sich durch das postulierte Folgeprodukte 31b, in der Formamid

durch einen Wasserstoff ersetzt ist, vollständig interpretieren. Die drei Protonen

entsprechende Intensität des Signales bei 7,16 ppm wird nun verständlich und ausser dem zu

erwartenden Signal bei ca. 13,4 ppm trat für jedes Protonen der postulierten Struktur das

erwartete Signal im 1 H-NMR-Spektrum auf, vom H(N-Pyrrol) abgesehen.

Das FAB(+)-Massenspektrum unterstützt den Strukturvorschlag für den am Kobalt

gebundenen Alkylrest, denn das Signal der protonierten, mit 31b alkylierten Tetranatrium-

disäure (m/z 1336,74) ist deutlich sichtbar.

Die Alkylierung zu 31 war sowohl mit 5'-Chloro-5'-deoxy-l,N6-etheno-adenosin als auch

1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) reproduzierbar. Während zur Alkylierung mit

5'-Chloro-5'-deoxy-1 ,N6-etheno-adenosin jedoch ein 20-facher Uberschuss an

Alkylierungsmittel nötig war, um die Reaktion innerhalb einiger Stunden ablaufen zu lassen,

genügte beim Tosylat 16 ein Uberschuss von nur wenigen Prozent. Beim 5'-Chloro-5'-

deoxy-l,N6-etheno-adenosin hingegen verblieben selbst nach sechsfacher Fällung ca. 10%

Alkylierungsmittel bezogen auf das Corrin im Präzipitat, welches daher noch

dünnschichtchromatographisch gereinigt werden musste.

Analog dem Co(ll)-cobyrinat wurde Co(ll)-cobamido-N,N,,N",N"',N"",N"'",N -hepta-

(n-decyl-10'-carboxylat) mit 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin in Gegenwart

eines 200-fachen Überschusses von Natriumborhydrid zu 32 alkyliert.

Das Alkyl-cobamido-N,N',N",N"',N"",N"'",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) 3 2

Hess sich während der Aufarbeitung nicht mittels Ausschütteln der wässrigen

Reaktionslösung gegen Methylenchlorid von überschüssigem Alkylierungsmittel reinigen.

Bei der dünnschichtchromatographischen Trennung auf C-18 Kieselgel mit

Methanol/Wasser 6,5:5 trennte zwar eine fluoreszierende Substanz deutlich von der

Hauptbande mit dem Alkylierungsprodukt 32 ab, doch enthielt dieses nach Elution vom

Kieselgel und Fällung mit Aceton aus methanolischer Lösung gemäss 1 H-NMR-Spektrum noch

immer 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin. Zog man hingegen das Rohprodukt analog

dem Hexakalium-Coo-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N' -hepta-

(n-decyl-10'-carboxylat) (18) mit KHCO3 auf SepPack auf, konnte man das Alkylierungs¬

mittel mit Methanol/Wasser (8:2) auswaschen und direkt das gewünschte Salz darstellen.

Gemäss 1 H-NMR-Spektrum war die am Kobalt gebundene Alkylgruppe des isoHerten

Produktes 32 mit dem des analog hergestellten Cobyrinates 31 identisch.

66

2.3.4 1,N6-Ethenoadenosylierungen

Hexana trium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobynnat (21)

Nachdem nun die Alkylierung in Anwesenheit von Natriumborhydrid nicht zu den

gewünschten Verbindungen führte bot sich als Alternativmethode die elektrochemische

Reduktion des Cornnes an, die schon bei den Cobalaminen erfolgreich angewendet werden

konnte [104]

Im Rahmen der elektrochemischen Synthese wurde die Möglichkeit der

platinoxidkatalysierten Reduktion des Dicyano-heptakalium Co(lll) cobyrinat (24) zu

Co(ll)-cobyrmat ausserhalb der Glove box geprüft Sämtliche Synthesen, welche mit derart

reduziertem Material durchgeführt wurden, lieferten kein einheitliches 1H NMR-Spektrum

sondern wiesen im Bereich 1 3 ppm eine deutliche Wölbung der Grundlinie sowie nicht

interpretierbare Signale auf Diese Beobachtungen waren gemäss HCN-Test nicht allein mit

Verunreinigung der NMR-Probe durch Co(ll) cobyrinat zu erklären (HCN-Zugabe führte

nicht zu einem sofortigen Auftreten einer Bande bei 367 nm im UV/vis-Spektrum)

Es wurden zwei Synthesevarianten untersucht Das Alkylierungsmittel wurde vor der

Reduktion des Co(ll)-cobynnates zum Co(l)-cobynnat bzw nach quantitativer Reduktion

zum Co(l) corrin zugegeben Die nach Aufarbeitung und Reinigung isolieren Hauptprodukte

der beiden Synthesevarianten waren gemäss 1 H-NMR-Spektrum identisch Erfolgte die

Zugabe des Alkylierungsmittels bereits zu Beginn der Co(ll)/Co-(l)-Reduktion wurde

jedoch 5' Chloro 5'-deoxy-1,N6 etheno adenosin, wahrscheinlich durch elektrochemische

Dehalogenierung [92], verbraucht

Die elektrochemische Reduktion des Co(ll)-cobynnates zum Co(l)-cobynnat benötigte für

ca 60 mg Co(ll) cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n decyl 10'-carboxylat)

vier Stunden Die anschliessende Alkylierung war eine Stunde nach Zugabe des

Alkylierungsmittels abgeschlossen

In Analogie zu 31 & 32 konnte 5' Chloro-5'-deoxy-1 ,N6 etheno adenosin nicht durch

Fällung aus Methanol mit Aceton entfernt werden, ebensowenig wie durch Ausschütteln einer

Lösung des Rohproduktes in Wasser gegen Methylenchlond Die als Alternative bereits bei

31 angewendete SepPack Methode mit Aufziehen der Substanz aus saurer Lösung auf C-18

Kieselgel und anschliessender zweimaliger Fällung des Natriumsalzes 21 aus wässriger

Lösung mit Aceton war auch in diesem Falle erfolgreich Bei Zugabe des 5'-Chloro-5'-

67

deoxy-1 ,N6-etheno-adenosin vor der elektrochemischen Reduktion musste das Rohprodukt

nach der Entfernung des Alkylierungsmittels an SepPack noch dünnschichtchromato-

graphisch von Nebenprodukten an einer C-18-Kieselgel Umkehrphase gereinigt werden. Die

Ausbeute an isoliertem Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat

(21) betrug für diesen Syntheseweg nur 61 % anstatt der 81 %, die bei Zugabe des

Alkylierungsmittels nach quantitativer Reduktion zum Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",

N ,N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) erzielt werden konnten.

Die 1 ,N6-Ethenoadenosylsignale im 1 H-NMR-Spektrum (D20) (Abbildung 28), 8,91 ppm,

8,07 ppm 7,90 ppm und 7,50 ppm lagen in vergleichbaren Regionen wie die des 1,N6-

Ethenoadenosylcobalamin (4) in Deuteriumoxid/10%Deuterotrifluoressigsäure10 (8,89

ppm, 8,71 ppm, 7,84 ppm und 7,51 ppm). Die Riboseprotonen wurden ausgehend vom

H(C-5') Signal bei 0,00 ppm (CD3OD) (Abbildung 29) und dem Peak des C-1-

Riboseprotons durch Entkopplungsexperimente identifiziert und zugeordnet.

Das UV/vis-Spektrum zeigte die erwartete, für das 1 ,N6-Ethenoadenin typische Bande bei

255 nm mit dem entsprechenden, doppelt so hohen Extinktionskoeffizienten e wie beim

Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-

decyl-10'-carboxylat) (18). Die drei weiteren Absorptionsmaxima des 1,N6-

Ethenoadenosin schlagen sich ebenfalls in erhöhten Absorptionen nieder. Das

Absorptionsmaximum längster Wellenlänge ist im Vergleich zum Hexakalium-Coa-aquo-

Coß-5'-adenosyl-cobyrinat (20) um 6 nm zu kürzeren Wellenenlängen nach 454 nm

verschoben.

In Analogie zu anderen im Rahmen der vorliegenden Arbeit beschrieben Alkylcorrinen wies

das FAB(-)-Massenspektrum zwar keinen Molekularpeak auf doch war das Signal des

dealkylierten Moleküls, m/z 1087,4, beobachtbar.

Ausgehend vom Hexanatriumsalz 21 wurde die freie Säure dargestellt indem in Wasser

gelöstes 21 auf SepPack C-18 adsorbiert, mit Wasser gewaschen, mit Methanol wieder

eluiert und durch Zugabe von Ether gefällt wurde. Die Signale des (1,N6-

Ethenoadenosyl)adenosylrestes im 1 H-NMR-Spektrum (CD3OD und D20) der freien Säure

waren stark verbreitert (Halbwertsbreite 0,1 ppm).

10 vgl. 6.2

68

U7uvJuJ

^

MJ_l I u _l I I l_

11 10 9 8 76 5432 10 ppm

Abbildung 28: 'H-NMR-Spektrum von Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-

etheno)adenosyl-cobyrinat (21) in Deuteriumoxid, c= 2,00-W2

M, 300,13 MHz

&uva_JUj"

8 1 PPm

Abbildung 29: 'H-NMR-Spektrum von Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-

etheno)adenosyl-cobyrinat (21) in Deuteromethanol, c= 2,00-10-2

M, 300,13 MHz

69

Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobamido-N,N',N",

N"'^""^ ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (19)

Die Synthese des Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (19) wurde analog der des

Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat (21) durchgeführt.

Erfreulicherweise war trotz der Alkylketten das Kobaltzentrum für eine elektrochemische

Reaktion an einer festen Elektrode genügend zugänglich, um ohne Mediator zum Co(l)-

cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) reduziert zu

werden. Bei der 1,N6-Ethenoadenosylierung des Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",

N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) war die Reihenfolge der Alkylierungsmittelzugabe

jedoch kritischer als beim Co(l)-cobyrinat. Sofortige Zugabe des Alkylierungsmittels 5'-

Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin bei Beginn der Elektrolyse zum Co(l)-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N"'",N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) führte gemäss 'H-NMR- und

UV/vis-Spektrum zu ca. 30% Nebenprodukten, welche nicht weiter identifiziert wurden. Es

verblieb nach Aufarbeitung und Reinigung eine isolierte Ausbeute von 30%. Gab man das 5'-

Chloro-5'-deoxy-1 ,N6-etheno-adenosin nach abgeschlossener Reduktion zum Co(l)-

cobamido-N,N,,N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) dazu, resultierte

hingegen eine Ausbeute von 81%.

Zur Reinigung des Rohproduktes wurde das Produkt analog 32 direkt aus der

Reaktionslösung auf eine C-18-Umkehrphase aufgezogen, mit einem Wasser-Methanol-

Gemisch, 3:7, das 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin eluiert und das

Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobamido-N,N,,N",N'",N"",N ,

N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (19) nach Elution mit Methanol mit Aceton gefällt.

Das Präzipitat wurde ebenso wie das Hexakalium-Coa-aquo-Coß-methyl-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (30) während des

Trocknungsprozesses lackartig.

Wurde das Alkylierungsmittel, d.h. 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin, vor Beginn

der elektrochemischen Reduktion zugegeben, mussten die entstehenden corrinoiden Neben¬

produkte mit Dünnschichtchromatographie abgetrennt werden.

70

Abbildung 30 UV/vis-Spektrum von Hexanatnum-Coa-aquo-Coß-5'-(1",Ne-

etheno)-adenosyl-cobamido-N,N,,N",N'",N"",N""",N -hepta-(n-

decyl-10'-carboxylat) (19) m Wasser, c= J,90 10~s M

l 5

Abbildung 31 CD-Spektrum von Hexanatnum-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-

etheno)-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N""',N"""-hepta-(n-

decyl-W-carboxylat) (19) in Wasser, c= 1,90 10 5M

71

Die UV/vis-Spektren von 19 sind in Wasser (Abbildung 30) und Methanol identisch und

ähneln denen des Hexakalium-Coo-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,

N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (18). Das langwelligste Absorptionsmaximum

liegt für 19 bei 456 nm, verglichen mit 458 nm bei 18.

Die CD-Spektren von 19 in Wasser (Abbildung 31) und Methanol unterscheiden sich

hingegen wie bereits bei Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,

N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)es (17) in wässriger und methanolischer Lösung

voneinander. In Methanol werden zusätzliche Nulldurchgänge bei 459 und 470 nm

beobachtet während im Vergleich zum CD-Spektrum in Wasser die Nulldurchgänge bei 235

und 239 nm fehlen. Die Lage der Maxima in den CD-Spektren ist praktisch identisch.

Das 1 H-NMR-Spektrum von 19 in CD3OD (Abbildung 32) entsprach dem des Hexakalium-Co

a-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N,,N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carb-

oxylat) (18). Die Signale des Ribose C-5a und ß traten in Deuteromethanol deutlich hervor,

wenn auch bei 0,38 & 0,91 ppm statt bei 0,30 81 0,40 ppm wie beim Adenosylanalogen 18,

und die chemischen Verschiebungen einiger Riboseprotonen konnten für 19 durch

Entkopplungsexperimente bestimmt werden.

In D20 bestand das 1 H-NMR-Spektrum nur aus Signalhaufen mit Maxima bei 1,15, 1,40,

2,05 und 3,00 ppm.

Das 13C-NMR-Spektrum von 19 in Deuteromethanol (Abbildung 33) zeigte erst nach

Abkühlung der Probenlösung auf -5,8 °C sämtliche erwarteten Signale und kontrastiert

somit zu den Alkyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-

carboxylat)en 32 & 18, deren 13C-NMR-Spektrum bereits bei -1,0 °C eine vergleichbare

Auflösung aufwiesen.

Der Nachweis einer Kobalt-Kohlenstoff-Bindung wurde nochmals unabhängig durch eine

analog dem Hexakalium-Coo-aquo-Coß-methyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -

hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (30) in präparativem Massstab ausgeführte

Dealkylierung erbracht: das Produkt 19 lieferte nach Reaktion mit Kaliumcyanid unter

Lichtausschluss und anschliessender Aufarbeitung ein 1 H-NMR-Spektrum, das mit dem des


carboxylat) (17) identisch war.

72

10 8 1 0 ppm

Abbildung 32: 1 H-NMR-Spektrum von Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-

etheno)-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N -hepta-(n-

decyl-10'-carboxylat) (19) in Deuteromethanol, c= 2,56-10~2 M,

300,13 MHz

.eil =i ; * t i e **B'

ffff t ?m ? ? i ; : ii ?b ias< in au s s

I I I I I I ! I I I I II

KOOC{CH})](flNOC

KOOC(CH2)I(>HNOC

> CYKOOCICHJufmOC CONH(CH,)^COOK

-Ju i.(19)

ml.;,; LiL

Abbildung 33: '3C-NMR-Spektrum von Hexanatrium-Cocc-aquo-Coß-5'-(1",N6-

etheno)-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N"'",N"""-hepta-(n-

decyl-10'-carboxylat) (19) in Deuteromethanol, c= 1,27-1Q-2M,

100 MHz, -5,8 °C

73


Das micellartig erweiterte Cobyrinsäurederivat, Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17), über dessen

Assoziationsverhalten zu Beginn dieser Arbeit keinerlei Erfahrungen vorlagen, sollte auf

seine Eigenschaften als Wirtmolekül untersucht werden. Die idealen Eigenschaften eines

komplementären Gastmoleküls wurden dabei wie folgt definiert:

/. das Corringerüst nicht überschreitende Grösse

2. minimale Löslichkeit in Wasser

3. günstige Fluoreszenzeigenschaften

Als erstes wurde das leicht zugängliche 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22)

synthetisiert. Die Fluoreszenzeigenschaften von 9,10 symmetrisch disubstituierten

Anthracenen waren bereits gut untersucht [123]. Die Synthese von Homologen zu 22 wäre

praktisch identisch durchführbar gewesen, sodass der gewünschte Variationsspielraum zum

genauen Abgleich mit den Eigenschaften des Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24)

und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-

10'carboxylat) gegeben zu sein schien. Die Experimente mit 9,10-Di-(4-

brombutyloxy)-anthracen zeigten jedoch, dass Assoziate mit Heptakalium-dicyano-Co(lll)-

cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) nur unter

ganz besonderen Bedingungen, und zwar in Anwesenheit von Methylenchlorid, herstellbar

waren. Die derart erhaltenen Assoziate waren zudem metastabil11.

Analoge Versuche mit 5'-0-Tosyladenosin (15) waren ermutigender, da sie eindeutig auf

eine Assoziation von 15 mit Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",

N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) hindeuteten. Damit stellte sich die

Frage nach den relativen Lagen von Wirt- und Gastmolekül. 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-

tosylat (16), das durch die 1 ,N6-Etheno-Brücke Fluoreszenzeigenschaften erhält, die als

Sonde zur Aufklärung der nächsten Umgebung genutzt werden können, wurde daher erstmalig

hergestellt und auf seine Assoziationseigenschaften mit Dicyano-heptakalium-Co(lll)-

cobyrinat (24) und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N",",N -

hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (17) untersucht12.

11 vgl. 4.1

12 vgl. 6.6 & 6.8

74

(33)

II H20 I jf INaOH

Na2S204

21

Br

Br

(22)

NH,

N^VN&

Sv-^JV r/'L.O-S-C^-CH,

(15) IS—PIS\ 0,

v+H°

(i6OHOH

MeOH I Phosphatpuffer (1 M, pH 9)

Abbildung 34: Synthese der Gastmoleküle 9,10-Di-(4-brom-

butyloxy)-anthracen (22) und 1.^-EthenoadenosylS'-O-tosylat (16)

75

9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22)

22

Cherkasov [124] und Clark [125] stellten 9,10-substituierte Anthracenderivate aus

Anthrachinon 33 erstmals als Zwischenprodukt der Synthese von 9,10-Di-(4-

carboxybutyl)-anthracen bzw. im Zusammenhang mit Untersuchungen zum Einfluss von

Substituenten am Anthracen in 9,10-Stellung auf das UV/vis-Spektrum dar.

Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführte Synthese stützte sich auf die Vorschrift von

Yeung [123], der in situ aus Anthrachinon 33 und Dithionit erzeugtes Anthra-9,10-diol

mit Halogenalkylen umsetzte.

Anthrachinon wurde mit Natriumdithionit zum 9,10-Anthradiol reduziert, welches mit in

grossem Uberschuss eingesetztem 1,4-Dibrombutan zum 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-

anthracen 22 weiterreagierte. Das Produkt 22 Hess sich aus dem Rohprodukt weder fällen

noch kristallisieren. Das Rohprodukt wurde daher chromatographiert wobei die grosse

Menge an überschüssigem 1,4-Dibrombutan sich rasch und problemlos durch Waschen der

Kieselgelsäule mit Hexan vor Beginn der eigentlichen Chromatographie abtrennen Hess. Die

Ausbeute lag mit 9,5 % isolierter, kristalliner Substanz deutlich unter den 45%, die von

Yeung [123] mit der Monobromverbindung erzielt wurden. Die Vorschrift wurde allerdings

in Bezug auf die Ausbeute noch nicht optimiert, da rasch genügend Material für die weiteren

Experimente vorlag.

Das 1H-NMR- und 13C-NMR-Spektren sowie die Mikroanalyse zeigten ausschliesslich die

erwarten Signallagen und Intensitäten und bestätigten die Synthese des gewünschten

Produktes. Das IR-Spektrum war mit der Struktur von 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-

anthracen 22 kompatibel und zeigte bei 1075 cm~1 die für Etherbrücken charakteristische

Absorptionsbande. Das UV/vis-Spektrum von 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen 22

wies mit seinen Maxima bei 403, 381, 363 und 258 nm das gleiche Muster mit ungefähr

den gleichen Absorptionskoeffizienten auf wie die von Yeung [123] und Cherkasov [124]

publizierten UV/vis-Spektren der 9,10-Di-(alkyloxy)-anthracene.

76

1,N6-Etheno-5'-tosyl-5'-deoxy-adenosin (16)

o

o

KU

1 6

Ein fluoreszierendes Adenosinanaloges wurde erstmalig von Kochetkov et al. [126] durch

Ringschluss am Adenin und Cytosin mittels Chloroacetaldehyd synthetisiert.

Bei der Umsetzung von 5'-0-Tosyladenosin (15) mit 1,2-Dibromethylacetat hingegen,

bereits von Powell et al. [127] 1974 erfolgreich angewendet, tritt die Hydrolyse in

Konkurrenz zum Ringschluss, sodass deutlich geringere Ausbeuten resultierten. Die

Reaktion verläuft zudem beim 5'-0-Tosyladenosin (15) wesentlich langsamer ab. Kimura

[128] zum Beispiel konnte erst nach 60 Stunden Reaktionsdauer (37 °C, pH 6,5) Adenosin

quantitativ in 1,N6-Ethenoadenosin überführen.

Für die Reaktion mit Chloroacetaldehyd hatte von Wang et al. [129] gezeigt werden können,

dass die Reaktion mit dem Angriff des N(1) auf den Aldehydkohlenstoff beginnt.

In der vorliegenden Arbeit wurde nun 5'-0-Tosyladenosin (15) in Methanol/

Phosphatpuffer pH 7, 1:1, suspendiert und 1,2-Dibrom-ethylacetat zugefügt. Die

Suspension, die langsam in Lösung ging, wurde mit wässrigem KOH während der mehrtägigen

Reaktionsdauer wiederholt auf ca. pH 4-6 eingestellt. Die Lösungsmittelzusammensetzung

erklärt sich durch das Löslichkeitsverhalten der Reaktionsteilnehmer. Kochetkov [126] gab

in seiner Vorschrift zu einer wässrigen Lösung Ethanol allein zur Homogenisierung der

Lösung hinzu. Die Reaktion Hess sich auch in reinen Ethanol oder Propanol nicht von Beginn

an homogen durchführen.

Überschüssiges Edukt wurde aus der Reaktionslösung durch Ausschütteln mit

Methylenchlorid entfernt. Im 1 H-NMR-Spektrum des verbleibenden, eduktfreien

Rohprodukts (gewogene Ausbeute 60%) fanden sich die Signale der Zielverbindung 16 sowie

77

einer weiteren Substanz, die dieselbe Anzahl Protonen besass jedoch nicht isoliert werden

konnte. Das diffizile Löslichkeitsverhalten des Tosylates 16, sowohl in Methanol als auch in

Methylenchlorid konnten nicht beliebig konzentrierte Lösungen hergestellt werden, bedingte

in der anschliessenden präparativen säulenchromatographischen Trennung einen

ungewöhnlich grossen Säulendurchmesser. Das dabei isolierte 1 ,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-

tosylat (16) (34,5 %) Hess sich, im Gegensatz zu 1 ,N6-Etheno-5'-deoxyadenosin [5], nur

in Mikrokristallen aus Chloroform und Petrolether in 30%iger Ausbeute kristallisieren.

In einer Versuchsreihe, in der identische Ansätze nach unterschiedlichen Zeiträumen

aufgearbeitet wurden, wurden die absoluten Ausbeuten an 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-

tosylat (16) und die relativen Anteile an Rohprodukt und Tosylat 16 in Funktion der

Reaktionsdauer bestimmt. Eine Verlängerung der Reaktionzeit über 500 Stunden hinaus

führte zu praktisch keiner Steigerung der Ausbeute mehr.

Das Produkt 16 wurde durch 1H-NMR-, 13C-NMR- und UV/vis-Spektroskopie, Mikro¬

analyse und das Massenspektrum umfassend charakterisiert. Die Spektren sind sämtlich mit

der Struktur des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) kompatibel.

Das UV/vis-Spektrum besteht aus der ebenfalls dem 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-

adenosin [95] typischen Bandenstruktur mit ausgeprägtem Maximum bei 227 nm und vier

Maxima bedeutend geringerer aber untereinander vergleichbarer Intensität bei 258 nm,

265 nm, 275 nm und 296 nm.

Durch Entkopplungsexperimente wurden die Signallagen der Riboseprotonen im 'H-NMR-

Spektrum identifiziert. Die Signale im 1 H-NMR-Spektrum bei 7,64 ppm respektive 8,08

ppm)13 wurden gestützt auf Deuteriummarkierungsexperimente von Leonard et al. [130]

den Positionen 10 bzw. 11 im 1 ,N6-Ethenoadenin zugeordnet.

Die Assoziatbildung des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) ist in der Literatur

wiederholt beschrieben [129, 131-136]. Das FAB(+)-Massenspektrum spiegelt dieses

Verhalten wider, indem nämlich nicht nur ein Signal der Intensität des Molekularsignales

(m/z 445) sehr deutlich hervortritt sondern auch bei (m/z 891), dem doppelten

Molekülargewicht.

Spektrum aufgenommen in CD3OD, c« 3,93-10"2 M.

78

Das 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) war im Gegensatz zu Methyl- und 5'-0-

Tosyladenosin (15) [137-140] in Deuteriumoxid relativ hydrolyseunempfindlich. In einer

gesättigten Lösung in Deuteriumoxid Hess sich 1 H-NMR-spektroskopisch selbst nach einer

Woche keine Hydrolyse feststellen. Bei 5'-0-Tosyladenosin (15) hingegen mussten im

Rahmen der innerhalb eines Tages durchgeführten Assoziationsexperimente die

Konzentrationen um den hydrolysierten Anteil korrigiert werden. Der Umfang der Hydrolyse

belief sich im Zeitrahmen der durchgeführten Experimente, d.h. innerhalb eines Tages, auf

maximal 10%.

Ursache für die langsamere Hydrolyse des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) im

Vergleich zu 5'-0-Tosyladenosin (15) könnte die Stacking-Tendenz des 1,N6-

Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) [129, 131-136] sein. Erst ab Konzentrationen

unterhalb 10"3 M liegt 16 zu mehr als 98% in monomerer Form vor. Durch die Assoziation

der Moleküle von 16 wird wahrscheinlich die Hydrolyse des Tosylates behindert.

79

3. Wirt-Gast-Komplexe des miceiiartigen Cobyrinsäure

derivates

Zusammenfassung

Wässrige Lösungen von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und Heptakalium-

dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)

(17) wurden mittels Ultraschall mit 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22), 5'-

O-Tosyladenosin (15), Methyltosylat sowie 1.f^-EthenoadenosylS'-O-tosylat (16)

gesättigt und die resultierenden Lösungen UV/vis- und 1 H-NMR-spektroskopisch, im Falle

von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat zusätzlich mit Totallumineszenzspektroskopie

untersucht.

Für Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) konnte mit den Alkylierungsmitteln 22,

15 und 16 keine signifikante Assoziation nachgewiesen werden.

Hingegen zeigten sämtliche analog durchgeführten Experimente in wässrigen Dicyano-

heptakalium-cobamido-N,N",N",N"",N"",N""",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)-Lös-

ungen 17 deutlich erhöhte Löslichkeiten der Alkylierungsmittel:

1. 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22) wurde bei Raumtemperatur in An¬

wesenheit von Methylenchlorid in derselben Konzentration wie 17 gelöst während in reinem

Deuteriumoxid kein 22 detektienoar war. Bei 5 °C kristallisierte 22 vollständig aus.

2. Für 5'-0-Tosyladenosin (15) wurden aufgrund spektroskopischer Daten Assoziate

vermutet, deren mittlere Stöchiometrie von der Konzentration der Heptakalium-dicyano-

Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)-Lösung

abhängig war. Diese Assoziate konnten ebenfalls über die zur Alkylierung zu Hexakalium-

Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N"'",N"""-hepta-(n-decyl-10'-

carboxylat) (18) führende Reaktion mit Natriumborhydrid nachgewiesen werden.

3. Assoziate des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N '-

hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) mit I.NP-EthenoadenosylS'-O-tosylat (16)

wurden mit 1H-NMR-, UV/vis- und Totallumineszenzspektroskopie nachgewiesen. Wässrige

gesättigte l.f^-EthenoadenosylS'-O-tosylat-Lösungen, welche mit festen Dicyanocorrinen

24 und 17 versetzt wurden und wässrige Lösungen derselben Dicyanocorrine, die mit 1.N6-

Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gesättigt waren, wiesen trotz gemäss UV/vis-Spektrum

unterschiedlichen Konzentrationen an 1^-EthenoadenosylS'-O-tosylat identische

Totallumineszenzintensitäten auf.

80

CONH(CH,)t£OOK

S^—-._ CH, r-CONmCHJufiOOK

KOOC(CH,)I(f{NOC—% J^jL^StlcH

CT//

KOOCiCHJxflNOC

CONH(CH,)i,COOK

VYKOOC(CH,),^INOC COHHiCHJußOOK

VYCOOK COOK

c)

CV^Jy v-i-o—

UV/vis-Spektroskopie

'H-NMR-Spektroskopie

für c. zudem :


Abbildung 35: Schematische Darstellung der Experimente zu den Wirt-Gast-

Eigenschaften von Dicyano-heptakalium-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N '-hepta-(n-

decyl-10 '-carboxylat)

81

Mit den Experimenten zum Assoziationsverhalten sollte die Fähigkeit des Cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) zur Aufnahme eines

Gastmoleküles untersucht werden.

Bei der Alkylierung der Corrine mit den Alkylierungsmitteln 15 und 16 liegt das Kobalt

nicht in der Dicyanoform (Co(lll)) sondern als Co(l) vor. Für sämtliche Assoziations¬

experimente wurden dennoch die Dicyanoverbindungen eingesetzt, weil diese

erstens in aerober Lösung stabiler sind als die entsprechenden Co(l)- und Co(ll)-

Verbindungen, die z.B. bei Alkylierung in aerober Lösung keine gemäss 1H-

NMR-Spektrum einheitlichen Produkte ergaben, sodass die entsprechenden

Assoziationsexperimente unter Inertgas hätten ausgeführt werden müssen,

zweitens die Dicyanoverbindungen 24 & 17 mit1 H-NMR-Spektroskopie untersucht

werden konnten, was z.B. für die Co(ll)-verbindungen aufgrund ihrer

paramagnetischen Eigenschaften unmöglich ist, und

drittens aufgrund der relativen Grösse der Cyanidliganden keine sterischen Effekte zu

erwarten waren.

In einem orientierenden Experiment mit dem im Vergleich zum Corrin kleinen Methyltosylat

wurde zuvor abgeklärt, ob Assoziation tatsächlich beobachtbar ist.

Dazu wurden Lösungen von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,

N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) bzw. -cobyrinat (24) gleicher

Konzentration in Deuteriumoxid mit Methyltosylat versetzt, mit Ultraschall behandelt und

nach Zentrifugation der Suspensionen das 1 H-NMR-Spektrum aufgenommen.

In der Lösung von 17 (7,1 mM) war 'H-NMR-spektroskopisch eine ungefähr doppelt so

hohe Konzentration an Methyltosylat nachweisbar als in einer gleichkonzentrierten Lösung

von 24. Dieses Ergebnis ermutigte dazu, weitere Moleküle auf ihre Assoziationseigen¬

schaften genauer zu untersuchen.

3.1 Die Assoziation mit 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22)

Lösungen von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-

(n-decyl-10'-carboxylat) (17) bzw. Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) in

Deuteriumoxid wurden (a) mit festem 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22)

versetzt, oder (b) mit einer an 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen gesättigtem

Hexanlösung überschichtet oder (c) mit einer an 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen

gesättigen Lösung von Deuteromethylenchlorid versetzt und die Proben jeweils mit

Ultraschall behandelt. Die Probenlösungen wurden anschliessend zentrifugiert und mit

UV/vis- sowie 1 H-NMR-Spektroskopie analysiert. Aus diesen Spektren wurden die

82

Konzentrationen an Corrin und Anthracen 22 durch Auswertung der Absorptionsintensitäten

im UV/vis-Spektrum bzw. der Intensitätsintegrale im 1 H-NMR-Spektrum bestimmt und

sodann die mittlere Stöchiometrie postulierter Assoziate als Verhältnis der Konzentrationen

von Gastmolekül zu Corrin abgeleitet.

Während in den Experimenten (a) und (b) in der Deuteriumoxid-Phase der Dicyano-

heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-Probe weder 1H-NMR- noch UV/vis-spektroskopisch

9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen delektiert werden konnte, fand sich bei (b) in der

Probe des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N '-hepta-(n-

decyl-10'-carboxylat) UV/vis-spektroskopisch ein Gehalt an 9,10-Di-(4-brombutyl-

oxy)-anthracen in Höhe von 2,3% der Corrinkonzentration.

In Experiment (c) führte die Ultraschallbehandlung einer Lösung von Heptakalium-dicyano-

Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) in Deu¬

teriumoxid, welche mit einer an 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen gesättigen Lösung

von Deuteromethylenchlorid überschichtet worden war, zu einer D20-Phase, dessen 'H-

NMR-Spektrum in Abbildung 36 oben wiedergegeben ist. Die Auswertung der Integrale des

9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen, das in Deuteriumoxid praktisch unlöslich ist, und

des Corrins 17 zeigte ein Verhältnis der Konzentrationen an Anthracen und Corrin von

1,05:1,00. Möglicherweise liegen Assoziate vor. Dabei lassen sich aufgrund der

Stöchiometrie monomere Komplexe eines Wirtmoleküls 17 mit einem Gastmolekül 22

vermuten, doch sind auf der Basis der vorliegenden Daten weder eine Verteilung

verschiedener Assoziate unterschiedlicher Stöchiometrien mit dem zufälligen Mittelwert 1:1

noch multiple Einheiten von 1:1 Komplexen ausschliessbar. Im 1 H-NMR-Spektrum findet

sich durch die Signallage des C3 des Corrins, welches statt bei 4,06 ppm im Beschreibungs¬

spektrum nun bei 4,23 ppm beobachtet wurde, ein Hinweis auf Assoziation. Ansonsten war

das Spektrum der Probenlösung eine Superposition der Spektren der reinen Substanzen.

Die beobachteten Löslichkeiten waren bei Reduktion der Temperatur der Lösung nicht stabil.

Nach 12 Stunden bei 5 °C fiel der Gehalt der gemäss (c) hergestellten Probenlösung an 9,

10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22) unter die 1H-NMR-spektroskopische Nach¬

weisgrenze (vgl. 1 H-NMR-Spektrum in Abbildung 36 unten). Um die Löslichkeit als

Funktion der Zeit genauer zu untersuchen, wurde analog eine Lösung von 17 mit 9,10-Di-

(4-brombutyl-oxy)-anthracen gesättigt, bei konstanten 5 °C lichtgeschützt gelagert und

regelmässig UV/vis-spektroskopiert. Der beobachtete lineare Löslichkeitsrückgang von

Anthracen 22 als Funktion der Zeit ist in Abbildung 37 dargestellt.

Aufgrund der vorliegenden Daten lässt sich über die genaue Ursache für die beobachtete

Dekomplexierung nur spekulieren. Ein wesentlicher Faktor könnte eine Abnahme des Deu¬

teromethylenchlorid-Gehaltes der Probe sein, für dessen Konstanz keine Vorkehrungen ge¬

troffen wurden und dessen Anwesenheit anscheinend essentiell für die Komplexbildung war.

83

CONH(CH,)rfOOOK

^—z CH, *-CONH<CH,),fOOK

*0OC(CH,),flNOC -% /\>L-^JCH

cw/

KOOCfCHJiJWOC

CONHICH,)„fOOK

VYKOOC(CH,)JINOC CONHICHJ^OOK

(17) (22)

Ultraschall

D20 / CD2C12

'H-NMR

5°C

12 h

'H-NMR

-3 I-jJ

Abbildung 36: 1H-NMR des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",

N"",N""',N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)/9,10-Di-(4-brombutyoxy)-anthracenin Deuteriumoxid unter Anwesenheit von Deuteromethylenchlorid, unten: Spektrum nach

12 Stunden bei 5 °C, oben: zentrifugierte Lösung direkt nach Ultraschallbehandlung

84

100-1

90-

80.

70^

60-

50-

40.

30-

20-

10^0

_

50 100 150

Zeit / Stunden

200

—I—

250

—I

300

Abbildung 37: Verhältnis der Konzentrationen von 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-

anthracen (22) zu 17 (Besetzungsgrad) in Prozent des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-

cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) vs. Zeit¬

dauer der lichtgeschützten Lagerung bei 5 °C, Lösung in Deuteriumoxid, t= 0 bei Sättigung

mit Ultraschall, Konzentrationsbestimmung von 17 aus Absorption der Probenlösung bei

579 nm, Konzentrationsbestimmung des Anthracen 22 aus der Absorption bei 265 nm des

Differenzspektrums der Probenlösung mit einem UV/vis-Spektrum von 17 gleicher

Konzentration (vgl. 6.7.3.1).

85

3.2 Die Assoziation mit 5'-0-Tosyladenosin (15)

Die Assoziationseigenschaften von 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22) mit


carboxylat) (17) Hessen auch für die Alkylierungsmittel 15 & 16 Assoziation erwarten.

Bereits bei der Synthese des Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (18) legte die schwierige

Entfernung überschüssigen 5'-0-Tosyladenosins (15) aus dem Rohprodukt nahe, dass eine

Assoziationstendenz zwischen 5'-0-Tosyladenosin (15) und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-

cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) besteht.

5'-0-Tosyladenosin (15) ist nicht mehr wie das 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen

(22) praktisch unlöslich in Deuteriumoxid. Das Assoziationsverhältnis ist daher nicht

mehr identisch mit dem Quotienten der Konzentrationen von Tosylat 15 zu Corrin. Da das

5'-0-Tosyladenosin sich, wenn auch wenig, in Deuteriumoxid löst, muss bevor das

Assoziationsverhältnis berechnet wird, die Eigenlöslichkeit des 5'-0-Tosyladenosin in

Deuteriumoxid von der experimentell bestimmten Konzentration an 5'-0-Tosyladenosin

subtrahiert werden.

Zur Bestimmung der Löslichkeit des 5'-0-Tosyladenosin in Deuteriumoxid wurde in einer

Messreihe Deuteriumoxid mit dem Tosylat 15 gesättigt und das UV/vis-Spektrum gemessen.

Unter Verwendung des der Literatur [100] entnommenen Extinktionskoeffizienten bei 263

nm wurde die Löslichkeit zu 4,5-10"4 M berechnet.

Zur Bestimmung der Assoziationseigenschaften der Corrine mit 5'-0-Tosyladenosin (15)

wurden zwischen 0,2 mM und 4,9 mM konzentrierte Lösungen der Dicyanocorrine 24 und

17 in Deuteriumoxid mit festem Alkylierungsmittel versetzt, zehn Minuten Ultraschall der

Frequenz 50 kHz ausgesetzt und die UV/vis- sowie 1H-NMR-Spektren gemessen. Die 1H-

NMR-Spektren erlaubten die Korrektur der via die UV/vis-Spektren berechneten

Konzentrationswerte des Tosylats 15 um den Anteil hydrolysierter Substanz, der wie

Literaturdaten zur Hydrolyseverhalten einiger Alkyltosylate bereits erwarten Hessen

[137-140] mit einem Anteil bis ca. 10% innerhalb einer Experimentserie nicht

vernachlässigbar war.

Mit den Extinktionskoeffizienten wurden aus den UV/vis-Spektren die absoluten

Konzentrationen der Corrine 24 und 17 und der Alkylierungsmittel berechnet, von der

Konzentration der Alkylierungsmittel die vorgehend bestimmte Löslichkeit in Deuteriumoxid

86

sowie der Anteil hydrolysierter Substanz subtrahiert und der Quotient der Konzentrationen

gebildet.

Im folgenden wird der um die Hydolyse und die Löslichkeit des Gastmoleküles im verwendeten

Lösungsmittel korrigierte Quotient der Konzentrationen von Alkylierungsmittel zu Corrin

als Assoziationsgrad (Besetzungsgrad) bezeichnet und in Prozent bezogen auf die

Corrinkonzentration angegeben.

Abbildung 38 zeigt den Assoziationsgrad von 5'-0-Tosyladenosin (15) mit Heptakalium-

dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)

(17) ausgedrückt als Besetzungsgrad in Funktion der Corrinkonzentration. Der

Besetzungsgrad variiert stark mit der Corrinkonzentration: Je geringer die Konzentration

des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-

10'-carboxylat), desto höher die relative Löslichkeit des Alkylierungsmittels. Bei relativ

hohen Konzentrationen an Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,

N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat), im Bereich von 1-5 mM, liegt der Besetzungsgrad

bei maximal 25%, steigt für den Konzentrationsbereich 0,5-1,0 mM sprunghaft auf ca.

100 % während unterhalb 0,5 mM ein Wert von ca. 200 % bestimmt wurde, der sich durch

eine relativ starke Schwankungsbreite auszeichnet. Die starken Variationen im unteren

Konzentrationsbereich reflektieren nicht zwangsläufig Undefinierte Assoziationsverhältnisse

sondern sind eher als Folge der aus der Bestimmung der Konzentrationen herrührenden

Fehlerfortpflanzung auf das numerische Ergebnis des Besetzungsgrades aufzufassen.

Die ganzzahligen Verhältnisse der Konzentrationen von 17 & 15 in praktisch dem gesamten

untersuchten Konzentrationsbereich widerspiegeln eine mittlere Assoziationsstöchiometrie

(Wirt:Gast) von 1:1 bzw. 1:2. Diese Beobachtung lässt sich am einfachsten durch 1:1- bzw.

1:2-Assoziation auf molekularer Stufe interpretieren.

Für das 5'-0-Tosyladenosin (15) sollte im Anbetracht der geringen Unterschiede zwischen

der a- und ß-Seite des Corrinringes und dem Fehlen spezifischer Wechselwirkungen das


carboxylat)-Molekül (17) spiegelsymmetrisch bezüglich der Ebene des Corrinringes sein

und wenn, dann auf der <x- und ß-Seite mit der gleichen Anzahl Gastmoleküle assoziieren. Im

Konzentrationsbereich unterhalb 0,5 mM scheint genau dies auch der Fall zu sein.

Die Assoziationsstöchiometrie von 1:1 im Konzentrationsbereich 0,5 bis 1 mM ist daher

erstaunlich. Ein Nachweis der Aggregatbildung für 17 steht zwar noch aus, doch würde eine

Dimerbildung, wie sie bereits für Cobalamine in wässriger Lösung nachgewiesen wurde

[141], das Abfallen des Besetzungsgrades auf 100 % erklären.

87

COMHCHJijCOOK

^—-. CH, r-CONHICHjl^OOOK

<OOC(CH,IJINOC -» /\X^->(<CHC"? \--\N_/ CONHICHJkCOOK

c«A X >K0OC(CH1lKflN0C-\/—irciht=\ CH,

(17) -s ch,;i r Ultraschall

K00CICH1),^m0C CONHICHJitPOOK

D20 'H-NMR-Spektroskopie

+

UV/vis-SpektroskopieHH,

(15)

<H^) \-u-\

k3'CH,

250

225

200

175

'S

o>150,

g> 1253

| 100

ö 75

50

25

0

+ UV/2 Experiment NMR/1 Expenment

0 UV/3 Experiment D NMR/2 Experiment

O UV/4 Experiment A NMR/3 Expenment

UV/5 Expenment • NMR/5 Expenment

K UV/6 Experiment NMR/6 Experiment

L-j• \\

t^W—-— |r-—i

1 1 1 1—1——i—i—i——i——1—i—l——1 r—r

355 1 15 2 25 3

[Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-1 ff-carboxylat)] / mM

45

Abbildung 38 Besetzungsgrad von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) ("Wirt") mit 5'-0-

Tosyladenosm (15) ("Gast") in Deuteriumoxid, bestimmt mit ' H-NMR- und UV/vis-

Spektroskopie, Besetzungsgrad Menge der Gastmoleküle, welche durch die Anwesenheit eines

Wirtmolekules zusätzlich in Lösung gehen, in Prozent der Wirtmolekule

88

Der Rückgang des Besetzungsgrades in noch höher konzentrierten Lösungen, 1 bis 5 mM,

wäre durch Selbstaggregation von 17, die die Assoziation mit 5'-0-Tosyladenosin (15) in

den Hintergrund treten lässt, erklärbar. Die Assoziation mit 5'-0-Tosyladenosin sollte dann

in Analogie zur Beobachtung in Micellen, bei denen sich hydrophobe Gastmoleküle bevorzugt

am äusseren Rand des hydrophoben Kerns befinden [73], vorwiegend an der Oberfläche und

nur zu geringem Teil auch innerhalb der Aggregate erfolgen.

Im experimentellen Teil sind die totalen Konzentrationen, aus denen die Daten aus Abbildung

38 berechnet wurden, bei den einzelnen Experimenten angegeben. Die nichtlineare

Entwicklung des Besetzungsgrades mit der Corrinkonzentration führt zu lokalen Maxima

einer Abbildung der totalen Konzentration an Tosylat 15 als Funktion der Konzentration des


carboxylat) (17).

89

3.3 Die Assoziation mit l^-Ethenoadenosyl-S'-O-tosylat (16)

1 ,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) erlaubt aufgrund seiner Lumineszenz¬

eigenschaften aus dem Totallumineszenzspektrum Rückschlüsse über seine nähere Umgebung

[73, 74]. Der Wechsel von einer hydrophilen zu einer hydrophoben Mikroumgebung ist in

der Regel von einer dramatischen Erhöhung der Quantenausbeute und einer Blauverschiebung

im Maximum der Fluoreszenz begleitet [73]. Der Fluoreszenzzerfall reagiert zudem in

ionischen Micellen in der Regel empfindlich auf die Anwesenheit von Sauerstoff oder eines

Gegenions, z.B. einem Schwermetallion wie Kobalt, mit verminderter Fluoreszenzintensität

(Quenching).

Für die Assoziationsexperimente mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) musste daher

der Einfluss von Sauerstoff auf die Lumineszenzintensität quantifiziert werden. Dazu wurden

zwei mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat gesättigte Deuteriumoxid-Lösungen hergestellt.

Eine sauerstoffreie Lösung wurde in der Glove-box bei [02]< 15 ppm bereitet und aus ihr

noch eine Probe mit Deuteriumoxid auf ca. Vs gasfrei verdünnt. Eine sauerstoffgesättigte

Lösung wurde analog hergestellt, indem man in der normalen Atmosphäre Deuteriumoxid mit

1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat sättigte und die Lösung anschliessend mit Sauerstoff

begaste. Von diesen Lösungen wurde das UV/vis-und das Totallumineszenzspektrum

(Emissions-Exitations-Matrix) aufgenommen (Tabelle 1).

Sauerstoffgesättigte und sauerstofffreie Lösungen von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat

(16) in Deuteriumoxid zeigten keine Unterschiede in ihren Lumineszenzintensitäten. Eine

eventuelle Beeinflussung der Fluoreszenzintensitäten durch unterschiedliche

Sauerstoffkonzentrationen beim Wechsel von wässriger zu einer micellaren Umgebung, die

als relativ sauerstofffrei gilt [73], konnte somit ausgeschlossen werden. Es bot sich daher

an, die Experimente zum Assoziationsverhalten von 16 mit den Dicyanocorrinen in

Laboratmosphäre durchzuführen.

Tabelle 1: Maxima der Emissions-Exitations-Matrix von 1,N6-

Ethenoadenosyl-5'-Q-tosylat (16) in Deuteriumoxid

Oz-Atmosphäre Stickstoff

3bS 265 nm 1,024 0,851 0,134

E*max= 320 ± 1 318 ± 3 315 ± 1

En>max= 429 ± 3 431 ± 4 436 ± 2

Messbereich Exitation: 300-340 nm, Emission: 400-450 nm; abs2e5 nm: UV-Absorption

90

Abbildung 39: Isometrische Projektion der Exitations-Emissions-Matrix von 1,N6-

Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) in D20, 296 K, unter Normalatmosphäre mit

Ultraschall gesättigt: vorn: Emission, 305-560 nm: seitlich: Exitation, 250-380 nm:

vertikal: Lumineszenzintensität

2.5x10

3.0x10

ü 3.5x10

A 0x10

3.0x10 2.5x10

emission /cm-1

2.0x10

Abbildung 40: Kontur-Repräsentation der Exitations-Emissions-Matrix von 1,N6-

Ethenoadenosyl-S'-O-tosylat (16) in D20, 296 K, unter Normalatmosphäre mit

Ultraschall gesättigt; waagerecht: Emission in cm1; senkrecht: Exitation in cm~1

91

In Tabelle 1 sind die Emissions- und Exitationsmaxima sauerstoffgesättigter und

sauerstofffreier Lösungen von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) in Deuteriumoxid

zusammengestellt. Das Exitationsmaximum und das Emissionsmaximum scheinen eine

geringe Konzentrationsabhängigkeit aufzuweisen mit einem Shirt des Exitationsmaximum zu

kürzeren und dem des Emissionsmaximum zu höheren Wellenlängen mit fallender

Konzentration. Die isometrische Projektion der Exitations-Emissions-Matrix von 1,N6-

Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat in Deuteriumoxid ist in Abbildung 39, eine

Konturpräsentation desselben Spektrums in Abbildung 40, und nochmals vergrössert in

Abbildung 41 wiedergegeben. Abbildung 42 ist eine das Emissionsspektrum

repräsentierender Schnitt durch das zweidimensionale Spektrum. Die Spektren gesättigter

Lösungen wiesen neben dem absoluten Maximum bei 429 nm eine Schulter bei 406 nm auf,

die den Literaturwerten für 1 ,N6-Ethenoadenosin, Maximum bei 428 nm mit Schulter bei

406 nm in wässrigem Phosphatpuffer pH 7, entsprechen [142].

Die Selbstassoziationstendenz von 1 ,Ne-Ethenoadenosin und 1 ,N6-Ethenoadenosylphosphaten

in wässriger Lösung ist seit langem bekannt [131-134]. Da diese Selbstassoziation mit

einer Änderung der direkten Umgebung des 1 ,N6-Ethenoadenosylmoleküles verbunden ist,

könnten Konzentrationseffekte die Fluoreszenzintensitäten von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-

tosylat (16) in Deuteriumoxid beeinflussen.

Aus 1,4 ml Deuteriumoxid und 10 mg 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat wurde eine

gesättigte Stammlösung hergestellt und das UV/vis-Spektrum zur Konzentrationsbestim¬

mung sowie das Totallumineszenzspektrum (Emissions-Exitations-Matrix) gemessen.

Wegen der extrem langen Messzeiten für zweidimensionale Totallumineszenzspektren und

ihrem für die zu untersuchende Fragestellung praktisch identischen Informationsgehalts

wurden für die Assoziationsexperimente nur eindimensionale Totallumineszenzspektren

(Emission) aufgenommen. Von der Stammlösung wurden Verdünnungen von 1/2,1/5, V10

und Vso der Ausgangskonzentration bereitet und analog der Stammlösung Spektroskopien.

Abbildung 43 zeigt die Lumineszenzintensität von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)

in Deuteriumoxid als Funktion der Konzentration im gesamten Löslichkeitsbereich. Eine

Erhöhung der Quantenausbeute mit zunehmendem Sättigungsgrad wurde nicht beobachtet. Im

Gegenteil, oberhalb ln(l/lo)— 0,6 nahm die Lumineszenzintensität unterproportional mit

der Konzentration zu. Es lässt sich daher in Analogie zum 1,N6-Ethenoadenosin, dessen

Assoziationsverhalten Gegenstand einer Reihe von Untersuchungen bildet [129, 132-135,

142, 143], eine ausgesprochene Tendenz zur Bildung nichtkooperativer Assoziate höherer

Ordnung vermuten.

92

Abbildung 41 Kontur-Repräsentation des Maximalbereiches der Exitations-

Emissions-Matnx von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) in D20, 296 K, unter

Normalatmosphäre mit Ultraschall gesättigt, waagerecht Emission in cm1, senkrecht

Exitation in cnr1

2,80x10* 2.60X104 2.30x1a4 2,00x10*cm-1

Abbildung 42 Emissionsspektrum 1,Ne-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16),

gesättigte Lösung in Deuteriumoxid, Exitation 320 nm, Emission 350-500 nm

93

30000

o

| 20000

E

| 10000

K>,

D Totallumineszenzcounts

der gesättigten Lösung

O Totallumineszenzcounts

.4 .6 .8

ln(l/lo) bei 265 nm

1.2 1.4

0.50 1.00 1.50

mM

Abbildung 43: Konzentrationsabhängigkeit der Totallumineszenz von

1 ,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) in Deuteriumoxid bei

Umgebungstemperatur, [16] vs. Totallumineszenz, Regressionsgerade aus 4

Messpunkten abs 2S5 nm< 0,6, R2= 1,000, Exitation 320 nm, Emission

340-520 nm

Die Löslichkeit von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) bestimmte sich UV/vis-

spektroskopisch zu 1,29-10"* M (23,0 °C). Dazu wurde Deuteriumoxid in einem auf 23,0

°C ± 0,1 °C thermostatisierten Ultraschallbad mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat

gesättigt, suspendiertes Material abzentrifugiert, die Probe mit UV/vis- und

Totallumineszenzspektroskopie untersucht und die Konzentration mithilfe der

Absorptionskoeffizienten aus dem UV/vis-Spektrum bestimmt.

Damit die Experimente zum Assoziationsverhalten des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat

mit den Corrinen ohne ständige 1H-NMR-spektroskopische Kontrolle der Proben auf

Hydrolyse durchgeführt werden konnten, musste das Hydrolyseverhalten des Tosylates 16

genau bekannt sein.

Eine gesättigte Lösung von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) in Deuteriumoxid

wurde dazu über festem 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat in Deuteriumoxid lichtgeschützt

bei 23 °C während sieben Tagen gelagert und wiederholt UV/vis- und 1H-NMR-

spektroskopiert. Basierend auf der Identität der erhaltenen Spektren mit dem Spektrum des

Beschreibungsansatzes von 16 erübrigten sich Korrekturen für die Hydrolyse wie sie für

das 5'-0-Tosyladenosin (15) notwendig waren.

94

2.75x10 4 2.00x10 4

emission /cm-1

Abbildung 44 Totaiiumineszenzspektrum Hexanatnum-Coa-aquo-Coß-5'-(1",Ne-etheno)adenosyl-cobyrmat (21), Lösung in D20, Emissionsspektrum 350-500 nm, Ex=

320 nm, dx= 0,100 cm

1000"COOK COOK

exitation/cm-1

*:

Abbildung 45 Totaiiumineszenzspektrum Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat(24), Lösung in D20, Exitationsspektrum 250-440 nm, Em= 380 nm, dx= 0,100 cm

95

750

500

250

2,75x10emission/cm-1

2,00x10

Abbildung 46 Totaiiumineszenzspektrum Hexanatnum-Coa-aquo-Coß-5'-(1",Ns-

etheno)adenosyl'Cobamido-N,N',N",N"',N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)

(19), Lösung in D20, Emissionsspektrum 350-500 nm, Ex= 320 nm, dx= 0,100 cm

2000

2 10OO "

CÖNHiCH^nCOOK

—-. CH, r-CONHKHjluCOOK

<cooc(CH,),smoc -y y^^J^^\icH

K00C{CH,)„pH0C

CONHICH,)ifiOOH

VYKOOCICHJnHNOC COtimCH,)j:OOK

•xltation /cm-12,5x10

Abbildung 47 Totaiiumineszenzspektrum Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17), Lösung in D20,

Exitationsspektrum 250-400 nm, Em= 380 nm, dx= 0,100 cm

96

Nachfolgend wurde das Lumineszenzverhalten der Dicyanocorrine 24 und 17 und der 1,Ne-

Ethenoadenosylcorrine 21 & 19 geprüft.

Die in Blindproben mit Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat

(21) und Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) gemessene Lumineszenzintensität

(Abbildungen 44 und 45) belief sich auf eine Grössenordnung von einem Promille einer

1,N6-Ethenoadenosyltosylat-Lösung gleicher Konzentration. Bei Hexanatrium-Coa-aquo-

Coß-5'-(1",N6-etheno)-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-

10'-carboxylat) (19) und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,

N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (17) (Abbildungen 46 und 47) wurde unter

denselben Versuchsbedingungen hingegen nur das Hintergrundrauschen beobachtet.

Zur Bestimmung des Assoziationsverhaltens von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)

in Deuteriumoxid mit den Dicyanocorrinen 24 und 17 wurden zwei Arten von Experimenten

durchgeführt. Einerseits versetzte man gesättigte Lösungen von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-

tosylat in Deuteriumoxid mit variablen Mengen fester Dicyanocorrine, andererseits wurden

unterschiedlich konzentrierte Lösungen der Dicyanocorrine in Deuteriumoxid mit 1,N6-

Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gesättigt.

Lösung von Dicyanocorrinen in mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)

gesättigtem Deuteriumoxid

In einer ersten Versuchsreihe wurden Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) bzw.


carboxylat) (17) in mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gesättigtem

Deuteriumoxid gelöst und die cirka 2,5-103 molare Probe mit UV/vis- und

Totallumineszenzspektroskopie untersucht. Von einigen der Proben wurden noch das 1H-

NMR-Spektrum aufgenommen. Die Proben wurden anschliessend mit 1,N6-Ethenoadenosyl-

5'-0-tosylat gesättigtem Deuteriumoxid derselben Stammlösung auf ungefähr die Hälfte

verdünnt und die Messungen wiederholt bis die Konzentration des Corrin cirka ein

Hundertstel der Ausgangskonzentration betrug.

Abbildung 48 zeigt die UV/vis-Spektren der Konzentrationsreihe des Dicyano-heptakalium-

Co(lll)-cobyrinat (24), die jeweils Superpositionen der Spektren von Dicyano-

heptakalium-Co(lll)-cobyrinat und 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) sind.

97

Abbildung 48: UV/vis-Spektren der Konzentrationsreihe Dicyano-heptakalium-

Co(lll)-cobyrinat (24) verdünnt mit einer gesättigten Lösung von I.Nß-Ethenoadenosyl-

5'-0-tosylat (16) in Deuteriumoxid, Schichtdicke 0,100 cm

Tabelle 2: 1H-NM R-Signalverschiebungen von Dicyano-heptakalium-

Co(lll)-cobamido-N,N,,N",N,,,,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-

10'-car-boxylat) (17) in mit 1,N6-Et henoadenosy l-5'-0-

tosylat (16) gesättigtem Deuteriumoxid

Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxvlat) (17)

1 ,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)

[17]/M reine

Substanz

mit 1 6

gesättigte

Lösung

reine

Substanz

in Lösung mit

1 7

1.23-10-3 4,06 4,07 1,85

6,74

7,39

1,96

6,82

7,42

98

In Analogie zu den nachfolgend beschriebenen Experimenten, in denen Dicyanocornnlösungen

mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat gesättigt wurden, waren in den 1H-NMR-Spektrenim Fall des Dicyano-heptakalium-Co(lll) cobyrinat (24) im Konzentrationsbereich 0,27-

0,66 mM die Signale die Summe der Spektren der isolierten Substanzen, während eine 1,23

mM Lösung von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -

hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) in mit 16 gesättigtem Deuteriumoxid eine

minimale Verschiebung des C-3 Signales von 4,07 nach 4,06 ppm und eine Verschiebung

dreier Signale des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat zeigte (Methylgruppe des Tosylats in

16- 1,96 statt 1,85, Phenylnng in 16 6,82 statt 6,74 und bei 7,42 statt 7,39) (Tabelle

2).

Die Änderung chemischer Verschiebungen von Verbindungen des 1 ,N6-Ethenoadenosins durch

micellare Einlagerungen oder auch durch Lösungsmitteleffekte, ist in der Literatur seit

langem bekannt [144, 145] und wurde als Indiz für Assoziation mit anderen Molekülen

aufgefasst

Die 1 ,N6-Ethenoadenosyl-5'-0 tosylat-Molekule nähern sich aber wie die Lumineszenz¬

intensitäten belegen anscheinend nicht genügend dem Metallzentrum, damit ihre

Lumineszenzintensität gelöscht wird

Abbildung 49 zeigt die Lumineszenzintensitäten in Abhängigkeit der Corrinkonzentration

Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobynnat (24) und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-

cobamido-N,N',N",N"',N"",N""',N -hepta-(n decyl 10'-carboxylat) (17) liegen auf

exakt derselben Kurve

Die Konzentrationen der Probenlösungen bezüglich 1,N6-Ethenoadenosyl 5'-0-tosylat

(16) waren identisch, da für beide Experimentreihen dieselbe mit 1,N6-Ethenoadenosyl-

5'-0-tosylat (16) gesättigte Stammlösung verwendet wurde

Die UV/vis- und Totallumineszenzspektren zeigten für die beiden Corrine identisches

Verhalten. Allem die Signalverschiebungen in den 1H-NMR-Spektren der Probe mit

Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'

carboxylat) (17) lassen sich nur mit einer Wechselwirkung zwischen dem Tosylat 16 und

dem Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl

10'-carboxylat) (17) erklären

Damit die Assoziation kompatibel mit dem Totallumineszenzdaten bleibt, muss die Assoziation

in den äusseren Regionen des Cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n decyl-10'-

carboxylat)es 17 stattgefunden haben Gemäss Förster's Theorem [74] finden nämlich die

Übertragung der elektronischen Exitationsenergie zwischen einem fluoreszierenden Donor

und einem Energieakzeptor über Distanzen von bis zu 70 A statt wobei die Geschwindigkeit

des Transfers proportional zur sechsten inversen Potenz des Abstandes ist.

99

CONHICH,l,^COOK

--. CH, l-CONHKHJgPOOK

KOOC(CH,)„)tN<X:-\ y^J^^SCH,

* CO v-l-o-(16)

in D20


I Totallumineszenzcounts

Dicyano-heptakalium-Co-

(lll)-cobyrinat


Heptakalium-dicyano-Co-(lll)-cobamldo-N',N",N•".N"",N ,N"'"\ N -

hepta-(n-decyl-10'-carb-oxylat) O

2,5[CorrinJVmM

Abbildung 49: Totallumineszenzintensität einer gesättigten Lösung von I.Nß-Etheno-

adenosyl-5'-0-tosylat (16) in D20 bei Variation der Konzentrationen an Dicyano-

heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) bzw. Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-

N,N',N",N"',N"",N""',N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17), Xelc 320 nm, Xam

440 nm, T= 300 K, Umgebungsatmosphäre

100

Sättigung von Dicyanocorrinlösungen mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat

(16)

Da sich gezeigt hatte14, dass durch Ultraschallbehandlung für Lösungen von Dicyano-

heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) unterschiedliche

Konzentrationen an 5'-0-Tosyladenosin (15) erhalten werden können, wurden in einem

zweiten Experiment Konzentrationsreihen der Dicyanocorrine 24 und 17 in Deuteriumoxid

mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) durch 15-minütige Ultraschallbehandlung

gesättigt. Vorbereitende Experimenten hatten zuvor bestätigt, dass nach 15 Minuten

Ultraschallbehandlung der Gleichgewichtzustand erreicht war.

a) In einer Serie von UV/vis-Experimenten15 wurden wässrige Lösungen von Dicyano-


N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) ohne Thermo-

statisierung des Ultraschallbades in Anwesenheit eines Überschusses an 1,N6-

Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) mit 16 gesättigt, die Lösungen zentrifugiert und ihr

UV/vis-Spektrum aufgenommen. Die Konzentrationen der Corrine und des Tosylates 16

wurden aus den UV/vis-Spektren berechnet.

Aus den UV/vis-spektroskopisch bestimmten Konzentrationen des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-

O-tosylat wurde die Eigenlöslichkeit des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat subtrahiert und

die Differenz in Prozent der Corrinkonzentration ausgedrückt (Besetzungsgrad). Die

Ergebnisse sind in Abbildung 50 dargestellt. Da nur wenige Punkte gemessen wurden handelt

es sich nur um ein grobes Raster.

Die ermittelten Besetzungsgrade belaufen sich für das Dicyano-heptakalium-Co(lll)-

cobyrinat (24) auf 0-10% während sie für Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) mindestens 40 % ([17] =

2,1 mM) bzw. 150 % ([17]= 1,1 mM) betragen.

Die beobachteten Besetzungsgrade im Konzentrationsbereich des Heptakalium-dicyano-

Co(lll)-cobamido-N,N',N",N,",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) von 1,1

14 vgl. 3.2

15 vgl. 6.8.2

101

(17)

(24)

m

^^?

_I o

WOH OH

Uberschuss

D20

(16)


160,

140.

120.

\|100.

g 80.

§ 60.

40.

20.

0

1

D Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-

cartxjxylat)

1.2 1.4 1.6 1.8

[Corrin]/mmol

0 Dicyano-heptakalium-

Co(lll)-cobyrinat

2.2 2.4 2.6

Abbildung 50: Mit UVMs-Spektroskopie bestimmter Besetzungsgrad von Dicyano-


N,N;N",N,",N"",N"";n -hepta-(n-decyl-W'-carboxylat) (17) mit I.hfi-Etheno-

adenosyltosylat (16) in Deuteriumoxid unter Sättigung der Lösung mit Ultraschall in

Anwesenheit eines Überschusses an Tosylat 16

102

mM bis 1,8 mM lassen auf Komplexe der mittleren Stöchiometrie von ca. 1:1 schliessen. Der

Konzentrationsbereich für diese Art vom Komplexen liegt hier bei höheren Konzentrationen

als bei den Assoziaten mit 5'-0-Tosyladenosin (15). Dort wurde eine 1:1-Stöchiometrie

zwischen 0,5 bis 1,1 mM beobachtet. Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24)

assoziert wiederum nicht mit dem angebotenen Gastmolekül.

Die Assoziationsstöchiometrie wurde beim 5'-0-Tosyladenosin als eine Folge der

konzentrationsabhängigen Selbstassoziation des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) erklärt und sollte daher

eigentlich gastunabhängige Funktion der Corrinkonzentration sein. Da die Sättigung in den

orientierenden Experimenten allerdings ohne Temperaturkontrolle durchgeführt wurde, ist

die hier beobachtete Abweichung zum Verhalten mit 5'-0-Tosyladenosin nicht weiter

erstaunlich.

b) Es wurden sodann Konzentrationsreihen der Dicyanocorrine 24 und 17 in

Deuteriumoxid mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) durch 15-minütige

Ultraschallbehandlung bei 23,0 + 0,1 °C gesättigt, zentrifugiert und von den klaren

Lösungen die UV/vis-, 1 H-NMR- und Totallumineszenzspektren gemessen.

Die Konzentrationen an Corrin und 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat bestimmte man aus

den UV/vis-Spektren.

Die Auswertung der UV/vis-Spektren (Abbildung 51) lässt wiederum die deutliche

Steigerung des Gehaltes an 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat einer Lösung von


carboxylat) (17) verglichen mit einer Lösung von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-

cobyrinat (24) identischer Corrinkonzentration erkennen.

Die Totallumineszenzspektren von mit 16 gesättigten Lösungen von Dicyano-heptakalium-

Co(lll)-cobyrinat (24) zeigten Maxima bei 323,3 nm und 435,9 mit einer Schulter bei

409 nm während in der analogen Lösung mit Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (26) neben den Maxima bei

322,5 nm und 434,0 nm sowie einer Schulter bei 410 nm, in denen sich die beiden Proben

nicht signifikant voneinander unterschieden, eine weitere Schulter bei 308,9 nm auftrat

(Tabelle 3). Diese Schulter entspricht genau der von Singer [73] beschriebenen

Blauverschiebung im Maximum der Fluoreszenz beim Wechsel von einer hydrophilen zu

einer hydrophoben Mikroumgebung.

103

Formelschema siehe Abbildung 50

16,

14.

t 1 2-1

.2 E

a>

£in

Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N ,N",N'",N""

,N ,N -hepta-(n-decyl

-10,-carboxylat)

Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat

1 12 14 16 18

abs 580 bzw 576 nm

22 24 26

Abbildung 51 1 ,Ne-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat [16] als Funktion der

Corrinkonzentration, l.hfi-Ethenoadenosyl-S'-O-tosylat-gesättigte (16) Lösungen von

Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobynnat (24) und Heptakahum-dicyano-Co(lll)-

cobamido-N,N',N",N"',N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) in D20,

£580 nm(17)= 9'480, e576 nm(24)= 9'790, dx= 0,100 cm, [16] berechnet aus der

Absorption bei 265 nm (zuvor wurde von der experimentell ermittelten Absorption bei 265

nm der durch das Cornn bedingte Absorptionswert, welcher aufgrund der bei 580 bzw 576

nm nur von Cornn herrührenden Absorption berechnet wurde, subtrahiert)

Abbildung 52 illustriert den Verlauf der experimentell bestimmten Totallumineszenz¬

intensitäten im untersuchten Konzentrationsbereich (0-2,6 mM) Bemerkenswerterweise

waren die Totallumineszenzintensitäten von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat in Lösungen

von Dicyano-heptakahum-Co(lll)-cobyrinat (24) und Heptakahum-dicyano-Co(lll)-

cobamldo-N,N',N",N"',N"•', N ,N"""-hepta (n decyl-10'-carboxylat) (17) identischer

Konzentration identischI

104

(17)

(24)

n

ITIh (16)

Uberschuss

D,0


300000„

S 200000 .

2

P100000


Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"'N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)

Totallumineszenzcounts

Dicyano heptakalium-Co(lll)-cobynnat

1 12 14 16

abs 580 bzw 576 nm

1 8 22 24 26

Abbildung 52. Totallumineszenzintensitäten von mit 1.NS-EthenoadenosylS'-O-

tosylat (16) gesättigten Lösungen von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrmat (24) und

Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N'"",N' -hepta-(n-decyl-10'

-carboxylat) (17) in D20 als Funktion der Corrinkonzentration, Xex 320 nm, Xem 435 nm,

Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N"""-hepta-(n-decyl-l 0'

carboxylat) esso nm= 9'480; Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrmat eS76 nm= 9'790,

dx= 0,100 cm

Unterschiedliche absolute Lunineszemintensitäten im Vergleich zu anderen Expenmenten, vgl z B

Abb 49, sind durch verschieden lange Messzeiten, über die die Daten aufkumuliert wurden, bedingt

105

Tabelle 3 Lumineszenzeigenschaften von mit l,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-

tosylat (16) gesättigter Corrinlösung in D20, Konzentrations¬

bestimmung mit UV/vis-, 1 H-NMR- & Lumineszenzspektroskopie

Dicyano-heptakalium-

Co(lll)-cobyrinat

CH

Heptakalium-dicyano-Co

(lll)-cobamido-N,N',N'•,N•",

N"",N ,N -hepta-(n-

decyl-10'-carboxylat)

(17)

i

CK

(24)

Exmax= 323,3 ± 0,6

( 308,9 ± 3,0 sh )

322,5 ± 0,2

Emmax= 435,9 ± 2,7

( 409 ± 2 sh )

434,0 ± 0,8

( 410 ± 2 )

[Corrin]* 9.29-10"4 1.55-10-3

[16]+ 1.39-10"3 2.33-10"3

[16]" 1.40-10"3 1.82-10"3

Assoziationsverhältnis 0,1 0,6

*: aus UV/vis-Spektrum unter Verwendung von e(24 $7Snm)= 9790, e(17)S80nm)= 9'450; +: aus

1 H-NMR-Spektrum durch Auswertung der Integrale und Kalibierung mit UV/vis-spektroskopischbestimmter Corrinkonzentration; ": aus UV/vis-Spektrum, t(16)2e5nm^ 8'100; alle Konzentra¬

tionen in M; Assoziationsverhältnis auf Basis der UV/vis-Spektren

Im 1 H-NMR-Spektrum der Proben mit Hexakalium-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',

N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) Hessen sich zahlreiche

Veränderungen gegenüber den Spektren der reinen Substanzen beobachten (Tabelle 4). Die

Signalshifts waren beim 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) am ausgeprägtesten und

variierten mit der Konzentration der Hexakalium-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,

N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)-Lösung. Das Hexakalium-Co(lll)-cobamido-N,N',

N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) selbst zeigte nur veränderte

chemische Verschiebungen der Signale des C-3 und des C-19, die bei 4,03 ppm und 3,67

ppm anstatt bei 4,07 ppm und 3,66 ppm auftraten.

106

Tabelle 4: Signalshifts im 1 H-NMR-Spektrum in mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5-O-tosylat (16) gesättigten Lösungen von Hexakalium-di-

cyano-Co(MI)-cobamido-N1N'IN"1N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17)

Heptakalium-dicyano-Co(lii) 1 ,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-cobamido-N,N',N",N'",N"", tosylatN ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) (16)

[17]/M reine mit 1 6 reine in Lösung mit

Substanz gesättigte

Lösung

Substanz 1 7

0,43 10 a 4,07 4,06 6,75 6,78

1,34 10 3 4,07 4,03 8,928,217,987,607,416,774,854,63

4,454,281,85

8,938,238,00

7,617,426,804,804,604,444,27

1,93

1,55 10 3 4,07 4,03 7,416,774,854,634,454,281,85

7,446,824,834,624,424,261,82

2,13 10 3 4,07 4,03 8,92 8,953,66 3,67 8,21

7,416,776,004,854,634,451,85

8,247,436,84

6,024,88

4,584,431,96

2,56 10"3 4,07 4,03 8,928,217,987,60

6,776,001,85

8,888,17

7,927,566,825,971,82

Messungen in Deuteriumoxid, 300,13 MHz, Angaben in ppm, Referenzwerte für die reine

Substanz beziehen sich für Heptakalium-dicyano Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,

N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) auf Lösungen ähnlicher Konzentration, für

1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) auf eine gesättigte Lösung in Deuteriumoxid

107

Für das Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) waren im gesamten untersuchten

Konzentrationsbereich, d.h. von 0,43 bis 2,56 mM, die 1H-NMR-Spektren Superpositionen

der1 H-NMR-Spektren der reinen Substanzen.

Gemäss UV/vis- und 1 H-NMR-Spektrum war in einer Lösung von Heptakalium-dicyano-

Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17)

verglichen mit einer gleichkonzentrierten Lösung von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-

cobyrinat zusätzliches 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gelöst. Diese zusätzlich

gelöste Tosylatmenge ist nicht anders als über Assoziate mit dem Heptakalium-dicyano-

Co(lll)-cobamido-N,N,,N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) erklärbar.

Im 1 H-NMR-Spektrum wiesen die deutlichen Signalverschiebungen in der Lösung mit

Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N"""-hepta-(n-decyl-10'-

carboxylat) ebenfalls auf eine Assoziatbildung hin. Die Richtung und der Umfang dieser

Positionsänderungen der chemischen Verschiebung waren konzentrationsabhängig und für

das Gastmolekül deutlich stärker ausgeprägt als für den Wirt (Tabelle 4). Dies macht

wahrscheinlich, dass die Assoziation vorwiegend mit den Methylenseitenketten stattfindet,

sodass die Umgebung verglichen mit wässriger Lösung sich für den Gast zwar drastisch, für

die Protonen des Corringerüstes jedoch kaum änderte.

c) Gleichkonzentrierte Lösungen von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat und

Hepta-kalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-l0'-

carboxylat) (17) zeigten identische Lumineszenzintensitäten, unabhängig davon ob die

festen Corrine in mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gesättigten Deuteriumoxid

gelöst oder aber Lösungen der Corrine in Deuteriumoxid mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-

tosylat gesättigt wurden. Die UV/vis-Spektren zeigten allerdings, dass in letzterem Fall die

Konzentration an 16 in Lösungen von 17 höher war als in Lösungen von 24. Da die Lösungen

ausser dem Kobalt im Zentrum der Corrine keine Quencher enthielten, muss aufgrund der

totalen Lumineszenzlöschung das in Lösungen von 17 zusätzlich gelöste 1,N6-

Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat sich in genügender Nähe zum Kobalt des Heptakalium-dicyano-

Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10' -carboxylat) aufgehalten

haben, um gequencht werden zu können.

Aus mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gesättigten Lösungen nahmen die Corrine

folglich keine Moleküle Tosylat 16 auf sondern lagerten sie erst bei Einwirkung von

108

Ultraschall in Anwesenheit eines Überschusses Tosylat 16 ein Es war anscheinend eine

Energiebarriere zu überwinden

Diese Barriere sollte auch in umgekehrter Richtung wirken und einmal gebildete Assoziate

stabilisieren Dies wurde auch beobachtet

a) Während der Zeitdauer zwischen Ultraschallbehandlung und Beendigung einer

Messung, d h je nach der angewandten spektroskopischen Untersuchungsmethode

zwischen ca 30 Minuten und einigen Stunden, war UV/vis-spektroskopisch keine

Konzentrationsveränderung des 1,N6 Ethenoadenosyl 5'O tosylat (16)

feststellbar

b) Hexakahum Coa-aquo Coß 5' adenosyl cobamido N,N',N",N'",N"",N ,N hepta

(n decyl 10'carboxylat) (18) konnte erhalten werden, indem eine wässrige Lösung

Co(ll) cobamido-N,N',N",N"',N'" ,N ,N hepta (n-decyl 10' carboxylat) mit

1,N6 Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat-Komplexe16 gesättigt, durch Zentnfugation von

suspendiertem Tosylat 16 befreit und nach Zugabe von Natnumborhydnd analog dem

entsprechenden Beschreibungsansatz der präparativen Synthese von 18 aufgearbeitet

wurde

Da sich das Dicyano heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und Heptakalium dicyano

Co(lll) cobamido N,N',N",N'",N"",N"" ,N hepta (n decyl 10' carboxylat) (17) nur

durch sieben (n Decyl-10'-carboxylat)-Ketten unterscheiden, muss die Barrierenwirkung

auf eben diese (n Decyl-10'-carboxylat)-Ketten zurückgeführt werden

16 vgl 6 7 32

109

4. Reduktionskinetik

Zusammenfassung

Die Geschwindigkeitskonstanten der Reduktion von Co(ll)-cobyrinat und Co(ll)-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) mit Natriumborhydrid in

Phosphatpuffer zu den Co(l)-corrinen wurden gemessen.

Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N '-hepta-(n-decyl-W-carboxylat) wurde in

1 M Phosphatpuffer, pH 9, durch Natriumborhydrid cirka dreimal schneller reduziert (k=

35,6 min-iM-1) als Co(ll)-cobyrinat (k= 11,34 miir^M-i).

Wie im vorangehenden Kapitel gezeigt, weist das Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) eine Assoziations¬

tendenz mit ö'-O-Tosyladenosin (15) und l,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) auf. Es

ist daher interessant zu untersuchen, ob auch bereits bei der Reduktion der Co(ll)-corrine

mit Natriumborhydrid unterschiedliche Reaktionsgeschwindigkeiten festgestellt werden

können.

In einer Glove-box wurden Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",

N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) und Dicyano-heptakalium-Co(lll)-

cobyrinat (24) in Methanol gelöst, mit Essigsäure versetzt, Pt02 als Katalysator zugefügt

und unter Wasserstoffatmosphäre zu den Co(ll)-Verbindungen reduziert. Sobald die Reaktion

gemäss UV/vis-Spektrum quantitativ war, wurde die Lösung durch Watte filtiert und am

Hochvakuum getrocknet.

Zur Messung der Reduktionskinetik wurden in 1 M Phosphatpuffer, pH 9, cirka 10~2 molare

Lösung der Co(ll)-corrine bereitet und noch in der Glove-box in eine Apparatur wie sie für

die Alkylierungsexperimente17 verwendet wurden gefüllt. In das obere Reservoir legte man

Natriumborhydrid vor und verschluss die Apparatur gasdicht.

17 vgl. 5.1, Abbildung 47

110

NaBH4

LMU

VYCOONacoONa

HaOOC

NaOOC

NaBH4

LM2

LM i = Methanol

LM 2 = Phosphatpuffer (1 M, pH 9)

Abbildung 53: Zusammenfassende Darstellung der Experimente zur Reduktionskinetik

111

Tabelle 5

Isobestische Punkte der Reduktion von Hexakalium-Co(ll)-cobyrinat und

Hexakalium-Co(ll)-cobamido-N,N,,N",N,",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-

10'-carboxylat) zu Pentakalium-Co(l)-cobyrinat bzw. Pentakalium-Co(l)-

cobamido- N ,N', N", N,",N"",N ,N -hepta-fn-decyMO'-carboxylat)

Hexakalium-Co(ll)-cobyrinat Hexakalium-Co(ll)-cobamido-N,N',N",N,",N"",N ,N -


1M Phosphatpuffer, pH 9 IM Phosphatpuffer, pH 9

nm nm

Reduktion

Co(ll) zu Co(l)232

257

237

257

265 269

305 307

344 355

411 415

543 557

Aufgeführt sind die Mittelwerte der Einzelexperimente. Für jedes Experiment wurden dazu

die isobestischen Punkte graphisch aus einem Spektrenoverlay bestimmt.

Tabelle 6

Wellenlängen mit lokalen Maxima der e-Differenzen von Edukt und Produkt:

Reduktion von Hexakalium-Co(ll)-cobyrinat und -cobamido-

N,N,,N",N,,',N"",N ,N -hepta-fn-decyl-IO'-carboxylat) zu den

Co(l)-Verbindungen

Hexakalium-Co(ll)-cobyrinat Hexakalium-Co(ll)-cobamido-N,N,,N',,N"',N"",N ,N -


1M Phosphatpuffer, pH 9

nm

1M Phosphatpuffer, pH 9

nm

248

292 294

313 316

345

385 390

466 466

112

Das UV/vis-Spektrum der Eduktlösung wurde gemessen, anschliessend das

Natriumborhydrid in die Lösung gespült und die Veränderung der Absorption bei 388 nm

(Cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)) bzw. bei 384

nm (Cobyrinat) verfolgt.

Die isosbestischen Punkte der Reduktion der Co(ll)-cobyrinat und Co(ll)-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) in Phosphatpuffer zu den

Co(l)-corrinen sind in Tabelle 5 zusammengestellt. In Tabelle 6 sind die Wellenlängen

aufgeführt, deren Absorptionskoeffizienten zwischen Edukt und Produkt ein lokales

Maximum aufweisen.

Die Geschwindigkeitskonstanten wurden berechnet indem die Absorptionswerte bei 388 nm

bzw. bei 390 nm gemäss einem Ansatz erster Ordnung ausgewertet18 und anschliessend die

erhaltene Geschwindigkeitskonstante durch die Konzentration des Reduktionsmittels bzw. des

Alkylierungsmittels vor Reaktionsbeginn dividiert wurde. Tabelle 7 zeigt die Ergebnisse der

Einzelexperimente.

Die Reduktion des Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-

carboxylat) mit Natriumborhydrid in Methanol verlief mit k= 35,6 min-1M"1 dreimal so

schnell wie die des Co(ll)-cobyrinat, für das die Geschwindigkeitskonstante k zu k= 11,34

min-1 bestimmt wurde.

Eine unterschiedliche Reaktivität des Co(ll) im Zentrum der Corrinringe ist sehr

unwahrscheinlich, sodass die Differenz der Reduktionsgeschwindigkeiten in der (n-Decyl-

10'-carboxylat)-Hüile des Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N"""-hepta-(n-decyl-

10'-carboxylat)es begründet liegen sollte.

Ursache für die beobachtete um den Faktor drei erhöhte Reduktionsgeschwindigkeit des

Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)es mit

Natriumborhydrid könnte eine Detergenzeffekt der (n-Decyl-IO'-carboxylat)-Ketten sein,

der eine Beschleunigung der Lösung des als Feststoff zugegebenen Natriumborhydrides

bewirkt. Die Konzentration an gelöstem Natriumborhydrid in der Lösung mit Co(ll)-

abst.n-abstlineare Regression über die Gerade: -kt = In (1 + I 1 )

absf-abst^oo

113

cobamido-N,N',N",N'",N"",N"'",N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) steigt so schneller

an als in der analogen Lösung des Hexakalium-Co(ll)-cobyrinat und es wird eine

anscheinend höhere Geschwindigkeitskonstante der Reduktion zum Co(l)-corrin beobachtet.

Analog der von Moskophidis [47] bei Cobyrsäure, Pseudovitamin B12 sowie Faktor III

gemachten Beobachtung war bei der Reduktion des Co(ll)-cobyrinat zum Co(l)-cobyrinat in

Methanol die Absorption bei 380 nm lineare Fuktion der Zeit mit einer Steigung von 360

Min-1 ([NaBH4]t=0= 420 mM).

Tabelle 7

Geschwindigkeitskonstanten der Reduktion von Co(ll)-cobyrinat und Co(ll)-

cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) zu

Co(l)-cobyrinat und Co(l)-cobamido-N,N',N",N,",N,,,,,N ,N -hepta-

(n-decyl-IO'-carboxylat)

>£>wry

s-5»>*^yNjCKJcSI

Co(ll)-cobyrinat Co(ll)-cobamido-N,N',N",N,",N"",N ,N -hepta-


MeOH 360* nicht gemessen

1 M Phosphatpuffer, pH 9 11,34 ±1% 35,6 ± 5%

>21,4

36,4

unabhängige Experimente, Angaben als k/minr1M-t; 'lineare Funktion der Zeit, vgl. [47]

114

5. Alkylierungskinetik

Zusammenfassung

Die Geschwindigkeitskonstanten der Adenosylierungen von Co(l)-cobyrinat und Co(l)-

cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) in Methanol und

Wasser, sowie der Methylierung von Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N '-hepta-

(n-decyl-10'-carboxylat) in Wasser wurden gemessen.

Die Adenosylierung des Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N '-hepta-(n-decyl-10'-

carboxylat) mit 5'-0-Tosyladenosin (15) ist gegenüber der des Co(l)-cobyrinat deutlich

beschleunigt, in wässriger Lösung mit 6,8 min'1M-1 vs. 1,3 min-1M-1 cirka fünffach, in

Methanol mit 4,3 min'1M-1 vs. 0,37 minm1M-1 cirka zehnfach. Bei der Umsetzung von einer

mit 5'-0-Tosyladenosin gesättigten Lösung von Co(ll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N'"",

N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (0,6 mM) in Phosphatpuffer mit Natriumborhydrid

konnten Geschwindigkeitskonstanten von cirka 14 mim1M-1 erreicht werden.

Die Methylierung von Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-

carboxylat) mit Methyltosylat in wässriger Lösung war mit k= ca. 3V00 min'1M-1 deutlich

schneller als in Methanol (k= V200 mim1M-1).

Die systematisch erhöhte Reaktionsgeschwindigkeit der untersuchten Alkylierungs-

reaktionen im Cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10"-carboxylat)

kann durch die Wirkung der lipophilen Hülle, durch die sich das Cobamido-

N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxyiat) von der Cobyrinsäure

unterscheidet, erklärt werden. Dabei handelt es sich u.a. um in einem vorgelagerten

Gleichgewicht ähnlich dem Substrat-Enzym-Komplex entstehende Assoziate des Cobamido-

N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) mit dem Alkylierungsmittel.

115

LMU

rtrtj

\**/ «4^0?-O"CHstei (is)

Variante a

VY (24> VariantebNH,

LM,

(20)

(17)

LM,

fcl (15) R,

(18)

H£ ~° ?~\~f~CH>

LM,,2

CHS

M /(30)

LM i = Methanol

LM 2 = Phosphatpuffer (0,1 M, pH 9)

Abbildung 54: Zusammenfassende Übersicht der Experimente zur Alkylierungskinetik

116

Assoziationsexperimente hatten bereits gezeigt19, dass in mit 5'-0-Tosyladenosin (15)

oder 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gesättigter, wässriger Lösung von


carboxylat) das Tosylat eine Tendenz zur Assoziation mit den (n-Decyl-10'-carboxylat)-

Ketten aufweist. Durch ein derart vorgelagertes Gleichgewicht, ähnlich einem Enzym-

Substrat-Komplex, sollte die effektive Konzentration an 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylatin der Nähe des Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-

carboxylat) höher sein als in einer analogen Lösung des Co(l)-cobyrinat. Demzufolge war

für die Alkylierung des Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-

carboxylat) mit Methyltosylat bzw. 5'-0-Tosyladenosin (15) zu Hexakalium-Coa-aquo-

Coß-methyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (30)

bzw. zu Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobyrinat (20) und Hexakalium-Coa-

aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxy-

lat) (18) eine beschleunigte Alkylierungsgeschwindigkeit zu erwarten.

Das Reaktionsablauf der Alkylierungen von Co(l)-corrinen mit festem Alkylierungsmittel

ist komplex (vgl. auch Abbildung 55).

Die Alkylierungsprodukte Hexakalium-Coa-aquo-Coß-methyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",

N ,N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (30), Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-

adenosyl-cobyrinat (20) und Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (18), und die Edukte zu

ihrer Synthese, Co(ll)-cobyrinat und Co(ll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -

hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat), sind in Methanol und in Wasser gut löslich. Bei der

Umsetzung von Co(ll)-cobyrinat und Co(ll)-cobamido-N,N',N",N"',N"", N ,N -hepta-

(n-decyl-10'-carboxylat) in wässriger Lösung mit nur beschränkt löslichen

Adenosylderivaten wie 5'-0-Tosyladenosin (15) beinhaltet der Reaktionsablauf mehrere

Schritte: das Lösen des Alkylierungsmittels, den Transport in die Nähe des

Reaktionszentrums und die Reaktion mit dem Co(l)-zentrum.

Die neben dem Experimenten in Phosphatpuffer, pH 9, durchgeführten Messungen in

homogener methanolischer Lösung vermeiden zwar die aus der beschränkten Löslichkeit der

Alkylierungsmittel resultierenden Probleme, doch sind sie ein weniger gutes Modell für eine

dem Käfigeffekt unterliegende Reaktion, da die Löslichkeitseigenschaften des Gastmoleküls in

wässriger Lösung die Austrittsbarriere erhöhen.

19 Kapitel 3

117

Abbildung 55: Stationen einer als festes Alkyltosylat vorgelegten

Alkyleinheit bei der Alkylierungsreaktion mit

Co(l)-corrinen

Alkyl-tosylat(,9St> - - - >

Alkyl-tosylat(»el08t> - - - >

[Alkyltosylat; Co(l)-corrin](99lost) --->

Alkyl-Co(lll)-corrin(gelost>

Ausgehend von der durch Pt02-katalysierten Reduktion mit Wasserstoff aus Dicyano-


N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) gewonnenen, cirka

zwei millimolaren Stammlösungen der entsprechenden Co(ll)-corrine wurden in einer

Glove-box durch Reduktion mit Natriumborhydrid in situ die entsprechenden Co(l)-corrine

hergestellt und nachfolgend in einer speziellen Glassapparatur mit Alkyltosylaten, 5'0-

Tosyladenosin (15) und Methyltosylat, bzw. 5'-Chloro-5'-deoxy-adenosin, umgesetzt.

Der Glassrezipient bestand aus einem mit einem langen Glasrohr versehenen Rundkolben mit

seitlich angeschmolzener UV/vis-Küvette, auf den über eine Schliffverbindung ein

abgebogener Birnkolben aufgesetzt werden konnte (Abbildung 56).

Die Alkylierungen wurden mit Methanol einerseits und in wässriger Lösung andererseits

durchgeführt. Anstatt mit einer einfachen wässrigen Lösung wurde ungeachtet der erhöhten

Hydrolysegeschwindigkeiten der eingesetzten Alkylierungsmittel in Phosphatpuffer, 1M, pH

9, gearbeitet, da NaBH4 in saurem und neutralem Medium im Vergleich zu der zu messenden

Alkylierung schnell hydrolysiert.

In dem Rundkolben befand sich neben der Reaktionslösung ein Magnetrüher. Für die

Reduktionen füllte man das Natriumborhydrid in den aufsetzbaren, abgebogenen Birnkolben,

für die Alkylierungen entsprechend das Alkylierungsmittel. Observable für den

Reaktionsverlauf war die optische Dichte, welche am Absorptionsmaximum der Co(l)-

corrine in einem auf 23,0 ± 0,2 °C thermostatisierten Spektrophotometer gemessen wurde.

Die Zahl der Messdaten und Übersichtspektren über den gesamten UV/vis-Bereich (200-

900 nm) wurde der Reaktionsgeschwindigkeit angepasst und die Zwischenprodukte, Co(ll)-

und Co(l)-corrine, über ihre UV/vis-Spektren identifiziert.

118

Abbildung 56: Apparatur zur Kinetikmessung; links:

UV-Küvette, dx= 0,100 cm; rechts: Vorratsgefäss mit

Magnetrührer zur schnellen Durchmischung; oben:

Reservoir mit NaBH4 bzw. Alkylierungsmittel:Gesamthöhe: 20 cm

Bei der Alkylierung der Co(l)-cornne mit 5'-0-Tosyladenosin (15) erschienen die

methanolischen Losungen bereits nach einigen Sekunden homogen während die wässrigen

Losungen sich aufgrund suspendierten 5'-0-Tosyladenosin (15) zuerst eintrübten. Die

UV/vis-Spektren in Methanol zeigen oberhalb der langwelligsten Absorptionsbande bis 900

nm die erwartete horizontale Basislinie, die bei den in Wasser durchgeführten Experimenten

für die ersten Messungen eine Wölbung aufwiesen. Um dennoch das Experiment so

reproduzierbar wie möglich zu gestalten, wurde mit im Ultraschallbad pulverisierten 5'-0-

Tosyladenosin (15) alkyliert. Die beobachte geringe Trübung bei Zugabe des

Alkylierungsmittels verschwand in wässrigen Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -

hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)-Losungen schneller als bei den analogen Ansätzen mit

Co(l)-cobyrinat.

119

Abbildung 57 (a): Alkylierungskinetik von Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N"'",

N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) mit 5'-0-Tosyladenosin f\5) in Methanol

(Experiment 1a); Overlay der UV/vis-Spektren bei t= 0, 6, 17 & 90 Minuten

Methanol

säe 63« ?-.e

nm

120

Tabelle 8

Isobestische Punkte der Alkylierung von Pentakalium-Co(l)-cobyrinat bzw.

Co(l)-pentakalium-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decy I-

10'-carboxylat) mit Methyl- und Adenosylderivaten

/P*^^

^^7"

Cobyrinat Cobamido-

N,N',N",N"',N"",N ,N -


Methanol, nm Wasser, nm Methanol, nm Wasser, nm

Methylierung 241

253

269

r322

308

R. /358

420

539

358

417

543

Adenosylierung 257

285

R= 326

410

349

411 414

353

410

HO\j "H

7546

608

735

530 539 535

Aufgeführt sind die Mittelwerte der Einzelexperimente. Für jedes Experiment wurden dazu

die isobestischen Punkte graphisch aus einem Spektrenovertay bestimmt.

121

Tabelle 9

Wellenlängen mit lokalen Maxima der e-Differenzen von Edukt und Produkt

bei Alkylierung von Co(l)-cobyrinat und Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",

N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)

/£*^7

i

Hfi Hfi '.

Cobyrinat Cobamido-

N,N',N",N"',N"",N ,N -


Methanol, nm Wasser, nm Methanol, nm Wasser, nm

Methylierung

I"

244

264

304

345

R= / 389

457

390

457

Adenosylierung

R= 342 301

388 385 389 389

„0-F*^"HO-U? "H

7462

554

456 457 453

122

Die Alkylierungen wurden erst nach Konstanz des UV/vis-Spektums abgebrochen und waren

immer quantitativ20. Die Alkylierungsprodukte, Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-

cobyrinat (20), Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,

N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (18) bzw. Hexakalium-Cocc-aquo-Coß-methyl-

cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (30) konnten

nach Aufarbeitung der Reaktionslösungen analog den präparativen Synthesen durch 1H-

NMR- und UV/vis-Spektroskopie aufgrund ihrer Identität mit den Beschreibungsspektren

der entsprechenden präparativen Synthesen identifiziert werden. Die isolierten

Alkylierungsprodukte waren noch mit maximal zwei Äquivalenten Alkylierungsmittel

verunreinigt. Auf zusätzliche Reinigungsschritte zur Reindarstellung wurde jedoch wegen

der sehr geringen Substanzmengen21 verzichtet.

Aus der Schar der Übersichtsspektren (analog Abbildung 57 a) wurden die isobestischen

Punkte (Tabelle 8) und Wellenlängen mit lokalen Maxima der Differenzen der

Extinktionskoeffizienten der Produkte und Edukte (Tabelle 9) bestimmt.

Die Geschwindigkeitskonstanten wurden berechnet indem die Absorptionswerte (analog

Abbildung 57 b) gemäss einem Ansatz erster Ordnung ausgewertet wurden (analog Abbildung

57 c) und anschliessend die erhaltene apparente Geschwindigkeitskonstante pseudo-erster

Ordnung durch die aus der Gesamtmenge des zu Reaktionsbeginn zugefügten

Alkylierungsmittels berechnete Konzentration dividiert wurde. In Tabelle 10 sind die

Ergebnisse der Einzelexperimente zusammengestellt.

Der Konzentrationsbereich der Co(ll)-corrinlösungen, ca. 2-10"2 M, war so gewählt, dass

er zwei Grössenordnungen über der Löslichkeit von 5'-0-Tosyladenosin (15) in Wasser lag.

Die Kinetiken Hessen sich über mehrere Halbwertzeiten auswerten und lieferten für

unterschiedliche Konzentrationen an Co(l)-corrin identische Werte.

Daraus muss geschlossen werden, dass entweder der Lösungsprozess verglichen mit der

Alkylierungsreaktion schnell ablief oder, da zur Alkylierung immer die ungefähr gleiche

Anzahl Äquivalente festes Alkylierungsmittel eingesetzt wurde, diese Linearität auf

ungefährer Proportionalität der aktiven Oberfläche zur eingesetzten Menge

Alkylierungsmittel beruhte. Eine direkte Vergleichbarkeit ist sicherlich problematisch, auf

20 Nach Zugabe von KCN in der Dunkelheit war keine Veränderung des UV/vis-Spektrums zu

beobachten.

21 Es fielen nach vollständiger Alkylierung pro Kinetikmessung cirka 1 mg alkyliertesCorrin an.

123

jeden Fall aber sollte der gefundene Wert für die Geschwindigkeitskonstante wenn, dann zu

klein verglichen mit dem wahren Wert ausfallen. Da die experimentellen Werte für die

Alkylierung von Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-

carboxylat) in Wasser jedoch sämtlich über jenen für Methanol liegen, besitzen sie

mindestens qualitative Aussagekraft.

Die Linearitätsbereiche der Auftragung des In (l/l0) vs. Reaktionsdauer erstreckten sich

analog den Beobachtungen von Blaser und Halpern [23], die die Alkylierung von Co(ll)-

cobalamin mit Alkylhalogeniden in Wasser und Methanol untersuchten, über einige

Halbwertzeiten. Die Reproduzierbarkeiten bewegten sich ebenfalls im Bereich von 10%.

Abbildung 57 (b, c): Alkylierungskinetik von Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",

N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) mit 5'-0-Tosyladenosin (15) in Methanol

(Experiment 1a);

(b) optische Dichte bei 388 nm

124

(c) Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte gemäss Ansatz pseudo-erster-Ordnung

ln(l1 8-

/lo)

1 6

1 4.

1 2,

1.

8.

6.

4.

C\l

w— 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Zeit/ mm

Die Methylierung von Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-

carboxylat) zu Hexakalium-Coa-aquo Coß-methyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -

hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (30) verlief in Wasser mit ca 3'000 min 1M 1

(Experiment 5) mehr als doppelt so schnell als in Methanol, für das eine

Geschwindigkeitskonstante von 1'200 mm 1M 1 (Experiment 6) ermittelt wurde (Tabelle

10). Die Kinetik der Methylierung des Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-

(n-decyl-10'-carboxylat) war zudem aufgrund der besseren Löslichkeit von Methyltosylat

in Wasser erwartungsgemäss wesentlich schneller als die der Adenosylierungen

Aufgrund der sehr hohen Alkylierungsgeschwindigkeit des Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',

N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)es mit Methyltosylat in Phosphatpuffer

war die Methylierung schon zum grössten Teil erfolgt als die erste Messung nach

Vermischung der Co(l)-Lösung mit dem Methyltosylat vorgenommen werden konnte

Erstaunlicherweise wurde für die Alkylierung der letzten Prozente Co(l)-cornn eine

Kinetik pseudo-erster Ordnung beobachtet, die jedoch wesentlich langsamer war als die

Alkylierungsgeschwindigkeit zu Beginn der Reaktion wie die grossen Achsenabschnitte in den

entsprechenden Experimenten (Experiment 5 & 6) belegen

125

Tabelle 10

Geschwindigkeitskonstanten k 2. Ordnung der Alkylierung von Co(l)-

cobyrinat und Co(l)-cobamido-N,N',N,,1N,")N"", N ,N -hepta-(n-

decyl-10'-carboxylat) mit einigen Alkylierungsmitteln

Methylierungmit Methyltosylat

CH

I

Co(l)-cobyrinat

Hfi

Co(l)-cobamido-N,N',N",N"\N'"\N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)

A**"-

in MeOH V200 ± 1%

lLL__inH20 3'250 ± 30%

2'500 ± 20%

(11

Adenosylierungmit 5'-0-Tosyladenosin

in MeOH 0,37 ± 5%

dt»

4,3 ± 5%

da)

inH20 1,33 ± 10%

(2b)

6,3 ± 4%

6,8 ± 7%

7,5 ± 10%

(2a)

in H20 mit 5'-Chloro-5'-

deoxy-adenosin

[Co(ll)corrin/5'-0-Tosyl-

adenosin]-Assoziat in H20

0,55 ± 9%

(4)

nicht gemessen

13,6 ± 20%

16,0 ± 10%

(3)

unabhängige Experimente, Angaben als k/min-1M-1, "nicht durchführbar, fett in Klammern:

Experiment-Nummer im experimentellen Teil

126

Die Adenosylierung von Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N' -hepta-(n-decyl-10'-

carboxylat) war sowohl in Wasser mit ca. 6,8 min"1M-1 (Experiment 2a) als auch in

Methanol mit 4,3 min_1M-1 (Experiment 1a) wesentlich schneller, als bei Co(l)-

cobyrinat, dessen entsprechende Werte 1,33 min"1M"1 (Experiment 2b) und 0,37 min-1M-

1 (Experiment 1b) betrugen: Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-

decyl-10'-carboxylat) wurde in Wasser cirka fünfmal schneller als Co(l)-cobyrinat

adenosyliert bzw. zehnfach schneller in Methanol.

Die Adenosylierung von Co(l)-cobyrinat in wässriger Lösung mit 5'-Chloro-5'-deoxy-

adenosin lieferte k= 0,55 min-1M'1 (Experiment 4), ein Wert, der verglichen mit der

entsprechenden Reaktion des 5'-0-Tosyladenosin (15), mit Chlorid als der schlechteren

Abgangsgruppe erwartungsgemäss geringer ausfiel.

Für die Adenosylierungsgeschwindigkeiten lassen sich somit drei charakteristische

Eigenschaften feststellen, von denen eine auch bei den Methylierungsreaktionen

nachgewiesen werden konnte, wenn auch die vollständige Analogie nicht umfassend

untersucht wurde:

1. Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N"'",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)

alkyliert systematisch schneller als Co(l)-cobyrinat

Bei allen untersuchten Adenosylierungsreaktionen schwankte der Quotient der apparenten

Geschwindigkeitskonstanten der Alkylierung von Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,

N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)/Co(l)-cobyrinat zwischen fünf und elf.

Da sämtliche untersuchten Reaktionen durch Vermischen mit einem Festkörper initiiert

wurden, war allein schon aufgrund der vermuteten Oberflächenaktivität des Co(l)-

cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) eine beschleunigte

Lösung des festen Reaktionspartners und damit eine erhöhte Reaktionsgeschwindigkeit zu

erwarten.

Zudem lässt sich die erhöhte Geschwindigkeit mit Assoziation des 5'-0-Tosyladenosin mit

dem Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) er¬

klären, die in weiteren Experimenten22 und synthetisch durch die praparative Alkylierung

22 vgl. Assoziationsexperimente Kapitel 3

127

über die Reduktion einer mit 5'-0-Tosyladenosin gesättigten Lösung Cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) nachgewiesen werden konnte.

In einem weiteren, orientierenden Experiment wurde die Bedeutung der Assoziatbildung für

die Geschwindigkeitskonstante der Alkylierung untersucht.

Assoziate von Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carb-

oxylat) mit 5'0-Tosyladenosin (15) wurden durch Ultraschallbehandlung einer mit einem

Uberschuss an festem 5'-0-Tosyladenosin (15) versetzten wässrigen Lösung des Co(ll)-

cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) und anschlies¬

sendem Abzentrifugieren des verbleibenden suspendierten 5'-0-Tosyladenosin (15)

hergestellt. Die analog dem oben beschriebenen Vorgehen berechneten apparenten

Geschwindigkeitskonstanten der Alkylierung dieser Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,

N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat/5'-O-Tosyladenosin-Lösungen, dabei handelt es sich

wahrscheinlich um Assoziate, in wässriger Lösung durch Umsetzung mit Natriumborhydrid

lagen im Bereich von cirka 14 min~1M~1 (Experiment 3). Dieses Ergebnis war nicht

signifikant verschieden von 11 min~1M~1, dem Wert für die Reduktion von Co(ll)-cobyrinat

mit Natriumborhydrid in wässriger Lösung (Tabelle 7).

Es war daher zu vermuten, dass das 5'-0-Tosyladenosin (15) in diesen Assoziaten sehr nahe

am Kobalt lokalisiert war und die Alkylierung erfolgte sobald das Reduktionsmittel gelöst

war.

2. Systematische Unterschiede der absoluten Geschwindigkeiten in Wasser & Methanol

Die experimentell bestimmten Geschwindigkeitskonstanten für die Methylierungen und die

Adenosylierung liegen in Wasser systematisch über jenen derselben Reaktion in Methanol.

Einen Grund hierfür könnte die bessere Stabilisierung des Übergangszustandes der

nukleophilen Substitution in Wasser als in Methanol darstellen.

In methanolischer Lösung wurden die Lösungen praktisch augenblicklich makroskopisch

homogen. Da in wässriger Lösung eine Beschleunigung der Alkylierung eintrat könnte auch

bedingt durch den bevorzugten Aufenthalt des Corrins an der Grenzfläche des festen

Alkylierungsmittels (ähnlich Detergenzmolekülen) die effektive Konzentration des

Alkylierungsmittels in der Nähe des Co(l)-zentrums grösser gewesen sein als in der

homogenen Lösung in Methanol.

Die Phänomene sind insgesamt komplex und können in der vorliegenden Arbeit nicht

bezüglich der Beiträge der Einzelfaktoren quantifiziert werden.

128

3. Die Unterschiede der Adenosylierungsgeschwindigkeiten sind in Wasser kleiner als in

Methanol

Die Verminderung der relativen Adenosylierungsgeschwindigkeiten von Co(l)-cobyrinat und

Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) beim

Wechsel von Methanol zu Wasser als Lösungsmittel ist durch das Zusammenwirken

mehrerer Faktoren erklärbar:

a) Die (n-Decyl-IO'-carboxylat)-Ketten könnten in wässriger Lösung eine andere

Konformation einnehmen als in Methanol und so den Zugang zum nukleophilen Zentrum

beeinflussen. Dabei erscheint aufgrund des überwiegend lipophilen Charakters der

Seitenketten ein Zusammenknäulen der lipophilen Teile und eine Ausrichtung der

hydrophilen Endgruppen in die Wasserphase nicht unwahrscheinlich.23

b) Andererseits bewirkt eventuell ein Detergenzeffekt des Co(l)-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) in Wasser eine bessere

Lösungskinetik des als Festkörper zugegebenen Alkylierungsmittels.

c) Beim Übergang von Wasser zu Methanol als Lösungsmittel wirken wahrscheinlich

daneben noch bedingt durch den zu ionischen Produkten führenden Substitutionsmechanismus

Lösungsmitteleffekte. Bekannterweise beeinflusst nämlich die Polarität des Lösungsmittels

die Geschwindigkeit von Sn2 Reaktion in Abhängigkeit davon, inwieweit im Vergleich zum

Eduktzustand eventuelle Ladungen im Übergangszustand der Reaktion delokalisiert werden.

23 vgl. 2.2.2

129

EXPERIMENTELLER TEIL

6.1 Allgemeine Bemerkungen

Für die Bestimmung der analytischen Daten danke ich Frau B. Brandenberg, Frau V. Egli,

Herrn M. Welti und Herrn PD Dr. Bernhard Jaun (1H-NMR- und 13C-NMR-Spektren), Herrn

Dr. U. Schefer (Massenspektren) sowie den Herren H. Hediger und R. Dohner (CD-, UV/vis-

und IR-Spektren für Charakterisierungen).

Unterstützt hat mich auch die Gruppe Prof. U. Wild bei der Durchführung der Total-

Lumineszenz-Spektroskopie, wobei ich insbesondere Herrn Michael Parti für seine

Einführung in die Fluoreszenzmessungen danke.

6.1.1 Apparative Ausstattung

Arbeiten unter Stickstoff

Die Herstellung sämtlicher Lösungen zur Messung der Reduktionskinetik, die Vorbereitung der

geschlossenen Kinetikapparatur sowie die praparative Synthese der alkylierten Corrine

wurden in der Glove-box durchgeführt ([02] <18 ppm bzw. während Arbeiten mit Co(l)-

Lösungen [02] ca. 2-3 ppm):Meca-Plex Glove-box, Grenchen, Schweiz, Typ 2201 (Kristallisation und Alkylierungen

Cobalamine, [02] <2 ppm), Typ 2540 (sonstige Elektrochemie und Applikationen, [02] <18

ppm). Messung des Sauerstoffgehaltes mit Teledyne, Trace Oxygen Analyser.

CD

Messung des Circular-Dichroismus mit Jobin-Yvon Mark III, 200-700 nm, Angaben in

L/Mol/cm.

Elektrolyse

Alkylierung der Cobalamine und Ausarbeitung der Synthesemethodik für Hexanatrium-Coa-

aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat (21) mit Electrochemistry System Model

170, Princeton Applied Research, Princeton, N.J., USA. Alle übrigen Elektrochemie¬

experimente mit Potentiostat AMEL, Model 550.

Elektrochemische Zelle gemäss [105]. Gegenelektrode Piatindraht, Arbeitselektrode Queck¬

silber im elektrischen Kontakt über eine Platindrahtverbindung, Referenzelektrode Kalomel

(in Kontakt zur Reaktionslösung über: 0,1 M wässriges KCl/ 0,1 M KCl in Methanol-Wasser

1:1 / 0,1 M Inertelektrolyt in Methanol-Wasser 1:1). Bei der Synthese des 1,N6-

Ethenoadenosylcobalamin (4) wird zusätzlich noch ein Element 0,1 M Inertelektrolyt in

Methanol vor dem Kontakt mit der Reaktionslösung geschaltet.

130

LumineszenzmessungenDie Fluoreszenzmessungen erfolgten nach der front face Methode ([146]) Hochauflösendes

computergesteuertes Spektrometer mit Photonenzähler Bandbreite des anregenden Lichtes

einige nm

Monochromatoren SPEX Modell 1402, Steuerung der Monochromatoren SPEX Speed

Controller, Photomultiplier Emission RCA Electronic Components C31034 A, PhotomultipherReferenz Hamamatsu R 928, Counter Emission General Radio 1192 B, Counter Referenz

Seyffer Modell 150, Lampe Osram Xenon Hochdruckkurzbogenlampe XBO, 2500 W, IR

Filter Glas, Kuvetten Hellma Quartzkuvetten suprasil, dx= 0,100 cm, Datenauswertung mit

Software von Kallir [146]

Gewichtsbestimmungen

Sämtliche Gewichtsbestimmungen mit Mettler Waagen, Zürich, Genauigkeit ± 0,1 mg bzw ±

1,0 mg

IR

Perkin Eimer 781 Infrared Spectrophotometer, für Messungen in KBr Perkin Eimer

Gitterspektrograph PE 983, Bandenlage in cm 1, s= stark, m= mittel, w= schwach

Massenspektroskopieal {+)&(-) FAB MS

Fast Atom Bombardment Massenspektrometer ZAB 2 SEQ, Normierung der Peakhöhe auf

jeweils höchste Intensität in ausgewählten Messbereich 100 % Peak (Basispeak), Matrix und

Messbereich sind angegeben wobei die Matrixsignale unberücksichtigt blieben (Elimination

durch Vergleich mit entsprechenden Matrixspektren)b/ El MS

Electron Impact Massenspektrometer Hitachi RMU 6D (lomsationsenergie 70 eV) und Tib

nd (70 eV), Angabe in m/z, Intensitäten in % des Basispeaks

Mikroanalysen

Durchgeführt im mikroanalytischen Laboratorium des Institutes für organische Chemie der

ETH Zürich

NMR Spektroskopie1H NMR-Spektren gemessen auf Bruker Spectrospin AMX 400 (400 MHz), Bruker

Spectrospin WM-300 (300,13 MHz), Vanan Gemini 200 bzw Bruker Spectrospin WP-80

(80 MHz)

13C NMR-Spektren 75 MHz auf Vanan XL 300 oder 100 MHz auf Bruker Spectrospin AMX

400, jeweils breitbandentkoppelt und DEPT

Chemische Verschiebungen 8 in ppm Die Spektren sind auf das Lösungsmittel referenziert Die

Verwendung interner Referenzen, TMS oder DSS, ist gesondert vermerkt

Alle NMR-Messungen ohne Temperaturangabe wurden bei Umgebungstemperatur gemessen

131

H-C-COSY, H-detected, 13C-detected Spektroskopie

gemessen auf Bruker Spectrospin 400 MHz, Spectrospin, Fällanden, Schweiz.

Photolyse

Photolyseexperimente in verdunkeltem Raum mit:

A. UV-Lampe, Universal, Camag, Muttenz, Schweiz, TL-900, mit Lichtquellen: SylvaniaF8T5/ BLB, Sylvania Electric Products Inc., Danvers, Mass., USA 01923 (366 nm) und

Heisskathodenröhre sterilAir UVC-9 (254 nm).

B. Lichtquelle und Monochromator nach Neier [122] mit Xenon-Hochdrucklampe, Osram,

XBO (Gleichstrom), 1600 W, SPEX Monochromator, SPEX Industries Inc., Metuchen, N.J.

08840, Siemens Zündgerät Z 5203, Transistor Netzgerät, Heinzinger Typ TNX 1600 W,

Halbwertsbreite des Strahlenbündels 20 nm. Messung der Intensität mit Sciencetech 365,

power & energy meter, Sciencetech Detector, Catalogue No. 360001, Sciencetech, Boulder

Colorado.

Schmelzpunkt

Schmelzpunktapparatur Büchi, Flawil, nach Tottoli, mit offenem Probenrohr.

Thermostatisierung

Das UV/vis-Spektrometer Uvikon 860 wurde während der Messungen zur Alkylierungskinetikund das Wasserbad des Ultraschallgerätes während der Assozationsexperimente mit einem

Thermostaten Haake F3S auf ± 0,2 °C themostatisiert, wobei die thermostatisierte Flüssigkeit

(Wasser) die Küvettenhalterung des UV/vis-Gerätes bzw. eine Kühlspirale, welche in das zu

thermostatisierende Ultraschallbad eingetaucht war, durchströmte.

Trockenschrank

Memmert-Trockenschrank mit natürlicher Durchlüftung, 120 °C Innentemperatur, Memmert

GmbH, Schwabach, Deutschland.

Ultraschall

Elgasonic, Elga S.A., Biel/Bienne, Schweiz, Frequenz 50 kHz.

UV/vis-SpektroskopieFür Routinespektren: Uvikon 860, Kontron Instruments; für Charakterisierung: Perkin-

Elmer 555; Angaben in cnr1M\ 200-800 nm, Küvetten Hellma, Suprasil, Schichtdicke

0,100 cm soweit nicht anders vermerkt.

Zentrifugation

Runne Zentrifuge Modell 100-2, ungekühlt, soweit nicht anders vermerkt 4'000 UpM.

132

6.1.2 Standard-Arbeitsabläufe

Vorbereitung

Sauerstoffsättigung der Proben

Sauerstoff wurde während mindestens 45 Minuten durch Kieselgel und nachfolgend durch zwei

in Reihe geschaltete Gaswaschflaschen geleitet, welche das Lösungsmittel der zu sättigenden

Lösung enthielten.

Glaswarentrockung

Für wasserfreie Ansätze wurden die benötigten Glaswaren mindestens 12 h im Trocken¬

schrank bei 120 °C getrocknet und anschliessend unter Inertgas (Argon- oder Stickstoff¬

strom) ausgekühlt.

Reinigung der UV-Zellen

Die Zellen wurden vor Gebrauch mit MeOH (Fluka, puriss.), nachfolgend mit Aceton (Fluka,

puriss.) jeweils innen und aussen gewaschen und am Hochvakuum während 30 Minuten bei RT

getrocknet.

Entgasen der Lösungen

Die zu entgasenden Lösungen wurden dreimal unter heftigem Rühren am HV mit flüssigem

Stickstoff eingefroren und anschliessend aufgetaut. Wurden Lösungen in eine Glove-box

transferiert legte man in der Box sofort nochmals Hochvakuum an bis keine wesentliche

Blasenentwicklung mehr zu beobachten war.

SEP-Pack Vorbehandlung

Originalverpackte SEP-Pack Kartuschen wurden vor Gebrauch mit 5 ml Methanol und 10 ml

H20 gewaschen. Vor dem zweiten Gebrauch einer Kartusche wiederholte man die Vor¬

behandlung. Die Kartuschen wurden nur für dieselbe Substanz, maximal jeweils zweimal,

verwendet.

Reinigung S'-O-Tosyladenosin

Vor Verwendung des 5'-0-Tosyladenosin bei den Assoziationsexperiemnten wurde die

kommerzielle Ware wie folgt behandelt: ca. 150 mg 5'-0-Tosyladenosin (15) wurden in 5,0

ml H20 suspendiert, 15 Minuten mit 50 kHz Ultraschall beschallt, während 10 Minuten mit

4'000 UpM zentrifugiert und die farblose, partikelfreie Lösung vom Niederschlag vollständig

abpipettiert. Der Vorgang wurde wiederholt und der Rückstand eine Stunde am Hochvakuum

lyophilisiert. Gemäss 300 MHz 1 H-NMR war das 5'-0-Tosyladenosin (15) nun frei von

Hydrolyseprodukten.

133

Herstellung gesättigter Lösungen von I.Nß-EthenoadenosylS'-O-tosylat und S'-O-Tosyl¬adenosin

Gesättigte, wässrige Lösungen von 1 ,N6-Etheno-5'-0-tosyladenosin 16 und Tosyladenosin 15

wurden analog der Reinigung von S'-O-Tosyladenosin mit vorgereinigtem Material hergestellt.

Man filtrierte die mithilfe von Ultraschall gesättigte Mutterlauge durch eine mit Glaswatte

gefüllte Pasteurpipette.

XAD-PräparationGrundsätzlich wurde der feucht einzusetzende XAD-Harz mit den bei der entsprechenden

Aufarbeitung verwendeten Chemikalien vorbehandelt (Angaben je 50 ml XAD):

1. Cobyrinsäure: Waschen des suspendierten Harzes mit 50 ml Eisessig, 500 ml Wasser, 200

ml wässriger, 2 %iger KCN-Lösung, 200 ml Aceton/Methanol, 1:1, und zuletzt wiederum mit

500 ml Wasser.

2. HeptakaliunW-natrium-cobyrinat: 100 ml ges. KHCO3 + 0,1 gl-1 KCN, 5-faches Volumen

H20, 5-faches Volumen MeOH, 5-faches Volumen H20. Wurde das Harz bereits verwendet

reinigte man es vorher bis zur vollständigen Entfärbung mit MeOH/2N NaOH (1:1).

3. Bei den alkylierten Cobyrinaten, die aus saurer Lösung auf das XAD aufgetragen wurden,

wusch man zuerst mit 10 %iger Phosphorsäure, eventuell mit wenigen ml Methanol zur

vollständigen Benetzung, eluierte mit 100 ml Methanol und abschliessend mit ca. 200 ml H20.

4. Bei den basisch aufzutragenden alkylierten Cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-

(n-decyl-10'-carboxylat)en wusch man zuerst mit 100 ml Methanol, dann 100 ml

gesättigter, wässriger KHCO3 und abschliessend mit ca. 200 ml H20.

Regeneration Dowex

Zur Regeneration des Dowex 50 WX 2 wurden 150 ml Harz in Folge mit 800 ml 2 N NaOH,

1'000 ml H20, 700 ml HCl und 1'000 ml H20 gewaschen. Nach wiederholtem Gebrauch für die

Hydrolyse mussten zudem zur vollständigen Entfärbung des Harzes Substanzreste mit 100 ml

4 N NaOH gewaschen werden.

Synthese

Alkylierungen

Ausführung sämtlicher Alkylierungen, d.h. Methylierungen, Adenosylierungen und 1,N6-

Ethenoadenosylierungen, in einer Mecaplex Glove-box unter minimaler Kunstlichtbeleutung.

Der Sauerstoffgehalt wurde während der Alkylierung kontrolliert und überstieg in keinem Fall

30 ppm, bei elektrochemischer Reduktion nicht 3 ppm.

Die Aufarbeitung wurde ebenfalls unter stark reduzierten Lichtverhältnissen durchgeführt.

134

Kontrolle des Reaktionsverlaufes

Die Reaktionsverlauf wurde soweit nicht anders vermerkt mit DC, bei den Reduktionen der

Corrine zu Co(ll)-corrinen oder Co(l)-corrinen mit UV/vis-Spekroskopie verifiziert.

Flash ChromatographieZur Flash-Chromatographie wurde das Kieselgel nass und entgast im Laufmittel aufgezogen.Säulendimensionen und Methodik entsprechend [117].

DC-Chromatographie

Angegeben sind das verwendete Laufmittelgemisch und eventuelle Reagentien zur Detektion.

Kristallisation

Zur Kristallisation der Cobalamine löste man das Rohprodukt jeweils in H20 und tropfte

solange Aceton zu, in der Regel das 4-fache Volumen, bis sich die Lösung zu trüben begann. Bei

Kristallisation im Kühlschrank nutschte man nach den jeweils in den einzelnen Vorschriften

angegebenen Zeiten die Kristalle ab.

Analytik

Probenvorbereitung für NMR-Messungen

Man löste die zu analysierende Substanz zuerst in 0,7 ml deuteriertem Lösungsmittel, zog am

Rotationsverdampfer das Lösungsmittel ab, trocknete anschliessend am HV und löste zur

Messung erneut in 0,7 ml deuteriertem Lösungmittel. Wässrige Lösungen wurden entsprechend

lyophilisiert.

NMR-SpektroskopieDie angegebenen Zahlenwerte der J-Kopplungskonstanten sind bei Multipletten das Mittel der

Signaldifferenzen der jeweiligen Gruppe.Die Interpretation der Spektren der Cobalamine erfolgt auf der Basis der angebenen

Vergleichssubstanz indem die Differenzen der chemischen Verschiebungen möglichst minimiert

werden und die Multiplizitäten sowie Signalintensität, im Falle der 1 H-NMR-Spektroskopieauch die Signalform, mit der Zuordnung kompatibel sind.

Test auf Alkylierung eines Corrines

Die Alkylierungsansätze wurden erst nach befriedigendem Test auf quantitive Alkylierung

aufgearbeitet. Hierzu versetzte man eine mit Methanol verdünnte Probe der Reaktionslösung

(insgesamt 0,3 ml) mit ca. 0,05 ml methanolischer 1 %iger HCN-Lösung, schüttelte kurz und

heftig um und nahm umgehend das UV/vis-Spektrum auf.

Nicht alkylierte Co(ll)-Verbindungen gehen ausgenblicklich in die Dicyanoform über, deutlich

messbar an der Intensität des Maximums bei 578 nm in Falle der Cobyrinsäure und 581 nm

im Fall des Cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)es.

135

Mikroanalyse

Analysen mit jeweils ca. 0,5 bis 0,8 mg Probensubstanz. Eichsubstanz war Acetanilid.

Hydratwasser wurde in Schritten von 0,5 H20 pro Molekül berechnet bis beste Überein¬

stimmung der theoretischen mit den experimentellen Werten herrschte.

Von den jeweils doppelt gefahrenen Messreihen ist dasjenige Resultat, welches in seiner

Gesamtheit mit den theoretischen Werten besser übereinstimmt, erwähnt.

Handling

Fällungen

Die Mutterlauge wurde durch Zentrifugation vom Niederschlag abgetrennt, der Niederschlagnochmals mit Lösungsmittel aufgeschlämmt und zentrifugiert.

Rotationsverdampfer

Soweit in der Synthesevorschrift nicht explizit formuliert wurde am Wasserstrahlvakuum bei

Raumtemperatur (20 - 25 °C) das Lösungsmittel abgezogen.

Lagerung der Substanzen

Sämtliche Substanzen wurden im Dunkeln, die alkylierten Corrine unter vollständigem

Lichtausschluss, bei 5 °C gelagert. Lediglich die Dicyanocobyrinsäure und die Tosyladenosinewurden im Tiefkühler bei -20 °C aufbewahrt.

Datenauswertung

Bestimmung isobestischer Punkte

Die isobestischen Punkte wurden graphisch aus übereinander gezeichneten, auf DIN A 3-Grösse

vergrösserten Spektren bestimmt. Die Ablesegenauigkeit lag im Bereich ± 1 nm.

FehlerrechnungDie Fehlerrechung erfolgte gemäss Standardstatistikverfahren unter Verwendung der Her¬

stellerangaben betreffend apparativer Genauigkeiten (z.B. Waagengenauigkeit, Messzylinder,

UV-Küvette).

136

6.1.3 Qualität der verwendeten

Aceton (C3H60)

Acetonitril (CH3CN)

Aluminiumoxid (Al20s)

Anthrachinon (C14H8O3)

Argon (Ar)

Benzol (CöHe)

Benzylamin (C7H7NH2)

Blausäure (HCN)

11 -Bromundecansäure (Ci2H22Br02)tert.-Butanol (C4Hi00)Calciumchlorid (CaCI2)Celite

5'-Chloro-5'-deoxy-adenosin

(Ci0H12O3N5CI)

5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-ethenoadenosin

(C12H1203N5CI)

Chloroform (CHCI3)

Cobester (CMH73C0N6OH, 26)

Cobester-c-lacton (C53H69C0N6OH)

Cyanocobalamin

Cyclohexan (C6H12)

Cyclohexen (C6H10)

Deuteriumoxid (D20)

ien

a) Schalter ETHZ redest.

b) Fluka, puriss. p.a.

Fluka, puriss. p.a.

"Alumina Woelm B", bas. Aluminiumoxid,

Akt.l, Woelm Pharma, D-37269 Eschwege

Schalter ETHZ, purum

PanGas

Fluka, puriss. p.a

Fluka, puriss. p.a.

MeOH gesättigt mit HCN (10%ige Lösung),

für 500 ml MeOH wird HCN, aus 100 g in

300 ml H20 gelöstem NaCN und 110 ml konz.

H2S04, in eisgekühlte Methanolvorlage geleitet

Fluka, pract.

Schalter ETHZ, redest.

Schalter ETHZ

Schalter ETHZ

Sigma, 2x umkrist.

2x krist., 1H-NMR-rein (200 MHz), synthe¬

tisiert von Dr. Maria Ngu gemäss [97]

Fluka, puriss. p.a., stab. mit 1 % Ethanol,

über bas. Alox filtriert

Synthese gemäss [147], Reinigung durch Aus¬

schütteln mit MeCI2 und anschliess. Kiesei¬

gelsäule (Hexan/i-Propanol/1% HCN in MeOH,

5:2:1), 2x Kristallisation aus Toluol/Hexan,

gemäss1 H-NMR-Spektrum (200 MHz) >95%

2x krist., gemäss 1 H-NMR-Spektrum (200

MHz) >95% rein, von Ch. Bühler

siehe Vitamin Bi2,1

Fluka, purum

Fluka, puriss. p.a., stabilisiert mit 0,01 %

p-tert.-Butylkresol

a) ICN, >99,8 % D

b) Ciba-Geigy, ultrapuriss. 99,98 % D

c) ICN, 99,97 % D

137

Deuterochloroform (CDCI3)

Deuterodichlormethan (CD2Ci2)

Deuteromethanol (CD3OD)

1,4-Dibrombutan (C4HaBr2)

1,2-Dibromethylacetat (C4H5Br202)

Dicyano-cobyrinsäure-heptamethyl-

ester (C^HysCoNeOu, 26)

Diethylether (C4Hi0O)

Diisopropylether ((CH3)2)CH)20)

N,N'-Dimethyl-4-aminopyridin

(C7H12N2)

Dimethylformamid (C3H7NO)

Dimethylsulfoxid (C2H6SO)

Dioxan (C4H802)

Dowex 50 WX 2

Essigsäure (C2H402)

Essigsäureethylester (C4H802)

Ethanol (C2HeO)

Ether

Ethyltosylat

Ethin (C2H2)

Filterwatte

Heptan (C7H16)

Hexadecyltrimethylammoniumchlorid

([N(CH3)3(C16H33)]CI)Hexan (CeH14)

Hydroxycobalamin (C62H90CIC0N13O15P,

9)

5'-lodo-5'-desoxyadenosin (CioHi2N503l)

Kaliumbromid (KBr)

Kaliumcyanid (KCN)

d) Dr. Glaser AG, Basel, >99,95 %

Fluka, puriss. p.a., stabilisiert mit Ag, D >

99,98 %

Dr. Glaser AG, Basel

Ciba-Geigy, 99,98 % D

Fluka, purum

dest., 1H-NMR-rein, synthetisiert von Dr.

Maria Ngu, nach [97]

siehe Cobester

a) Schalter ETHZ, redest.

b) Fluka, puriss. p.a., über Na/Pb

c) Carlo Erba >99,8 %, stab. mit BHT

Fluka, puriss. p.a., stabilisiert mit 0,01%

Hydrochinon

Fluka, purum

Fluka, puriss. p.a.

dest. über Molekülarsieb 3 A

Fluka, puriss. p.a.

Fluka, p.a.

a) Merck, 100% p.a., Art. 63


Schalter ETHZ, dest.

Fluka, abs., Ph.Helv., puriss.p.a.

siehe Diethylether

siehe Toluol-4-sulfonsäure-ethyl-ester

PanGas

Hecht No. 1408/2

Fluka, puriss. p.a.

Fluka, 1x umkrist.



Fluka, als Hydrochlorid, >96 % HPLC, Bio-

chemika, < 12% Trockenverlust (20 °C,HV)

Sigma

Fluka, für die IR-Spektroskopie

a) Merck, zur Analyse, Art. 4967


138

Kaliumhydrogencarbonat (KHCO3)

Kaliumhydroxid (KOH)

Kaliumiodid (Kl)

Kieselgel 60

Kieselgel C-18 (RP-18)

Lithiumperchlorat (UCIO4)

Magnesiumsulfat (MgS04)

Methanol (CH3OH)

Methylenchlorid (CH2CI2)

Methyltosylat

Natriumborhydrid (NaBH4)

Natriumchlorid (NaCI)

Natriumcyanid (NaCI)

Natriumdihydrogenphosphat (NaH2P04)

Natriumdithionit (Na2S204)

Natriumdodecylsulfat ((CH2)12S04Na)

Natriumhydrogencarbonat (NaHC03)

di-Natriumhydrogenphosphat (Na2HP04)

Natriumhydroxid (NaOH)

Natriumperchlorat (NaCI04)Natriumsulfat (NaS04)Nitrobenzol (C6H5N02)

Palladium auf Kohle (Pd/C)

Perchlorsäure (HCI04)

Petrolether

Pivaloylchlorid ((CH3)3CCOCI)

Phosphorsäure (H3P04)

Platinoxid (Pt02)

a) Merck, p.a.

b) Fluka, microselect

Siegfried AG.CH-Zofingen, purum

Merck, p.a.

a) Fluka, für Flash-Chromatographie, Art.

60738

b) 20 x 20 cm Platten, Merck, Art. 5721,

ohne Fluoreszenzindikator

a) SEP-PAK Cartridge, Millipore, Waters

Associates, Part No. 51910

b) 10 x 20 cm Platten, Merck, Art. 5914,

für HPLC

Merck p.a., getrocknet

Schalter ETHZ

a) Schalter redest.

b) Fluka, puriss. p.a., abs. und acetonfrei


b) Fluka, puriss.p.a.siehe Toluol-4-sulfonsäure-methylester

Fluka, purum

Merck zur Analyse, Art. 6404

Schalter ETHZ

Fluka, purum p.a.

Fluka, purum

Fluka, puriss.

Merck, p.a.

Fluka, purum

Siegfried, PHVI

Fluka, purum p.a.

Schalter ETHZ

Fluka, puriss. p.a., stabilisiert mit 0,01 %

p-tert.Butylkresol

Engelhard, 10 % Pd on carbon catalyst, No.

4505

Merck p.a, etwa 60 %

Fluka, puriss. p.a., 50-70 °C

Fluka, purum

a)Merck, p.a., mind. 85 %

b)Fluka, puriss. p.a., crist.

a)Baker, 83,10 % Pt

139

Pressluft

Propanol (C3H8O)

Quecksilber (Hg)

RP-18

b)Engelhard, 92,33 % Pt

Hausleitung ETHZ

Fluka, purum

a) Merck, Art. 4403

b) Fluka, puriss.p.a. 99,9999 %

siehe Kieselgel C-18

Sauerstoff (02)

Schwefelsäure (H2S04)

SDS

Stickstoff (N2)

PanGas

Merck 95-97%, p.a., Art.731

siehe Natriumdodecylsulfat

PanGas

Tetrabutylammoniumhexafluorophosphat umkrist., Pingli Liu, rein gemäss 1 H-NMR

(NBu4PF6)

Tetrabutylammoniumperchlorat (NBu4CI04)umkrist., Pingli Liu, rein gemäss 1H-NMR

Tetrachlorkohlenstoff (CCI4)

Tetrahydrofuran (C4H80)

Toluol (C7H8)

Toluol-4-sulfonsäure-methylester

(C8H10SO3)

Toluol-4-sulfonsäure-ethylester

(C9H12S03)

5'-0-Tosyladenosin (C17H19O6N5S, 15)

Triethylamin (NEt3)

Trifluoressigsäure (CF3COOH)

Trifluoressigsäure-4-nitrophenylester

(C8H4N04F3)

Trimethyl-silyl-propansulfonsäure

(CsHie03S2)

Vitamin B12 (CesHasCoNHOuP, 1)

Fluka, puriss. p.a.

Fluka, puris. p.a., abs., stab. mit 0,025%

2,6-Di-tert.butyl-p-kresol, frisch dest.

über Natrium

Fluka, puriss. p.a.

Fluka, purum, 2x rekrist.

Fluka, pract., dest.

Sigma

Fluka, puriss. p.a., destilliert über CaH

Fluka, purum

Fluka, purum

Geigy

Roche, kristallin

Wasser (H20)

Wasserstoff (H2)

Watte

bidest., gereinigt mit Barnstaed NANOpur4.0, PanGas

Intern.Verbandstoffabrik, Schaffhausen, 75 %

Viscose/ 25% Baumwolle

XAD (Polystyrolharz) Serva, Heidelberg, reinst, Typ 2, 0,05-0,1 mm

140

6.1.4 Abkürzungen

Ado-Tos 5'-0-Tosyladenosin (15)

Berühr.pkt. Berührungspunkt

BHT 2,6-Di-tert.butyl-4-methylphenon

br. breit

bzgl. bezüglich

bzw. beziehungsweise

c Konzentration in M

13C-NMR 13C-KernspinresonanzCD Zirkular Dichroismus

d Dublett

DC Dünnschichtchromatogramm

dest. destilliert

AG freie Energie

Diss. Dissertation

DMF Dimethylformamid

DSS 4,4-Dimethyl-4-silyl-pentansulfonsäure-Natriumsalz

e Extinktionskoeffizient, in M"1cm_1

e 1,N6-Etheno-

EGW 60 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, Ethylenglykol, 1:1 (v/v)

El Electon ImpactEM Emission

Entkopp. Entkopplung

eV Elektronenvolt

EX Excitation

FAB-MS Fast Atom Bombardment Massenspektrometrie, positiv (+)

negativ (-)

Fe fraktionale Käfigeffizienz (nach Finke [36], Fc=kc/(kc+k

ges. gesättigt

Gly Glycerin

h Stunden

1H-NMR 1 H-Kernspinresonanz

HV Hochvakuum, 10"3 Torr

Hz Hertz

IR Infrarotspektroskopie

141

J Kernspinkopplungskonstanten

k Geschwindigkeitskonstante

m Multiple»m Masse

M Molarität, mol dm-3

MHz Megahertz

ml Milliliter

mw. Molmasse (molecular weight)

mol. Eilip. molare Elliptizität in grad mol nv1

MS Massenspektrogramm

3-NOBA 3-Nitrobenzylalkohol

0. oder

rf Retentionsfaktor der DünnschichtchromatographieRef. Referenz

rel. relativ

RP-18 reversed phase Kieselgel C-18

RT Raumtemperatur

s Singlett's' singloid

SDS Sodiumdodecylsulfatesh Schulter

t TriplettT TemperaturTBAP TetrabutylammoniumperchloratTEMPO 2,2,6,6-Tetramethyl-piperidinoxidTHF Tetrahydrofuran

u.a. unter anderem

undiff. undifferenziert

Upm Umdrehungen pro Minute

UV/Vis Ultraviolett-visible Photospektrometrie

vgl. vergleiche

vs. versus

z Elementarladung

142

6.2 Synthese des 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4)

CONH, 0H

H/IOC

HJIOC

1 uX

0 0- \)H

9

CONH,

CeüHggN^O^PCo

1 uX1 "

HO^I

o'V \H

4

C74HiooOi7Ni8CoP

In einer Glove-box wurden 110,7 mg (8,22-10-5 mol) Aquocobalaminchlorid (9) in 5 ml

einer 0,1 M Lösung von Tetrabutylammoniumperchlorat (TBAP) in Methanol gelöst, sodann in

einer Elektrolyseapparatur, vgl. [105], bei einem Potential von -0,6 V innert 2 Stunden

unter Braunfärbung zu Co(ll)-cobalamin und anschliessend bei -1,00 V unter Grünfärbung zu

Co(l)-cobalamin reduziert. Nach vier Stunden gab man 116,9 mg (3,58-10"4 mol, 4,4

Äquivalente) 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin, gelöst in 0,5 ml einer 0,1 M

methanolischen TBAP-Lösung, zu und entnahm nach weiteren sechs Stunden bei einem

Potential von -1,0 V (Stromverbrauch 2,3-10-4 Faraday, 2,8 Äquivalente) die Lösung der

Glove-box.

Aus der am Rotationsverdampfer auf ca. 2 ml eingeengten Reaktionslösung fiel mit 50 ml

Aceton rotes, gemäss DC mit Alkylierungsmittel verunreinigtes 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin(4) aus (insgesamt 120,3 mg), das nach nochmaliger Fällung mit 50 ml Aceton aus 5 ml H20ein DC-einheitliches Produkt ergab.Man trocknete den Niederschlag am Rotationsverdampfer, löste in möglichst wenig (ca. 10 ml)

H20 und engte dann wiederum am Rotationsverdampfer bei RT auf ca. 1 ml ein. Nach Zugabe von

Aceton bis zur beginnenden Trübung (ca. 2,5 ml) kristallisierten bei -20 °C innert zwei Ta¬

gen 99,5 mg (75%) 1 ,N6-Ethenoadenosincobalamin (4) aus.

Die am HV während vier Tagen getrockneten Kristalle gelangten zur Charakterisierung.

143

C74H1CXA7N1SCOP

mw. 1603,639

CAS-No. 54635-00-6

DC (Kieselgel C-18 (RP-18), 0,1 M Phosphatpuffer pH 7/ Methanol, 4:5)

rf= 0,72

UV/Vis (H20, c- 2,00- 10*M)

226

275

335

498

( 56'914), sh

22'700),

12'400), sh

7'000), sh

259

287

375

524

23'830),sh

19'400),sh4'200),

7'900)

265

310

438

(25'100),

(14'000),sh( 6'970),sh

UV/Vis (H2O+10% CF3COOH, C= 2,50- W5 M)

265

299

344

35'120),

21'320),sh

10'880),sh

273

313

378

( 31'080),sh

18'800),sh

7'600),sh

285

324

455

(26'920),

(16'440),sh( 8-600).

UV/Vis (CH3OH, c= 2,50-10-sM)

227

275

335

497

( 56'560),sh

23-520),

13'040),sh

7'120),sh

259

289

374

519

26'400),20-800), sh

10'560), sh

7'360).

265

300

442

(27'360),

(16'240), Sh

( 4-720), sh

UV/Vis (CH3OH+10% CF3COOH, c= 1,25-W5M)

264 ( 36'360), 273 ( 3V100),Sh 284

301 ( 22-100), 313 ( 19-300),Sh 325

377 ( 7'730), 455 ( 8'400)

(27'400),

(16'300),Sh

CD

Abb. 10

Allg. Teil

(H2O, c= 2,00-10-* M)

222

298

387

555

-23,30),

4,25),4,75),

-7,50),

239 (333 (429 (

17,50),1.75),

-2,75),

273 (360 (482 (

X0 bei 232, 257, 322, 340, 376, 406, 450, 520

4,25),

-7,75),

8,50),

144

©

Abbildung 58: CD-Spektrum von 1.N^-Ethenoadenosylcobalamin (4) in

Methanol, c= 1,2510-s M

(H^+10% CF3COOH, c= 2,50-10-5M)

262 (329 (431 (

-17,00),

23,60),

-10,20),

280 (377 (506 (

-5,20), Sh

-1,80),

-5,40),

305

400

572

5,40),sh

1.40),

4,00),

X0 bei 292, 364, 390, 406, 532

58

(CH3OH, c=1,25-10-s M)

224 ( -16,40), 239 ( 17,60), 263 ( -4,40),280 ( -4,00), 286 ( -2,40), Sh 300 ( 4,00),333 ( 4,40), 361 ( -7,60), 387 ( 2,40),429 ( -3,20), 482 ( 10.00J, 551 ( -7,60),

X0 bei 233, 253, 292, 344, 378, 400, 450, 516, 604

145

C D (CH3OH+10% CF3COOH, c= 2,2510-5 M)

263 ( -24,70), 280 ( -8,00), Sh 305 ( 7,56),sh329 ( 24,70), 377 ( -1,78), 400 ( 2,22),430 ( -7,56), 505 ( -5,78), 567 ( 4,22),

X0 bei 292, 361, 390, 409, 465, 534

(1,0 mg in 300 mg KBr)Abb. 59

3390 (s) 3190 (s) 2970 (m) 2940(m)1665 (s) 1645 (s) ,

sh 1620 (s) 1570(m)1540 (w) 1490 (m) 1465 (m), sh 1450(w)1400 (m), sh 1385 (m) 1350 (w) 1330(w)1300 (m) 1225 (m) 1155 (w) 1135(m)1095 (m) 1070 (m) 1045 (m), sh 1010 (w), sh

995 (w) 920 (w), sh 905 (w) 870 (w)845 (w) 815 (w) 730 (w), sh 700 (w)650 (m) 625 (m) 565 (m) 460 (w), sh

435 (w), sh

1 H-NMR (CD3OD, c= 9,36-103 M, 300,13 MHz)Abb. 13

Allg. Teil 9,13 ppm8,11

8,03

7,57

7,13

7,08

6,37

6,17

5,95

5,75

4,71

4,25-4,50

4,20

4,12

3,90-3,50

3,04

2,95

2,78

2,66

2,54

2,51

2,25

2,24

1,77

s, 1 H A-2 oder 8

s, 1 H A-8 oder 2

d, 1 H J = 1,6 Hz A-10 oder 11

d, 1 H J = 1,6 Hz A-10 oder 11

s, 1 H B7

s, 1 H B2

s, 1 H B4

d, 1 H J = 3,1 Hz R1

s, 1 H 10

d, 1 H J = 2,7 Hz A 1'

d+1:,1 H Jd= 4,3 Hz Jt=8,0 Hz R3

m, 5H Pr2,19,R2,A12

t, 1 H J = 3,7 Hz 3

m, 1 H R4

m, 4H R5, A13, Pr1

dd, 1 H Jl =14,0 Hz; J2=10,7 Hz 8

d, 1 H J = 9,1 Hz 13

m, 1 H 18

t, 1 H 181

s, 3H 51 oder 151

s, 3H 51 oder 151

s, 3H B51 oder B61

s, 3H B51 oder B61

s, 3H CH3

146

i ' ' ' i i ' ' ' i ' i i '—' i , i i i i i i i i i i i i i i i i , i i i i i

4000 3'500 3XX» 2500 2000 1800 1'600 1'400 1200 1000 800 600 400

cm-1

Abbildung 59: IR-Spektrum von 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4) in KBr (1

mg in 300 mg KBr)

o

H//OC

}CH, \.cr" f"1' ^CONH,

Hl «ÄCC0P0-%H (*)

HUL ,„VJ,.,,,, wUxhuÜp i.^iH.<Jj|„lllll,l|^ a>,.,mM300 400 500 600 700 000 900 1000 UOO 1200 1300 140015001600

u.on

.9.0B6

.1.0(6

7.0B6

.6.016

.5.016

.4.016

J.OS«

.2.0B6

L1.0B6

.0.010

noo M/Z

Abbildung 60: FAB(+)-MS-Spektrum von 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4),Matrix 3-NOBA

147

2,60-1,40 m, ca. 19 H

1,38 s, 3H

1,34 s, 3H

1,29 s, 3H

1,21 d, 3H

1,08 m, 1 H

0,68 s, 3H

0,55 m, 1 H

0,51 s, 3H

CH3

CH3CHi

J= 6,3 Hz Pr 3

A5'ß12B

A5'a

1A

zugeordnet analog [108]

1H-NMR (CD3OD+10% CF3COOD, c= 8,42-10'3 M, 300,13 MHz)

Abb. 14

Allg. Teil 9,42 ppm s, 1 H A-2 oder 8

9,31 s, 1 H A-8 oder 2

8,35 d, 1 H J« 2,1 Hz A-10 oder 11

8,33 s, 1 H B-2

7,99 d, 1 H J = 2,0 Hz A-10 oder 11

7,67 s, 1 H B 7 oder 4

7,58 s, 1 H B 7 oder 4

6,86 s, 1 H 10

6,52 d, 1 H J« 4,6 Hz R1

5,73 d, 1 H J* 1,8 Hz A-1-

4,91 m, 2H

4,78 d, 1 H J- 10,5 Hz 19

4,65 m, 1 H

4,43 m, 2 H J=ca.7,6 Hz

4,20 d, 1 H J = 7,0 Hz

3,90-3 ,70 m, 3H

3,40 m, 1 H

3,00 m, 1 H 1 8

2,71 m, 2H J=ca.5,5 Hz u.a 181

2,48 s, 3H 51 oder 151

2,43 s, 3H B51 oder B61

2,42 s, 3H B51 oder B61

2,40 s, 3H 51 oder 151

2,60-1 ,50 ca. 27 H (ohne bereits zugeordnete)

1,74 s, 3H CH3

1,61 s, 3H CH3

1,50-1 ,40 2 H (ohne bereits zugeordnete)

1,45 s, 3H CH3

1,38 s, 3H CH3

1,20 d, 3H J- 6,3 Hz Pr 3

0,95 s, 3H 12B

0,88 s, 3H 1A

0,33 t, 1 H J. 8,8 Hz A5'a


148

13C-NMR (D20, c= 1,86 1(r2 M, 100 MHz, breitbandentkoppelt und DEPT)

17,93 (qjc C-51 ) 18,49 q,1C C-151 ) 19,24 (q,1C C-17B )

19,50 (q>1c C-2A ) 21,21 q,1C C-7A ) 21,38 (q,1C Pr3 )

21,88 (q.ic B-61 ) 22,15 q,1C B-51 ) 23,15 (q,1C C-1A )

23,63 (q.ic C-12A ) 27,3 t,1C A-5' ) 28,35 (t,1C C-81 )

28,91 (t,1C C-31 ) 29,98 t,1C C-131 ) 33,94 (q,1C C-12B )

34,15 (t,1C C-171 ) 34,35(t ,30,181/82/172)37,73 (t,1C C32/132)

37,85 (t,1C C32/132) 42,24 d,1C C-18 ) 44,80 (t,1C C-71 )

45,91 (t,1C C-21 ) 47,36 t,1C Pr-1 ) 49,06 (s,2C C-2/12 )

51,55 (s,1C C-7 ) 52,76 q,1C MeOH ) 55,42 (d,1C C-13 )

56,97 (d,1C C-8 ) 58,01 d,1C C-3 ) 60,48 (s,1C C-17 )

62,94 (t,1C R-5 ) 71,65 d,1C R-2 ) 75,51 (d,1C A-2' )

75,77 (d,1C Pr2 ) 76,09 d,1C R 3 ) 76,23 (d,1C C19+ )

84,0 (d,1C A-3' + ) 84,07 d,1C R-4 ) 88,00 (d,1C A-4' )

88,39 (s,1C C-1 ) 88,96 d,1C R-1 ) 91,26 (d,1C A-1' )

97,51 (d,1C C-10 ) 106,6 s,1C C-15 ) 108,1 (s,1C C-5 )

113,1 (d,1C B-7 ) 115,6 d,1C,A-10/11) 121,0 (d,1C B-4 )

124,9 (s,1C A-5 ) 133,0 s,1C B-8 ) 134,0 (s,1C B-5 )

134,9 (d,1C A-10/11) 136,3 s,1C B-6 ) 140,0 (d,1C A-2 )

140,7 (s,1C A-4/6 ) 140,9 s,1C B-9 ) 143,1 (d,1C A-8 )

143,4 (s,1C A-4/6 ) 144,3 d,1C B-2 ) 166,1 (s,1C C-6 )

166,8 (s,1C C-14 ) 172,8 s,1C C-9 ) 177,3 (s,1C C-11/72)

177,3 (s,1C C-11/72) 177,8 s,1C C-173 ) 178,4 (s,1C C-4/16 )

178,4 (s,1C C-4/16) 178,7 s,1C C-182) 179,0 (s,1C C-22 )

179,9 (s,1C C-83 ) 180,7 s,1C, C133/33) 180,8 (s,1C C133/33)

interpretiert auf der Basis von [108], ^Zuordnung in Analogie zum 13C-NMR des

Ethylcobalamin (5)

MS

Abb. 60

(FAB(+), 3-NOBA, m/z 50-V700)

1606,8(11,1) 1605,7(33,3)

1603,6 (100,0, M+) 1602,5 (11,1)

1351.5 (55,6, [M-(eAdo)]+Na+)

1332,7(5,6) 1331,6(22,2)

1329.6 (83,3, [M-(eAdo)]+H+)

1327,6 (11,1) 1285,6 (5,6)

1125,5 (5,6)

1625,6 (5,6, M+Na+)

1604,6 (77,8, M+H+)

1601,6 (5,6)

1343,6 (5,6)

1330,6 (61,1)

1328,5 (16,7, M-(eAdo))

1183,5 (5,6, M-(Benzimid SeAdo))

1070,5 (5,6, M-(Benzimid&Ribose&eAdo)

989,5 (5,6, M-(Benzimid&Ribose&eAdo&Phosphat))972,5 (5,6) 971,5 (11,1) 859,4

813,4 (5,6) 803,0 (22,2, M+2H+) 802,4

801,4 (11,1) 665,2 (11,0, [M-(eAdo)]+2H+)

(5,6)

(22,2, M+2H+)

149

Überführung der Base-off in die Base-on-Form

Die Probenlösung für das 1 H-NMR-Spektrum in 10%igem CF3COOH in Methanol wurde durch

eine SepPack-Kartusche gespült, wobei das Cobalamin 4 als braunes Adsorbat haften blieb.

Nach Waschen mit zuerst 5 ml wässriger NaHC03 Lösung (unter Farbumschlag nach rot) und

20 ml H20, eluierte die base-on Form mit 5 ml Methanol. Man trocknete am Wasserstrahl. Aus

0,1 ml H20 und 3 ml Aceton kristallisierten bei -20 °C innerhalb 2 Tagen 80% (7,5 mg)dunkelrotes 1 ,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4)aus.Die am HV während drei Tagen getrockneten Kristalle wurden Spektroskopien.

1H-NMR (D20, C= 8,42-W3 M, 300,13 MHz)Abb. 11

Allg. Teil 8,96 ppm s, 1 H A-2

8,03 s, 1 H A-8

7,90 d, 1 H J = 1,6 Hz A-10 oder 11

7,50 d, 1.H J = 1,6 Hz A-10 oder 11

7,05 d, 1 H B7

6,85 s, 1 H B2

6,15 d, 1 H J = 3,0 Hz R1

6,12 s, 1 H B4

5,83 s, 1 H 1 0

5,57 d, 1 H J = 2,8 Hz A 1'

4,63 m, 1 H R3

4,48 m, 1 H A 12

4,26-4 ,12 m, 3H Pr2,C19,R2

4,00 m, 1 H C3, R4

3,80 d, 1 H J = 6,7 Hz R5' oder A 3'

3,78 d, 1 H J = 6,3 Hz R5' oder A 3'

3,64 dd, 1 H Ji = 3,6 Hz J2=3,8 Hz R5"

3,45 d, 1 H J = 13,7 Hz Pr 1-

3,16-3 ,01 m, 2H 8, Pr 1"

2,86 d, 1 H J = 10,1 Hz 13

2,70-2 ,20 ca. 18 H

2,36 s, 3H 51 oder 151

2,33 s, 3H 51 oder 151

2,20-1 ,80 ca. 9H

2,09 s, 3H 5 oder 15

2,08 s, 3H 5 oder 15

1,80-1 ,40 ca. 11 H

1,55 s, 3H CH3, 7A

1,30 s, 3H CH3,2Aoder 17B

1,27 s, 3H CH3,2Aoder 17B

1,22 s, 3H CH3,12A1,12 d, 3H J = 6,3 Hz CH3, Pr3

0,83 s, 3H CH3, 12B

0,75 m, 2H

0,54 t, 1 H J = 9,2 Hz A5'a

0,37 s, 3H CH3,1Azugeordnet analog [108]

150

1H-NMR (D20+10% CF3COOD, c= 7,58W3M, 300,13 MHz)Abb. 12

Allg. Teil 8,89 ppm S, 1 H A-2 oder 8

8,71 s, 1 H A-8 oder 2

7,84 d/s, 2H A-10/ oder 11

7,51 d, 1 H J = 2,2 Hz A-10 oder 11

7,06 s, 1 H B7 oder 4

7,03 s, 1 H B7 oder 4

6,41 s, 1 H C 10

6,04 d, 1 H J = 5,0 Hz R1

5,23 d, 1 H J = 1,7 Hz A 1-

4,49 t'oid,

1 H J = 4,5 Hz R2

4,41 m, 1 H R3

4,25 m, 2H 19 & R4

3,91 m, 1 H Pr 2

3,86 d, 1 H J = 5,5 Hz A2'

3,74 d, 1 H J = 9,5 Hz 3

3,42 m, 2H A 3' &. R 5

3,34-3 ,29 m, 1 H R5

3,20 m, 1 H 8

2,84-2 ,77 m, 2H Pr 1 & C13

2,39 m, 1 H 18

2,27 d'oid,2 H J = 5,4 Hz 60

2,20-1 ,50 ca. 24 H (ohne bereits zugeordnete)1,90 s, 3H 51 oder 151

1,86 s, 3H B51 oder B61

1,81 s, 3H B51 oder B61

1,79 s, 3H 51 oder 151

1,50-0 ,80 ca,.13 H (ohne bereits zugeordnete)

1,26 s, 3H CH3, 7A

1,10 s, 3H CH3,12A

0,95 s, 3H CH3

0,88 s, 3H CH3, 17B

0,70 d, 3H J = 6,3 Hz CH3, Pr 3

0,40 s, 3H CH3, 12B

0,35 d, 1 H A5'ß

0,29 s, 3H CH3,1A- 0,25 t, 1 H J = 8,9 Hz A5'a

zugeordnet analog [106, 107]

151

6.3 Orientierende Experimente zur Synthese anderer Organocob¬alamine

6.3.1 Methylcobalamin (2)

CONH, CN

HfiOC

HflOC

1 <£K1 H H0,

o'V \h

10

C63H88N14O14PC0

HflOC

HJiOC

1 <iX1 » «VI

ö'V \h

2

C63Ha,lN13014PCO

Bi2r (3) wurde aus 925,5 mg (6,83-10-4 mol) Vitamin Bi2 (10) durch katalytischeReduktion hergestellt [148] und mit 20 ml Aceton aus 3 ml Methanol quantitativ gefällt.

Die Synthese des Methylcobalamin (2) erfolgte via Umsetzung von elektrochemisch (2,16-10"3 Faraday, 3,16 Äquivalente) erzeugtem Co(l)-cobalamin mit Methyltosylat analog der

Synthese des Ethylcobalamins (5). Es wurden 367 mg (45%) kristallines Methylcobalaminerhalten.

Das UV/vis-Spektrum der Kristalle stimmt mit den Literaturwerten überein.

CraHcjiNisOMPCo

mw. 1344,413

CAS-No. 13422-55-4

152

1 H-NMR (D20. c-1.06-10'2 M, 300,13 MHz)

7,18 s, 1H B-7

6,99 S, 1H B-2

6,30 S, 1H B-4

6,26 d, 1H J= 3,20 Hz R-1

5,94 s, 1H C-10i

unter HDO R3

4,33 q. 1H J= 2,30 Hz Pr2

4,24 t, 1H J- 3,85 Hz R2

4,06 m, 2H R4, (D-19

3,98 d, 1H J= 9,98 Hz C-3

3,89 m, 1H R5'

3,74 m, 1H J,=12,60Hz J2==3,83Hz R5"

3,55 d, 1H J=14,00 Hz Pr1"

3,35 m, 1H C-8

3,08 m, 2H C-13,,PrV

2,80-1 ,60 ingesamt 33 H

2,49 s, 3H CH3 C-51 oder 151

2,46 s, 3H CHs C-51 oder 151

2,23 s, 3H CH3 B51 oder 61

2,22 s, 3H CH3 B51 oder 61

1,78 s, 3H CH3 C-7A

1,50-0 ,80 insgesamt 16 H

1,41 s, 3H CH3 C2A/17B/12A

1,36 s, 3H CH3 C2A/17B/12A

1,33 s, 3H CH3 C2A/17B/12A

1,21 d, 3H J= 6,18 Hz CH3 Pr3

0,97 s, 3H CH3 C-12B

0,48 s, 3H CH3 C-1A

0,02 s, 3H CH3 Mfi-Co

Zugeordnet auf Basis von [118]

13C-NMR (020, c=1,21-10'2 M, 75 MHz, breitbandentkoppelt und DEPT)

17,99 (q,1C,51/151) 18,19 (q,1C,C51/151) 19,21 (q,1C C-17B )

19,33 (q1C C-2A ) 21 ,34 (q,2C, 7A,Pr3) 21,84 (q,1C B51.B61)

22,15 (q,1C B51.61) 22,47 (q,1C C-1A ) 22,79 (q,1C C-12A )

28,35 (t,1C C-81 ) 28,61 (t,1C C-31 ) 30,18 (HC, C-131 )

34,25 (t,1C C-171) 34,45 (t,3C C-181,82,172)

34,82 (q,1C C-12B) 37,44 (t,1C,C32/132) 37,67 (t,1C C-32/132)

41,62 (d,1C C-18 ) 45,35 (t,1C,C-71/21) 45,75 (t,1C C-71/21)

47,37 (t,1C Pr-1 ) 48,85 (s,2C,C-2,7,12) 49,06 (s,1C C-2,7,12)

52,76 (q,1C C0-CH3) 55,63 (d,1C C-13 ) 56,67 (d,1C C-8, 3 )

57,72 (d,1C C-8,3 ) 60,34 (s,1C C-17 ) 62,89 (t,1C R-5 )

71,47 (d,1C R-2 ) 75,42 (d,1C Pr-2 ) 75,63 (d,1C R-3 )

76,25 (d,1C C-19 ) 84,06 (d,1C R-4 ) 87,59 (s,1C C-1 )

88,89 (d,1C R-1 ) 96,46 (d,1C C-10 ) 105,94 (s, 1C C-15)

107,68 (s, 1CC-5) 113,03 (d, 1CB-7) 120,76 (d, 1C B-4)

132,95 (s, 1CB-8) 134,06 (s, 1CB-5) 136,28 (s, 1C B-6)

153

140,62 (s, 1CB-9) 144,38 (s, 1CB-2) 165,61 (s, 1CC-6/14)

166,02(s,1C, C6/14) 172,14 (s, 1CC-9) 175,87(s,1C,11,72,173)

177,39(S,2C,11,72,173)177,71(s,1C C-14,16) 177,85 (s, 1CC14.16)

178,68(s,1C,C182,22) 178,82(s,1C C182.22) 179,89 (s, 1C C-83)

180,59(s,1C,133/33) 180,75(s,1C C-133/33)

Zugeordnet auf der Basis von [108]

MS (FAB(+), 3-NOBA, m/z 38-1'420)

1351.49 (17,1, [M-CH3]+Na+) 1345,52 (31,6)

1344,52 (42,1, M+H+) 1343,51 (19,2, M+) 1336,49 (19,9)

1335.50 (26,6) 1331,52 (35,7) 1330,52 (72,4)

1329.51 (100,0,[M-CH3]+H+) 1328,49 (25,9)

1327,49 (25,6) 1314 (20,2") 1270 (13,5*)

1183 (16,8*,[M-(Benzimid &Me)])

1069 (23,6*, [M-(Benzimidazol&Ribose&Me)])1051 (13,4*) 989(26,9*, [M-(Benzimidazol&Ribose&Me&Phosphat)])

971,73 (22,2) 943 (10,1*) 931 (10,0*)

914 (10,0*) 898 (10,0*) 884 (10,0*)

870 (10,0*) 859 (10,0*) 841 (6,7*)

801 (26,9*)*

graphisch aus Spektrum bestimmt

6.3.2 Orientierendes Experiment zur Herstellung von Ethyl-cobalamin (5)

CONH, HJIOC

/> CH, f-CONH, J Hfi

w,.-**tr "

CONH,

1 vC

O' "o- \)o

3 5

C62H88N13O14PC0 C64H93N13O14PC0

154

Zusammen mit 350 mg (2,55-10-4 mol) B12r(krist.) (3) [148] wurden in einer Glove-box

(02< 6 ppm) 0,587 g (2,93-103 mol, 11,5 Äquivalente) Ethyltosylat in 7 ml 0,1 M UCIO4in einem 1:1 Gemisch Wasser/Methanol gelöst und in einer Apparatur gemäss [105] bei einem

Potential von -1,0 V elektrolysiert bis der Stromfluss auf weniger als 5% des Ausgangs¬wertes gefallen war (2,70-10-4 Faraday, 1,37 Äquivalente).Die Elektrolyseapparatur wurde nach UV/vis-spektroskopischer Kontrolle der Glove-box

entnommen, die nun rote Lösung abpipettiert, direkt mit 50 ml Aceton gefällt, noch zweimal

mit Aceton gewaschen und anschliessend getrocknet.

Der Niederschlag wurde in 2 ml Methanol gelöst, 20 ml Aceton zugegeben und lichtgeschütztbei 5 °C innerhalb von fünf Tagen 271,5 mg ockerfarbene Kristalle erhalten. Dieses

Kristallisat enthielt gemäss1 H-NMR-Spektrum noch 0,5 Äquivalente Ethyltosylat.

Nach einer zweiten, analog durchgeführten zwölfstündigen Kristallisation und Trocknung am

HV während 24 Stunden wurde das Produkt 5 (Ausbeute 101,1 mg, 29%) charakterisiert.

C64H93N130i4PC0

mw. 1358,440

CAS-No. 13422-56-5

UV/Vis (H20, C= 3,30-10-5 M)

266

313

447

( 17'400),

( 12'900),

( 3'820), sh

279

345

509

15'400)sh,

1V270) ,

7'920)

290

375

(14 900),

( 7'970), sh

CD (H20, c= 3,30-10-s M)

(231

288 (359 (501 (

1,89) ,256 (

3,18) ,sh 297 (

5,30) ,387 (

8,79) ,558 (

-9,24),

5,23),

5,61),

-3,86),

276 (328 (434 (

2,58),

-2,50),

-5,76),

X.o bei 225, 237, 269, 314, 374, 404, 459, 535

IR (2,0 mg in 300 mg KBr)

3360 (s) 3190 (s) ,2970 (m) 2940(m)

2870 (m)sh 2750 (w)sh 2550 (w)sh 2450(w)2410 (w)sh 2080 (w)sh 1660 (s) 1620 (s) sh',1565 (s) 1535 (m) ,

1490 (s) 1475 (S) sh,

1450 (m)sh 1390 (m) ,1350 (m) 1295(m)

1230 (s) 1210 (s) sh 1155 (m) 1135(m) sh',1105 (m) 1070(m) ,

1045 (m)sh 1020(m)

995 (m) 920 (w) ,900 (w) 865 (w)

845 (w) 810 (w) ,560 (m)

155

1H-NMR (D20, c= 2.1-102 M, 300,13 MHz)

7,17 S, 1H

7,03 S, 1H

6,28 S, 1H

6,24 d, 1H J= 3,1 Hz

6,07 s, 1H

4,45 m, 1H

4,35 m, 1H

4,26 t'oid,1H J= 1,8 Hz

4,14 m, 2H

4,05 d, 1H J= 8,6 Hz

3,90 m, 1H

3,75 m, 1H

3,53 d, 1H J= 14,0 Hz

3,39 m, 1H

3,19 m, 1H

3,16 m, 1H

2,80- 2,30 insgesamt ca. 22.5H

2,50 s, 3H

2,48 s, 3H

2,30- 1,60 insgesamt ca.24,5H

2,23 6H

2,21 12H

1,79 s, 3H

1,60-10,80 insgesamt <ca. 23H

1,46 s, 3H

1,39 s, 6H

1,20 d, 3H J= 6,3 Hz

1,08 s, 3H

0,90 d, br. 1H Ji= 3,9 Hz

0,62 t, 1H J= 3,9 Hz

0,52 s, 3H

-0,57 t, 3H J= 7,6 Hz

B-7*

B-2*

B-4*

R-1*

C-10*

R-3

Pr-2

R-2

R-4/C-19

C-3

R-5'

R-5"

Pr 1-

C-8

C-13

Pr-1"

C-51*

C-151*

B51/61*

C-7A*

C-12A*

C-17B/2A*

Pr-3*

C-12B*

Co-CH2 a*

Co-CH2 ß*C-1A*

CoCH2CHa*

[149 a]; Zuordnung der restlichen Signale analog [108]

1H-NMR (CD3OD, c= 5.89-10-3 M, 300,13 MHz)

7,14 S, 1H

7,13 S, 1H

6,39 s, 1H

6,18 d, 1H J- 3,2 Hz

6,12 s, 1H

4,69 m, 1H

4,36 q. 1H J= 7,5 Hz

4,30 d, 1H J= 8,9 Hz

4,22 t, 1H J = 3,8 Hz

4,16 m, 2H

3,88 dd, 1H Jt-3,0 Hz

B2/7

B2/7

B4

R1

C-10

R3

Pr2

C-19

R2

R4/C3

R5'

156

3,76 dd, 1H J= 4,4 Hz R5"

3,70 m, 2H C-8

3,59 d, 1H J=13,5Hz PrV

3,28 m, 1H (teilweise unter MeOH) C-13

3,05 m, 1H Pr1"

2,82 m, 1H C-18

2,63 m, 2H C-181

2,60-1,60 insgesamt ca. 38H

2,55 s, 3H C-51

2,53 s, 3H C-151

2,26 s, 3H B-51/61

2,25 S, 3H B-51/61

1,82 s, 3H C-7A

1,60-1,30 insgesamt ca. 19H

1,50 s, 3H C-12A

1,39 s, 3H C-2A/17B

1,30-1,00 insgesamt 8H1,38 s, 3H C-2A/17B

1,22 d, 3H J=6,3 Hz Pr3

1,10 S, 3H C-12A

0,73 t, 1H J=7,4 Hz Co-CHja0,55 S, 3H C-1A

-0,53 t, 3H J=7,6 Hz Co-CH2CJdaZuordnung der Signale analog Spektrum in D20

13C-NMR (D20, c= 4.03-10-2 M, 75 MHz, breitbandentkoppelt & dept)

18.01 (q,2C C51.151) 19,20 (q,1C C-17B ) 19,83 (q, 1C C-2A

21,11 (q,1C C7A,Pr3) 21,63 (q,1C C7A,Pr3) 22,14 (q, 2C B51.61

22,30 (q,1C C-1A ) 24,63 (q,1C C-12A ) 28,52 (t, 1C C-81

28,68 (t,1C C-31 ) 29,42 (t,1C C-131 ) 33,94 (t, 1C C-171

34.02 (q,1C C-12B ) 34,63 (t,2C,181,82,172)34,94 (t, 1C 181,82,172)

36,06 (t,1C 32,132) 37,68 (t,1C 0-32,132)41,87 (d, 1C C-18

45,42 (t,1C C71.21 ) 45,73 (t,1C C-71,21) 47,10 (t, 1C Pr-1

48,58 (s,1C C-2, 12) 49,10 (s,1C C-2,12 ) 51,45 (s, 1C C-7

52,41 (q.1C.CoCH?CHa> 55,33 (d,1C C-13 ) 57,43 (d, 1C C-8,3

57,85 (d,1C C-8, 3 ) 60,77 (s,1C C-17 ) 63,28 (t, 1C R-5

72,77 (d',1C,CoCÜ2CH3) 72,85 (d,1C R-2 ) 75,10 (d, 1C Pr2

76,52 (d,1C,R-3/C19) 77,14 (d,1C R-3/C19) 86,28 (d, 1C R-4

88,34 (s,1C C-1 ) 89,19 (d,1C R-1 ) 98,04 (d, IC C-10

107,79(s,1C, C-15 ) 109,17 (s, 1C C-5) 114,10 (d, 1C B-7

127,90(d,1C B-4 ) 131,97 (s, 1C B-8) 132,40 (s, 1C B-5,6,9

136,48(s,1C B-5,6,9) 137,56 (s, 1C,B5,6,9)142,63 (I, 1C B-2

165,62(s,1C C-6,14 ) 165,90 (s, 1C,C6,14) 172,86 (s, 1C C-9

176,78(s,1C,11,72,173)177,68(s,2C,C11,72,173)177,84 (s, 1C C-14,16

178,01(s,1C,C-14,16) 178,73 (s, 2C,182,22)180,18 (s, 1C C-83

180,57(s,1C,C-133,33) 180,71 (s, 1C,133,33)

zugeordnet analog [108], i. Multiplizität inkompatibel mit Zuordnung, ?. Zuordung ten-

tativ

157

MS (FAB(+), 3-NOBA, m/z 50-V400)

1359 (7,6*, M+H+) 1332,72

1330.70 (100,0, M-Et) 1329,69

1327.71 (12,8

1184 (5,0*;

1069 (7,5*,1051 (7,5*

972,80 (14,9]

(36,0 ) 1331,72 (69,0)

(72,8 ) 1328,70 (20,7)

) 1312 (10,0*,-CONH2)1271 (5,0*)

M-(Ethyl&Dimethylbenzimid) )

M-(Et&Benzimid&Ribose )) 1052 (10,0*)

989,5 (10,0, M-(Benzimid &Ribose&Et&Phosphat))802 (10,0)

Intensität graphisch bestimmt

6.3.3 Vinylcobalamin (23)

HJtOC

HJtOC

CONH, CJV

1 X HO I

o"o

1 %xx1 X H0 l

o'' \V„

0 0-^OH

10

C63H88N14OHPC0

23

C64H9lN13014PC0

Cyanocobalamin (10), 1,088 g (8,03-104 mol), wurde in 14 ml Wasser/Methanol, 1:1,

gelöst, in einer Glove-box mit 22,2 mg (9,78-105 mol) Platindioxid, 120 ul Essigsäurewährend drei Stunden zu Co(ll)-cobalamin (3) (UV/vis-spektroskopische Kontrolle)reduziert, anschliessend die Lösung durch Watte filtriert und am HV getrocknet.Man beschickte eine Elektrolyseapparatur [105] in der Glove-box mit dem in 5 ml 0,1 M

LiCI04, H20/MeOH, 1:1, gelösten Co(ll)-cobalamin (3), und führte nach Entnahme der bis auf

einen definierten Auslass gasdichten Apparatur aus der Box die Elektrolyse bei -1,0 V in einem

schwachen Ethinstrom durch.

158

Nachdem der Stromfluss auf weniger als 5 % des Ausgangswertes gefallen war (2,02-10"3Faraday, 2,51 Äquivalente e~), pipettierte man die Lösung ab, entfernte das Methanol am

Rotationsverdampfer und versetzte den mit 10 ml Wasser aufgenommenen Rückstand bis zur

beginnenden Trübung mit ca. 80 ml Aceton. Nach vier Tagen bei Raumtemperatur bildeten sich

0,914 g (84 %) dunkelrote Kristalle, die noch mit Aceton gewaschen und vor der

Charakterisierung vier Tage am HV getrocknet wurden.

C64H91N13O14PC0

mw. 1356,424

CAS Nr. 15053-74-4

UV/Vis (H20, c=2,50-10-5 M)

272 ( 15-200),371 ( 10'440),

288 ( 12'960),475 ( 4 -300),

Sh

Sh

337 ( 10'920)521 ( 7'040)

CD (H20, c=2,50-10-5 M)

230

287

331

402

1,50),

1,30),0,40),

3,80), sh

257 (296 (356 (467 (

-10,50),

3,10),-8,90),

8,10),

278

320

388

551

-0,70),

-2,00),

4,70),

-4,10),

Sh

X0 bei 221, 240, 282, 312, 328, 334, 376, 520, 605


3350 (s), 3190 (s), 2970 (m), 2940(m),2880 (m), sh 2760 (w) sh 2160 (w), br 1665(s),1615 (s), 1570 (s), 1545 (m), sh 1495(s),1485 (m), sh 1450(m) 1400 (s), 1365(m),1350 (m), 1310(m) 1295 (m), sh 1260{m),1220 (m), 1155(m) 1120 (m), 1110(m),1085 (m), 1070(m) sh 1045 (m), sh 1000(m),975 (w), 950 (w) sh 870 (w), 850 (w),810 (w), 625 (m) 585 (m), 565 (m).

sh

1H-NMR (D20, c= 1,05-10-2M, 300,13 MHz)

7,20 s, 1 H B7

7,10 s, 1 H B4

6,39 s, 1 H C-10

6,28 d, 1 H J= 3,08 Hz R1

159

5,93 s, 1 H

5,65 m, 1 H J1=6,0 Hz, J2= 14,6 Hz H^CCH

4,33 m, 1 H

4,25 t'oid,1 H J=ca.3,7 Hz

4.19 d'oid,1 H J=ca.4,0Hz HfrHciSCCH

4,08 m, 3H

3,92 m, 1 H

3,75 m, 1 H

3,59 d+d, 2H HtrHcfeCCH3.33 m, 1 H

3.20 d, 1 H J= 8,73 Hz

3,05 m, 1H Pr-1'

2,61 's',14H

2,54 s, 3H C-51/151

2,52 s, 3H C-51/151

2,70-2,38 m, insgesamt ca. 20H

2,24 s, 6H B-51/61

1,81 s, 3H CH3


1,42 s, 3H CH3

1.34 s, 3H CH31,29 s, 3H CH3

1,22 d, 3H Pr3

1,03 s, 3H C-12B

1,18-0,80 m, insgesamt 6 H

0,47 s, 3H C-1A

Zuordnung der restlichen Signale analog [108, 149 a]

Entkopplungsexperimente

eingestrahlt Beobachtung

5,68 ppm d (4,21) zu S

d (Signale 3,59 & 3,64) zu s

13C-NMR (D20, c=1,05-10-2 M, 75 MHz, breitbandentkoppelt und DEPT)

17,87 (q,1C C-51 ) 18,06 (q,1C C-151 ) 18,68 (q. 1C C-17B )

19,29 (q,1C C-2A ) 21,30 (q,1C C-7A ) 21,81 (q, 2C Pr3, B61 )

22,20 (q,1C B-51 ) 22,30 (q,1C C-1A ) 22,77 (q, 1C C-12A )

28,57 (t,2C C81.31 ) 30,58 (t,1C C-131 ) 33,57 (q, 1C C-12B )

34,37 (t,3C,82,171,172,181) 34,61 (t, C 82,171,172,181

37,39 (t,1C C32/132) 37,68 (t,1C C32/132) 41,47 (d, 1C C-18 )

45,13 (t,1C C-71 ) 45,52 (t,1C C-21 ) 47,41 (t, 1C Pr-1 )

48,90 (s,1C C-2,12 ) 49,33 (s,1C C-2,12 ) 52,65 (s, 1C C-7 )

55,78 (d,1C C-13 ) 57,30 (d,1C C-8 ) 58,12 (d, 1C C-3 )

60,53 (s,1C C-17 ) 62,82 (t,1C R-5 ) 75,39 (d, 1C R-2/Pr2 )

75,56 (d,1C R2/Pr2) 76,64 (d,1C C-19 ) 83,96 (d, 1C R-4 )

84,08 (t,1C CoCHCJd2) 87,60 (s,1C C-1 ) 89,02 (d, 1C R-1 )

96,60 (d,1C C-10 ) 106,27(s,1C, C-15 ) 108,24 (s, 1C C-5 )

113,07 (d, 1C B-7) 120,87(!1C, B-4 ) 122,88 (I, 1C CoCüChfc )

160

132,85 (s, 1C B-8) 134,18(s,1C, B-5 136,38 (s, 1C B-6 )

140,48 (s, 1C B-9) 144,64(I1C B-2 165,75 (s, 1C C-6 )

166,22 (s, 1CC-14) 172,91(s,1C, C-9 176,51 (s, 1C C-11/72 )

177,23 (s, 1CC11/72)177,73(s,1C, C-173 177,90 (s, 1C C-4/16 )

178,09 (s, 1CC4/16) 178,73(s,1C, C-182 178,91 (s, 1C C-22 )

179,95 (s, 1CC-83) 180,63(s,1C,133/33 180,86 (s, 1C C-133/33)

zugeordnet analog zu [107], '

Zuordnung

experimentell bestimmte Multiplizität inkompatibel mit

MS (FAB(+), 3-NOBA, m/z 38 -V400)

1394,75

1362,82

1336,83

1255,78

1096,78

1002,73

989,76

971,78

888,68

868,66

829,71

681,53

655,45

(4,2*

(66,

02,

(4,2

(4,2,

(4,2

(4,2,

(4,2

(4,2

(4,2

(4,2

(4,2

(4,2

M+K+) 1378,73

1357,85

1335,77

1254,85

(8,3,M+Na+)

(70,8)

(12.5)

(4,2)

1363,83

1356,81

1329,78

1151,74

1015,80M-(Vinyl&Benzimidazol&Ribose))

) 998,82 (4,2)

M-(Vmyl&Benzimidazol&Ribose&Phosphat))

) 912,64 (4,2) 910,62

) 886,67 (8,1) 871,61

) 858,63 (4,2) 842,69

) 770,57 (4,2) 697,50

) 678,53 (4,2) 669,47

) 626,44 (4,2) 596,41

(41,6)

(100,0, M+H+)

(16,7,M-Vinyl)

(4,2)

(4,2)

(4,2)

(4,2)

(4,2)

(4,2)

(4,2)

(4,2)

161

6.3.4 Dicyanocobalamin (11)

HJ40C

hjoc

n H ho^j

O o. \»

CONH,

CONHj CN

HiNOC

10

C63H88N14O14PC0

1 1

C64H88N15014PC0K

5,5 mg (4,6-10'6 mol) Cyanocobalamin (10) und 0,5 mg KCN0"3'- (7,68-1 Qe mol) wurden

in 0,7 ml Deuteriumoxid gelöst und nach Ereichen des Endpunktes der Farbvertiefung

(UV/vis-Kontrolle) die Lösung UV/vis- und 1H-NMR-spektroskopisch charakterisiert.

C64H88N15014PC0K

mw. 1420,512

UV/Vis (H20, c= 1,16.10-4M, 1,95-W4 M KCN, dx= 0,100 cm)Abb. 15

Allg. Teil 578 ( 9500), 541 ( 9320), 501

418 ( 2820), 366 ( 31400), 306

285 ( 16700), 277 ( 16850).

( 6070),

( 11030),

1H-NMR (D20, c= 6,56.10-3M, 1.10-10-3 M KCN, 300,13 MHz)Abb. 61

8,26 ppm S, 1 H

7,43 S, 1 H

7,31 S, 1 H

6,27 d, 1 H J= 4,31 Hz

5,79 s, 1 H

4,60 t, 1 H J= 4,51 Hz

162

4,47

4,27

3,80

3,64

3,59

3,29

3,17

3,12

2,70

2,65-2,35

2,35-2,10

2,25

2,24

2,14

2,30-1,80

1,80-1,50

1,60

1,32

1,30

1,25

1,18

1,12

1,08

m,

m,

qd,d,

d,

m,

d,

m,

m,

1 H

1 H

2H

1 H

1 H

2H

1 H

1 H

1 H

insgesamt 5 H

insgesamt 21 H

s, 3H

s, 3H

s, 6H

ca. 6H

insgesamt 7 H

s, 3H

3H

3H

3H

3H

3H

3H

J= 2,5 Hz

J= 7,34 Hz

J=10,36 Hz

J= 6,46 Hz

J=15,3 Hz

CH3CH3CH3

CH3Pr3

CH3CH3

CONH, CN

J HjC* f-CONH,

ppm 8

Abbildung 61: 1 H-NMR-Spektrum von Dicyanocobalamin (11) in Deuteriumoxid, 10

mM KCN, c= 6,56.10"3 M, 300,13 MHz

163


6.4.1 Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat24 (24)

COOK

VYHjCOOC COOCH,

_». KOOC

CH, /-COOK

COOK

VYCOOK COOK

26

C54H730HN6CO

24

C47H52014N6CoK7

Man löste unter Rühren bei Raumtemperatur 1,800 g Cobester (26) (1.65-10'3mol) in 20 ml Methylenchlorid und gab 0,7 ml Trifluoressigsäure (9,16-10"3 mol)zu. Sobald der Farbumschlag von violett nach hellrot stattgefunden hatte, d.h. nach ca.

15 Minuten, wurde am Rotationsverdampfer und Hausvakuum das Lösungsmittelabgezogen.

Der Rückstand wurde anschliessend in 30 ml Essigsäure gelöst. Die gelöste Substanz

adsorbierte beim ersten Durchströmen durch 400 ml Dowex 50 WX 2 quantitativ. Man

wusch nun das Dowexharz mit 500 ml H20, suspendierte es in weiteren 700 ml H20und hielt die entgaste und unter Argon gesetzte Suspension vier Stunden lichtgeschütztbei einer Ölbadtemperatur von 70 °C.

Nach Abkühlen der Reaktionsmischung auf Raumtemperatur wurde die Lösung vom

Harz abfiltriert, mit 500 ml H20 gewaschen und in 700 ml H20 suspendiert. Sodann

wurde das Reaktionsgemisch gründlichst entgast und wiederum unter Argon gesetzt.Nach 21 Stunden heftigem Rühren unter Lichtausschluss bei einer Ölbadtemperaturvon 70 °C war die Reaktion gemäss DC beendet.

Auf das von der erkalteten Lösung abfiltrierte Harz wurde festes KHCO3 gegeben bis

weitere Zugabe nicht mehr von Schaumbildung begleitet war. Das Cobyrinat 24 wurde

24 Vorschrift nach R. Stepanek [91] mit veränderter Aufarbeitung

164

dann mit 400 ml ges. KHC03-Lösung, 0,1 g KCN pro Liter enthaltend, praktischquantitativ eluiert25.

Dieses Eluat wurde zur Entsalzung auf 100 ml XAD aufgezogen indem man die

Suspension von XAD in dieser wässrigen Lösung solange vorsichtig mit conc. H3P04versetzte bis die Lösung völlig entfärbt war26. Das XAD wurde vor Elution der

Substanz auf einer Glasfilternutsche (Porengrösse 3) mit ca. 200 ml H2Ö nun solangegewaschen, bis das Cobyrinat begann, sich vom Trägerharz abzulösen und dann die

Cobyrinsäure mit 300 ml Methanol, 1% HCN/ Aceton, 1:1, eluiert27.

Man engte die Lösung am Rotationsverdampfer bei RT bis auf ca. 1 ml ein (hellroteLösung), versetzte mit 2,2 ml einer 5 M wässrigen KCN-Lösung und lyophilisierteden Rückstand am HV. Das derart isolierte Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat(24) wurde in 15 ml 1% HCN/Methanol gelöst und fiel im Kühlschrank (T= 0 °C, 24

Stunden) bei Zugabe von 300 ml Ether praktisch quantitativ aus. Die farblose

Mutterlauge wurde abpipettiert, das Präzipitat nochmals mit Ether gewaschen und der

pulvrige Niederschlag zuerst im Stickstoffstrom, dann während 24 Stunden am

Hochvakuum getrocknet.Es resultierten 2,050 g (99%, 1,63 mM) violettes, schwach hygroskopischesPulver, welches charakterisiert wurde.

Lagerung des so erhaltenen Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) unter

Stickstoff und bei Lichtausschluss bei einer Temperatur von 5 °C führte gemäss 1H-

NMR-Spektrum in Deuteromethanol nach einem Jahr zu keiner beobachtbaren

Veränderung der Substanz.

mw. 1257,592

C47H52Oi4N6CoK7

DC (Kieselgel 60, i-Propanol/H20/1% HCN in MeOH/Et3N, 70:40:10:1)

rf= 0,20

(RP-18, 1% HCN in MeOH/H20, 10:1)

rf= 0,44

UV/Vis (H20, c= 4.51-10-5 M, 0,16 g KCN h1)Abb. 16

Allg. Teil 210 ( 5V620), 221 ( 47'100), 276 (10'320)302 ( 9-790), 311 ( 9'790), 348 (15'350)365 ( 31-500), 469 ( 3'180), 504 ( 6'090)535 ( 8-760), 576 ( 9'790).

sh

25 Farbwechsel von hellrot zu violett

26 Farbwechsel von violett zu hellrot

27 Farbwechsel von hellrot zu violett

165

t i

Abbildung 62: CD-Spektrum von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) in

Wasser, c=4,51-10"5 M, dx= 0,100 cm, 0,16 g KCN I"1

CD

Abb. 62

(H20, c= 4,51-10-5 M, 0,16 g KCN r1)

212 ( 7,76), 226 ( 7,76), 241 ( -5,99)249 ( -11,10), 274 ( 1,33), 285 ( 1,11)305 ( -11,10), 321 ( -6,87), 346 ( -10,90)366 ( -42,10), 395 ( 18,40), 424 ( 12,40),484 ( -1,70), 512 ( -3,33), 534 ( -4,66),574 ( -4,66),

X0 bei 236, 263, 289, 372, 464

(1,2 mg in 300 mg KBr)

3420 (s) 3250 (m) sh 2960 (m) 2930(m) sh

2500 (w), br 2140 (w) sh 2120 (w) 1770(w) ,sh

1695 (m) 1640 (m) sh 1580 (s) 1500 (s)1445 (w) 1400 (s) 1370 (s), sh 1355 (m) sh

1295 (w) 1220 (w) 1200 (w) 1155(m)1135 (w), sh 1105 (w) 1050 (w) 1020(w)

166

1H-NMR (D20, 300,13 MHz, c= 1,12 W2 M, 1,4 gl' KCN)Abb. 20

Allg. Teil 5,74 ppm s, 1 H C-10

3,81 d, 1 H J= 7,7 Hz C-3*

3,52 d, 1 H J= 10,3 Hz C-19*

3,45 m,1 H C-8*

3,04 m,1 H C-13*

2,77 t, 1 H J= 10,1 Hz C-18*

2,20 S, 3H C51 oder 151

2,18 S, 3H C51 oder 151

1,75- 2,63 insgesamt 27 H

1,63 s, 3H CH31,41 s, 3H CH3

1,39 s, 3H CH31,36 s, 3H CH3

1,19 s,3H CH31,07 S, 3H C-12B

1,00- 1,70 insgesamt 21H

laut Vergleichspektrum mit Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobynnat-c-lacton (25)

verunreinigt, vgl 5,80 ppm (ca 5%) und Methylgruppenbereich,

die von Stepanek [91] beschriebenen Signallagen sind um 0,13 ppm bei höherem

Feld referenzler,

'zugeordnet mit H-C-COSY-Spektrum

13C-NMR (D20, c= 3,68-10-2 M, 0,5 gf1 KCN, 100 MHz, breitbandentkoppelt und

DEPT)

17,43 (q,lC )

20,28 (q,1C )

24,26 (q, 1C )

30,50 (t, 1C

36,54 (t, 1C

38,52 (t, 1C

48,50 (t, 1C

51,46 (s,1C,7,12,17)*

59,52 (d,1C C-3)

85,68 (s,1C

106,5 (s,1C

166,5 (s,1C

179,5 (s, 1C "

)

182,4 (s, 1C"

)

185,4 (s,1C"

)"

22, 33, 72, 83, 133, 1

[107], vgl auch [149 b],* irrtümlicherweise wurde

Wert 52,5 ppm angegeben

51,5 ppm auftrat

C-1 )

C-5 )

C6.14)

17,95

21,43

28,58

32,93

37,45

40,63

48,52

56,33

61,42

93,71

115,0

167,3

180,2

184,6

185,4

73, 182

(q,

(q,

(t,

(q,

(1,

(t,

(t,

(d,

(s,

(d,

(s,

(s,

(s,

(s,

(s,

& 4,

19,24 (q,1C21,46 (q,1C30,02 (t,lC36,00 (t,lC37,91 (t,lC43,02 (d,1C C18

49,73 (s,2C,C7,12,17

1C

1C

1C

1C C12B

1C

1C

2C

1C C-13) 57,29 (d, 1C C-8

1C C-2 ) 78,17 (d, 1C C-19

1C C-10) 105,4 (s, 1C C15

1C ) 142,5 (s, 2C CN

1C C6.14) 175,3 (s, 1C

1C "

) 181,8 (s, 1C

1C"

) 184,8 (s, 1C

1C "

16, 'zugeordnet aufgrund Analogie mit

von Stepanek [91] für das Signal bei 51,5 ppm der

obwohl im Originalspektrum das Signal ebenfalls bei

167

100-

90.

1» .0

70.

7B0 730 •Oft

1«B.3 I

lHr«rwr/jflHMiM«SO »00 »30 1000 1050 1100

Abbildung 63: FAB(+)-MS-Spektrum von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24), Matrix 3-NOBA

1H/13C-NMR

(H-C-COSY, D20, c= 3,68-10-2 M, 0,5 gr1 KCN )Abb. 18

Allg. Teil

8 1H / ppm 813C/ppm 81H/ppm 813C/

1,07 32,99 1,19 20,27

1,36 21,43 1,39 24,26

1,41 19,24 1,63 21,46

1,66 30,50 1.70&2.05 30,02

1.90&2.23 28,58 1,93&2,34 36,54

2,04&2,55 36,00 2,12&2,23&2,56 48,50

2,21&2,34 37,91 2,21 37,45

2,26 17,95 2,29 17,43

2,378i2,49 40,63 2,47ci2,67 38,52

2,8 43,02 3,1 56,33

3,5 78,17 3,55 57,29

3,9 59,52 5,9 93,71

MS (FAB(+), 3-NOBA, M/Z 500-1 300)Abb. 63

1295 (0,5; M+K+) 1280 (0,3; M+Na+) 1264,2 (1,0; +K+-2Na+)1258 (0,5, M+H+) 1225 (0,9;M-2CN+3H+) 1222 (0,4;M+-2CN+H2O)1211 (1,0; M-2CN-K++2Na+) 1210

1209,3 (1,7; M-3K++3Na++H+) 1202

11 2 8,2 (8; M-4K++Na++4H+) 1090,0

1051,3 (30; M-6K++Na++6H+) 1014,3

968,3 (14; M-CN-6K++Na++7H+) 537,1

500,1 (100; Ringfragment)

(0,6; M+H20-4K++4Na++H+)(1,0; M-2K++Na++2H+)

(18; M-5K++Na++5H+)

(22; M-7K++Na++7H+)

(57; Ringfragment+K+)

168

6.4.2 Dicyano-hexakalium-Co(lll)-cobyrinat-c-lacton (25)

HfOOC—y/ -«OIW=*\ CH,

CH,,_

CH,

VYHfOOC COOCH,

COOCH,

VYCOOK COOK

28

C53He90i4N6Co

25

C47H5iOi4N6CoK6

Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-c-lacton (25) ist ausgehend vom

Dicyanocobester-c-lacton (28) ebenso wie das Cobyrinat 24 durch Hydrolyse an

Dowex synthetisierbar.Dazu wurden 21,0 mg (1,9-10'5 mol) Dicyanocobester-c-lacton (21) mit 20 pl

Trifluoressigsäure und 1,5 ml Methylenchlorid versetzt, die Lösung eine halbe Stunde

gerührt, wobei mehrmals Hausvakuum angelegt wurde, und anschliessend am

Rotationsverdampfer das Lösungsmittel abgezogen. Der zurückbleibende hellrote Lack

wurde noch zwei Stunden am Hochvakuum getrocknet.Der Lack wurde in 0,25 ml Essigsäure gelöst und die Lösung mit Hausvakuum durch

20 g (cirka 25 ml) Dowex 50 WX2 gesogen wobei das Lacton 28 praktisch quantitativabsorbierte. Das Harz wurde mit 50 ml Wasser gewaschen, anschliessend in 30 ml

Wasser suspendiert, die Suspension dreimal gründlich entgast, unter Argon gesetzt und

lichtgeschützt im Ölbad während vier Stunden bei 70 °C gerührt.Die Suspension wurde sodann im Kühlschrank auf ca. 0 °C gekühlt, das Harz

abgenutscht, mit 200 ml Wasser gewaschen, wiederum in 30 ml Wasser suspendiert,gründlichst entgast und unter Argon gesetzt bevor es für weitere 24 Stunden

lichtgeschützt und unter Rühren im Ölbad bei 70 °C belassen wurde.

Die Suspension wurde vor dem Öffnen der Apparatur wiederum auf ca. 0 °C gekühlt,das Harz abgenutscht, das Produkt mit 35 ml gesättigter KHCO3, welche 0,1 g KCN /l

enthielt eluiert, in das Eluat 5 ml XAD gegeben und bis zur Entfärbung der Mutterlauge

tropfenweise konz. H3P04 zugefügt.Das XAD-Harz wurde sofort mit 400 ml Wasser gewaschen, das Produkt mit 10 ml

1,23-10"2 M KCN in Methanol (8 mg, 6,1 Äquivalente, 1,23-104 mol) unter

vollständiger Entfärbung des XAD eluiert und am Rotationsverdampfer das

Lösungsmittel abgezogen bevor eine halbe Stunde am HV getrocknet wurde.

Der nun tiefviolette Lack wurde in 1,0 ml Methanol gelöst und mit 100 ml Ether

gefällt. Im Verlauf von drei Stunden setzte sich im Kühlschrank bei 0 °C der feine

Niederschlag ab und die farblose Mutterlauge konnte abpipettiert werden.

Das während zwölf Stunden am HV getrocknete, violette Pulver (23,5 mg, 0,018 mM,

97%) wurde charakterisiert.

C47H550i4N6CoK6

169

Abbildung 64: UV/vis-Spektrum von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyr-inat-c-lacton (25) in Methanol, c= 9,24-105 M, dx= 0,100

cm

Abbildung 65: CD-Spektrum von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-c-lacton (25) in Methanol, c= 9,24-10'5 M

170

mw. 1255,576

DC (Kieselgel 60, i-Propanol/H20/1% HCN in MeOH/Et3N, 70:40:10:1)

rf= 0,61

UV/Vis

Abb. 64

(CH3OH, c= 9,24-10-5 M)

278 ( 6'410), 307

352 ( 9-420), sh 366

512 ( 3'620), sh 543

( 5'540), Sh

(18'330),

( 5'480),

314 (418 (583 (

5'910),

1'690),

6'750)

CD

Abb. 65

(CH3OH, C= 9,24-10-5 M)

246 ( -5,30),sh 253

346 ( -9,31), 364

427 ( 9,31), 483

554 ( 0,87), 579

(

(

(

(

-8,01),

-5,74),

-1,30),

-0,22),

309 (392 (520 (600 (

-6,28),

13,40),

-0,33),

0,43),

Xo bei 238, 272, 279, 371, 456, 536, 573, 588


3420 (s), br 3250 (m), sh 2970(m), 2940(w), sh

2860 (m), sh 2170 (w), 2190(w), 1990(w),

1695 (w), 1660 (m), sh 1630(m), 1580(s),

1505 (s), 1470 (m), 1445(m), sh 1400(s),1370 (S), sh 1350 (m), sh 1310(w), 1295(w),1275 (w), sh 1220 (w), 1200(w), 1190(w), sh

1155 (m), 1130 (m), sh 1115(m), 1095(w), sh

1050 (w), 1025 (w), 1000(w), 975 (w),

950 (w), 925 (w), 880 (w), 800 (w),

765 (w), sh 730 (w), 650 (m), br

1H-NMR (D20, 300,13 MHz, c= 7,96-10'3 M, 1,0 gV KCN)Abb. 21

Allg. Teil 5,80

3,85

3,57

S, 1 H

d, 1 H J= 8,3 Hz

d, 1 H J= 10,5 Hz

C-10

C-19+

C-3

3,10 m, 1 H J1= 8 Hz J2= :3 Hz C-13

2,80 td, 1 H J1= 10 Hz J2= :3 Hz C-18+

2,58 dd, 1 H Ji= 15 Hz J2=3,5 Hz C-181 +

2,50- 1,50 insgesamt ca. 26 H

2,24 s, 3H C51 oder 151

2,20 s, 3H C51 oder 151

1,61 s, 3H CH3

1,43 s, 3H CH3

1,42 s, 6H CH3

171

1,22 s, 3H CH3

1,11 S, 3H C-12B

Zuordnung auf Basis Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobynnat, + zugeordnet mit

Entkopplungsexperiment


Einstrahlung Beobachtung

2,84 ppm 3,58 ppm, d zu s,

2,58 ppm, dd zu d, J= 3,5 Hz verschwindet,

2,30-2,50 Intensitätsverschiebung

1 H-NMR (CD3OD, 300,13 MHz, c= 7,96-10'3M)

5,88 s, 1 H C-10

4,26 d, 1 H J= 8,0 Hz

3,79 d, 1 H J= 10,5 Hz C-19+

3,04 m, 1 H

3,02 t, 1 H J= 10,5 Hz C-18+

2,64 dd, 1 H J1= 25,1 Hz J2= ca. 2 Hz

2,66-2,47 insgesamt 2 H, Maximum 2,5'I ppm

2,47-1,78 insgesamt 24 H

2,33 s, 3H 51 0. 151

2,32 s, 3H 51 0. 151

weitere Maxima 2,07/ 2,03 / 1,99/ 1,95

1,78-1,10 insgesamt 16H

1,68 s, 3H CH31,57 s, 3H CH31,54 s, 3H CH3

1,44 s, 3H CH3

1,31 s, 3H CH3

1,17 s, 3H CH3*

Zugeordnet analog Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobynnat (24), + Zugeordnet

aufgrund Entkopplungsexperiment


Einstrahlung Beobachtung

3,82 ppm 3,01 ppm, t zu d

3,00 ppm 3,82 ppm, dzus

2,71/2,76 Kopplung von ca. 1 Hz verschwindet

2,38/2,42 Signale mit höherer rel. Intensität

172

13C-NMR (D&, 300,13 MHz, c>

DEPT)

7,96-10-3M, 1,0 gr1 KCN, breitbandentkoppelt &

17,54 (q,1C C51/151

19,75 (q,1C C2A

24,24 (q,1C, C12A.1A;

33,06 (q,1C C12B

36,52 (t,1C

38,48 (t,1C

48,56 (t,1C

55,24 (s,1C C7

61,62 (s,1C C2

88,22 (s,1C C8

107.0 (s,1C C5

163.7 (s,1C

174,4 (s,1C

180.8 (s,1C

182,6 (s,1C

185.1 (s,1C

17,83

20,13

28,67

35,52

38,10

40,62

48,69

56,43

78,12

91,67

141,7

166,3

180,3

182,4

184,7

185,4

q,1C C51/151) 19,32 (q,1C, 2A/17A)

q,1C, 37A) 21,61(q,1C,7A,12A,1A)

t,1C 30,17 (t, 1C )

t,1C, C71 81) 36,06 (t, -ic )

t,1C, C71 81) 38,16 (t, 1C )

t,1C 43,06 (d, 1C )

t,1C 49,98 (s,1C,C12,17)

d,1C C13 59,57 (d, 1C C3)

d,1C C19 85,82 (s, 1C C1)

d,1C C10 106,2 (s,1C C15)

s,1C CN br) 142,2 (s,1C, CN, br)

s,1C 167,7 (s, 1C br)

s,1C 180,5 (s, 1C )

s,1C 182,4 (s, 1C )

s,1C 184,9 (s, 1C )

s,1C

Zuordnung analog Dicyanocobyrinat 24

173

6.4.3 Dicyano-Co(lll)-N>N,,N,,,N,",N"",N ,N -hepta-

(4-nitrophenyl)-cobyrinat28 (29)

,,{yooc

N02-Q-OOCo»

24

C47H52014N6CoK7

VY0,-Q-Ooc coo-^yNo2

29

C89H8o02gNi3Co

Zu 1322 mg (1,06 10 3 mol) in 20 ml H20 gelöstem und zusammen mit 40 g XAD

vorgelegtem Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobynnat (24) tropfte man unter Ruhren

konz H3PO4 solange zu (ca 2 ml) bis die Farbe von violett nach karminrot umschlugund das Corrin unter vollständiger Entfärbung der Lösung an das XAD Harz

adsorbierte

Das XAD Harz wurde sodann mit 80 ml Phosphatpuffer, pH 3, 0,1 g KCN 11, und

anschliessend mit H2029 gewaschen bis Substanz begann auszutreten (ca 50 ml) Die

Cobyrinsäure liess sich nun mit 300 ml Methanol vollständig eluieren Man zog das

Lösungmittel zuerst am Rotationsverdampfer ab und trocknete den Rückstand eine

Stunde am HV (0,08 Torr)Die hellrote Substanz wurde mit 10 ml 10 % HCN haltigem Methanol gelöst, mit 0,16

ml Et3N (2,2 Äquivalente, 2,33 mmol) versetzt und vor der Trockung am HV (5 h,

0,05 Torr) das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt Es blieb ein

tiefvioletter Lack zurück

Man legte die Dicyanocobyrinsäure unter Stickstoff vor, kühlte mit Eis/NaCI auf ca

10 °C und fügte 30,0 ml Methylenchlond, dann 1,50 ml Tnethylamin (9,01 10 3

mol, 8,5 Äquivalente) und zuletzt 6,250 g (2,66 10 2 mol, 25,1 Äquivalente)Tnfluoressigsäure 4 nitrophenylester gelöst in 10,0 ml Methylenchlond dazu Das

Eisbad konnte sofort entfernt werden Zu der unter Ruhren gehaltenen Lösung gab man

nach ca 2 Stunden weitere 0,50 ml Tnethylamin Die Reaktion war gemäss Dunn-

schichtchromatogramm nach 22 h Stunden beendet

Zur Aufarbeitung verdünnte man die hellrote Lösung mit 100 ml Methylenchlond30und schüttelte mit 15 Portionen ä ca 200 ml einer gesättigten wässrigen NaHC03-

Lösung, die 0,1 g KCN I1 enthielt, aus31, filtrierte durch Watte und engte die

tiefvioletten Lösung am Rotationsverdampfer auf ca 30 ml ein Zugabe von 300 ml

Hexan führte zur quantitativen Fällung des Produktes 29, das noch zweimal mit 300

ml Hexan gewaschen wurde bevor das bläulich-violette Pulver nach 16-stundigerTrocknung bei 10 3 Torr zur Charakterisierung gelangte (1,923 g, 99,5 %)

28 Vorschrift analog R Stepanek [91] mit der freien Säure als Edukt

29 Die tiefviolette Dicyanoform verliert beim Waschen mit Wasser wieder einen

Cyanidliganden und beginnt kurz vor Beginn der Ablösung der Substanz vom Trägereine rote Farbe anzunehmen

30 Substituierbar durch Ether

31 Die letzte Portion der wässrigen Phase bleibt praktisch farblos

174

ch, r-coo-^yNo,'fCH,

°-C}xo,

Abbildung 66: UV/vis-Spektrum von Dicyano-Co(IM)-heptakalium-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(4-nitrophenyl)-cobyrinat (29)in Methylenchlorid, c= 3,78-10'5 M

s35

©

Abbildung 67: CD-Spektrum von Dicyano-Co(lll)-heptakalium-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(4-nitrophenyl)-cobyrinat (29) in

Methylenchlorid, c= 3,78-10"5 M

175

CsgHeoC^sNisCo mw. 1838,633

DC (MeCI2/1%HCN in MeOH, 95:5, Kieselgel 60)

rf= 0,90

Löslichkeitsverhalten

löslich

nicht löslich

Acetonitril, Methylenchlorid, Nitrobenzol, Essig-

säureethylesterBenzol, Toluol

UV/Vis

Abb. 66

(Methylenchlorid, c= 3,78-10'5 M)

590 nm

424 nm

268 nm

(10'330),

( 2-380),

(70'710)

548 nm

373 nm

( 8'140),

(29'790),

510

355

nm

nm

( 4-970),

(15'100), sh

CD

Abb. 67

(Methylenchlorid, c= 3,78-10-5 M)

250 (284 (329 (397 (605 (

-5,30),

-3,18),

-10,30),

18,00),1,32),

A.0 bei 239, 268, 278, 378

258 (303 (350 (431 (

-6,89),-8,48),

-9,27),

10,60),

274 (312 (372 (562 (

1,32),

-14,30),

-7,68),

2,12),

IR (3,1 mg in 80 ßl CHCI3)

3690 (w), 3115(w), 3080(w), 3020 (w),

2985 (m), 2925(w), 2860(w). 2455 (w),2120 (w), 1915(w), 1760 (s), 1615 (m),

1595 (m), 1580(m), 1530 (S), 1500 (m),

1490 (S), 1470(w),sh 1450(w), 1415 (w),

1400 (w), 1390(w), 1365(w), sh 1350 (s),

1325 (w), 1295(w), 1200(m), 1160 (S),

1125 (S), 1050(w), 1040(w), sh 1015 (m),

995 (w), 975 (w), 945 (w), sh 925 (w),

900 (w), 865 (m), 830 (w)

sh

1H-NMR (CDCI3, c= 2,26-10-2M, 300,13 MHz)Abb. 68

8,35-8,00 m,14 H

7,40-7,05 m,14 H

5,79 s, 1 H

4,05 d, 1 H

4,01 d, 1 H J= 13,2 Hz

Phenyl(C3-)Phenyl(C2')C-10

C-3

C-19*

176

f\-ooc

CH, I-COO-Qno.\c»,

ch, f"

(29)> r

ppm 8

Abbildung 68: 1 H-NMR-Spektrum von Dicyano-Co(lll)-heptakalium-N,N-,N", N'", N"", N

,N -hepta-(4-nitrophenyl)-cobyrinat

(29) in Chloroform, c= 2,26-10'2 M, 300,13 Hz

Iiloa 3 |

iiMlrtLlJn.,i,,1.üi..i..wi'1,300 400 500 «00 T&0 000 »00

1100 1200 1300 1400 1300

1437 4 ««« »I

, . ,,i^^-.v, , , .-injUM»,!1*00 1700 ltOO 1!

I IIS

711

! 5Bi

: ie<

.TB«

SM

»00 2000

Abbildung 69: FAB(+)-MS-Spektrum von Dicyano-Co(lll)-heptakalium-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(4-nitrophenyl)-cobyrinat(29), Matrix 3-NOBA

177

3,64 dd, 1 H J1= 3,75 H;'. ^z

3,21 m, 1 H

3,13-2 ,50 m, insgesamt 15 H

2,43 s, 3H

2,37 s, 3H

2,50-2 ,20 m, insgesamt 10 H

2,10-1 ,90 m, 3H

1,78 s, 3H

1,73 s, 3H

1,66 s, 3H

1,62 m, undiff

1,51 s, 3H

1,46 s, 3H

1,33 s, 3H


3,25 Hz C-8*

C-13*

C51 oder 151

C51 oder 151

CH3CH3CH3

CH3CH3CH,

*

Zuordnung aufgrund Analogie zum Dicyanocobyrinat 24

13C-NMR (CDCI3, c= 8,56 W3M, 100 MHz, breitbandentkoppelt und DEPT)

15,68, 16,39, 17,65, 18,89, 19,37, 20,11, 22,48 (q, je 1C )

24,44 (t, 1C ) 24,62 (t, 1C ) 26,39 (t, 1C )

29,78 (t, 1C ) 30,07 (t, 1C ) 31,15 (t, 1C )

31,61 (q, 1C, C-12B ) 32,02 (t, 1C ) 32,33 (t, 1C )

33,44 (t, 1C ) 39,58 (d, 1C, C-18 ) 41,44 (t, 1C )

42,21 (t, 1C ) 46,14 (s, 1C.C-2/7/12) 46,94 (s,1C,C2/7/12)

48,84 (s,1C,C2/7/12) 53,89 (s, 1C.C-2/7/12) 48,84 (s,1C,C2/7/12)

53,89 (d, 1C, C-13 ) 54,23 (d, 1C, C-8 ) 56,67 (d, 1C, C-3 )

58,54 (s, 1C, C-2 ) 74,77 (d, 1C, C-19 ) 82,80 (s, 1C, C-1 )

91,54 (d, 1C, C-10 ) 103,09 (s, 1C, C-5/15 ) 104,04 (s, 1C, C-5/15)

115.56 (d, 1C ) 122,08, 122,15, 122,32, 122,41, 122,43, 122,56

(d, je 2 C, C-2 des Nitrophe), 124,88, 125,07, 125,10, 125,28, 125,33, 125,38,

125,53 (d, je 2C, C-3, des Nitrophenyl), 126,10 (d, 1C )

130,6 (breit, s, 2 CN) 145,22, 145,36, 145,46, 145,60, 14564, 145,82,

145,91 (s, je 2C, C-4 des Nitrophenyl), 154,43, 154,46, 154,75, 154,81, 154,

93, 155,16, 155,35 (s, je 2C, C-1 des Nitrophenyl) 163,48 (s, 1C C-6/14)

163.57 (s, 1C C-6/14) 168,21, 169,34, 169,70, 169,93, 170,04, 170,63,

171,27, 171,59, 175,21, 175,80, 177,26 (s, je 1C, 22, 33, 72, 83, 133, 173,

182 & 4, 16)

MS (FAB(+), 3-NOBA, M/Z 500-2W0)Abb. 69

1838.2 (9, M++H+ ) 1837,2(16, M+ ) 1812,5(34 )

1810.3 (72) 1809,5 (88, M-CN ) 1794,7 (26, M-N02+H+)1793,7 (28, M-N02 ) 1787,0(5, M-2CN) 1786,0(24 )

1784,9 (59, M-2CN ) 1783,8(54, M-CN--HCN)1769,1 (22, M-2CN-0 )

1768,2 (23, M-CN-HCN-O) 1646,9 (17, M-CN-(COOC6H4N02))

Signalgruppe 1590-1700 (M-Nitrophenylat) 1437,4 (13, M+H20-2CN

-3x(C6H4N02) ) Signalgruppe 1400-1510 (M- 2 Nitrophenylat )

1018 (8, M-CN+H20-5x(OC6H4N02)-(C6H4N02)) 993 (8, M-2CN+2H20

6x(C6H4N02) ) 869,53 (30, M-7x(OC6H4N02) )

759,5(84, M-3x(OC6H4N02)+2Na+) 737,54 (88,[M-3x(OC6H4N02)]2+ )

640 (20, M-7x(COOC6H4N02)-CN+H20) 610,22 (30, M-7x(COOC6H4N02)-

2CN-CH2) ) 585,12 (58, Ringfragment )

568 (42,Ringfragment) 548,21 (100,Ringfragment )

178

Kristallisationsversuche

Kristallisationversuche mit 29 wurden nach der Methodik der isothermischen

Diffusion durchgeführt [150, 151]Je 2 mg Dicyano-Co(lll)-heptakalium N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(4-nitro-phenyl)-cobynnat (29) in 0,2 ml Lösungsmittel [teils frisch destilliert und

absolutiert, teils puriss pa (vgl Tabelle 11)] wurden in einen Birnkolben gefülltund dieser mit durch Nadelstiche performiertem Parafilm verschlossen Den Kolben

stellte man in ein zweites Gefäss, welches das zweite Lösungsmittel, in dem der

Nitrophenylester 29 nur beschränkt löslich oder unlöslich ist, enthielt und

verschloss hermetisch Es wurden nur solche Lösungsmittelsysteme eingesetzt, aus

denen sich in einem Vorversuch Dicyano-Co(lll) heptakahum-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(4-nitrophenyl)-cobynnat (29) fällen hess

Die Knstallisationsansätze wurden lichtgeschutzt bei Raumtemperatur stehengelassenund zwei Monate beobachtet, bzw bei Systemen mit Mischlucke der Versuch nach der

Phasentrennung abgebrochen

Kristallisation wurde bei keinem der untersuchten Lösungsmittelsysteme beobachtet

In der Regel ölte der Nitrophenylester 29 aus, bildete aber bei Hexan/Acetonitril

einen Lack während das System Ether/Methylenchond immer zu einer Fällung führte

Tabelle 11 Losungsmittelsysteme der Kristallisationsversuche

für Dicyano-Co(lll)-heptakalium-N,N',N",N"',N"",N'"", N -hepta-(4-nitrophenyl)-cobyrinat(29)

Acetonitril*

Diffusion von

Aceton

Essigethylester X

1,4-Dioxan* X

Diethylether* X

Dusopropylether*Toluol X

Tetrachlorkohlenstoff X

Cyclohexan X

n-Hexan X

Heptan X

Petrolether X

Cyclohexen X

29 gelöst in

Aceton Nitrobenzol

X

X

X

Methylenchlondt

X

X

X

X

X

X

'frisch destilliert und absolutiert, ffnsch über Alox

179

6.4.4 Dicyano-Co(lll)-N,N',N",N",,N,,,,,N ,N -hepta-

(10-tert.butyloxycarbonyl-n-decyl)-cobamid32(27)

CONH(CH,),<f:Ofi(CH,),

CH, r-CONHICHJnCOJCH,),

(CHJfiOfitCHjKflNOC-y S^XLs\.CH

,,-Q-ßoc COO-Qno,

{CH,)fi0piCH,)ÎNOC

CONHICHJxflOfitCH,)

ICH,)fiOfi(CH,)ÎNOC CONHICHJÔfifCH,),

29

CsgHaoOaNisCo

27

Ci 52H262021Ni 3C0

Zu 1546 mg in einem getrockneten Kolben mit Serumstopfen unter Stickstoff vorge¬

legtem Dicyano-Co(lll)-heptakalium-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(4-nitro-phenyl)-cobyrinat (29) (8,41-10 mol-4) fügte man 20 ml THF, eine Lösung von

3,268 g 10-tert.Butyloxycarbonyl-n-decyl-ammonium-perchlorat33 (9,13-103mol, 10,9 Äquivalente) in 10 ml THF sowie zuletzt 2,1 ml Triethylamin (1,51-10"2mol, 17,9 Äquivalente) und hielt die Reaktionslösung unter Rühren auf Raum¬

temperatur. Das DC zeigte nach 3,5 Stunden Reaktionszeit vollständigen Umsatz an.

Zur Aufarbeitung wurde die Reaktionslösung in ca. 300 ml Ether aufgenommen, zuerst

gegen 200 ml Phosphatpuffer (2,3-10~3 mol, pH 4,0), dann mit gesättigter NaHC03mit 0,1 g KCN pro Liter solange ausgeschüttelt bis die Wasserphase nur noch schwach

gelb gefärbt war (ca. 4 I). Die Wasserphasen schüttelte man nach jeder Trennung

jeweils mit einigen ml Ether aus und vereinigte mit der organischen Phase der

Hauptfraktion.Man zog sodann den Ether am Rotationsverdampfer ab, dekantierte das zurückbleibende

Wasser, trocknete bei 0,03 Torr (25 h) und erhielt 1972,6 mg rot-violettes, gemässDC nicht einheitliches Rohprodukt.Dieses Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie mit Kieselgel 60 (Säulen¬durchmesser 8 cm, Füllhöhe 12 cm, Laufmittel Methylenchlorid / 1% HCN in MeOH)

gereinigt. Der Methanolgehalt des Laufmittel wurde im Verlauf der Trennung erhöht,

beginnend mit 25:1 für die ersten 2'500 ml, über 10:1 für die folgenden 1'000 ml,

bis auf 5:1 für die letzten VOOO ml. Man beobachtete eine Bandenstruktur bestehend,

in der Reihenfolge ihrer Elution, aus einer intensiven sowie einer schwachen Bande

mit kleinem rf-Wert. Das gewünschte Cobamid 27, 1882 mg (83,9 %), befand sich

in der ersten intensiven Bande.

Diese Fraktion gelangte nach zwölfstündiger Trocknung bei 3-10~4 Torr zur

Charakterisierung.

Ci 52^262021 N13CO

mw. 2666,791

32 Synthetisiert auf Basis der Vorschrift von Stepanek [91]33 Synthetisiert analog der Vorschrift von Stepanek [91]

180

4* 1

M

CpNHtCHjKCOflCH,),CH, r-CONHfCHJriCOJCH,!,

CHifiOflCH,),iirHOC~y y^JJ^\CH,

CONHICHjlufOflCH,)CH,

CH,)fiOfi(CH,)„flNOC

vy(CHJfOflCHJxflNOC CONHICH,)^:OftCH,),

Abbildung 70: UV/vis-Spektrum von Dicyano-Co(lll)-N,N',N",N'",N"",N ,

N - hepta - (10-tert.butyloxycarbonyl-n-decyl) - cobamid

(27) in Methylenchlorid, c= 3,31-10"5 M

8r*~

I

Abbildung 71: CD-Spektrum von Dicyano-Co(lll)-N,N',N",N-,N"",N ,

N -hepta- (10-tert.butyloxycarbonyl-n-decyl) - cobamid

(27) in Methylenchlorid, c= 3,31 -10"5 M

181

Löslichkeitsverhalten

löslich Ether, MeOH, EtOH, Aceton, Hexan, i-Propanol,

Methylacetat, Toluol, Methylenchlorid

DC (Kieselgel 60, Methylenchlorid/MeOH, 95:5)

rf= 0,23

UV/Vis

Abb. 70

(c= 3,31-10-5 M, MeCI2)

278 ( 10-260),352 ( 14'030),505 ( 5'280),

309 ( 9'510),368 ( 28-360),543 ( 8'150),

314 ( 9'660),417 ( 2'410),581 ( 1 0'110).

CD

Abb. 71

(C= 3,31-10-5 M, MeCi2)

247 ( -16,30),sh281 ( -10,60),326 ( -9,95),sh382 ( 15,40),sh488 ( -2,41),

255

299

348

395

530

(-20,20),(-10,30),sh(-15,40),( 27,80),( -0,91),sh

270

310

363

428

582

(

((

(

(

-7,54),

-18,70),

-6,94),

18,10),

-3,02),

X0 bei 372, 459

sh

(2,7 mg in 70 pl CHCI3)

3665 (w) 3440 (w) 3220 (m) 3080 (w) ,

3000 (s) sh 2980 (s) 2930 (s) 2855 (s) ,

2460 (w) br 2120 (w) 1720 (S) 1655 (s)1580 (m) 1550 (m) 1505 (s) 1465 (m)1455 (m) 1440 (w) Sh 1410 (w) 1400 (m)

1390(m) 1370 (s) 1355 (m) sh 1305 (w)1155 (s) 1110 (m) 1065 (w) 1035 (w)1010 (w) 1000 (w) 970 (w) 950 (w)915 (w) 900 (w) 880 (w) 845 (m)

1 H-NMR (CDC/3, C= 1,41-10-2M, 300,13 MHz)Abb. 72

8,05 ppm

7,63 ppm

6,91 ppm

6,77 ppm

6,61 ppm

6,50 ppm

6,20 ppm

5,56

4,52

3,83

1 H

1 H

1 H

1 H

1 H

1 H

1 H

1 H

1 H

1 H

J= 5,6 Hz

J= 5,6 Hz

J= 5,6 Hz

J= 5,6 Hz

J= 5,6 Hz

J= 5,6 Hz

J= 5,6 Hz

J= 9,6 Hz

J= 9,7 Hz

CH2-NH-CO-CH2-NÜ-CO-

CH2-NH-CO-

CH2-NH-CO-

CH2-NM-CO-

CH2-NH-CO-

CH2-NÜ-CO-C-10

C-3

C-19

182

ppm 8 1

Abbildung 72: 1 H-NMR-Spektrum von Dicyano-Co(lll)-N,N',N",N-",N"",N ,N -hepta-(10-tert.butyloxycarbonyl-n-decyl)-cob-amid (27) in Deuterochloroform, c= 1,41 -102 M, 300,13MHz

275 0 ,

412 j

IraWwiltillM it-HiTi",200 300 400 500 "W 700 «0 »öo'

1500

100.

10.

«0.

iVoo'

io'oo

4 OB«

2 OSC

.0 OBO

M/S

» »B6

7 »C

.5 »K«

.4 OBf

.2 OB«

,0 010

~1Ä -U*j^2 *3 4

.7 «*

5 »SC

.4 OS«

.2 Ol«

.0 010

2800 M/S

Abbildung 73: FAB(+)-MS-Spektrum von Dicyano-Co(lll)-N,N',N",N'"N"",N ,N -hepta-(IO-tert.butyloxycarbonyl-n-decyl)-cobamid (27), Matrix 3-NOBA

183

3,40-3,25 m, ca 4,5 H

3,25-2,86 m, ca. 11,5 H

2,82 m, 1 H

2,71 d, 1 H J= 1

2,50 t'oid, 1H

2,25 s, 3H

2,22-2,10 m, ca. 23 H

2,07 s, 3H

2,45-1,90 m, insgesamt ca. 39 H

1,74 s, 3H

1,70-1,46 ca. 23 H

1,44 ca. 63 H

1,28 ca. 78 H

1,22 ca. 33 H

1,13 s, 6H

14,1Hz

CM2NH-COu.a. CJ&NH-CO

C-5,15

u.a.CÜ2CO

C-5,15

CH3

tert.Butyl

CH3

13C-NMR (CDCI3, c= 2,36 10~2M, 75 MHz, breitbandentkoppelt und DEPT)

15,07

18,16

22,02

25,72

27,19

28,08

28,86

29,51

31,69

36,00

39,61

40,28

45,67

50,49

59,03

75,76

77,00

79,84

90,64

132,74

162,92

169,26

172,14

173,01

175,19

q,1 C

q,1 C

q,1 C

t,1 C

t, ca 2 C

;d, ca21C, 0

t,1 C

t, ca 14C

t, 1 C

t,1 C

t,1 C

t,1 C

t,2C

s,2C

d,1C,C3,8

s,1 C

|d,> 7 C

[s, ca 7C, O-

d,1 C, C10;

s,i c, -cn;

s,1C,C6/14

s,1 C

s,1 C

s,1 C

s,1 C

15,63

18,83

24,31

26,96

27,60

C(£H3)3)

29,07

30,40

32,13

36,41

39,77

40,45

46,12

53,86

3)60,87

76,10

77,10

-£(CH3)3)

101,65

135,88

22,33.

171,41

172,61

173,26

175,96

(qjc )

(q,IC )

(t, 1C )

(t, ca 7 C )

(t,1C )

(t, ca 7 C

(t, 1 C

(d, 1 C

(t, 1 C

(t, 1 C

(d,1 C,

(t, 2C

(d,1 C,

(s,1 C,

(s, 1 C

(s,1 C

)

)

)

)

)

C18)

)

C3,8,1

C-17)

(s, 1C.C5/15)

(s, IC, -CN)

72,83,133,173,1

(s,1C )

(s,1C )

(s.-ßOO'Bu, ca

(s,1C )

16,07

19,86

25,06

27,04

27,80

28,77

29,31

31,09

35,55

39,48

40,00

42,46

47,15

3)55,7371,84

76,58

77,42

83,57

107,14 (s,

161,22 (s,

(q, 1C

(q, 1C

(t, ca 7 C

(t, ca 7 C

(t, 1 C

(t, 1 C

(t, ca 14 C

(t, 1 C

(t,>7C

(t, 2C

2C

1 C

1 C

(d, 1 C, C3,8,13)

(s, 1 C, C-19)

(s,>7C

(s,>7C

(s, IC,

1 C,

1 C,

(t,

(t,

(t,

C-1

C5/15)

C6/14)

82 & C4/9/11/16

171,91 (s, 1 C

172,93 (s, 1 C

7C)

176,13 (s, 1 C

MS

Abb. 73

(FAB(+), 3-NOBA, m/z 150-2W0)

2655,4 (12,2) 2639,5 (97,9,M-CN) 2613,26 (100,0, M-2CN)

412,11 (14,7) 312,08 (22,8) 275,04 (19,7)Bereich 260-490 regelmässig wiederkehrende Maxima in Abstand 14 m/z

184

6.4.5 Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N",N",N"-,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)34

(17)

27

C152H262O21N13C0

1 7

Ci 24H199O21N13C0K7

Eine Gasentwicklungsapparatur wurde mit 140 ml konz Schwefelsäure sowie 200 g

NaCI beschickt und 1,7827 g Dicyano-Co(lll)-N,N',N",N-",N"",N ,N -hepta-(10-tert.butyloxycarbonyl-n-decyl)-cobamid (27) (6,68 10'4 mol) in einem,

über einen PVC-Schlauch verbundenen 250 ml-Kolben als Lack vorgelegt. Stickstoff

durchströmte langsam die Apparatur vom NaCI zum 250 ml-Kolben, anfänglich zur

Trocknung der Apparatur, dann während der gesamten Reaktionszeit als schwacher

Trägerstrom

Cirka eine Stunde nach Beginn des Stickstoffflusses, jedoch vor Beginn der HCI-Ent-

wicklung wurde das Cobamid 27 in 100 ml Chloroform gelöst. Diese Lösung wurde bis

Ende der Hydrolyse gerührt und die HCI-Entwicklung nun so gesteuert, dass das

Natriumchlorid in der Vorlage im Laufe von ca. 100 Minuten aufgebraucht war. Dabei

wurde ein hypsochromer Effekt beobachtet, der wahrscheinlich auf die Entstehung von

Chloro-cyano-heptakalium-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(10-tert.butyloxy-car-

bonyl-n-decyl)-cobamid durch ügandenaustausch am Kobalt zurückzuführen ist.

War die HCI-Entwicklung praktisch zum Stillstand gekommen, wurden dem Cobamid

10,0 ml Tnfluoressigsäure (0,131 mol, 196 Äquivalente bzgl. Co) zugeführt.35Vier Stunden nach Zugabe der Tnfluoressigsäure zeigte das einheitliche DC der Lösungdas Ende der Reaktion an.

Man entfernte das Lösungsmittel der Reaktionslösung am Rotationsverdampfer bei

einer Wasserbadtemperatur von 40 °C, und trocknete anschliessend zwölf Stunden am

Hochvakuum (p= 10 3 Torr)Der in ca. 10 ml Methanol aufgenommene hellrote Rückstand wurde mit KCN versetzt

bis sich das zuletzt zugegebene Cyanid nicht mehr löste.36 Die Fällung des

Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"-,N"",N ,N -hepta-(n-dec-yl-10'-carboxylat) (17) aus dieser methanolischen Lösung mit 150 ml Ether erfolg

34 Synthese analog R. Stepanek [91] ohne XAD-Chromatographie.35 Die Reaktionslösung ist jetzt leuchtend rot.

36 Die entstehende Dicyanoform färbt die Lösung tief violett.

185

CpNH(CH,),tPOOKCH, f-CONmCH{l,fiOOK

Abbildung 74: UV/vis-Spektrum von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cob-amido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-car-

boxylat) (17) in Wasser, c= 3,23-10"5 M, 0,13 g KCN M

Abbildung 75: CD-Spektrum von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)(17) in Wasser, c= 3,23-10-5 M, 0,13 g KCN I"1

186

te quantitativ. Der Niederschlag setzte sich im Laufe von einigen Stunden bei Raum¬

temperatur ab. Die praktisch farblose Mutterlauge wurde abpipettiert, der Nieder¬

schlag mit 150 ml Ether gewaschen, zuerst im 40 °C Wasserbad am Rotations¬

verdampfer und Hausvakuum, dann bei 10-3 Torr während zwölf Stunden getrocknet.Man erhielt gemäss UV/vis-Spektrum 1,6984 g (99 %) violettes Pulver, das unter

Argon und Lichtausschluss bei 5 °C gelagert, nach einem Jahr 1H-NMR-spektro-skopisch keine Veränderungen aufwies.

Cl24Hi9902iN13CoK7

mw. 2540,664

DC (RP-18, 1% methanolisches HCN/H20, 10:1)

0,30

UV/Vis

Abb. 74

(H20, c= 3,23-10-5 M, 0i13 g KCN ri)

579 ( 9'480),416 ( 2'080),305 ( 8'860),

539 ( 8'090),367 ( 27'200),277 ( 9'250),

509 ( 5'550),312 ( 8'860),233 ( 44-390).

CD (H20, c= 3,23-10-5 M, 0,13 g KCN r1)Abb. 75

244 ( -10,20), sh 252 (-14,30), 267 ( -4,34)278 ( -5,89), 296 ( -8,67),Sh 308 ( -18,90)323 ( -9,29), 347 (-11,20), 367 ( -6,20)396 ( 22,60), 426 ( 14,30), 488 ( -1 ,24)555 ( 1,55), 595 ( 1,55),

XO bei 232, 374, 463, 534

CD (H20, c= 8,90-10-5M, 1,99-W2M SDS (224 Äquivalente), 3,13-W4M KCN (3,5 Äquivalente), 400-700 nm)

signifikant geringerer Cirkular-Dichroismus im Bereich 500-650 nm:

555 ( 1,26), 595 ( 1,27)


3430(m) sh 3310 (m) 3080 (m) 2930 (s)2860 (s) 2690 (w) 2490 (w) 2120 (m)1790(w) sh 1695 (m) sh 1650 (s) 1580 (s)1565 (S) 1505 (S) 1470 (m) 1455 (m)1440(m) 1405 (s) 1370 (m) 1355 (m)sh1305(m) 1285 (m) 1260 (m) 1225 (m)sh1205(m) 1180(m) 1155 (m) 1135 (m)sh1110(m) 1070 (w) 1040 (w) 1020 (w)sh995 (w) 970 (w) 955 (w) 890 (w)835 (w) 805 (w) 735 (w) sh 725 (w)665 (w) 625 (w) 595 (w) 475 (w)

187

1 H-NMR (CD3OD, c= 1,41-10-2M, 300,13 MHz)

Abb. 22

Allg. Teil 5,78 S, 1 H C-10

4,33 d, 1 H J = 8,6 Hz C-3

3,78 d, 1 H J = 10,2 Hz C-19

3,25-3,04 m, insgesamt ca 21 H Cifc-CONH

3,04-2,96 3H Maxima 3,03/2,99

2,65 1 H

2,36 6H C-5/15

2,18 t/m,ca. 28 H alip. Kette

Ctfe-COO-

2,00-1,90 m, ca. 1 H

1,90-1,75 m, ca. 1 H

1,71 s, 3H CH3

1,65-1,50 m,insgesamt ca 30 H Maxima 1,60/1,51

1,55-1,40 m, ca. 3H Maximum 1,60

1,40-1,22 m,insgesamt ca. 100 H

1,19

Maxima 1,44/1,32/1,2

s, 3H

-(CH2)-CH3

1 H-NMR (D20, c= 5,43-10-3M, 300,13 MHz, 0,13 g KCN H)

77

06

66

33-

82

58

2,90

2,40-1,90

1,90-1,66

1,62

1,44

1,38-1,28

1,28-1,10

1,08

s, 1 H

d, 1 H

d, 1 H

m,ca. 15 H

m, 1 H

m, 1 H

m, ca. 32 H

J= 8,4 Hz

J-11,2 Hz

t'oid. Max 3,10 u.a.

C-10

C-3

C-19

CONHCH2

Maxima

u.a.

m, insgesamt ca. 6 H

s, 3H

m,ca. 22 H

m,ca. 15 H Maxima

m,ca. 84 H Maxima

s, 3H

2,31/2,24/2,04 CÜ2-COOK

bei

bei

CH3

1,33/1,35/1,371,21/1,17/1,11

CH3

13C-NMR (CD3OD, c= 2,0910-2M, 75 MHz, breitbandentkoppelt & DEPT)!37

16,02 (q, 1C 17,44 (q, -IC 18,45 (q, 1C )

19,45 (q, 1C 19,86 (q, 1C 22,91 (q, 1C )

26,83 (t, 1C 27,42 (t, 1C 27,59 (t, >7C )

27,84 (t,ca. 7C 28,11 (t,ca. 2C 28,57 (t, 1C )

29,55 (t,ca. 2C 29,84 (t, 1C 30,35, 30,50, 30,67,

30,75, 30,91 (t, zus.c a. 30C) 31,80 (q, 1C C12B)

33,18 (t, 1C 33,58 (t, 1C 34,14 (t )

34,89 (t, 1C 36,93 (t, 1C 39,36 (t, >7C )

40,39 (t, 1C 40,52 (t,ca. 2C 40,74 (t,ca. 2C )

40,93 (t,ca. 4C 43,37 (t, 1C 46,24 (t, 1C )

47,77 (t, 1C 47,90 (t, 1C 51,17 (q. 1C )

54,96 (d, 1C 57,44 (d, 1C 57,90 (d, 1C )

37 Zugeordnet aufgrund Analogie mit [107]

188

60,10 (s 1C C 17)

76,39 (d 1C C 19)

104,19 (s 1C C5/15)

163,92 (s 1C C6/14)

171,91 (s 1C )

173,53 (s 1C )

175,02 (s 1C )

178,12 (s 1C )

4 911 16

70,46 (s 1C ) 73,40 (s 1C )

84,55 (s 1C C 1) 92,12 (d 1C C 10)

106,76 (s 1CC5/15) 135,88 (s 2C CN)

164,50 (s 1CC 6/14) 170,36 (s 1C )

172,76 (s 1C ) 173,01 (s 1C )

174,48 (s 1C ) 174,58 (s 1C )

175,21 (s 1C ) 178,06 (s 1C )

178,29 (s 1C )

183,05 (s 7C COOK)

22 33 72 83 133 173 182 &

13C NMR (CD3OD, c= 4,11 10 2M, 100 MHz, breitbandentkoppelt & DEPT)

16,12 (q 2C ) 17,72 (q 1C 18,55 (q 1C )

19,53 (q 1C ) 19 96 (q 1C 23,01 (q 1C )

26,13 (t 1C ) 26,93 (t 1C 27,46 (t 1C )

27,89 (t ca 7C ) 27,92 (tca 7C 28,19 (tca 4C )

28,25 (t ca 2C ) 28,34 (tca 2C 28,38 (tca 2C )

28,71 (t 1C ) 28,80 (t 1C 30,27, 30,38, 30,44,

30,50, 30,57, 30,59 30,61, 30,66, 30,71 , 30,78, 30,83, 30,86,

30,92, 31,00, 31,03 (t insgesamt ca 20 C 30,01 (t 1C )

31,93 (t 1C ) 33,30 (t 1C 33,67 (t 1C )

34,18 (t 1C ) 34,92 (t 1C 37,01 (t 1C )

39,46 (t ca 7C CH2 COO ) 40,41 (q 1C )

40,56 (t ca 2C ) 40 61 (tca 3C 40,72 (t ca 2C )

40,79 (t ca 2C ) 40,99 (t 2C 43,42 (t 1C )

46,32 (t 1C ) 47,86 (dca 2C 47,97 (d ca 2C )

48,17 (s 1C ) 51,16 (s 1C 51,26 (s 1C )

53,29 (s 1C ) 55 03 (d 1C 57,45 (d 1C )

57,99 (d 1C ) 60,17 (s 1C C 17 76,47 (d 1C C 19)

84,62 (s 1C C 1) 92,18 (d 1C C 10 104,27 (s 1C C 5 15)

106,85 (s 1C C5 15) 136 00 (s(br) 2CN 163,41 (s 1C C 6 14)

163,97 (S 1C C6 14) 164,55 ( 1C 171,98 172,85, 173,10

173,59, 174,56, 174,67, 175,09 175,28, 178,11, 178,20, 178,37

(s je ca 1C 22 33 72 83 133 173 182 & 49 11 16)

183,12 (s 7C COOK)

13C NMR (D20 c= 1,41 10 2 M, 1 S102M KCN 100 MHz, br bandentk & DEPT)

17,46

20,50

24,70

29,00

29,77

40,65

42,71

53,23

84,8

108,9

166,10

176,46,

33 72 83

186,31

(q 1C

(q 1C

(q 1C

(t ca 7C

(t 1C

(tca 14C

(t 1C

(s 1C

(s 1C C 1)

(s 1C C5/15)

(s 1C C6/14)

176,85, 177

133 173 182 &

(s 2C C.OO)

18,00 (q 1C )

21,50 (q 1C )

28,40 (t,1C )

29,38 (t 1C )

31,0 31,8(tmmd35C)

(t

(d

(d

(d

42,15

48,85

56,15

93,7

110,2

167,48 (s

,50, 177,53,

4 9 11 16)

(s(br )

C 10)

CN)

ca7C)

179,0

19,15

21,70

28,99

29,55

33,85

42,46

49,46

61,70

105,3

1C

1C

1C

1C

1C

1C

164,00 (s 1C

174,10, 174,28,

179,5, 180,0 (s je

186,23 (s 3C

(q 1C

(q 1C

(t ca 7C

(t

(q

(t

(d

(d

(s C5/15

C6/14

174,6,

1C 22

COO)

186,43 (s 2C C.OO)

189

MS

Abb 76

(FAB(+), 3-NOBA, m/z 170-3V00)

2839,3

2763

2724

2525,0

2316,5

2092

1926

1840

1703

1591

2600

1199

197,8

(0,007, M+Na++2x[(CH2)4COOK]

(0,003, M+[(CH2)ioCOOK]+H+)

(0,004, M+3CN-+K++3Na+) 2659 (0,004, M+2CN-+3Na+)

(0,02, M+H+-K++Na+) 2432,4 (0,038, M-5K++5Na+-CN)

(0,07, M+6H+-7K++2Na+ & M-[(CH2)10COOK]+H+)

(0,034, -2x[(CH2)10COOK]+H+)

(0,022, M-2x[(CH2)10COOK]-[(CH2)6COOK]+H+)

(0,01 8, M-[(CH2)10COOK]-2x[NH(CH2)10COOK])

(0,013, M-4x[(CH2)9COOK])

(0,01 0, M-CN-2x[(CH2)ioCOOK]-2x[NH(CH2)10COOK)+H+)

1500 (Vielzahl von Signalen ähnlicher Intensität)

0 (M-6x[(CH2)10COOK] 536,1 (0,26, Ringfragmente+K+)

(100, (CH2)8COOK]+H+)

Abbildung 76' FAB(+)-MS-Spektrum von

do- N, N-, N", N"•,N"",N',

(17), Matrix 3-NOBA

Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobami-'",N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)

190

6.5 Praparative Alkylierungen von Cobyrinat und Cob¬

amido- N, N', N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)

6.5.1 Methylierungen: Hexakalium-Coa-aquo-Coß-methyl-

cobamido-N,N,,N",N"\N,,,,,N,"",N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)3s (30)

CONH(CH,),JCOJC

CH, B-CONmCHJnfiOJi

KOfi(CH,),^NOC -WvA^'XCWjCH?

KOf(CH,),fiNOC

KOOC

CONH(CH,),£OJi KOOC

VYKO,C(CH,),JINOC CONH(CH,)„pOj:

1 7

Ci24Hi9g02iNi3CoK7

30

C123H2q202i N11 CoK6

In einer Glove-box wurden 15,1 mg (5,94 10 6 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) in

5,0 ml Methanol gelöst, mit 9,0 mg Platindioxid sowie 5 pl Essigsäure versetzt und

heftig gerührt Im Laufe der Reduktion legte man wiederholt Vakuum an und flutete

anschliessend das Reaktionsgefäss mit Wasserstoff Nach quantitativer Reaktion (120Minuten, UV/vis-spektroskopische Kontrolle) zum Hexakalium-Co(ll)-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) wurde der Katalysatordurch Watte abfiltnert und am Rotationsverdampfer das Lösungsmittel abgezogen

Der in 5,0 ml Phosphatpuffer aufgenommene lackartige Ruckstand liess sich durch

Zugabe von 15 mg (4,0-10 4 mol, 66 Äquivalente) NaBH4 unter heftigem Schäumen

quantitativ (gemäss UV/vis-Spektrum) zum Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) reduzieren Der Farbumschlag von

braun nach grün erfolgte praktisch augenblicklichDie Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta (n-decyl-10'-carboxylat)-

lösung wurde auf 7,5 mg (4,03 10 5 mol, 6,8 Äquivalente) Methyltosylat pipettiert

und nach 30 Minuten der Glove-box entnommen

38 Synthese analog R Stepanek [91] mit veränderter Aufarbeitung

191

0,2

0,0

CONHtCHJufOOlV

-. CH,\OOC{CH,),JINOC

KOOC(CH,),flNOC

-CONH(CHJ,fiOOK

<I£H,

\ CHYKOOC(CH2)xPNOC CONH(CH2}ItJCOOK

« [-J m

Abbildung 77: UV/vis-Spektrum von Hexakalium-Coa-aquo-Coß-methyl-cobamido- N, N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-

carboxylat) (30) in Wasser, c= 4,06-10-s M

Abbildung 78: CD-Spektrum von Hexakalium-Coa-aquo-Coß-methyl-cobamido- N, N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-

carboxylat) (30) in Wasser, c= 4,06-105 M

192

Zur Aufarbeitung trug man die alkylierte Verbindung direkt aus der Reaktionslösungauf eine C-18-Kieselgelkartusche auf indem man zur Lösung solange krist KHCO3

zufugte bis das Corrin auf dem Harz adsorbierte und spulte mit 160 ml 0,01 M H3PO4Man wusch anschliessend mit 100 ml H20, 100 ml 0,01 H3PO4, wiederum mit 100

ml H20, benetzte das Harz mit 20 ml gesättigter KHC03-Lösung und entfernte vor der

Elution des Produktes mit 30 ml Methanol überschüssiges KHCO3 mit 30 ml Wasser

Nach Abziehen des organischen Lösungsmittels am Rotationsverdampfer wurde

lyophilisiert und das bräunlich-gelbe Pulver (13,9 mg, 95%) charakterisiert

Ci 23H2o202i N11C0K6

mw 2464,565

UV/Vis (H20, c= 4,06 10-eM)Abb. 77

264 (22'920), 303 (2V440), 353 ( 10-665), sh

372 ( 9'310), sh 458 ( 9'680), 495 ( 8'030),sh

(CH3OH, 190-900 nm, qualitative Messung, angegeben ist die gemessene

Absorption)263 ( 0,235), 303 ( 0,184), 365 ( 0,097),sh465 ( 0,091)

CD (H20, c= 4,06 10 6M')Abb 78

262 ( -25,60), 305 ( 5,91),sh 329 ( 16,70)360 ( -2,71), 457 ( -10,30), 515 ( 7,64)545 ( 4,68),

X0 bei 288, 350, 395 (Berühr pkt), 488 nm

IR (0,5 mg in 300 mg KBr)Abb 79

3430 (m) 3260 (m),,sh 3140 (w) sh 3070(w)

2930 (m) 2860 (w) 2710 (m) 2630(m)2200 (w) 1920 (w),,

br 1695 (s) ,sh 1660 (s)

1635 (s) 1580 (m),,sh 1420 (s) 1375 (s)1345 (m), sh 1330 (m) 1260 (w) ,

sh 1215 (w),1100 (w) 1060 (w) 1010 (m) 980 (m)835 (s) 705 (m) 665 (w)

sh

193

-i——i t r——i— i i '—r—i ' '

i

4'000 3'500 3'000 2500 2'000 V800 V600 1400 1'200 1000 800 600 400

cm-1

Abbildung 79: IR-Spektrum von Hexakalium-Coa-aquo-Coß-methyl-cobamido- N, N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-l0'-

carboxylat) (30), 0,5 mg in 300 mg KBr

Abbildung 80: FAB(-)-MS-Spektrum von Hexakalium-Coa-aquo-Coß-methyl-cobamido- N, N', N", N'", N"", N

,N -hepta-(n-

decyl-10'-carboxylat) (30), Matrix 3-NOBA

194

1H-NMR (CD3OD, c= 8,69 10'3 M, 300,13 MHz)

Hauptisomeres6,63 ppm

ppm

ppm

ppm

4,33

3,86

3,52

s,

d,

t'oid,

t'oid,

1 H

1 H

1 H

1 H

3,28-3,00

2,78 ppm

2,70

2,50

2,37

2,14

1,90

1,75

1,70-1,40

2,00

ppm

ppm

ppm

ppm

m,ca 14 H

1 H

insgesamt ca 30 H

s, 3H

s, 3H

t'oid, ca.14 H

d'oid, 1 H

s, 3H

ca. 40 H

ca 72 H

s, 3H

s, 3H

s, 3H

s, 3H

1,40-1,20

1,14

1,01

0,92

-0,21

Nebenprodukt (soweit als diskrete Signale erkennbar)

6,32

0,62

0,46

-0,10

s,

s,

s,

s,

Isomerenverhältnis ca.

1 H

3 H

3H

3H

4-1

C-10

C-3

C-19

C-8

-CONHCÜ2-

51 oder 151

51 oder 151

-CJ±>-COOH

CÜ3

u.a. NHCH2CÜ2-8CÜ2CH2COOH-(CH_2)6-CH2-

QüacüaCÜ3

Cba-Co

c-10

chb

ctlaCM3-C0

13C-NMR (CD3OD, c= 8,69-103M, 100 MHz)

27,91, 30,75 ((CH2)-Einheiten des Undecanoat); 39,45, 49,05

(CD3OD); 52,52; 161,51 (HCO3).

MS (FAB(+), 3-NOBA, m/z 500-2'520)

breiter Haufen 2'200-2'400 und 1'950-2100; 2597,9 (30)

Abb. 80

2511.6 (26, M+NaCN), 2430,5

2373.7 (58, M-3K++Na++3H+), 2339,2

2253,1 (100,M-((CH2)9COOK)), 2251,6

2238.3 (96, M-CH3-(CH2)9COOK),2220,72132,6 (74, M-6K++7H+-CH3-2C02),

2050.5 (72, M-CH3-(COOK)-2K++2H+-(HN(CH2)10COOK)),1959.6 (64, M-6K++7H+-CH3-6C02),

1448.4 (32, M-4x(HN(CH2)10COOK)-CO2+Na+),

1129,3 (46, M-5x(HN(CH2)10COOK)-CH3-((CH2)3COOK))

(FAB(-), 3-NOBA, m/z 500-2500)

(40, M-2K++2Na++H+),

(90, M-5K++3Na++3H+),

(100, M-(COOK)-4K++Na++5H+),

(98, M-6K++7H+-CH3),

breiter Signalhaufen 2'200-2'400 2464,6 (37,

2426,9 (34, M-CH3+H-K+), 2405,4 (40,

2374,5 (46, M-4K++3Na+), 2358,5 (64,

2327,5 (74, M+H20-4K++3H+), 2304,4 (83,

2287,7 (100, M-5K++4H++H20), 2271,6(90,

2251,7 (83, M-6K++Na+), 2219,7(72,

2123,7 (32, M-(CH)7-4Kn3H+-2C02),1148,3(21,

851,5 (15, M-COOK-6x((CH2)i0COOK))

M-K++Na++H20),

M-2K++Na+),

M-CH3--5K++3Na+),M CH3+H2C03-6K++5H+),

M-5K++4H+),

M-6K+-CH3+5H+),

M-5K++4H++Na+-)

195

6.5.2 Adenosylierungen

Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobyrinat (20)

CN

iCN

24

C47H52014N6COK7

a. Praparative Synthese

In einer glove-box (20 ppm 02) wurden 38,6 mg Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) (3,02-10"5 mol) in 4,0 ml Methanol gelöst und mit 10 pl (1,75-10"4mol, 5,6 Äquivalent) Essigsäure, 15,6 ml Pt02 und Wasserstoff analog 17 zum

Co(ll)-cobyrinat reduziert. Nach 70 min heftigem Rühren lag gemäss UV/vis-

spektroskopischer Kontrolle quantitativ Co(ll)-cobyrinat vor. Man filtrierte den

Katalysator mit einer mit Glaswatte gefüllten Pipette und zog das Lösungsmittel am

Rotationsverdampfer mit HV ab.

Zur Alkylierung wurde das erhaltene Co(ll)-hexakalium-cobyrinat in 4,0 ml

Methanol gelöst, zuerst 15,9 mg (1,37 Äquivalent) 5'-lodo-5'-deoxy-adenosin, dann

NaBH4 in Portionen zu 22, 20 und 11 mg zugefügt (insgesamt 100 Äquivalente)39.Das nach Beendigung der Gasentwicklung (ca. 7 min) bezüglich Corrinchromophor DC-

einheitliche Produkt wurde 40 Minuten nach der NaBH4-Zugabe aus der Glovebox

genommen und die Lösung am Rotationsverdampfer am Wasserstrahlvakuum bei

Raumtemperatur getrocknet.

Der in 15 ml 6%iger wässriger H3PO4 gelöste Rückstand Hess sich auf eine C-18

Kartusche unter vollständiger Entfärbung der Lösung aufziehen. Man wusch mit 30 ml

Wasser, benetzte die Kartusche mit ca. 0,1 ml gesättigter KHC03-Lösung und eluierte

vollständig mit 5,0 ml MeOH. Das Methanol wurde am Rotationsverdampfer, das

Wasser anschliessend durch Lyophilisation am HV entfernt.

Der in 1,0 ml MeOH aufgenomme Rückstand wurde durch Glaswatte filtriert und mit

50 ml Aceton gefällt. Der Niederschlag setzte sich innerhalb zwölf Stunden bei 4 °C ab.

Nach Abpipettieren der schwach gefärbten Mutterlauge (Substanzverlust gemäss

UV/vis-Spektrum < 2%) wurde zuerst am Rotationsverdampfer, dann 24 h am HV

(0,05 Torr) getrocknet.Das verbleibende, lichtempfindliche, braune Pulver (34,5 mg, 76 %) gelangte zur

Charakterisierung.

1

Hfi

20

CssHfieOisNgCoKs

Unter heftigem Schäumen eintretende Farbaufhellung.

196

CssHeeOisNgCoKe

mw. 1434,712

DC (RP-18, MeOH/H20 1:1)

rf= 0,66

UV/Vis (H20, c= 2,16.10-5 M)

460

302

( 4 '836),

(10'360),

400

262

{ 3'685),

( 19'670)

Sh 345 ( 8-980),

CD (H20, C= 2,16.10-5 M)Abb. 25

Allg. Teil 212 ( 3,57), 221 ( 0,92), sh 246 ( -4,84)305 ( 2,53),sh 330 ( 8,41), 341 ( 8,41)382 ( -0,58), 401 ( 0,23), 433 ( -3,34)493 ( -1,61), 565 ( 1,27),

Abb. 81

X0 bei 208, 227, 287, 368, 396, 404, 521


3400 (s) 2970 (m) 2250 (w) 2080 (w)1700 (m), sh 1668 (S) 1575 (s) 1400 (s)1332 (s) 1300 (m), sh 1260(m) 1206 (w) ,sh

1155 (w) 1125 (w), sh 1102(m) 1070 (w)1025 (w) 985 (w) 960 (w) 860 (w)

838 (w) 800 (w) 690 (w) 670 (w)645 (w) 580 (w)

1 H-NMR (D20, C= 2,40-10-2M, 300,13 MHz)Abb. 24

Allg. Teil 8,08 (breit) S, 1H A-2 oder 8

7,95 S, 1H A-2 oder 8

6,77 S, 1H C-10

5,54 d, 1H J= 4,5 Hz C-1'

4,52 d'oid,1H J=10,5 Hz C-19

4,48 t'oid ,1H J= 4,5 Hz C-2'

4,14 d, 1H J- 8 Hz C-3

3,72 m, 1H Ji= 9 Hz J2=3,5Hz C-8

3,60 t, 1H J= 5Hz C-3'

3,07 m, 1H C-13

2,74 t'oid, 1H C-18

2,34 s, 3H 51 oder 151

197

1 i i i i i i i i I' ' '

I

4'OCIO 3'500 3000 2'500 2000 1'800 1'600 V400 1'200 1000 800 600 400

cm-1

Abbildung 81: IR-Spektrum von 1,2 mg Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'adenosyl-cobyrinat (20), in 300 mg KBr

ppm 9876543 2 10

Abbildung 82: 1 H-NMR-Spektrum von Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobyrinat (20) in Deuteromethanol, c= 3,34-10-2M, 300,13 MHz

198

2,23 s, 1H 51 oder 151

2,12 m C-4'

1,72 s, 1H CH31,48 s, 1H CH31,36 s, 1H CH30,94 s, 1H CH30,75 s, 1H CH30,57 s, 1H CH30,32 d, 1H J= 8,1 Hz C-5' a

0,04 t, 1H J= 8,8 Hz C-5' ß


eingestrahlt Beobachtung

5,53 ppm

3,75 ppm

3,60 ppm

0,04 ppm

4,48 t+d zu d+d

keine ÄnderungenIntensitätsverschiebung bei 2,14;

4,48 d+t zu d+d

0,32 d zu s; 2,14 Intensitätserhöhung

1 H-NMR (CD3OD, c= 3,34-102 M, 300,13 MHz)Abb. 82

1,59

1,28

1,19

1,90-1

0,90

0,75

0,64

0,03

s,

s,

d,

m,

m,

t,

8,29/8,22/8,16

8,08

6,82

5,62

4,35 breit

3,97

3,74

3,10

2,99 breit

2,74

2,70

2,57

2,43

2,80-2,20

2,20-1,90

1,81

2H

1 H

1 H

3H

1 H

1 H

J =

J =

d'oid,1 H

t, 1 H

1 H

1 H

s, 3H

s, 3H

insgesamt 20 H

insgesamt 15 H

s, 3H

s, 6H

s, 3H

00 insgesamt 15 H

s, 3H

d, 1 H J =

s, 3H

t, 1 H J =

3,1 Hz

6,4 Hz

9,7 Hz

7,9 Hz

8,7 Hz

A2 oder A8

A2 oder A8

C-10

-1'

-3,19,2'

-8

-3'

-13

-18

C-

C-

C-

C-

C-

C-

51 oder 151

51 oder 151

CH3CH3

CH3

CH3C-5'a

CH3

C-5'ß

199

13C-NMR (D20, c= 3,34-10-2M, 75 MHz, jedes Signal entspricht einem C, breit¬

bandentkoppelt und DEPT)17,868

19,480

22,015

29,903

35,295

37,679

43,308

49,106

55,124

61,306

78,017

90,508

110,219

151,470

167,170

178,168

181,567

184,639

185,096

(q C51 )

(t, A 5' )

(q C 12A )

(t, C31 )

(t, C 172 )

(t, 181/132

(d C 18 )

(t, C21 )

(d C 13 )

(s C 17 )

(d, A 2' )

(d, A V )

(s, C5 )

(s, A4 )

(s, C 6/14 )

(s, C 11 )

(s, COO" )

(s, COO" )

(s, COO" )

18,131

20,379

26,637

30,817

35,550

38,186

48,160

49,412

57,785

74,787

88,854

99,637

121,840

155,415

167,170

179,222

182,643

184,902

Zuordnung analog [107]

(q, C 151 )

(q. C2A )

(q, C 1A )

(t, C 131 )

(t, C 171 )

(t, 181/132

(t. C71 )

(s, C 2/12 )

(d, C3 )

(d, A 3' )

(d, A 4' )

(d, C 10 )

(s, A 5 )

(s, A2 )

(s, C 14/6 )

(s, C 4/16 )

(s, COO" )

(s, COO" )

19,325 (q C 17B )

21,645 q C7A )

29,522 t, C 81 )

33,547 q C 12B )

37,514 t, C 82 )

40,870 t, C32 )

48,362 s C 2/12 )

52,343 s, C7 )

58,339 d, CS )

74,787 d, C 19 )

89,552 s, C1 )

109,348 s, C 5' )

143,805 s, A 8 )

158,264 s, A 6 )

174,640 s, C9 )

179,553 s C 4/16 )

182,643 s, COO" )

184,966 s, COO" )

b. Versuch der präparativen Alkylierung via Wirt-Gast-KomplexZu in 5,0 ml Phosphatpuffer, pH7, gelöstem Co(ll)-cobyrinat (3,0-10e mol) wurden

ca. 25 mg 5'-0-Tosyladenosin gegeben, die Probe 15 Minuten Ultraschall ausgesetzt,anschliessend zentrifugiert, die nun klare Lösung abpipettiert und unter Lichtaus-

schluss und Stickstoff mit 15 mg NaBH4 in mehreren Portionen versetzt40.

Der Cyanidtest nach jeder NaBH4-Zugabe lieferte keinerlei Hinweis auf Alkylierung.Das UV/vis-Spektrum der Reaktionslösung zeigte nach beendeter NaBH4-Zugabe bei

>400 nm nur die Struktur des Co(ll)-cobyrinat. Im 1 H-NMR-Spektrum (Abbildung

83) der Probenlösung war praktisch nur Lösungsmittel erkennbar.

-_jJ

ppm 8 7 6 5 4 3 2 1

Abbildung 83: 1 H-NMR-Spektrum des Produktes der versuchten Adenosyl¬

ierung von Co(l)-cobyrinat in CD3OD via einen isolierten Komplex von Co(ll)-

cobyrinat mit 5'-0-Tosyladenosin (15)

40vgl. Synthese des Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N"

N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (18)

200

Hexakalium-Coa-aquo-Coß-adenosyl-cobamido-N,N',N",N"',

N"'\N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (18)

1 7 18

Ci 24H199O21 N13C0K7 Ci32H2i 1O25N1 6C0K6

a. Praparative Synthese

Es wurden 31,9 mg (1,25-10-5 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) in 4,0 ml

Methanol gelöst und in einer Glove-Box (02= 15 ppm) mit 25,7 mg P1O2, 10 ml

Essigsäure und Wasserstoff analog 24 zum Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) reduziert. Nach zwei Stunden

heftigen Rührens war der Umsatz zum Co(ll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -

hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) gemäss UV/vis-Spektrum quantitativ, und die

dunkelbraune Lösung wurde nach Entfernung des Katalysators durch Filtration durch

Glaswatte am Hochvakuum zur Trockene eingedampft.

Der Festkörper wurde in 1,0 ml Methanol gelöst, mit 73,4 mg NaBH4 (155 Äqui¬valente) versetzt41 und schliesslich 9,4 mg (2,17 Äquivalente) 5'-lodo-5'-deoxy-adenosin zugegeben. Die Reaktionslösung färbte sich augenblicklich hellbraun.

Zur Aufarbeitung entnahm man sodann die Reaktionslösung der Glove-box, versetzte

mit 7,0 ml eines 1,0 molaren Phosphatpuffers (pH 4,5) und zog am

Rotationsverdampfer das Methanol ab. Dabei bildete sich unter vollständiger

Entfärbung der Lösung ein brauner Niederschlag, welcher quantitativ abzentrifugiertwerden konnte.

Der amorphe Niederschlag Hess sich mit 10 ml ges. KHC03-Lösung langsam lösen und

derart gelöst auf ca. 10 ml XAD adsorbieren. Das XAD wurde zuerst mit 20 ml ges.

KHC03-Lösung gewaschen, dann mit 200 ml Wasser entsalzt. Die Elution mit 40 ml

Methanol führte zur vollständigen Entfärbung des XAD-Harzes. Man entfernte das

Methanol am Rotationsverdampfer, das verbleibende Wasser durch Lyophilisation.Das hellbraune Produkt fiel mit 8,0 ml Aceton aus 0,1 ml Methanol quantitativ aus42.

Nach Zentrifugation wurde der Niederschlag nochmals in 10 ml Aceton suspendiert und

zentrifugiert. Die Fällung wird wiederholt und das Produkt 24 h am Hochvakuum

getrocknet.Es verblieben 26,6 mg (89,2 %) 18 in Form eines feinen, braunen Pulvers.

41 Heftige Schaumentwicklung und Grünfärbung42 Die Mutterlauge war farblos.

201

Cl32H21l02sNi6CoK6

mw. 2715,769

DC (RP-18, MeOH) rf - 0,56

UV/Vis (H20, c= 1,45-10-5 M)

263 (20'550),350 ( 9'140),

304 (12'520), 314 ( 11'830),sh385 ( 4'860), sh 458 ( 5'240)

CD

Abb. 84

(H20, c= 1,45-10-5 M)

216 (306 (401 (573 (

2,59),

3,28),Sh1,03),

2,76),

253 (331 (431 (

-0,10),

12,40),

-5,17),

X0 bei 211, 225, 293, 365, 391, 409, 528

280 (378 (502 (

-2,93),sh

-1,21),

-2,41),

•l t* l e

t

cotmcH,),fioom

—-. CH, I f-CONHICH,)^:OOK<:OOC(CH,)rflNOC -

KOOCICHJJINOC

CH,

CONHKHJxpOOl

KOOC(CH,)jmOC^ CONH(CH,I^COOK

Abbildung 84: CD-Spektrum von Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-

cobamido- N, N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-

carboxylat) (18) in Wasser, c= 1,45-10'5 M

Hz6,7J=H1t,

H1m,

H1m,

Hz9,9J=H1d,

Hz1,9J=H1d,

H1s,

H1s,

H1s,

C-3'Hz6,7J=H1t,

3,75

3,98

C-2'H1m,

4,38

4,43

C-rHz1,9J=H1d,

5,70

6,88

7,98

8,26Allg.Teil

26Abb.

MHz)300,138,26-103M,c=(CD3OD,1H-NMR

dzumppm4,26ppm5,51

kollabierteingestrahlt


aC-5'H1m,0,28

1,17&1,42Maxima,

H143ca.insgesamt,401,60-0

CH33Hs,0,67

CH33Hs,0,80

CHg3Hs,1,56

CH3H3s,1,69

2,06MaximumH,45ca.insgesamt,602,60-1

151oder513Hs,2,27

151oder51H3s,2,32

H15ca.insgesamt,603,40-2

C-3'u.a.2Hm,3,63

H1m,4,18

C-2'H1m,4,26

c-rH1d,5,51

C-10H1S,6,87

8oder2AH1S,7,88

8oder2AH1S,ppm8,13

85Abb.

MHz)300,13M,5,36.10-3c=(D20,1H-NMR

(m)720(w)800(w)1040

(m)11101155(m)(w)1205(w)1220

(m)1250sh(m),1265(m)1310(m)1350

(s)14051465(m)(m)1495(s)1570

(s)1645(w)2410(w)2480(s)2860

(s)2920(m)3080(m),sh3290(s)3425

KBr)mg300inmg(1,0

202

203

CH?

KOOC<CH,),JINOC

CONHtCH,),£00*

CH, I f-CONHfCHJxPOOfK00C(CH,)^N0C-

CONHICH

jnOCICHjtxJINOC CONH(CH,),^COOK

h£°oi

(U)

Vj^^Jczr

876543210ppm

Abbildung 85: 1 H-NMR-Spektrum von Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido- N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carb-

oxylat) (18) in Deuteriumoxid, c= 5,36.10-3 M, 300,13 MHz

2,86 d, 1 H J = 16,1 Hz

3,40-2,80 insgesamt ca 15 H

2,44 s, 3H 51 oder 151

2,39 s, 3H 51 oder 151

2,60-2,15 insgesamt ca 33 H, Maximum 2,16

1,77 s, 3H CH3

2,15-1,70 insgesamt ca. 17 H

1,25 s, 3H CH3

1,70-1,00 insgesamt ca. 125 H, Maxima 1,60 & 1,18

0,97 s, 3H CH3

0,86 s, 3H CH3

0,78 s, 3H CH3

0,40 d, 1 H J= 7,5 Hz C-5'ß

0,30 t, 1 H J= 7,5 Hz C-5'a

Entkopplungsexpenmente

eingestrahlt kollabiert

0,25 ppm keine Veränderung sichtbar

4,28 ppm 3,76 ppm, t zu d / 5,68 ppm, d zu s

5,68 ppm 4,30 ppm, m zu d

204

13C-NMR (CD3OD, c= 1,26.10-2M, -1,0 °C, breitbandentkoppelt & DEPT)

16,37, 6,90, 17,35, 18,58, 20,00, 20,09, 20,63, (q, Je 1C )25,26 ( 1 C ) 26,29 1C ) 27,96 (t, ca 14 C )28,22 (t, ca 4C ) 28,28 ;t, ca 3 C ) 28,41 (t, ca 2C )

29,70 ( 1 C ) 29,94 1C ) 30,49 (t, ca 3C )

30,53 (t, ca 3C ) 30,61 ;t, ca4C ) 30,70 (t, ca 7C )

30,87 (t, ca 7C ) 30,91 t. ca7C ) 30,98 (t, ca 7C )31,07 (t, ca 7C ) 32,32 q, 1 C, C12B) 33,53 (t, 1 C )

33,88 (t, 1 C ) 34,02 t, 1C ) 34,92 (t. 1 C )

35,53 (t, 1 C ) 36,98 t, 1C ) 39,40 (t, ca 7C )

40,57 (t, 2C ) 40,74 t, 2C ) 41,10 (s, 1C.C2/12)

43,88 (d,1C, C18) 44,79 s, 1C.C2/12) 46,94 (d,1C,C3/8/13)48,04 (d,1C,C3/8/13) 51,61 s, 1C, C7) 54,00 (d,1C,C3/8/13)60,32 (s, 1C, C17) 73,98 d, 1C, A3') 74,56 (d,1C,A27C19)76,37 (d,1C,A27C19) 86,14 d, 1CA4711) 88,40 (s, 1C, C1)89,44 (d,1C A1714) 98,74 d, 1C, C10) 108,28 (s, 1C, C5/15)

109,35 (s, 1C,C5/15) 120,26 s, 1C A5) 150,53 (s, 1C, A8)

154,44 (s, 1C A4) 157,55 s, 1C, A2) 161,60 (s, 1C, A6)

164,18 (s, 1C, C6/14) 165,61 s, 1C C6/14)

172,00;1 73,03;173,39; 173,50; 174,58; 174,62; 174,67; 174,93;

174,99; 177,40; 178,00 (je 1CC.ON und C-4, 9, 12, 16)

183,18 (s, 7C, -COO") Zugeordnet analog [106]

MS (FAB(-), 3-NOBA, m/z 500-2V00)

2426,4 (58,

2349,5 (100

2039,7 (50,

1767,6 (28,

1616,4 (20,

1469,3 (25,

1179,3 (44,

1156,0 (40,

1147,2 (50,

M-Ado-K++H++H-) 2388,7 (70, M-Ado-2K++2H+-i

M-Ado-3K++3H++H") 2249,4 (80, M-Ado+CH2"-6K+

M-Ado-14x(CH2)-6K++6H+)

M-Ado-24x(CH2)-3C02-6K++6H+)

M-Ado+H20-33x(CH2)-4C02-6K++6H+)

M-Ado-39x(CH2)-5C02-6K++6H+)

M-Ado-6xHN-6K++6H+-47x(CH2)-7C02)

M-Ado-6xHN-6K++6H+-50x(CH2)-7C02+H20)

M-Ado-6xHN-5K++6H+-52x(CH2)-7C02)

H")f6H+

b. Versuch der präparativen Alkylierung zu 18 via Wirt-Gast-

Komplex

7,6 mg (3,0-10-6 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) wurden analog 24 in 5 ml

Methanol gelöst und mit 5 ul Essigsäure, 11,9 mg Platindioxid und Wasserstoff

während einer Stunde zu Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) reduziert43. Der Katalysator wurde sodann durch Watte

abfiltriert und die Lösung am Rotationsverdampfer getrocknet.

43 Siehe 7.5.1, quantitativ gemäss UV/vis-Spektrum

205

In einer Glove-box löste man das Co(ll)-cobamido-N,N',N",N"',N"", N ,N -

hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) in 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7, versetzte mit

25,6 mg (6,1-10'5 mol) 5'-0-Tosyladenosin (15) und beschallte das gutverschlossene Gefäss nach Entnahme aus der Glove-box während 15 Minuten mit 50

kHz Ultraschall. Suspendiertes Material wurde abzentrifugiert. Man verbrachte das

Gefäss wieder in die Glove-box, wo 15 mg (0,41 mM) Natriumborhydrid zur

abpipettierten Lösung zugegeben wurden. Nach beendeter Reaktion (UV/vis-

spektroskopische Kontrolle) wurde die Lösung der Glove-box entnommen.

Die Aufarbeitung erfolgte analog der Synthesevariante a des Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carb-

oxylat) (18).

Das 1 H-NMR-Spektrum des Produktes (Abbildung 86) in Deuteromethanol war

identisch mit dem des 18 enthielt aber als Verunreinigung ca. 1,5 Äquivalente S'-O-

Tosyladenosin (15). Das UV/vis-Spektrum entsprach im Bereich oberhalb 300 nm

dem des Beschreibungsansatzes des Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (18).

Nach Zugabe von KCN in der Dunkelheit und Stehenlassen der Lösung, bis zur Konstanz

des UV/vis-Spektrums wiederholte man die Messung des 1H-NMR-Spektrums in

Deuteromethanol. Das 1H-NMR-Spektrums des erhaltenen Produkts war nun

abgesehen von der Verunreinigung durch 5'-0-Tosyladenosin identisch mit

Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-

10'-carboxylat) (17).

J I I I I I I L

8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

Abbildung 86: Hexakalium-Coa-aquo-Coß- 5'- adenosyl- cobamido- N, N', N", N"\

N"",N'"",N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (18) in CD3OD, synthetisiert via

isolierten Komplex von Co(ll)-cobamido-N,N',N",N-,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-

10'-carboxylat) mit 5'-0-Tosyladenosin (15) in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,

verunreinigt mit ca. einem Äquivalent 5'-0-Tosyladenosin (15)

206

6.5.3 Alkylierung mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat

(15) und 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin

unter Natriumborhydridreduktion

Produkt der Umsetzung mit Co(l)-cobyrinat (31)

a) mit 5'-Chloro-1,N6-ethenoadenosin

Man reduzierte 33,8 mg (2,69-105 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat(24) mit 20,5 mg Platindioxid, 16 ui Essigsäure und Wasserstoff in einer Lösungvom 5 ml Methanol analog 1744 zum Co(ll)-cobyrinat.Die am Rotationsverdampfer getrocknete Hexakalium-Co(ll)-cobyrinsäure wurde

zusammen mit 121,9 mg (3.74-10"4 mol, 13,9 Äquivalente) 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin-H20 in 5 ml Methanol gelöst und in Abständen von ca. 20

Minuten 412 mg (1,09-102 mol, 404 Äquivalente) NaBH4 in ungefähr fünf

gleichgrossen Portionen zugegeben. Die Reaktion war gemäss UV/vis-Spektrum und

Cyanidtest nach zwei Stunden quantitativ abgelaufen (konstantes Spektrum).

Zur Aufarbeitung versetzte man zuerst mit 3 ml 1M wässrigem Phosphatpuffer, pH 3,

sowie 5 ml Phosphatpuffer pH 4,5 und zog das Methanol nach Beendigung der

Gasentwicklung bei Raumtemperatur ab.

Die wässrige Lösung wurde durch eine SEP-Pack C-18 Kartusche geführt und solange1 M Phosphatpuffer pH 4,5 zugegeben (ca. 10 ml) bis die Substanz auf dem Trägerhaften blieb.

Der C-18 Träger Hess sich gemäss UV/vis-Spektrum der Waschflüssigkeit ohne

Substanzverlust mit 10 ml Wasser waschen und das Produkt 31 mit 8 ml Methanol

vollständig eluieren. Die Kapazität der verwendeten SEP-Pack Kartuschen lag bei ca.

40 % der hier verwendeten Substanzmenge, sodass der Adsorptions- und

Elutionsvorgang zweimal zu wiederholen war.

44 Siehe 7.5.1

207

Von den vereinigten Eluate wurden zuerst am Wasserstrahl das organische Lösungs¬mittel abgezogen, anschliessend die zurückbleibende wässrige Lösung lyophilisiert.Das Rohprodukt enthielt nach viermaliger Fällung (anfangs gelöst in jeweils 5 ml

Methanol mit 100 ml Aceton gefällt, dann dreimal gelöst in 0,2 ml Methanol und mit

10 ml Aceton gefällt) und 12 stündiger Trocknung am Hochvakuum noch ca. 10 % 5'-

Chloro-5'-deoxy-l,N6-etheno-adenosin.Die praparative Dünnschichtchromatographie des Rohproduktes auf einer RP-18

Platte 10 x 20 cm, Methanol:H20 , 6,5:5, lieferte drei Banden (rf= 0,07 fluoreszier¬

end, rf= 0,41 dunkelbraun, rf= 0,45-0,64 hellbraun). Die Letzteren enthielten die

als Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat (21) ver¬

mutete Substanz wobei nur die Bande mit rf= 0,41 gemäss 1 H-NMR-Spektrum frei

von Verunreinigungen durch Alkylierungsmittel war. Das methanolische Eluat dieser

Fraktion wurde nach Einengen am Rotationsverdampfer auf ca. 0,1 ml mit 8 ml Ether

gefällt, der feine Niederschlag bei 4'000 Upm während fünf Minuten abzentrifugiert,die farblose Mutterlauge dekantiert und der braune, pulvrige Rückstand (3,8 mg, 10

%) 48 Stunden am Hochvakuum getrocknet.

C56H660i8N8CoNae

mw. 1335,465

DC (RP-18, CH3OH:H20, 10:2)

rf= 0,20

1 H-NMR (CD3OD, C= 3,72-103M, 300,13 MHz)

7,33 ppm s, 1 H Alkylrest7,16 S, 3H Alkylrest6,83 S, 1 H C-10

5,36 d, 1 H J = 3,8 Hz C-1-

4,98 d, 1 H J- 9,8 Hz C-19*

4,27 d, 1 H J = 8,6 Hz C-3*

4,00 m, 2H C-2', C-8*

3,47 t, 1 H J = 6,2 Hz C-3'

3,00 t, 1 H J = ca. 9 Hz C-18*

2,47 s, 3H 51 oder 151

2,45 s, 3H 51 oder 151


1,80 s, 3H CH3


1,60 s, 3H CH3

1,57 s, 3H CH3


1,34 s, 3H CH3

0,97 s, 3H CH3

0,89 s, 3H CH3

0,50 d, 1 H J = 9,0 Hz C-5'a

0,20 t, 1 H J = 7,6 Hz C-5'ß*

Zuordnung analog [107]

208

abs

2.0

0,0

Abbildung 87: UV/vis-Spektrum von 31 in Wasser, c= 4,66-10'5 M

—dcAÄ

ppm 7

M^iJLAJ_J I L-

5 4 3

Abbildung 88: 1 H-NMR-Spektrum von 31 in Deuteromethanol, c= 3,72-103

M, 300,13 MHz

209

13C-NMR (CD3OD, 100 MHz, c- 4,11 1Qr2 M, breitbandentkoppelt & DEPT)

16,60 (q, C51 ) 16,72 (q. C 151 ) 18,09 q, C 17B

19,49 (t, A5' ) 19,97 (q, C2A ) 20,95 q, C7A

25,18 (q, C 12A ) 29,01 (t(b elt)C 81 ) 32,31 q, C 1A

32,44 (q, C 12B ) 33,4 (t(brelt)C 31 ) 34,3 •(brelt)C 131

35,2 (t(br)C 172 ) 35,98 (t, C 172 ) 36,65 t(breit)C 82

37,01 (t, 181/132) 37,29 (1, C 181/132) 39,30 t, C32

41,96 (d, C 18 ) 47,08 (t, C71 ) 47,88 t, C21

51,00 (s, C 2/12 ) 54,54 (d, C13 ) 57,11 d, C3

57,24 (d, C8 ) 57,52 (d, ) 57,73 d,

57,99 (d, ) 60,81 (s, C17 ) 73,59 d, A 3'

73,82 (d, C 19 ) 75,31 (d, A 4' ) 77,68 d, A 4'

86,89 (d, ) 88,47 (s, C1 ) 88,97 s, A V

97,77 (d, C 10 ) 108,11 (s, C15 ) 108,77 s, C5

122,66 (d, ) 126,36 (s, ) 132,48 (d,

139,74 (s, ) 143,59 (s, ) 164,15 s,

167,20(s, ) 174,17 (s, C9? ) 176,58 s, coo-

178,22 (s, COO" ) 179,05 (s, COO" ) 179,42 s coo

179,95 (s, COO" ) 180,42 (s, COO" ) 180,71 s, COO"

' Zuordnung tentativ

b) mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)

Man reduzierte 19,8 mg (1,56.10"5 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobynnat(24) mit 22,0 mg Platindioxid, 16 ul Essigsäure und Wasserstoff in einer Lösungvom 5 ml Methanol analog 17 zum Co(ll)-cobynnat

Zur Adenosylierung wurde das Co(lt)-cobynnat in 5 ml Methanol gelöst, mit 9,3 mg

(2,09 10 s mol, 1,33 Äquivalente) 1,N6-Ethenoadenosyl-5--0-tosylat45 (16)versetzt und nacheinander 649 mg NaBH4 in vier etwa gleichgrossen Portionen

zugegeben Der Cyanidtest zeigte nach einer Stunde das Ende der Reaktion an

Zur Aufarbeitung versetzte man die Reaktionslösung mit 25 ml 1 M Phosphatpuffer,

pH 4,5, zog das Methanol am Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur ab, und

adsorbierte das Produkt durch Spülen der klaren Lösung durch drei SEP-Pack

Kartuschen unter praktisch vollständiger Entfärbung der Lösung Die Kartuschen

wurden daraufhin jeweils mit 5 ml H20 gewaschen, anschliessend mit 5 ml Methanol

das Produkt vollständig eluiert Das Produkt 31 liess sich nach Abziehen des

Lösungsmittels am Rotationsverdampfer und am HV mit 50 ml Aceton aus 1,4 ml

Deuteromethanol fällen Nach zwei Stunden bei 5 °C konnte die nur schwach gefärbte

Mutterlauge vom Bodensatz abpipettiert werden Das nach dieser ersten Fällung gemäss

DC noch als Verunreinigung enthaltene Tosylat 16 trennte bei einer zweiten, analogen

Fällung ab

Das am HV während 48 Stunden getrocknete, hellbraune Pulver (11,5 mg, 50,0 %)

gelangte zur Charakterisierung

aus Beschreibungsansatz

210

UV/Vis (H20, C» 4,66-10-5 M)Abb. 87

263 ( 32-900) 293 ( 25'300), sh 301 ( 25'200),374 ( 8'180),sh 393 ( 7'260), Sh 454 ( 8'650)

CD (H20, c- 4,66-10-5 M)Abb. 89

218 ( 5,36), 250 ( -15,50), 279 ( -2,79),sh302 ( 6,22),Sh 328 ( 23,60), 378 ( -3,86),401 ( 1,07), 432 ( -7,08), 503 ( -5,79),567 ( 3,43),

X0 bei 211, 228, 288, 360, 395, 408, 531

IR (1,2 mg in 300 mg KBr)Abb. 90

3430 (s) 2970 (m)1490 (m) 1400 (s)1200 (w) 1130 (m)990 (w) 932 (w)

1760 (w), sh 1570 (s)1350 (m), sh 1300 (m)1105 (m) 1050 (w)820 (w) 735 (w)

670 (w),sh 610 (w),sh 545 (m)

1 H-NMR (CD3OD, c= 1,13-102M, 300,13 MHz)

7,33 s, 1 H Alkylrest7,14 s, 3H Alkylrest6,82 S, 1 H C-10

5,36 d, 1 H J = 3,8 Hz C-1'

5,12 d, 1 H J = 10,6 Hz C-19*

4,31 d, 1 H J = 8,7 Hz C-3*

4,02 m, 1 H C-2-+

3,98 m, 1 H C-8*

3,47 t, 1 H J = 6,3 Hz C-3'+

3,28 m, 1 H C-13*

3,03 (breit) t, 1 H C-18*

2,78 (breit) q, 2H

2,65- 1,80 ca. 26 H

2,47 s, 3H 51 oder 151

2,45 s, 3H 51 oder 151

1,79 s, 3H CH3

1,60 s, 3H CH3

1,57 S, 3H CH3

1,35 S, 3H CH3

0,97 s, 3H CH3

0,88 s, 3H CH3

0,54 d, 1 H J= 3,07 Hz C-5'

0,15 t, 1 H J = 17,77 Hz C-5'

Zuordnung aufgrund Entkopplungsexpenment;* Zuordnung analog [107]

211

Abbildung 89: CD-Spektrum von 31 in Wasser, c= 4,66-10"5 M

-I l • I I I' '

I ' ' ' l ' ' i ' ' i

4'000 3'500 Stt» 2'500 2'000 1800 V600 V400 1'200 l'OOO 800 600 400

cm-1

Abbildung 90: IR-Spektrum von 1,2 mg 31 in 300 mg KBr

212

Entkopplungsexperiment (300,13 MHz)

eingestrahlt bei

5,36 ppm

3,48 ppm

0,54 ppm

Änderungen im Spektrumm, (4,05 ppm) zu d, J=ca. 6 Hz

m, (4,05 ppm) zu d, J= ca. 6 Hz

Wirkung auf C-4' nicht sichtbar

t, (0,15 ppm) zud, J= 12,4 Hz

MS (FAB(+), 3-NOBA, m/z 500-1'500)Abb. 91 1394 (0,002; M-Na++2K+);

1379 (0,004; M+H20+Na+);1356 (0,005; M+H20+H+);1336,9 (0,010; M+H+);1317 (0,007; M-Na++2H+);1117,6(5; M-Alkyl-Na++2H++H20);1096,5 (13; M-Alkyl-2Na++3H++H20);1075,5(17; M-Alkyl-2Na++3H+);1058,5 (18);1037,1 (23);

1021,1 (18);998,1 (15;);975,9 (12; Ringfragment).

(FAB(-), 3-NOBA, m/z 50-1'500)1370.4 (1,5);1312.5 (2,0; M

1155.6 (1,1)958,2 (1,9)882,2 (1,5)837,4 (1,6).

1337,4 (1,0; M-);-2Na++3H++H20); 1274,6

1035,2 (2,6)928,3 (1,3);851,3 (1,5);

(1-8);

Abbildung 91: FAB(+)-MS-Spektrum von 31, Matrix 3-NOBA

213

Produkt der Umsetzung mit Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"", N""',N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (32)

1 7 32

Cl24Hl9902iN-|3CoK7 ?

Analog der bereits beschriebenen Vorgehensweise46 reduzierte man 69,6 mg

(2,74-105 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,

N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (17) in einer Lösung vom 5 ml Methanol mit

33,0 mg Platindioxid, 100 ml Essigsäure und Wasserstoff.

Das am HV getrocknete Hexakalium-Co(ll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -

hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) wurde zusammen mit 194,1 mg (5,96-10-4 mol,

21,7 Äquivalente) 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin-H20 in 5 ml Methanol

gelöst und in Abständen von einigen Stunden 652 mg (1,79-10"2 mol, 237

Äquivalente) NaBH4 in vier ungefähr gleichgrossen Portionen zugegeben. Die

Reaktionslösung, die gemäss UV/vis-Spektrum und Cyanidtest nach 18 Stunden weder

Co(l)- noch Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) enthielt, wurde mit 7 ml 1 M Phosphatpuffer pH 9 versetzt und das

Methanol noch in der Glove-Box am HV47 entfernt.

Die Lösung wurde solange mit kristallinem KHCO3 versetzt bis der Chromophorquantitativ an 5 ml XAD adsorbierte. Nach Waschen mit 10 ml Wasser und Elution mit

10 ml Methanol wurde das Lösungsmittel entfernt.

Das in ca. 10 ml Wasser gelöste Rohprodukt wurde mit ca. 200 mg kristallinem KHCO3versetzt und die Substanz auf drei SEP-Pack Kartuschen aufgezogen. Man wusch

anfangs jeweils mit 120 ml MeOH:H20,1:2, und erhöhte dann für die nächsten 200 ml

den Methanolanteil auf 80 %. Die durch anschliessende Elution mit 20 ml Methanol

erhaltene hellbraune Lösung trocknete man am Rotationsverdampfer und anschliessend

am HV. Der derart erhaltene Lack wurde in 0,1 ml Methanol aufgenommen und mit 5

ml Ether gefällt. Der während fünf Minuten bei 4000 Upm abzentrifugierteNiederschlag 32 gelangte nach 48 Stunden am HV als hellbraunes Pulver zur

Charakterisierung.

46 Siehe 7.5.1

47 Bildung eines temporären Niederschlages

214

Cl33H21l02sN15CoK6

mw. 2713,773

DC (RP-18, CH3OH/H20, 50:10)

rf= 0,10

UV/Vis

ä I

(H20, c= 5,65-10-5 M)

264 ( 24-200), 303 ( 16'730), 314 ( 15'130), sh

380 ( 6'270), 454 ( 6'520).

CD (H20, c= 5,65-10-5 M)Abb. 92

251 ( -12,40), sh 260 ( -13,80), 280 ( -4,42),sh

306 ( 6,02), Sh 330 ( 20,40), 378 ( -1 ,42),

401 ( 1,95), 434 ( -7,08), 505 ( -4,25),568 ( 3,36)

X0 bei 220, 292, 363, 390, 411, 532 nm

\J

Abbildung 92: CD-Spektrum von 32 in Wasser, c= 5,65-105 M

215

1 H-NMR (CD3OD, c= 4,95-W3M, 300,13 MHz)Abb. 93

7,29 ppm

7,13

6,91

5,36

4,97

4,54

4,00

3,51

3,45

3,26

2,90

2,66

2,48

2,42

2,24

2,22

2,00

1,77

1,66

1,59

1,43

1,32 (breit)

1,21

0,99

0,83

0,46

0,34*

Zuordnung

S,

S,

S,

d,

d,

d,

m,

t,

m,

1 H

3H

1 H

1 H

1 H

1 H

2H

1 H

1 H

3,0 Hz

9,9 Hz

7,5 Hz

8,7 Hz

-3,20

-2,46

ca. 48 H

s, 6H

s, 3H

ca.9H

ca.6H

ca.9H

ca. 24 H

s,ca. 3 H

s, 3H

m, ca. 24 H

s, 6H

m, ca. 48 H

s,ca. 3 H

s, 3H

s, 3H

d, 1 H

t, 1 H

analog [107]

7,5 Hz

7,0 Hz

AlkylrestAlkylrestC-10

V

19

3

2-,8

3'

13

18

-C-NH-CO-

CH3

u.a.CH3

u.aCH3u.a.CH3-a-coo-

CH3

CH3

aliphat.Kette

aliphat.Kette

CH3CH3C-5'

C-5'

=JJct

Abbildung 93: 1 H-NMR-Spektrum von 32 in Deuteromethanol, c= 4,95-10'3 M,

300,13 MHz

216

6.5.4 1,N6-Ethenoadenosylierungen

Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat (21)

j^^

24 2 1

C47H52O14N6C0K7 Cs/HseOisNgCoNas

a1. Zugabe des Alkylierungsmittels nach elektrochemischer Erzeugungdes Co(l)-cobyrinat

32,4 mg (2,58-10'5 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) wurden mit

13,3 mg Pt02, 10 ml Essigsäure und Wasserstoff analog (17) zu Co(ll)-cobyrinat in

einer Glove-box reduziert, in 7 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7, Methanol/Wasser,

1:1, gelöst und in eine Elektrolyseapparatur gemäss (105] gefüllt. Nach vier Stunden

bei einem Potential von -1,2 V, nachdem der Strom auf unter 5% des Anfangswertes

gefallen war, fügte man 62,5 mg (1,92-10-4 mol, 7,4 Äquivalente) kristallines 5'-

Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin zu (7,6.10-5 Faraday, 3,0 Äquivalente).

Zur Aufarbeitung entfernte man 40 Minuten später am Rotationsverdampfer das

Methanol und versetzte die verbleibende wässrige Lösung solange mit 1 molarem

Phosphatpuffer, pH 4,5, bis das Produkt auf SEP-Pack C-18 (4 ml Kartusche)adsorbierte. Das Adsorbat wurde mit 80 ml Wasser gewaschen, mit 5 ml Methanol das

Corrin vom C18-Träger eluiert, das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei RT

abgezogen, der Rückstand mit ca. 1 ml Wasser versetzt und NaHC03 kristallweise

dazugegeben bis der Festkörper vollständig in Lösung ging.

Aus der am Rotationsverdampfer bei RT auf ca. 0,4 ml eingeengten Lösung wurde das

Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat (21) mit 8 ml

Aceton quantitativ gefällt. Nach Wiederholung der Fällung war das Präzipitat DC-

einheitlich und Hess sich nach Lyophilisation (Ausbeute gemäss UV/vis-Spektrum

87%) wie folgt charakterisieren.

C57H660l8NcjCoNa6

mw. 1361,482

217

DC (RP-18, CH3OH:H20, 7:3)

rf= 0,74

UV/Vis (H20, C= 4,41-10-5 M)Abb. 94

225 ( 43'630), 264 ( 24'410),302 ( 2V040), 372 ( 7'320),sh

274 ( 18-190),Sh454 ( 8-000)

CD

Abb. 95

(H20, C- 4,41-10-5 M)

235 ( 7,94), 260 (305 ( 7,48), sh 328 (433 ( -7,94), 501 (

-7,26), 280 (

22,70), 383 (

-6,12), 512 (

X0 bei 228, 242, 293, 362, 529 nm

1 H-NMR (D20, C= 2,00-10-2 M, 300,13 MHz)

Abb. 28

-5,22),-3,63),

4,54),

8,96 ppm S, 1 H A-2+

8,11 S, 1 H A-7+

7,93 d, 1 H J = 1,5 Hz A-10 Oder 11

7,53 d, 1 H J = 1,5 Hz A-10 oder 11

6,75 s, 1 H C-10

5,67 d, 1 H J = 4,1 Hz C-1'

4,54 d, 1 H Jf 4,1 Hz J2= 1,5 Hz C-19"

4,51 dd, 1 H A12"

4,14 d, 1 H J = 7,6 Hz C-3+

3,72 m, 2H A3' +, C8 0.13

3,08 m, 1 H C-8 oder 13+

2,71 t, 1 H C-18"

2,70-1,00 ca. 27 H (ohne bereits zugeordnete)

2,33 s, 3H 51 oder 151

2,21 s, 3H 51 oder 151

1,71 s, 3H C-47 0.25 o. 36+

1,45 s, 3H C-47 o.25 o. 36+

1,36 s, 3H C-47 o.25 o. 36+

0,86 s, 3H C-17B+

0,74 s, 3H C-12B+

0,51 s, 3H C-1A+

0,38 d, 1 H J = 8,5 Hz C-5' ß0,07 t, 1 H J« 8,4 Hz C-5' a

+ zugeordnet analog 1,N6-Ethenoadenosylcobalamin (4); "zugeordnet aufgrund


218

COONfCOONa

(21)

Abbildung 94: UV/vis-Spektrum von Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat (21) in Wasser, c=

4,41-10"5 M

Ec

8

V

Abbildung 95: CD-Spektrum von Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat (21) in Wasser, c=

4.41-10-5 M

219

1 H-NMR (CD3OD, c= 2,00-10'2M, 300,13 MHz)Abb. 29

Allg. Teil 9,10 s, 1 H A 2+

8,22 s, 1 H A7+

8,03 d, 1 H J= 1,2 Hz A-10 oder 11

7,56 s, 1 H A-10 oder 11

6,74 s, 1H C-10

5,72 d, 1 H J= 2,6 Hz C-1'

4,97 d, 1H z.Teil unter HDO C-19?

4,40 m, 1 H C-2'*

4,34 d, 1 H J= 8,9 Hz

3,96 m, 1 H

3,82 t, 1 H J= 6,5 Hz C-3'*

3,09 m, 1 H

2,99 t, 1H J = ca. 4,5 Hz

2,80-1,70 insgesamt 37H

2,71 d, 2H J= 13,5 Hz

2,49 s, 3 H CH3

2,42 s, 3H CH31,81 s, 3H CH31,70-0,40 insgesamt 18H

1,60 s, 3H CH31,51 s, 3H CH3

1,21 s, 3H CH30,94 s, 3 H CH3

0,51 s, 3H CH3

0,01 t, 1 H C-5' a

*: Zuordnung mit Entkopplungsexpenment, '• Zuordnung tentativ


eingestrahlt bei Änderungen im Spektrum

5,74 ppm 4,40 ppm, m zu d, J= ca. 6 Hz

4,40 ppm 5,74 ppm, dzus,

3,83 ppm, tzu d, J= ca. 7,2 Hz

3,83 ppm 4,40 ppm, mzud, J= ca. 3 Hz

minimale Intensitätsverschieb. 2,12 ppm

0,00 ppm minimale Intensitätsverschieb. 2,12 ppm

3,00 ppm minimale Intensitätsverschieb. 2,12 ppm

Intensitätsverschiebung 2,38 ppm

13C-NMR (D20, c= 2,12-10-2M, 100 MHz, breitbandentkoppelt & DEPT)

17,90 (q,1C, C 51) 18,19 (q,1C, C 151) 19,37 (q,1C, C 17B)

19,83 (t,1C, A 5') 20,47 (q,1C,C2A/7A) 21,62 (q,1C,C2A/7A)

21,86 (q,1C, C12A) 26,64 (q,1C, C 1A) 29,08 (t,1C, C 81)

29,45 (t,1C, C31) 30,18 (t,1C, C 132) 33,44 (q,1C, C 12B)

35,02 (t,1C, C 172) 35,14 (t,1C, C 171) 36,28 (t,1C, C 82)

220

36,57 (t,1C,181/132) 38,00 (t,1C,181/132) 40,57 (t,ic, C32)

43,23 (d,1C, C 18) 48,14 (MC C 71) 48,26 (t,1C, C 21)

48,94 (s,1C,C2/12) 49,27 (s,1C, C2/12) 52,47 (s,1C, CT,

55,08 (d,1C, C 13) 57,87 (d,1C, C3) 58,45 (d,1C, C8)

61,41 (s,1C, C 17) 74,91 (d,1C, A 3') 75,37 (d,1C, C 19)

78,09 (d,1C, A 2') 88,91 (s,1C, C1) 89,63 (d,1C, A 4')

91,20 (d,1C, A 1') 99,66 (d,1C, C 10) 109,49 (s,1C, C 15)

110,45 (s,1C, C5) 115,77 (d,1C,A10/11) 125,06 (s,1C, A 5)

134,71 (d,1C,A10/11) 140,10 (d,1C, A2/8) 141,17 (s,1C, A4/5)

143,13 (s,1C, A 4/5) 143,75 (d,1C, A2/8) 165,63 (s,1C, C6/14)

167,04 (s,1C,C14/6) 174,71 (s,1C, C9) 174,80 (s,1C, C 11)

178,17 (s,1C,C4/16) 179,17 (s,1C, C4/16) 179,63 (s,1C, £00-)

181,30 (s,1C, £00-) 182,38 (s,1C, £00-) 183,80 (s,1C, £00-)

184,01 (s,1C, £00-) 184,23 (s,1C, £00-) 184,56 (s,1C, £00-)

a2. Zugabe des Alkylierungsmittels vor elektrochemischer Reduktion zu

Co(l)-cobyrinat

Es wurden 45,7 mg (3,63-10"5 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24)

analog 1748 zum Co(ll)-corrin reduziert, in 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,

Methanol/Wasser, 1:1, gelöst, 84,8 mg (2,61-10"4 mol, 7,2 Äquivalente) 5'-

Chloro-5'-desoxy-1 ,N6-ethenoadenosin zugefügt und bei -1,2 V während drei Stunden

elektrolysiert (1,6-10"4 Faraday, 4,6 Äquivalente).

Zur Aufarbeitung entfernte man am Rotationsverdampfer das Methanol und versetzte

die verbleibende wässrige Lösung solange mit 1 molarem Phosphatpuffer, pH 4,5, bis

das Produkt auf eine 4 ml SEP-Pack C-18-Kartusche adsorbierte. Das Adsorbat wurde

mit 80 ml Wasser gewaschen und mit Methanol eluiert.

Mit der am Rotationsverdampfer auf ca. 0,1 ml eingeengten Lösung des Rohprodukteswurde eine praparative Dünnschichtchromatographie auf zwei RP-18 Platten, 10 x

20 cm, mit Methanol:H20 (6,5:5) als Laufmittel durchgeführt. Die Hauptfraktion49(rf= 0,77) wurde mit Methanol eluiert, das Eluat mit NaHC03 neutralisiert, das

Produkt 21 nach Einengen der Lösung am Rotationsverdampfer auf ca. 0,1 ml mit 8 ml

Ether gefällt, der feine Niederschlag bei 4'000 Upm während fünf Minuten

abzentrifugiert, die farblose Mutterlauge dekantiert und der braune, pulvrigeRückstand (3,8 mg, 10 %) 30 Stunden am Hochvakuum getrocknet.

Man erhielt 29,7 mg (61%) Produkt 21 in Form eines braunen Pulvers mit

folgenden spektroskopischen Eigenschaften.

48 Siehe 7.5.1

49 Das DC zeigte eine Vielzahl von Banden.

221


3430(s),br 3255(m),sh 3120(m),sh 2960(m),

2930(m),sh 2490 (w),sh/br 1775 (w), 1705(m),sh

1645(m), 1575 (s), 1480(m), 1400(s),

1385(s),sh 1350(m), 1355(m), 1300(m),

1260(w), 1220(m), 1205(m), 1185(w),sh

1155(w),sh 1135(m), 1100(m), 1045(m),

1020(m), 970 (w), 955 (w),sh 930 (w),875 (w), 815 (w), 750 (w),sh 700 (w),650 (m), 605 (m), 560 (m)

1 H-NMR (D20, c= 3,04-10'2 M, 300,13 MHz)

8,91 S, 1 H A2+

8,07 S, 1 H A8+

7,90 s, 1 H A-10/11

7,50 s, 1 H A-10/11

6,76 s, 1 H C-10

5,63 d, 1 H J = 3,81 Hz C-1'

4,53 d, 1 H J = 10,49 Hz C-19"

4,46 q'oid,1 H C-2' "

4,11 d, 1 H J = 8,72 Hz C-3

3,74 t, 1 H J = 6,01 Hz C-3' "

3,71 m, 1 H C-8 oder 13

3,15 m, 1 H C-8 oder 13

2,73 t'oid1,1 H J = 9,57 Hz C-18"

2,53 dd'oid,2 H Ü1 =. 15,6 Hz

J2.: 3,75 Hz


2,30 s, 3H C-51 oder 151

2,21 s, 3H C-51 oder 151

2,17 m, 1 H C-2' "

1,69 s, 3H CH31,41 s, 3H CH31,35 s, 3H CH30,90 s, 3H CH3 C-17B

0,72 s, 3H CH3 C-12B

0,51 s, 3H CH3 C- 1A

0,45 d, 1 H J = 8,02 Hz C-5' ß0,07 t, 1 H J = 8,79 Hz C-5' a

"

zugeordnet mit Entkopplungsexperiment



0,04 ppm 0,48 ppm, d zu s

2,18 ppm, m zu d, J= ca. 5,8 Hz

222

2,72 ppm 2,19 ppm, neuer Peak

4,55 ppm, d zu s

3,75 ppm 2,17 ppm, m zu d, J= ca. 7,0 Hz

4,48 ppm, t zu d, J- ca. 4,0 Hz

MS (FAB(-), Glycerin, m/z 50-1'50)

1087,4 (7; M'-eAdo) 1024,3 (10) 980,3 (10)

958,3 (21) 936,3 (100) 921,5 (22)

898,5 (25) 876,2 (30) 385,9 (6)

361,8 (140;(M-EAdo)3')

Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobyrinsäure

Ca. 12,1 mg (8,91 -10-6 mol) Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobyrinat(21) aus Synthese a1. wurden in wenig Wasser gelöst, aus dieser Lösung auf SEP-

Pack C-18 adsorbiert, mit 30 ml Wasser gewaschen, die Substanz mit Methanol

eluiert und der am Rotationsverdampfer getrocknete Rückstand mit 10 ml Ether aus

0,1 ml Methanol gefällt.

Nach zweitägiger Trocknung am Hochvakuum wurden 10,8 mg (8,82-10-6 mol, 99%)eines braunen Pulvers mit folgenden spektroskopischen Eigenschaften erhalten.

mw. 1230,192

1 H-NMR (CD3OD, c= 1,26W2M, 300,13 MHz)

9,11 (breit) s, 1 H A-2 +

8,24(breit) S, 1 H A-8/A 10 oder 11

8,13(breit) s, 1 H A-8/A 10 oder 11

7,92(breit) s, 1 H A 10 oder 11

6,91 s, 1 H C-10

5,80(breit) s, 1 H C-1'

4,30 m, 1 H

4,16 d'oid, 1 H J= 7,7 Hz

3,89 m, 1 H

3,78 m, 1 H

3,66 m, 2H

3,38 m, 1 H

3,10-0,60 insgesamt ca. 96 H mit Signalmaximabei 1,99/1 ,97/1,94/1,72/1,71 ppm

2,90 s, 3H CH3

1,83 s, 3H CH3

223

1,61 S, 3H

1,48 S, 3H

1,04 S, 3H

0,90 S, 6H

0,72 d, 1 H

0,37 t, 1 H

CH3

CH3

CH3

CH3J= 8,0 Hz A5'a

A5'ß

1 H-NMR (D2O, c= 3,22 10-2M, 300,13 MHz)

9,00(breit) S, 1 H A2

8,13(breit) s, 1 H A-8/A 10 oder 11

7,96(breit) s, 1 H A-8/A 10 oder 11

7,56(breit) s, 1 H A 10 oder 11

6,79 S, 1 H C-10

5,64(breit) s, 1 H C-1'

4,56 d, 1 H J= 10,2 Hz C-19

4,43 m, 1 H C-2'

4,10 m, 1H C-3

3,75 t, 1 H J= 5,9 Hz C-3'

3.68 m, 1 H C-8/13

3,21 m, 1 H C-8/13

3,00-0,30 insgesamt 51 H

2,71 t'oid C-18

2,30 s, 3 H 51 oder 151

2,24 s, 3 H 51 oder 151

1.69 S, 3H CH3

1,42 s, 3H CH3

1,35 s, 3H CH3

0,94 s, 3H CH3

0,72 s, 3H CH3

0,57 s, 3H CH3

0,50 d, 1 H J= 8,5 Hz A5'ß

0,12 t, 1 H J= 8,8 Hz A5'a

Zuordnung analog Synthese a1 von 21

224

Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cob-amido- N, N\ N-.N'-.N'-.N ,N -hepta-tn-decyl-IO'-carboxylat) (19)

1 7

Ci 24Higg02i N13C0K7

1 9

Ci34H2n024NieCoNa6

a1. Zugabe des Alkylierungsmittels nach elektrochemischer Erzeugungdes Co(l)-cobamido-N,N',N"1N,",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)

Es wurden 54,4 mg (2,22-10-5 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) in 5 ml

Methanol gelöst und analog der bereits beschriebenen Reduktion50 mit 9,7 mg Pt02,15 pl Essigsäure und Wasserstoff in einer Glove-box zum Co(ll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) reduziert. Nach

Beendigung der Reaktion gemäss UV/vis-spektroskopischer Kontrolle wurde die

Lösung durch Watte filtriert und am Rotationsverdampfer mit HV das Lösungsmittel

abgezogen.Der Rückstand wurde wiederum in ca. 0,3 ml Methanol gelöst, mit 3 ml 0,1 M

Phosphatpuffer, pH 7, Methanol/Wasser, 1:1, verdünnt und in eine Elektrolyse¬apparatur gemäss [105] gefüllt.Nach 50 Minuten bei einem Potential von -1,000 V war die Reduktion zu Co(l)-cobamidat gemäss UV/Vis-Spektrum quantitativ und 75,6 mg (2,33-10"4 mol, 10,5

Äquivalente) krist. 5'-Chloro-5'-desoxy-1,N6-ethenoadenosin wurden zugefügt. Nach

weiteren 100 Minuten, der Strom war auf unter zwei Prozent des Anfangswertesgefallen, wurde die Reaktionslösung abpipettiert und der Glove-box entnommen

(7,3-10° Faraday, 3,3 Äquivalente).Zur Aufarbeitung entfernte man am Rotationsverdampfer das Methanol und versetzte

die verbleibende wässrige Lösung solange mit 1 molarem Natriumphosphatpuffer, pH

50 Siehe 7.5.1

225

9 bis das Produkt auf drei SEP-Pack C-18 (Kartusche ä 4 ml) adsorbierte51. Das

Adsorbat wurde je Kartusche mit 10 ml H20 gewaschen, das Alkylierungsmittelvollständig mit 25 ml Methanol /H20, 7:3, eluiert und das nachfolgend mit 5 ml

Methanol eluierte Produkt am Rotationsverdampfer getrocknet.

Der braune Lack Hess sich aus ca. 0,5 ml Methanol mit 5 ml Ether quantitativ fällen.

Man dekantierte die farblose Mutterlauge nach 15 Minuten von dem bei 4'000 Upmabzentrifugierten, feinen Niederschlag, der am Hochvakuum während zwanzig Stunden

getrocknet (47,1 mg, 81%), zur Charakterisierung gelangte.

Ci 34H211024Ni6CoNa6

mw. 2626,540

DC (RP-18, CH3OH/Phosphatpuffer 0,1 M, pH 3, 95:5)

rf= 0,51

UV/vis

Abb. 30

Allg. Teil

(H20, c= 1,90-10-5 M)

224 ( 42'840), sh

303 ( 22-735),456 ( 8-370).

265

313

(

(

26'815),

20'750),sh

274

375

(20'315), sh

( 7-920), sh

UV/vis

Abb. 96

(CH3OH, c= 1,14-10-5

225 ( 4V130), sh

303 ( 2V630),457 ( 8'100).

M)

265

313

(

(

25'350),

19'800),sh

274

375

(18'710), sh

( 7'370), Sh

CD

Abb. 31

Allg. Teil

(H20, 0=1,90-10-5 M)

223 ( -22,10),306 ( 19,50), Sh

402 ( 1,05),565 ( 7,89),

262 (329 (433 (

-41,60),

52,60),

-16,80),

280 (380 (503 (

-11,60), sh

-4,74),-10,00),

X0 bei 235, 239, 291, 361, 395, 407, 523 nm

Die Adsorption erfolgte nicht ganz quantitativ.

226

Abbildung 96: UV/vis-Spektrum von Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)-adenosyl-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (19) in Methanol, c= 1,14-10"° M

VA

.ÄZs

V

Abbildung 97: CD-Spektrum von Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (19) in Methanol, c= 1,14-10-° M

227

CD

Abb. 97

(CH3OH, c= 1,14-10-5 M)

224 (306 (401 (565 (

-31,60),

27,20),

7,02),10,50),

Sh

264 {329 (430 (

-86,80),

70,20),

-14,90),

280 {378 (504 (

A,0 bei 291, 361, 389, 412, 459, 470, 529 nm


-19,30),

-5,26),

-9,65),

sh

3420 (m),br/sh 3290 (m), 3080(m), 2930 (s).2860 (s), 2690 (w),sh 2480(w), br 2410 (w), sh

1955 (w), br 1710 (m), br 1645 (s), br 1565 (S), br

1490 (m), 1470 (m), 1455(m), sh 1440 (m),1415 (m), 1380 (m), 1355(m), 1330 (m), sh

1295 (m), 1260 (m), sh 1220(m), 1180 (w), sh

1155 (m), 1140 (m), sh 1110(m), 1100 (w), sh

1040 (w), 1020 (w), sh 995 (w), sh 975 (w),930 (w), 875 (w), 815 (w), 725 (w),700 (w), 670 (w),sh 655 (w), 630 (w),595 (w), 570 (w), 480 (w)

1H-NMR (CD3OD, c= 2,56-W2M, 300,13 MHz)Abb. 32

Allg. Teil 9,13 S, 1 H A-2/7

8,06 s, 2H A-10/11

7,59 S, 1 H A-2/7

6,84 s, 1 H C-10

5,69 s, 1 H C-1'

4,75 d, 1 H J= 10,13 Hz

4,50 d, 1 H J= ca. 10 Hz

4,25 d'oid,1 H J= 2,68 Hz

3,96 m,

1 H

3,82 t, 1 H

3,40-2,80 insgesamt ca. 16 H (ohne CD3OD)Cl±>-CONH-

2,80-2,00 insgesamt ca. 39 H u.a. -CÜ2POO-weitere Maxima 2,20 / 2,65

2,48 s, 3H C-51/151

2,39 s, 3H C-51/151


weitere Maxima 1,30 / 1,60 / 1,88

1,72 s, 3H CH3

1,45 s, 3H CH3

0,91 d, 1 H J= 5,0 Hz C-5' ß

0,84 s, 3H CH3

0,83 s, 3H CH3

0,38 t, 1 H C-5' a

228


eingestrahlt bei Beobachtung

4,79 ppm Intensitätsverschiebung bei 2,93 ppm

1H-NMR (D20, C= 2,72-W3M, 300,13 MHz)

sehr breite Signalhaufen mit Maxima bei 1,15/ 1,40/ 2,05/ 3,00 ppm

13C-NMR (CD3OD, c= 1,26.102M, 100 MHz, -5,8 °C, breitbandentkoppelt &

DEPT)Abb. 33

Allg. Teil 15,58 (q, 1CC51 ) 17,55 (q, 1C C 151 ) 19,29 (q, 1C C 17B )

19,98 (q, 1C C 2A/7A) 20,18 (q, 1C.C2A/7A) 20,77 (q, 1C C 12A )

25,14 (q, 1CC1A ) 26,30 (t, 1C A 5"> ) 27,49 (t, ca 7C -£H2-

CH2-COOH) 27,70 (t, 1C C 81 )

28,21/28,25/28,40 (t, je ca 2C,-C_H2-CH2-CH2-NCO-R)

29,06 (t, 1CC31 ) 29,94 (t, 1C, C 131 )

30,40/30,48/30,57/30,65/30,71/30,85 (t, ca 35C res« Kette innen)

32.28 (q, 1C C 12B ) 32,91 (t, 1C "> ) 34,02 (t, 1C C 172 )

34.29 (t, 1C C 171 ) 34,97 (t, 1C C 82 ) 35,51 (t, 1C 181/132)

37,04 (t, 1C 181/132) 38,22 (t (br),ca 7C -£H2-COOH)

40,57/40,70/40,82/41,04 (t, ca 7C-£H2-NCO-R) darunter CH2, C32

& CH, C-18 (40,8 ppm) 44,40 (t, 1C C71/21')44,60 (t, 1C C 71/21)

47,33 (s, 1C C 2/12 ) 48,03 (s, C2/12 ) 51,72 (s, 1C C7 )

54,06 (d, 1C C 13 ) 56,55 (d, 1C C3 ) 60,59 (s. 1C C 17 )

67,07 (t, ' ) 73,46 (d. 1C C8? ) 73,64 (d, 1C A 3' )

75,02 (d, 1C C 19 ) 76,45 (d, 1C A 2' ) 87,15 (d, 1C A 4' )

88,47 (s, 1C C1 ) 90,27 (d, 1C A 1' ) 98,53 (d, 1C C 10 )

108,2 (s, 1C C 15 ) 109,3 (s, 1C CS ) 113,8 (d, 1C A10/1 1)

124,0 (s, 1C A 5 ) 133,5 (d, 1C A10/11) 138,5 (d, 1C A 2/8 )

140,0 (s, 1C A 4/5 ) 141,5 (d, 1C A 2/8 ) 142,1 (s, 1C A 4/5 )

164,8 (s, 1C C 6/14 ) 165,2 (s, 1C C 6/14) 171,7 (s, 1C )

173,3 (s, 1C ) 173,3 (s, 1C ) 173,6 (s, 1C )

174,6 (s, 2C ) 174,7 (s, 1C ) 175,0 (s, 1C )

176,9 (s, 1C ) 177,7 (s, 1C ) 177,9 (s, 1C )

(C 4/9/11/16 + 7x -HNC.O-) 181,8 (s, 7C -COOK )

' Zuordung tentativ

MS (FAB(+), 3-NOBA, m/z 400-2'900)

2322,5 (31, M-2Na+-eAdo + H20), 2291 (18); 2281 (21, M-eAdo"-

4Na++H20+4H + ), 2265,7 (24,[(Di-Na-pentasäure)-eAdo]+), 2221,6(19,

Heptasäure-eAdo), 1800-2500 Signalhaufen, 1161,3 (10, M-2Na+-eAdo-

+3H++H20), 450,0(100), 400-600 Signalhaufen im Abstand 14 m/z

229

a2. Zugabe des Alkylierungsmittels vor elektrolytischer Reduktion zum

Co(l)-cobamido-N1N,1N",N-1N--,N ,N -hepta-(n-decyl-1 0'-

carboxylat)

Es wurden 84,8 mg (3,34-10"4 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) wie bereits

beschrieben (6.5.1) mit 13,7 mg Pt02, 8 pl Essigsäure und Wasserstoff in Methanol

zum Co(N)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)reduziert, in 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7 in Methanol/Wasser, 1:1, gelöst, mit

111,3 mg (3,42-10-4 mol, 10,3 Äquivalenten) 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin versetzt und während elf Stunden bei -1,20 V elektrolysiert bis der

Stromfluss praktisch zum Erliegen kam (1.45-10-3 Faraday, 4,5 Äquivalente).Nach Aufarbeitung analog der Synthesevariante a1. erhielt man 69,5 mg braunes

Pulver, das gemäss 1 H-NMR-Spektrum ca. 65% Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (19) enthielt.

Die praparative Dünnschichtchromatographie auf RP-18 (3 Platten) mit 0,1 M

Phosphatpuffer pH 7/Methanol, 8:92, Elution der braunen Hauptfraktion mit 100 ml

Methanol mit anschliessender quantitativer Fällung der am Rotationsverdampfer bei

RT auf ca. 0,1 ml eingeengten Lösung mit Ether ergab nach zwanzigstündiger

Trocknung am HV 27,6 mg (30%) braunes Pulver mit folgenden spektroskopischenEigenschaften:

1H-NMR (CD3OD, c= 5,10-10-2 M, 300,13 MHz)

9,12 s, 1 H A 2 oder 7

8,06 s, 1 H A 2 oder 7

8,04 d, 1 H J = 1,5 Hz A10 oder 11

7,59 d, 1 H J = 1,5 Hz A10 oder 11

6,87 s, 1 H C-10

7,01/8i ,63/6,,35/6,32 insgesamt 1 H

5,72 d, 1 H J = 2,4 Hz C-1'*

4,80 d, 1 H J = 11,7 Hz

4,48 d, 1 H J = 8,9 Hz

4,25 m, 1 H C-2'*

4,03 t'oid, 1 H

3,90 d'oid, 1 H

3,82 t, 1 H J = 6,5 Hz C-3'*

3,52 m, 1 H

3,39 m, 2H


2,80-2 ,00 insgesamt 36 H u.a. C-4'*

Maxima 2,61/2,48/2,44/2,42/2,39/2,25

2,00-1 ,00 insgesamt 148 H

Maxima 1,90/1,73/1,58/1,32/1,20/1 ,13

0,96 d, 1 H J = 7,6 Hz C-5' ß»0,88 s, 3H CH3

0,82 s, 3H CH30,75 s, ca. 1 H

0,45 t, 1 H J = 8,4 Hz C-5' a*

'Zuordnung der Riboseprotonen mit Entkopplungsexperimenten

230


eingestrahlt bei Beobachtung

5,73 ppm

4,25 ppm

3,82 ppm

0,46 ppm

4,25 ppm, ddzud, J= 5,5 Hz

5,73 ppm, dzus,

3,82 ppm, t zu d, J= 7,5 Hz

4,25 ppm, ddzud, J= 2,5 Hz

2,00-2,10 ppm Intensitätsverschiebung0,99 ppm, dzus,

2,00-2,10 ppm Intensitätsverschiebung

Synthesebeweis von 10 durch Dealkylierung

Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (19), 10 mg (2,33-1 0'4 mol),wurden mit 1,0 ml 1% methanolischem HCN sowie 3 mg KCN versetzt und bis zur

Konstanz des UV/vis-Spektrums dem Sonnenlicht ausgesetzt.Nach Entfernen des Methanols am Wasserstrahl und Lösen des Rückstandes in ca. 1,0

ml Wasser zog die Substanz direkt auf SEP-Pack auf. Mit 30 ml H20/MeOH, 1:9,

eluierte eine fluoreszierende, farblose Lösung.Die verbleibende auf SEP-Pack adsorbierte Substanz wurde mit 3 ml Methanol

eluiert, die Lösung am Wasserstrahl getrocknet, der Rückstand in 0,1 ml 1 %

methanolischem HCN aufgenommen und mit 5 ml Ether gefällt.Der am Hochvakuum getrocknete violette Niederschlag zeigte mit Heptakalium-

dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxy-lat) (17) identische 1H-NMR-(D20) und UV/vis-Spektren.

231


6.6.1 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22)

Br

O 0'

o

Bf

33 22

Ci4Hs02 C22H2402Br2

In eine Vorlage mit 30 ml H20 und 20 ml Aceton gab man unter Stickstoff 2,0 g

(9,61-10-3 mol) Anthrachinon (33), 3,0 g NaOH-Plätzchen (7,5-10"2 mol) sowie

2,0 g Natriumdithionit (1,04-10"2 mol) und erhitzte am Rückfluss. Der Kolbeninhalt

färbte sich im Verlauf von ca. 15 Minuten tiefrot. Nach 30 Minuten wurden 10,0 ml

(8,3-10'2 mol) 1,4-Dibrombutan eingespritzt und weitere neun Stunden am Rück¬

fluss erhitzt.

Aus der unteren, der sich bei Abkühlung trennenden Phasen, Hess sich mit 100 ml

Hexan ein weisser Niederschlag ausfällen. Die abfiltrierte Lösung wurde mit insgesamt400 ml Dithionit-Lösung in drei Portionen ausgeschüttelt, die Hexanphase über MgSO.»

getrocknet und am Rotationsverdampfer bei 40 °C Badtemperatur das Lösungsmittel

abgezogen.Man erhielt ca. 2 g Rohprodukt, das zum grössten Teil aus 1,4-Dibrombutan bestand.

Die Wasserphase enthielt gemäss DC kein Produkt mehr.

Das Gemisch der Produkte wurde in einigen ml Hexan gelöst und auf eine mit Hexan

aufgezogene Kieselgelsäule aufgetragen. Die Säule wurde mit 21 Hexan gespült, um das

1,4-Dibrombutan auszuwaschen, dann mit Lösungsmittel wie folgt die Trennung

durchgeführt: 2,1 I Hexan/MeCI2 6:1, 1,2 I Hexan/MeCI2 5:1, 0,5 I Hexan/MeCI2

4:1, 0,4 I Hexan/MeCI2 0,8 I (2. fluoreszierende Bande, 366 nm). Die nächsten mit

der zweiten fluoreszierenden Bande beginnenden 1,5 I Hexan/MeCI2 3:1, beinhalteten

das 9,10-Di-(brombutyloxy)-anthracen (22). Der Elutionsprozess war mit

UV/vis-Spektroskopie (366 nm) gut zu verfolgen.

Das Produkt wurde am Rotationsverdampfer getrocknet, in 5 ml Hexan/Methylen¬chlorid (1:1) gelöst und kristallisierte bei Zugabe von 10 ml Methanol innerhalb

232

weniger Stunden aus. Die anfangs am Rotationsverdampfer, dann am HV (0,08 Torr,90 min) getrockneten nadeiförmigen Kristalle 22, Ausbeute 0,440 g (9,5 %),wurden charakterisiert.

C^H^O^^

mw. 480,243

Schmelzpunkt 102,5 °C

DC (Kieselgel, Hexan:MeCI2, 3:1, Detektion mit l2 und 366 nm)

rf= 0,14

MikroanalyseBr

berechnet 55,02 % 5,04 % 33,28 %

gefunden 55,06 % 5,06 % 33,49 %

UV/Vis (C= 2,62-10-* M, EtOH)

403 nm (7'123), 381 nm (8'208), 363 nm (5'283),346 nm (2-689), sh 328 nm (1'037),sh 315 nm ( 377),sh258 nm (73'200)*

'bestimmt durch Vergleich mit Intensität bei 403 nm

(2,8 mg in 70pJ CHCI3)

3090 (w)sh 3060 (w) 3030 (w) 3000 (w)2950 (w) 2940 (m) 2920 (w)sh 2870 (w)2850 (w) 1950 (w) 1930 (w) 1915 (w)sh1825 (w) 1805 (w)sh 1710 (w) 1620 (m)1560 (w) 1520 (w) 1455 (w) 1440 (w)sh

1430(m) 1405 (m) 1380 (w) 1350 (s)1295 (w) 1270 (w) 1260 (w) 1240 (w)

1170(m) 1115 (w) 1070 (s) 1035 (w)

1020 (w) 1000 (w) 985 (w)sh 970 (w)

960 (w) 920 (w) 895 (w) 825 (w)

690 (w) 610 (w)

233

1H-NMR (300,13 MHz, CDCI3, 3,64-10'2 M)

2,16-2,37 m,,8H C-2',3'

3,60 t, 4 H J= 6,50 Hz C-4'

4,19 t, 4H J= 6,15 Hz c-r

7,44-7,50 m,,4H C-ß Aromat

8,20-8,26 m,,4H C-a Aromat

zugeordnet nach Vergleich mit [122]

13C-NMR (75 MHz, CDCI3, 8,48-103 M, breitbandentkoppelt & DEPT)

29,4 (t, C-27C-3'); 29,8 (t, C-27C-3')

33,6 (t, C-4'); 74,9 (t, C-1');

122,6 (d, C-2); 125,1 (s, C-11) ;

125,4 (d, C-1); 147,3 (s, C-9 )

zugeordnet aufgrund Vergleich mit [122]

MS (El, 25-482, angegeben sind Signalintensitäten m/z > 4 %)

482 (5,1; M+[8lBr;81Br])) 480 (10,4; M*plBr;79Br])478 (5,1; M*(79Br;79Br))), 400 (0,3; {[M( 81Br)]-Br}+),398 (0,3; {[M( 79Br)]-Br)*), 346 (0,7; 0-C14H8-0(CH2)481Br*),344 (0,7;0-C14H8-0(CH2)4.79Br*), 265 (0,4; 0-CuH8.0(CH2)4),235 (0,9; C14H8-0(CH2)3+). 221 (2,6; Cl4HsO(CH2)2+),210 (16,9), 209 (93,6),208 (8,2;C14H802+), 207 (4,6),193 (3,9; C14HbO+), 192 (1,9; C14H80+),181 (4,7), 180 (25,4),176 (0,7; C14H8+), 165 (10,1),164 (11,9; C13HBV. 163 (11.3),153 (13,3;B'Br(CH2)40), 152 (41,4; C4H88'BrO),151 (12,7; 79Br(CH2)40), 150 (4,3; C4H879BrO),137 (76,0; 81Br(CH2)4), 136 (6.7)135 (77,1; 79Br(CH2)4). 115 (0,5; C9H7+),109 (3,3;81Br(CH2)2), 107 (3,4; 73BrCH2CH2),95 (0,9;81BrCH2), 93 (0,9; 79BrCH2),91 (1,1; C7H7+), 77 (5,2; C6HS+),76 (3,9; C6H4+), 56 (6,5; C4H8),55 (100,0; C4H7), 53 (4,1; C4HS),51 (4,1; C7H20) 41 (13,9; C2HS).39 (10,7; C3H3) 28 (22,6; (CH2)2),27 (17,2; C2H3)

234

6.6.2 1, N 6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)

o

D

W^oM,

15

C17H19O6N5S

1 6

dgHigOsNsS

250 mg (5,4-10"4 mol) 5'-0-Tosyladenosin (15) wurden in 10 ml MeOH und 10 ml

1 molarem Phosphatpuffer, pH 7, suspendiert und mit 0,5 ml 1,2-Dibrom-

ethylacetat versetzt. In der ständig gerührten, vor Lichteinwirkung geschützten

Reaktionslösung war im Laufe weniger Stunden ein markanter pH-Abfall zu

verzeichnen, der durch Zugabe von 1M wässriger KOH ausgeglichen wurde bis der pHwieder den Bereich 4 bis 6 erreichte. Nach zwei Tagen fügte man weitere 0,2 ml 1,2-

Dibromethyl-essigsäureester hinzu und glich die pH-Änderung entsprechend aus. Das

Produkt war mit DC bereits ab dem zweiten Tag als einzige stark fluoreszierende

Substanz identifizierbar. Nach ca. 10 Tagen begann Phosphat auszukristallisieren.

Nach insgesamt zwanzig Tagen extrahierte man die mit 200 ml H20 verdünnte

Reaktionslösung mit 10 Portionen Methylenchlorid ä 100 ml, zog das Lösungsmittel

ab, und fällte mit 100 ml Ether aus 5 ml Methanol.

Das Rohprodukt (149,6 mg) bestand gemäss 1 H-NMR-Spektrum aus zwei

Komponenten, davon etwa 60 % 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16).

Die Komponenten wurden mittels Säulenchromatographie (Laufmittel CH2CI2:Methanol, 85:15) aufgetrennt. Die Produktfraktion war die zweite fluoreszierende

Bande. Der Vorlauf bis nach dem Austritt der Fraktionen einer ersten schwachen,

fluoreszierenden Bande wurde verworfen. Die vereinigten, am Rotationsverdampfer

getrockneten Produktfraktionen wurden in wenigen ml Methanol aufgenommen und

nach Auffüllen mit ca. 100 ml H20 gegen zehn Portionen CH2CI2 ä 100 ml

ausgeschüttelt. Nach Entfernung des CH2CI2 am Rotationsverdampfer blieb das

Hauptprodukt 16 als farbloses Öl zurück.

Nach Fällung des Öls aus 0,3 ml Methanol mit 8 ml Ether und Trocknen am HV während

fünf Stunden erhielt man 91,2 mg (34,5 %) eines weissen Niederschlages. Aus einer

ca. 2-10-2 molaren Lösung dieses Niederschlages in Chloroform fielen beim Zutropfenunter heftigem Rühren in die 20-fache Menge Petrolether (50-70 °C) farblose

Mikrokristalle aus, die sich beim Altern in der Mutterlauge eintrübten und Flocken

bildeten. Die Kristalle wurden abzentrifugiert (4000 UpM, 5 min) und während 24

Stunden am Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 79,3 mg (30 %) 16 in Form

weisser Kristalle, die charakterisiert wurden.

Ci9H1906N5S (• 2,5 H20)mw. 445,453 (490,492)

235

Schmelzpunkt

schmilzt nicht unversetzt, sichtbare Verkohlung ab ca. 180 °C

DC (Kieselgel 60, ohne Fluoreszenzindikator, CH&I&CH3OH, 85:15)

rf = 0,59

Mikroanalyse

C H N

berechnet

gefunden

51,23 %

46,53 %

46,85 %

4,30 %

4,93 %

4,23 %

15,72 %

14,28 % mit 2,5 H2014,20 %

UV/Vis (CH3OH, c= 1,01-10"i M)

227 (35-900),275 ( 4'470),

258

296

( 4'030),

( 2'410)

265 ( 4'720),

CD (CH3OH, c:= 1,01-1 O^M)

222 (266 (

-5,47),

1,09),

234

276

( 11,10),

( 1,28),

258 ( 0,81),295 ( 0,19).

1 H-NMR (CD3OD, c= 3,93-10-2M, 200 MHz)

9,12 S, 1 H A-2 (oder 8)*8,33 S, 1 H A-8 (oder 2)*8,08 d, 1 H J= 1,57 Hz A-10*

7,75/7,70 2H CH3-C6Ü4-S7,64 d, 1 H J= 1,52 Hz A-11*

7,24/7,20 2H CH3-C6H4-S6,13 d, 1 H J= 4,43 Hz C-1

4,78 t, 1 H J= 4,78 Hz C-2 +

4,51 t, 1 H J= 5,15 Hz C-3 +

4,44-4,42 m,2H C-5

4,30 t, 1 H J= 4,04 Hz C--4

2,31 s, 3H CÜ3-C$H4*

zugeordnet analog [97]; + zugeordnet aufgrund Vergleich mit 400 MHz 1H-

NMR-Spektrum unterschiedlicher Konzentration

236

1 H-NMR (CD3OD, gesättigte Lösung, c= 6,24-10'2 M, 400 MHz)

8,98 d, "1H J» 2,55 Hz A-2 (oder 8)*

8,23 S, 1 H A-8 (oder 2)*

7,96 d, 1 H J= 1,57 Hz A-10*

7,63 d, 2H J= 8,10 Hz CH3-C6H4-S

7,54 d, 1 H J= 1,47 Hz A-11*

7,13 d, 2H J= 7,86 Hz CH3-C6Ü4-S

6,06 d, 1 H J= 4,34 Hz C-1 +

4,75 t, 1 H J= 4,81 Hz C-2+

4,46 t, 1 H J= 5,16 Hz C-3 +

4,33- 4,41 m, 2H C-5 +

4,26- 4,23 m(fd), 1 H C-4 +

2,23 s, 1 H CH3-C6H4"

Aufspaltung des Singlett 1licht eindeutig,"


ordnet aufgrund Entkopplungsexpenmenten

zuge-

Entkopplungsexpenment (300,13 MHz)


1822,21 Hz (6,07 ppm) t, 1430 Hz (4,76 ppm) zu d, J= 5,0 Hz

1425,04 Hz (4,76 ppm) d, 1822 Hz (6,07 ppm) zu s

t, 1338 Hz (4,46 ppm) zu d, J= 5,0 Hz

1339,23 Hz (4,46 ppm) t, 1430 Hz (4,76 ppm) zu d, J= 4,5 Hz

Effekt auf 1260-1320 Hz (4,20-4,40

ppm) nicht bestimmbar

1 H-NMR (D20, gesättigte Lösung, 40 °C, 200 MHz)

8,92 s, 1 H

8,21 s, 1 H

7,98 s, 1 H

7,60 s, 1 H

7,43/7,39 2H

6,80/6,74 2H

6,00 d, 1 H

4,85 m, 1 H

4,63 m, 1 H

4,45 m, 2H

4,28 t, 1 H

1,85 s. 3H

A-2 (oder 8)*A-8 (oder 2)*A-10*

A-11*

CH3-C6H4-S

CH3-C6M4-SJ=ca.l Hz C-1 +

C-2 +

C-3 +

C-5

C-4

ChU-Aromat

*

zugeordnet analog [97], + zugeordnet aufgrund Entkopplungsexpenmenten

handeln.N'-(2'-Bromethylen)-adenosyltosylatum1H-NMR-Spektrumsdesaufgrund

sicheskönnteZwischenprodukttentativesdiesemBeibesitzt.Adenosyleinheit

einenurwelchesherrühren,MoleküleinemvonEthenoadenosyl-5'-0-tosylat

1,Ne-desSignalederSubtraktionnachSignalesämtlichedassberechnet,Annahme

derunterwurdeKonzentrationDiezugeordnet.Signaleuntenstehende1H-NMR

imKomponentezweitenderwurdenRohproduktesdesSubstanzgemischesdesSpektrum

1H-NMR-demaus1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylatreinendesSpektrumsdes

SubtraktionDurchwar.vollzogennichtnoch,N6-Ringschluss1derdembeihandelte,Zwischenprodukteinumkonnte,werdenisoliertnichtSäulenchromatographie

durchwelcheSubstanz,zweitendieserbeisichesdassvermutet,daherwurdeEs

machen.sichtbargleichgutpraktisch

lodmitsichsieliessdochfluoreszierend,schwächerbedeutendwarKomponente

zweiteDiewerden.charakterisiertundisoliertkonnteund(16)5'-0-tosylat1,N6-Ethenoadenosyl-mitidentischLaufverhaltengemässwarKomponentenderEine

werden.ausgeschlossenKomponenteals(15)5'-0-TosyladenosinEduktdaskonnte

LaufverhaltensdesAufgrundKomponenten.zweiausDCgemässbestandRohproduktDas

ZwischenproduktTentatives

>400m/zfür1,6%bzw.16%,grosser<400m/z200<Signalmtensitat

(02S-Tolyl)+)(72,2;155,10

(18,2)156,10(23,9)159,10(100,0)160,11

(16,5)161,11(41,7)176,08(27,0;TosRib+)289,14

M+)(22,3;445,21(M+H)+)(100,0,446,23(33,9)447,23

(47,3;(Na+M)+)468,22(1,8)581,29(2,3)599,31

(M2)+)(9,0;891,42(4,4)892,43(2,1)893,42

(Na-M2)+)(7,0;913,40(3,4)914,41(1,6)915,41

C-4)c,1(s,146,6C-1")(s,1C,142,5

C-4")C,1(s,139,8C-8)C,(d,1137,9

C-10)c,1133,47(d,C-2,6")130,76(d,2C,

C-11)C,1124,43(s,)C-5C,113,42(s,1

C-4')c,1(d,83,42C-2')C,(d,175,40

C-5')

C,1(t,71,0C-7")(q,1C,21,52

WO)150-1m/z3-NOBA,(FAB(+),MS

C-2)C,141,7(d,1

C-6)C,134,0(8,1

C,C-3,5")129,0(d,2

C-1')C,17(d,91,1

C-3')C,171,75(d,C-5')

DEPT)&

breitbandentkoppeltMHz,1006,24-102M,c=Lösung,gesättigte(CD3OD,13C-NMR

ppm)(4,83-4,90

Hz1450-1470Intensitätsverschiebungppm)(4,63Hz1387

ppm)(4,63Hz1390Signalverjüngung

szuppm6,00beidppm)(4,85Hz1462

Hz1450-1470Int.relativeÄnderungppm)(6,00Hz1789

SpektrumimÄnderungenbeieingestrahlt

MHz)(300,13Entkopplungsexperiment

237

238

DC (Kieselgel 60, ohne Fluoreszenzindikator, CH2CI2:CH30H, 85:15)

rf = 0,16

1 H-NMR (CD3OD, c= 1,41-W2 M, 200 MHz)

9,45 s, 1 H A-2 (oder 8)8,65 s, 1 H A-8 (oder 2)8,43 m 1 H

8,10 s, 1 H

7,77 Tj" 2H CH3-C6H4-S7,40 d, 2H CH3-C6H4-S6,23 d, 1 H J= 4,4 Hz C-1

5,13 t, 1 H J- 4,7 Hz C-2

4,5-4,2 m 4H C-3 bis 5

2,43 s, 3H Chb-Aromat


Analyse der Reaktionskinetik

Zur experimentellen Analyse der Reaktionskinetik wurden vier Ansätze durchgeführt.Sie bestanden wie oben beschrieben je aus 250 mg 5'-0-Tosyladenosin (15), 0,5 ml

1,2-Dibromethyl-essigsäureester (4 Äquivalente) und 40 ml Lösungsmittel. Für die

Reaktionsdauer 766 Stunden wurde das Dreifache, für die von 67 Stunden ein Drittel

sämtlicher Mengen gewählt.Die Zusammensetzung des Rohproduktes, welches nur aus den beiden beschriebenen

Komponenten besteht, wurde analysiert.Die Mutterlaugen der Fällungen waren gemäss DC praktisch frei von diesen beiden

Substanzen.

Abbildung 98 zeigt die Zusammensetzung des Rohproduktes in Funktion der

Reaktionsdauer.

t Rohprod /% AHauptprod /%rel Nebenprod /%rel

300 400 500

Reaktionzeit / Stunden

Abbildung 98: Tosylat 15 und 1,2-Dibrom-ethylacetat, Reaktionskinetik in wäss-

rig-methanolischer Lösung, 1 M Phosphatpuffer, T= ca. 23 °C, Anteil Rohprodukt als

isolierte Ausbeuten bezogen auf das Gewicht in % des Eduktes, Prozentangaben Haupt-und Nebenprodukt bezogen auf isolierte Ausbeuten des Rohprodukt (Gew.% des Edukt)

239

6.7 Orientierende Wirt-Gast-Assoziationsexperimente

6.7.1 Bestimmung der Löslichkeiten der Alkylierungsmittel in

Deuteriumoxid

Löslichkeit von Methyltosylat in Deuteriumoxid

Eine Lösung von 1,185 mg DSS in 1,0 ml Deuteriumoxid wurde im auf 20 ± 1 °C

thermostatisierten Wasserbad mit Methyltosylat im Uberschuss während 30 Minuten

mit 50 kHz Ultraschall beschallt, die Probe zentrifugiert und die klare Mutterlauge

1H-NMR-spektroskopisch (80 MHz) untersucht. Die Operationen wurden nach 20

bzw. 190 Stunden mit derselben Probenlösung wiederholt.

Die relativen Konzentrationen von DSS und Methyltosylat wurde aus den 1 H-NMR-

Spektrum entnommen, indem die Integrale sämtlicher Signale ausgewertet wurden,

und mit der Einwaage an DSS kalibriert.

Die Konzentrationen an gelöstem Methyltosylat lagen bei 7,7-10'3 M (sofortige

Messung), 1,6-10"2 M (nach 20 h) bzw. 2,9-10-2 M (190 h nach erstem Kontakt mit

Deuteriumoxid). Nach 20 Stunden schlug sich Hydrolyse (ca. 10%) in Signalen im

1 H-NMR-Spektrum bei 7,67/7,63 ppm (C3/5), 7,35/7,31 (C3/5) sowie 2,35

ppm (Methyl des Tosylates) nieder.

Aufgrund einer möglichen Tensidwirkung des DSS sind diese Löslichkeitswerte als

Obergrenze zu betrachten. Bei den nachfolgend durchgeführten Experimenten mit

Methyltosylat, vgl. 6.7.3.3, war der Löslichkeitswert nicht kritisch für die

Interpretation.

Löslichkeit von 5'-0-Tosyladenosin (15) in Deuteriumoxid

a) Eine Lösung von 0,785 mg Trimethyl-silyl-propansulfonsäure (8,1-lO6 mol)

in 1,2 ml Deuteriumoxid wurde im auf 20 °C ± 1 °C thermostatisierten Wasserbad

mit im Uberschuss vorliegenden 5'-0-Tosyladenosin (15) während 30 Minuten mit

50 kHz Ultraschall beschallt, zentrifugiert und die Lösung 1H-NMR-spektroskopisch(300,13 MHz) untersucht.

Die Konzentration an gelöstem S'-O-Tosyladenosin lag in allen Fällen unterhalb der

Nachweisgrenze, d.h. unterhalb cirka 6,76-10"4 M entsprechend 10 % der

Konzentration der Trimethyl-silyl-propansulfonsäure. Bei Sättigung einer Lösung von

6,495 mg Trimethyl-silyl-propansulfonsäure in 1,0 ml Deuteriumoxid (28,1 mM)

bei RT mit 5'-0-Tosyladenosin ergab sich 1H-NMR-spektrometrisch (300 MHz) die

Konzentration an 5'-0-Tosyladenosin zu 4,5-10-4 M.

Die relative Konzentration des 5'-0-Tosyladenosins (15) wurde dabei aus der Summe

den Integrale zwischen 7,00 & 8,20 ppm (Phenylring und Purinring) und des

anomeren H bei 5,92/5,94 ppm auf der einen Seite und jenen der Trimethyl-silyl-

propansulfonsäure zwischen 0,60 und 3,00 ppm auf der anderen Seite erhalten. Über

die Einwaage an Trimethyl-silyl-propansulfonsäure ergab sich die absolute

Konzentration von 15.

240

Aufgrund der potentiellen Tensideigenschaften der Trimethyl-silyl-propansulfonsäurekonnte dieser Wert ebenfalls nur als Obergrenze dienen und da die dermassen

bestimmte Löslichkeit in der Grössenordnung der Corrinkonzentrationen lag, musste

mit UV/vis-Spektroskopie die Löslichkeit genauer bestimmt werden.

b) Die Löslichkeitsbestimmung von 5'-0-Tosyladenosin (15) durch eine UV/vis-

spektroskopische Messreihe bestehend aus 2x10 Messungen mit von 5 bis zu 50

Minuten zunehmenden Beschallungszeiten lieferte die für die Sättigung des

Deutriumoxides mit Tosylat 15 notwendige Mindestdauer der Ultraschallexposition.

Deuteriumoxid wurde mit einem Uberschuss 5'-0-Tosyladenosin versetzt, im auf

35,0 ± 0,1 °C thermostatisierten Bad beschallt, die Suspension zentrifugiert (4000

UpM, 5 min) und die erhaltene Lösung UV/vis-spektroskopisch untersucht. Das

Experiment wurde mit Beschallungszeiten von 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 und

50 Minuten wiederholt.

Nach 10 Minuten waren praktisch keine Änderungen im UV/vis-Spektrum mehr

beobachtbar: abs(o)26o nm= 0,744, o= 0,06, dx= 0,100 cm, entsprechend 3,72-10-4

M. Messungen bei T- 15 °C, lieferten als durchschnittliche Absorption, abs(0)26o nm=

0,443, o= 0,02, dx= 0,100 cm, entsprechend 2,22-10"4 M (6 Messungen); bei T=

20-23 °C, abs26o nm= 0,609, entsprechend 3,05-10-4 M (1 Messung), dx= 0,100

cm und die Bestimmung bei 30 °C abs26o nm= 0,745 (1 Messung), dx= 0,100 cm,

entsprechend 3,73-10-4 M.

1 H-NMR-Spektren der Gastmoleküle in Deuteriumoxid

Jeweils 2,4 mg 5'-Chloro-5'-deoxy-adenosin, 5,5 mg 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-

ethenoadenosin, 1,0 mg 5'-0-Tosyladenosin (15) und 13,8 mg Methyltosylat wurden

mit 1,4 ml Deuteriumoxid versetzt und im auf 35,0 °C thermostatisierten Wasserbad

während 30 Minuten mit 50 kHz Ultraschall beschallt, zentrifugiert und die Lösung

1H-NMR-spektroskopisch (80 MHz) untersucht. Nach Sättigung enthielten sämtliche

Lösungen noch ungelöste Substanz.

Die Signale der Verbindungen erschienen in den 1 H-NMR-Spektren (200 MHz) wie

folgt:

5'-0-Tosyladenosin (15)

8,14/8,17* s, 2H J= 9Hz Purin-H

7,52/7,55 d, 2H J= 9 Hz CH3-C6Ü4-

7,10/7,13* J= 9 Hz CH3-CeU4-

5,92/5,94* d, 1 H J= 6 Hz anomeres H

4,32 m, 3H C2-5

4,48 m, 1 H

2,28 s, 3 H (breit) C±b-C6H4-

5 '-ChloroS'-deoxy-1,Ne-etheno-adenosin

9,05* s, 1 H C-2 Purin

8,40* s, 1 H C-8 Purin

7,92* d, 1 H C-10 Purin

241

7,52 d, 1 H

6,20* d, 1 H

4,90 t, 1 H

4,52/4,40 t+t,,2H

3,93 m, 2H

C-11 Purin

anomeres H

C4'-Ribose

3'&2'-Ribose

5'-Ribose

Methyltosylat

7,83/7,79* 2H

7,49/7,45* 2H

3,78 S, 3H

2,43 S, 3H

7,67/7,63 2H

7,35/7,31 2H

2,35 s, 3H

1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)

siehe Charakterisierung im synthetischen Teil (7.6.2)

C-3/5

C-2/6

er

C-7

C-3/5"

C-2/6"

C-7"

Anteil Hydrolyseprodukt" bzgl. Methyltosylat ca. 30%

5'-Chloro-5'-deoxy-adenosin

8,32* s, 1H

8,19* s, 1H

6,06/6,08* d, 1 H

4,35-4,50 m, 2H

3,85-3,92 m, 2H

Relative Löslichkeiten der Gastmoleküle

Die relativen Löslichkeiten der als Gastmoleküle verwendeten Akylierungsmittel

wurden durch gleichzeitige Sättigung von Deuteriumoxid mit 5'-Chloro-5'-deoxy-1 ,N6-ethenoadenosin, 5'-0-Tosyladenosin (15), Methyltosylat und 5'-Chloro-5'-

deoxy-adenosin oder 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16), experimentell

bestimmt.

Für jede Temperatur (15,2; 18,2; 23,0; 33,0 °C, jeweils ± 0,1 °C) wurde separat

eine Mischung aus mindestens 2,4 mg 5'-Chloro-5'-deoxy-adenosin oder 1,N6-

Ethenoadenosyl-5"-0-tosylat (16), 5,5 mg 5'-Chloro-5'-deoxy-1,N6-etheno-adenosin, 1,0 mg 5'-0-Tosyladenosin (15) und 13,8 mg Methyltosylat mit 1,4 ml

Deuteriumoxid versetzt, umgehend während 10 Minuten Ultraschall (50 kHz)

ausgesetzt, in vorangehend thermostatisierten Zentrifugeneinsätzen während 10

Minuten suspendiertes Alkylierungsmittel abzentrifugiert und die überstehende klare

Lösung 1H-NMR-spektroskopisch untersucht (200 MHz).

C3/8 Purin

C3/8 Purin

er

C-2' ,& 3' Ribose

C-5' Ribose

242

Das relative Verhältnis der Löslichkeiten wurde aus der Summe der in der obigen

Aufstellung der 1 H-NMR-Spektren der Gastmoleküle in Deuteriumoxid (bzw. bei 16

im synthetischen Teil) mit*

gekennzeichneten Signale berechnet, deren Integrale

nicht miteinander überlappen und daher eindeutig ausgewertet werden konnten,

gewichtet mit der Anzahl der sie repräsentierenden Protonen.

Tabelle 12 Relative Konzentrationen von nebeneinander

gelöstem 5'-Chloro-5'-deoxy-adenosin, 5'-

Chloro-5'-deoxy-l ,N6-ethenoadenosin, S'-O-

Tosyladenosin (15), 1,Ne-Ethenoadenosyl-5--0-tosylat und Methyltosylat in Deuteriumoxid

T/c-C 5'- 5'- S'-O- Methyl¬ 1,N6-

Chloro- Chloro- Tosyl¬ tosylat Ethenoade

5'-deoxy- 5'-deoxy- adenosin nosyl-5'-

adenosin 1,N6-

etheno-

O-tosylat

adenosin (15) (16)

15,2 7,8 8,5 1 7,7

18,2 8,4 9,6 1 7,6

23,0 11,4 1 7,6 0,33

33,0 10,8 1 6,5 0,71

6.7.2 Methoden zur Bestimmung des Assoziationsgrades

a) Berechnung des Besetzungsgrades mit UVA/is-Spektroskopie

a) Die Konzentration an Corrin ([Corrin]) wurde mit dem Lambert-

Beerschen Gesetz aus den UV/vis-Absorptionswerten bei 580 nm bzw. 576 nm und den

entsprechenden Extinktionskoeffizienten gemäss synthetischem Teil berechnet.

Die Konzentration der Gastmoleküle konnte nicht direkt aus den UV/vis-Spektren der

Probenlösungen abgelesen werden, da im Bereich des Absorptionsmaximum von 9,10-

Di-(brombutyloxy)-anthracen (22) (407 nm), des S'-O-Tosyladenosin (15) (260

nm) und 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) (258 nm) die eingesetzten Corrine

ebenfalls stark absorbieren. Von dem UV/vis-Spektrum der Probenlösung wurde daher

das UV/vis-Spektrum einer gleichkonzentrierten Lösung des Corrines subtrahiert und

das UV/vis-Spektrum des in der Probe gelösten Gastmoleküles erhalten. Aus dem

Absorptionsmaximum des so generieren UV/vis-Spektrums wurde sodann die

Konzentration des Gastmoleküles berechnet ([Gast]totai).

Der Assoziationsgrad (Besetzungsgrad) ist das Verhältnis der Konzentration an

Gastmolekül, die die Löslichkeit des Gastmoleküles in reinem Deuteriumoxid

([GastJLösi.) übersteigt, zur Corrinkonzentration ([Corrin]).

Assoziationsgrad = (([Gast]totai-[Gast]Lösi.)/[Corrin])

243

Von der mit der obenbeschriebenen Differenzmethode ermittelten Gesamtkonzentration

des Gastes ([Gast]totai) wurde daher die durch separate Experimente52 bestimmte

Löslichkeit des Gastmoleküles ([Gast]L6si.) subtrahiert und von dem Resultat der

Quotient mit der Corrinkonzentration gebildet.

ß) In einigen Experimenten wurde statt der mathematischen Subtraktion des

UV/vis-Spektrums des Corrins vom UV/vis-Spektrum der Probenlösung die

Probenlösung direkt gegen eine Corrinlösung identischer Konzentration im

Referenzstrahl des UV/vis-Spektrophotometers gemessen. Das UV/vis-Spekrum des in

der Probenlösung gelösten Gastes wurde so experimentell erhalten.

Bei dieser Methode wurde vor Sättigung der Corrinlösung mit dem Gast ein Teil dieser

Lösung in eine UV/vis-Küvette gefüllt und mit einem Teflonstopfen und Parafilm

gasdicht verschlossen.

Die Berechnung der Konzentrationen und des Assoziationsgrades folgt ansonsten der

Methode 6.7.2aa.

b) Berechnung des Besetzungsgrades mit 1H-NMR-Spektroskopie

Der Assoziationsgrad konnte auch über die Kombination von UV/vis- mit 'H-NMR-

Spektren bestimmt werden.

Anhand von sich nicht überlappenden Signalen in 1 H-NMR-Spektrum (H(C10) des

Corrins bei 5,77 ppm (17) bzw. 5,74 ppm (24); Phenylprotonen des Tosylates bzw.

zusätzlich H(C10) & H(C11) bei 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)) wurden

die relativen Konzentrationen von Corrinteil und Gastmolekül festgestellt, über die

Auswertung des Absorptionsmaximums bei 580 nm die absoluten Konzentrationen

berechnet und analog 6.7.2aa von der Gastkonzentration die Löslichkeit des Gastes in

Deuteriumoxid subtrahiert sowie die Konzentrationen von Gast und Corrin zueinander

ins Verhältnis gesetzt.

6.7.3 Bestimmung des Assoziationsverhaltens in wässriger Lösung

6.7.3.1 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22)

Assoziation mit Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und Heptakalium-di-

cyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N'"",N -hepta-(n-decyl-10'-carboxy-

lat) (17) in wässriger Lösung

Jeweils 8,1-10"6 mol Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (10,2 mg) (24) bzw.


10'-carboxylat) (20,4 mg) (17) wurden in 5 ml H20 gelöst, die Lösungen in zwei

Portionen aufgeteilt, eine Hälfte mit 7,0 resp. 5,6 mg 9,10-Di-(brombutyloxy)-

anthracen (22) versetzt und während zehn Minuten ultrabeschallt.

52 6.7.1 & 6.8.1.3

244

Die Konzentration an 9,10-Di-(brombutyloxy)-anthracen (22) wurde bestimmt,

indem man von dem UV/vis-Spektrum der Probenlösung das UV/vis-Spektrum

entsprechend 6.7.2.aß gegen eine gleichkonzentrierte Lösung des reinen Corrins 17

aufnahm und aus der Absorption des resultierenden Differenzspektrum bei 265 nm die

Konzentration von 22 berechnete.

In der Lösung von 24 wurde UV/vis-spektroskopisch kein 22 detektiert, in der

Lösung von 17 lag der Gehalt an 22 bei 2,3 % der Corrinkonzentration.


cyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxy-lat) (17) in wässriger Lösung unter Phasentransfer Hexan/Wasser

Je 0,4 ml 1,37-10'3 molare, wässrige Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat(24) bzw. Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N-",N"",N ,N -

hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)-Lösung wurde zusammen mit 0,4 ml 5,42-10'3 M

9,10-Di-(brombutyloxy)-anthracen (22) in Hexan mit einem Magnetrührerwährend 12 Stunden gerührt und nachfolgend UV/vis-spektroskopisch mit der

Stammlösung als Referenz gemäss der unter 6.7.2aß beschriebenen Methode

untersucht. Die Lösung von 17 wurde nach der Messung vier Stunden auf 5 °C gekühltund nochmals gemessen.

Die frisch bereitete Lösung von 17 wies einen Gehalt an 9,10-Di-(brombutyloxy)-anthracen (22) von 2 ± 0,4 % auf (Methodik der Konzentrationsbestimmung siehe

6.7.2aß). In der Probe mit Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat und der auf 5 °C

gekühlten Lösung von 17 lag der Gehalt an gelöstem 9,10-Di-(brombutyloxy)-anthracen unterhalb der Nachweisgrenze.


cyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxy-lat) (17) in wässriger Lösung unter Phasentransfer Deuteromethylenchlorid/Deuteriumoxid

A.

10,1 mg (3,98-10"6 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) wurden in 1,0 ml D20 gelöst,

zuerst 0,5 ml Deuteromethylenchlorid, dann 10,1 mg (2,10-10'5 mol) 9,10-Di-(4-

brombutyloxy)-anthracen (22) zugefügt und bei einer Badtemperatur von 40 °C 15

Minuten lang 50 kHz Ultraschall ausgesetzt. Das überschüssige 9,10-Di-(4-

brombutyloxy)-anthracen, das die Lösung deutlich eintrübte, liess sich durch

Zentrifugation (2500 Upm, 30 Min) abtrennen. 1 H-NMR- und UV/vis-Spektren

wurden sofort gemessen und aus den UV/vis-Spektren durch Subtraktion eines

Referenzspektrums das Spektrum für 9,10-Di-(4-brom-butyloxy)-anthracen

245

berechnet (Methode 6.7.2aß). Das 1H-NMR-53 (Abbildung 36 oben) und das UV/vis-

Spektrum zeigten übereinstimmend ein Verhältnis der Konzentrationen von 17 zu 22

von 1,0:1,0 (± 0,1) an.

Nach Lagerung während 12 Stunden bei 5 °C war die Probe stark eingetrübt und Hess

sich nach Lyophilisation, auch unter Zugabe KCN nicht in eine homogene Lösung

überführen. Das 1 H-NMR-Spektrum dieser, nach Zentrifugation (2500 Upm, 10

Minuten) homogenen Lösung wies keine Signale des 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22) mehr auf (Abbildung 36 unten). Das UV/vis-Spektrum (Auswertung

gemäss 6.7.2aa) verifizierte einen Gastanteil von <5% und war mit dem des reinen


10'-carboxylat) (17) praktisch identisch.

Bei Durchführung des obigen Experimentes bei einer Badtemperatur während der Be¬

schallung von 20 °C war die Assoziatbildung innerhalb der Fehlergrenze von ca. 10%

gemäss UV/vis-Spektrum reproduzierbar. Wurde dabei jedoch auf Deuteromethylen¬chlorid während der Beschallung verzichtet, waren im 1 H-NMR-Spektrum keine

Signale des 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen (22) beobachtbar.

B.

Zu A. analoge Versuche mit einer Beschallungsdauer von 20 min führten mit 1,09-10*3 M wässrigem Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) zu keinem UV/vis-

oder 1H-NMR-spektroskopisch nachweisbarem Gehalt an Anthracen 22.

C

Es wurden 0,3 ml einer 1.15-10'3 M wässrigen Lösung von Heptakalium-dicyano-Co-

(lll)-cobamido-N,N',N",N"-,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17)mit 0,3 ml (1,1 MO'2 M) Anthracenlösung (22) in Methylenchlorid versetzt, zwei

Stunden mit 50 kHz bei einer Badtemperatur von 40 °C beschallt und mit 2500 Upmfünf Minuten zentrifugiert. Die nun klare Lösung wurde abpipettiert und ihr UV/vis-

Spektrum gemessen. Das Differenzspektrum zur Bestimmung der Konzentration von

22 und des Assoziationsgrades wurde nach der unter 6.7.2aa beschriebenen Methode

erhalten.

Man Hess die Probe anschliessend im Dunkeln und bei 5 °C stehen und wiederholte in

Intervallen die UV/vis-Messung sowie die Auswertung über das Differenzspektrumnach dem in 6.7.2aa beschriebenen Verfahren. Abbildung 37 zeigt den über die

UV/vis-Spektren ermittelten Assoziationsgrad des Cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)es mit 9,10-Di-(4-brombutyloxy)-anthracen als Funktion der Zeit.

Berechnung gemäss der unter 6.7.2b beschriebenen Methode

246

6.7.3.2 5'-Tosyladenosin (15)

Dicyanocobyrinat (24) und Co(ll)-cobyrinat

Assoziation der Dicyanoform (24)

Man versetzte 2,1 mg (1,68-10'6 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat

(24) und 12,6 mg (6,17-1 0"6 mol) 5'-0-Tosyladenosin (15) mit 0,75 ml

Deuteriumoxid, beschallte 30 Minuten mit 50 kHz in einem auf 21,0 ± 0,1 °C

thermostatisierten Ultraschallbecken, zentrifugierte bei 4*000 UpM während 15

Minuten und untersuchte die klare Lösung umgehend UV/vis- und 1H-NMR-

spektroskopisch. Der Besetzungsgrad wurde gemäss 6.7.2a<x ermittelt.

Nachfolgende schrittweise Verdünnung der Probenlösung mit jeweils ca. 0,15 bis 0,20

ml Deuteriumoxid unter Wiederholung des Sättigungsvorganges lieferte folgende

Ergebnisse:

[24]/mM Cobyrinat: Adotosylat

(24.15)

gemäss1 H-NMR

Besetzungsgrad

gemäss

UV/vis-Spektrum

2,18 6,5 : 1 0

1,76 nicht gemessen 0

1,43 4,0 : 1 0

0,91 nicht gemessen 0

Die 'H-NMR-Signale des Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und des S'-

O-Tosyladenosin (15) waren bis auf die nachfolgend aufgeführten Ausnahmen

identisch mit jenen der reinen Vergleichssubstanzen (Angaben in Klammern reine

Substanzen):

[Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat]= 2,18 mM: Dicyano-heptakalium-

Co(lll)-cobyrinat: 3,09 (3,05); 3,48 (3,45); 3,55 (3,53); 5'-0-Tosyladenosin:

5,84/ 5,85 (5,92/5,94); [Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat]= 1,43 mM:

Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat keine Abweichungen; 5'-0-Tosyladenosin:

5,84 /5,85 (5,92/5,94).

Die Auftragung der Cobyrinatkonzentration vs. abs26o nm ergab eine Gerade (R2=

0,998, Achsenabschnitt 0,82). Die Absorption von 0,82 bei 260 nm im

Achsenabschnitt entspricht dabei dem bereits unter 6.7.1 experimentell bestimmten

Wert der Löslichkeit des 5'-0-Tosyladenosin in Deuteriumoxid. Die mit der

Corrinkonzentration linear ansteigende Absorption bei 260 nm impliziert eine

konstante Konzentration an 5'-0-Tosyladenosin. Es wurde somit in Anwesenheit des

Cobyrinat 24 kein zusätzliches 5'-0-Tosyladenosin gelöst. Der Besetzungsgrad beträgt

daher null.

247

Assoziation der Co(ll)-Form

In einer Glove-box wurde eine Lösung von 5,8 mg (4,3-10'6 mol) Co(ll)-cobyrinat in

1,0 ml D20 mit 4,0 mg 5'-0-Tosyladenosin (15) versetzt, die Lösung analog der

Dicyanoform gesättigt, zentrifugiert und die Mutterlauge zur Spektroskopie

abpipettiert.Nach Zugabe von KCN lag der Gehalt an S'-O-Tosyladenosin gemäss

1 H-NMR-Spektrum

(300 MHz) mit 0,51 mM beim 0,13-fachen der Cobyrinatkonzentration. Dies

entspricht der Löslichkeit von 5'-0-Tosyladenosin (15) in Deuteriumoxid (vgl.

6.7.1).

Die Probe wurde anschliessend lyophilisiert, in Deuteromethanol gelöst und die 'H-

NMR-spektroskopische Messung (300 MHz) wiederholt, die nach Auswertung mit

Methode 6.7.2b ein praktisch identisches Konzentrationsverhältnis von 0,12 ergab.

Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-

hepta-(n-decyl-W'-carboxylat) und Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",

N"",N ,N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)

Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N '-hepta-(n-decyl-

10'-carboxylat)

1. Experiment

Eine mit 4,0 mg 5'-0-Tosyladenosin (15) versetzte Lösung von 11,1 mg

Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"-,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-

10'-carboxylat) (17) in 1,4 ml D20 (2,81 -10"* M) wurde während 15 Minuten

Ultraschall ausgesetzt, die Lösung während fünf Minuten mit 4'000 UpM zentrifugiert

und von der nun klaren Lösung das 1 H-NMR-Spektrum aufgenommen.

Die Integrale des Signale des S'-O-Tosyladenosin zwischen 7,00-8,00 ppm (vier

Protonen des Phenylringes) zum Integral des H(C-10)-Signales des Corrins bei 5,78

ppm ergaben ein absolutes Verhältnis der Konzentrationen des Corrins 17 zur

Konzentration des Tosylates 15 von 1,00 zu 0,45.

Auf der Basis dieses Konzentrationsverhältnisses berechnet sich aus dem 'H-NMR-

Spektrum gemäss 6.7.2b der Besetzungsgrad des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-

cobamido-N,N-,N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (17) mit S'-

O-Tosyladenosin (15) zu 16%.

2. Experiment

Analog Experiment 1 wurden 7,7 mg S'-O-Tosyladenosin (15) zu einer Lösung von

ca. 16 mg Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N"""-

hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) in 1,0 ml D20 gegeben (4,88-103 M), 15

min mit 50 kHz beschallt, zentrifugiert und die überstehende klare Lösung

schnellstmöglich mittels 'H-NMR- und UV/vis-Spektroskopie analysiert.

Für die nachfolgenden Messungen verdünnte man die jeweils mit der Stammlösung

vereinigten Proben mit D20 um ca. 1/4 und bestimmte UV/vis-spektroskopisch die

248

Konzentration an Cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) 17. Von jeder zweiten Verdünnung wurde zudem das 1H-NMR-Spektrumgemessen.

Aus den UV/vis-Spektren errechnete man der unter 6.7.2 aa beschriebenen Methode

folgend den Besetzungsgrad.

Unter Venvendung der unter 6.7.2b beschriebenen Vorgehensweise entnahm man den

1 H-NMR-Spektren die relative Konzentration an 5'-0-Tosyladenosin (15) und

berechnete erneut den Besetzungsgrad. Tabelle 13 fasst die Ergebnisse zusammen.

Tabelle 13 Assoziationsgrad in Prozent der Corrinkonzen¬

tration von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cob-

amido-N.N-.N-'.N-.N'-.N ,N -hepta-(n-

decyMO'-carboxylat) (17) und 5'-0-Tosyl-adenosin (15) in Deuteriumoxid

[17]/mM •15-,o,a|/•17-,o,a,gemäss

'H-NMR-

Spektrum

•»-.ou.in mM

gemässUV/vis-

Spektrum

Besetzungsgrad gemäss

'H-NMR- UV/vis-

Spektrum Spektum

4,88 0,16 0,84 7% 8%

3,81 - 1,02 nicht gemessen 15%

2,78 0,30 1,00 15% 20%


1,50 0,46 0,69 16 % 16%

3. Experiment

Mit 4,2 mg 5'-0-Tosyladenosin (15) in einer Lösung von ca. 8,4 mg Heptakalium-

dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxy-

lat) (17) (4,88-10'6 mol gemäss UV/vis-Spektrum) in 2,0 ml D20 wurde wie im 2.

Experiment verfahren. Tabelle 14 fasst die Ergebnisse zusammen.



amido-N,N•,N",N•",N•—,N ,N -hepta-(n-

decyMO'-carboxylat) (17) und S'-O-Tosyl¬adenosin (15) in Deuteriumoxid

[l7]/mM -15-,ota,/ [15),o,a, Besetzungsgrad gemäss

["Ul in mM

gemäss gemäss 'H-NMR- UV/vis-

'H-NMR- UV/vis- Spektrum SpektumSpektrum Spektrum

2,44 0,22 0,50 4% 2%


249

1,67 0,40 0,68 12% 14%


0,89 0,63 0,67 16% 25%

0,64 - 1,15 nicht gemessen 11 0%

0,48 1,7 0,99 85% 11 2%

4. Experiment

Analog dem als Experiment 2 beschriebenden Verfahren verdünnte man sukzessive eine

Lösung von ca. 5,0 mg Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) in 1,0 ml D20 (1,56-1 O*3

mol gemäss UV/vis-Spektrum), in der 5 mg S'-O-Tosyladenosin (15) suspendiert

war, und nahm jeweils nach Sättigung der Lösungen ihr UV/vis-Spektrum auf.

Die UV/vis-Spektren wurden gemäss der unter 6.7.2aa beschriebenen Methode

ausgewertet. Tabelle 15 fasst die Totalkonzentrationen des Corrins 17 und des

Tosylates 15 sowie die Ergebnisse der Auswertung der Experimente zusammen.



amido-N,N',N",N",,N"",N ,N -hepta-(n-

decyl-IO'-carboxylat) (17) und S'-O-Tosyl¬adenosin (15) in Deuteriumoxid, bestimmt mit


[l7]/mM [15]tota|/ mM Besetzungsgrad

gemäss

UV/vis-Spektrum

1,56 0,62 11%

1,32 0,78 25%

1,10 1,04 54%

0,99 0,95 51%

0,82 1,43 120%

0,73 1,29 116%

0,63 1,17 115%

0,56 1,09 115%

0,50 1,04 11 7%

0,46 0,99 11 7%

0,43 0,95 116%

0,32 0,96 161%

0,25 1,04 234%

0,17 0,80 206%

0,11 0,70 224%

250

Abbildung 99: UV/vis-Spektren der mit 5'-0-Tosyladenosin (15) gesättigten

Lösungen von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -

hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17), Konzentrationen vgl. Tabelle 14

I I 1 1 1 1 1 L.

ppm 8 7 65432 1

Abbildung 100: ' H-NMR-Spektrum von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) (2,44-1 0"3 M),

D20-Lösung gesättigt mit 5'-0-Tosyladenosin (15)

251

5. Experiment

Ca. 10 mg 5'-0-Tosyladenosin (15) wurden zu einer Lösung von 1,3 mg (5,12-10-7

mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-

decyl-10'-carboxylat) (17) in 2,8 ml D20 gegeben (1.83-10-4 M), in einem auf

21,0 ± 0,1 °C thermostatisierten Wasserbad beschallt, zentrifugiert und die

überstehende klare Lösung 'H-NMR- und UV/vis-spektroskopisch analysiert.

Die Auswertung des ' H-NMR-Spektrums mit der unter 6.7.2b beschriebenen Methode

ergab eine Konzentration an S'-O-Tosyladenosin (15) von 0,64 mM, dem 3,5-fachen

der Konzentration an 17 (0,18 mM), entsprechend einem Besetzungsgrad von 104%.

Die Auswertung des UV/vis-Spektrums gemäss 6.7.2a<x bestimmte die Konzentration

des 5'-0-Tosyladenosin (15) zu 0,69 mM, dem 3,8-fachen der Konzentration an

Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-

10'-carboxylat) (17), entsprechend einem Besetzungsgrad von 130%.

6. Experiment

Die Wiederholung des 5. Experimentes ausgehend von 4,2 mg (1,7-10-6 mol)


10'-carboxylat) (17) in 0,7 ml Deuteriumoxid lieferte nach analoger Auswertung

die in Tabelle 16 dargestellten Resultate.


tration von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-

cobamido-N.N'.N-.N-.N'-.N ,N -hepta-

(n-decyl-lO'-carboxylat) (17) und 5-0-Tos-

-yladenosin (15) in Deuteriumoxid, be¬

stimmt mit 1 H-NMR- & UV/vis-Spektroskopie

[17]/mM

2,28

1,80

1,47

'H-NMR-SpektrumVerhältnis von

5'-0-

Tosyladenosin

17 (15)

4,6

nicht

2,1

1,0

gemessen

1,0

Besetzungsgradgemäss

'H-NMR-

Spektrumb

17

UV/vis-

Spektrum3

11

0,93 nicht gemessen - 1 3

a: berechnet gemäss der in 6.7.2 aa beschriebenen Methode; b: berechnet

gemäss der in 6.7.2 b beschriebenen Methode

Abgesehen von der chemischen Verschiebung des H(C-3) bei 4,05 ppm, welches in den

Probelösungen bei 4,07 ppm beobachtet wurde, war das 'H-NMR-Spektrum des


10'-carboxylat) (17) identisch mit dem Beschreibungsspektrum (vgl. 6.4.5).

252

Die chemischen Verschiebungen der Signale des 5'-0-Tosyladenosin (15)unterschieden sich in den 'H-NMR-Messungen von jenen der Beschreibungspektrenwie folgt (Werte der Beschreibungsspektren der reinen Substanzen in Klammern, vgl.

6.7.1):

Im Experiment mit [17]= 2,28 mM: 8,07/8,04 (8,14/8,17); 7,49/7,46

(7,52/7,55); 7,08/7,05 (7,13/7,10); im Experiment mit [17]» 1,47 mM:

8,07/8,04 (8,14/8,17); 7,47/7,44 (7,52/7,55); 7,06/7,04 (7,13/7,10).

Assoziation mit Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)

Experiment 5 wurde in einer Glove-box mit 28,1 mg (1.13-10-5 mol) Hexakalium-Co

(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)54, 4,0

mg 5'-0-Tosyladenosin (15) in 1,0 ml D20 (Phosphatpuffer, pH 7, 0,1 M)

wiederholt.

Das 1 H-NMR-Spektrum (300 MHz) der Co(ll)-Lösung zeigte sehr breite

Signalhaufen, aus denen bei 7,28 und 7,60 ppm deutlich je zwei Signale hervortraten.

Zur Oxidation und Überführung in die Dicyanoform 17 versetzte man mit 2,04

Äquivalenten KCN, lyophilisierte und löste zur' H-NMR-spektroskopischen Analyse in

0,7 ml CD3OD.

Die Integrale des Signale des 5'-0-Tosyladenosin (15) zwischen 7,00-8,00 ppm

(vier Protonen des Phenylringes) zum Integral des H(C-10)-Signales des Corrins bei

5,78 ppm ergaben ein absolutes Verhältnis der Konzentrationen des Corrins 17 zur

Konzentration des Tosylates 15 von 1,0 zu 2,0. Die Totalkonzentration an S'-O-

Tosyladenosin betrug somit 22,6 mM.

Mit der unter 6.7.2b beschriebenen Methodik errechnete sich ein Besetzungsgrad des

Hexakalium-Co(ll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carb-

oxylat)es (17) mit 5'-0-Tosyladenosin (15) von 196%.

6.7.3.3 Methyltosylat

Es wurden 9,0 mg (7,17-10-6 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24)

bzw. 18,0 mg (7,09-10"6 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-

N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) mit je ca. 14 mg

Methyltosylat und 1,0 ml D20 (7,17-10"3 M bzw. 7,09-10"3 M) versetzt, die beiden

Proben gleichzeitig 25 min Ultraschall (50 kHz) ausgesetzt, gleichzeitig während 25

Minuten zentrifugiert (4000 UpM), die überstehenden Lösungen dekantiert und sofort

das 1 H-NMR-Spektrum (80 MHz) aufgenommen. Diese Prozedur wurde dreimal

54 Hergestellt aus 28,71 mg (1,13-10"5 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) mit 5 pl

Essigsäure, 11,7 mg Platindioxid und Wasserstoff analog 6.5.1.

253

durchgeführt, wobei die NMR-Probe nach der Messung wieder mit dem Anteil der

Lösung vereinigt wurde, von dem sie abpipettiert worden war.

Zur Errechnung des Verhältnisses von Methyltosylat und Corrin setzte man die

Integrale des 1H-NMR-Spektrums über die Bereiche 7,00-8,00 und 1,70-1,00

(24, 21 ) bzw. 1,90-1,00 (17, 135 H) ins Verhältnis. Diese Bereiche wurden

ausgewählt, weil von 7,00 bis 8,00 ppm nur die Signale der vier aromatischen

Protonen des Methyltosylat liegen während im Bereich 1,90/1,70-1,00 ppm nur

Signale des Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) bzw. Heptakalium-

dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N-",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxy-

lat) (17) auftreten.

In den ersten zwei Messungen war die Lösung von 24 gemäss der oben beschriebenen

'H-NMR-Auswertung gemessen an der Corrinkonzentration 2,0-fach ([15]= 14,3

mM), die Lösung des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,

N' -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)es (17) 4,4-fach ([15]= 31,2 mM) an

Methyltosylat konzentriert. Die Ergebnisse waren trotz der apparaturbedingten

geringen Auflösung in dem zweiten Experiment innerhalb 20 % reproduzierbar. Nach

dem dritten Durchgang jedoch zeichnete sich bedingt durch die einsetzende Hydrolyse,

es traten neue Signale bei 7,67/7,63 ppm (C3/5), 7,35/7,31 ppm (C3/5) sowie

2,35 ppm (Methyl des Tosylates) auf, ein deutlicher Anstieg der Tosylatkonzentration

ab.

Die Lösungen von 17 und 24 waren gemäss UV/vis-Spektrum in Bezug auf die

Corrinkonzentration mit 7,09 mM (17) zu 7,17 mM (24) praktisch identisch.

Dennoch besass die Lösung des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",

N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) eine doppelt so hohe Konzentration

an Methyltosylat als die Lösung des Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24).

Da die exakte Löslichkeit von Methyltosylat55 bei den gewählten experimentellen

Bedingungen in Deuteriumoxid nicht bestimmt wurde, können nur Schlüsse über den

relativen Einfluss dieser beiden untersuchten Corrine auf die Löslichkeit des

Methyltosylates in Deuteriumoxid gezogen werden. Und zwar, dass die Anwesenheit von


10'-carboxylat) (17) verglichen mit Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24)

die Lösung von ca. zwei zusätzlichen Molekülen Methyltosylat ermöglicht.

55 annähernde Löslichkeit 7,7 mM (6.7.1)

254

6.8 Assoziationsexperimente mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-O-tosylat (16) als Gast

6.8.1 Total-Lumineszenzexperimente

Allgemeines zur Total-Lumineszenzspektroskopie

Die Totallumineszenz, d.h. die Summe aus Fluoreszenz und Phosphoreszenz, wurde nach der

Front-face Methode mit einer Apparatur entsprechend Abbildung 101 gemessen. Exitation im

UV-Bereich war wegen des als IR-Filter vor den Exitationsmonochromator vorgeschaltetenWasserfilters aus Fensterglas nicht möglich. Mit zwei Photomultipliern wurde die Emissionund der durch den semidurchlässigen Spiegel reflektierte Teil des Exitationsstrahles als

Referenzstrahl delektiert. Die Exitationsspektren wurden durch Division der

Emissionsspektren durch die Referenzdaten um die Wellenlängenabhängigkeit der Intensität der

als Lichtquelle verwendeten Xenonlampe korrigiert.Monochromatoren: SPEX: Model 1402; Steuerung der Monochromatoren: SPEX: Speed Con-

troler; Photomultiplier Emission: RCA Electronic Components: C 31034 A; PhotomultiplierReferenz: Hamamtsu: R 928; Counter Emission: General Radio: 1192-B; Counter Referenz:

Seyffer: Modell 150; Lampe: Osram Xenon-Hochdruckkurzbogenlampe XBO, 2500 W, T=296K.Die Apparatur wurde freundlicherweise von Prof. U. Wild, Laboratorium für physikalischeChemie der ETH Zürich zur Verfügung gestellt.

Als Schrittweite zwischen zwei Messpunkten wurde jeweils ein Drittel der durch die

Schlitzöffnungen bestimmten Spektralauflösung gewählt.Für jede Experimentserie kalibrierte man mit einer gesättigten 1,Ne-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat-Lösung neu. Die Fluoreszenzmessungen einer Versuchsreihe wurden direkt

hintereinander ausgeführt und sind in ihren absoluten Werten vergleichbar. Bei allen anderen

Messungen, auch wenn sie unter Optimierung des Lichtweges durchgeführt wurden, ist die

numerische Vergleichbarkeit der delektierten Impulse nicht mehr gegeben.Die mangelnde Vergleichbarkeit von mit unterschiedlichen Küvetten durchgeführten Experi¬mentserien war insbesondere durch die Spiegelpositionierung begründet, die für jede Probe

neu optimiert werden musste.

Eine ungenaue Küvettenpositionierung beeinflusst bei der verwendeten Messmethode den

Messwert um weniger als 1 %.

Die Verschiebung des Exitationsmaximums von ca. 4 nm in Abhängigkeit der Konzentration an

1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat ist bei der beschriebenen Versuchsdurchführungbedeutungslos. Der Shift im Emissionsmaximum als Funktion der Konzentration des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) störte ebenfalls die Messungen nicht, da die

Lumineszenzmessungen durch Emissionsscans bei konstanter Exitationswellenlänge erfolgtenund jeweils das Emissionsmaximum ausgewertet werden konnte.

Die extreme Empfindlichkeit des Photomultipliers bedingte strikten Ausschluss von Streulicht.

Das Hintergrundrauschen bei ausgeschalteter Lampe und maximaler Öffnung sämtlicher

Blenden konnte auf maximal 460 counts/sec reduziert werden.

Der Messfehler der Lumineszenzintensität, bestimmt durch die Wurzel aus der Anzahl

Lumineszenzcounts, lag bei den vorliegenden Messungen zwischen 0,2 % und 2 % bezogen auf

das Lumineszenzmaximum der jeweiligen Messung.

255

<v

-01

MC

© IR-F

^v^wv.w.^^^m^^^k^^cy.1

MC O

Abbildung 101: Apparatur zur Messung der Totallumineszenz

B: Blende; St: Strahlenteiler; M: Spiegel; Pm: Photomultiplier; Pr:

Probenrohr; Qc: Quantenzähler

256

6.8.1.1 Totallumineszenz-Spektren von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat(16) in D20: Vergleich sauerstofffreier und sauerstoffhaltigerLösungen

In einer Glove-box wurden von je 1,0 mg mikrokristallinem 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) über je 1,4 ml Deuteriumoxid durch Beschallung mit Ultraschall der Frequenz50 kHz bei 23 °C zwei gesättigte Lösungen hergestellt, die entstehenden Suspensionen bei

4'000 UpM ausserhalb der Glove-box während fünf Minuten zentrifugiert, die Proben wieder

in die Glove-box geführt und die überstehenden, klaren Lösungen zur weiteren Verwendungabpipettiert.Eine Probe dieser sauerstofffreien Lösung wurde in der Glove-box mit Deuteriumoxid auf ca.

1/10 der Sättigungskonzentration verdünnt.

Zur Spektroskopie wurden die Lösungen in Küvetten mit einer Schichtdicke vom 0,100 cm

gefüllt, jeweils mit einem Teflonstopfen und Parafilm gasdicht verschlossen und sodann der

Glove-box entnommen.

Analog, jedoch in normaler Laboratmosphäre wurde ohne Verwendung einer Glove-box eine

sauerstoffgesättigte Lösung von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) in Deuteriumoxid

hergestellt.Die UV/vis- und 2D-Totallumineszenz-Spektren (Messdauer je 12 h) der drei Lösungen im

Bereich 250-380 nm (Exitation) und 305-560 nm (Emission) (Abbildung 39-42) wurden

gemessen.

Die Fluoreszenzintensitäten sauerstoffgesättigter und entgaster gesättigter Lösungen des 1 ,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) waren praktisch identisch: 02 < 15 ppm, abs26s nm=

0,851: 55'250 Counts; sauerstoffgesättigt, UV/vis-Spektrum: abs265 nm=1>024: 60'200

Counts.

Eindimensionale Emissions- und Exitationsscans im Bereich des Exitations/Emissionsmaxi-

mums (EM 340-520 nm, EX 300/320/340 nm & EX 280-360 nm, EM 410/430/450 nm)wurden jeweils von analog frisch hergestellten Lösungen mit erhöhter Sensitivität des

Spektrometers gefahren und die Lage des Emissionsmaximums aus je drei Exitationsscans

bestimmt. In Tabelle 1 sind die Lagen der Maxima der EM/EX-Matrix zusammengestellt.

Die'H-NMR-Spektren der Probenlösungen im Anschluss an die Fluoreszenzmessungen waren

mit dem Spektrum des reinen Eduktes 16 identisch.

6.8.1.2 Konzentrationsreihe von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)in D20

Zur Messung der Konzentrationsabhängigkeit der Fluoreszenzintensität wurde eine Serie von

Totallumineszenzmessungen durchgeführt.Ca. 1,4 ml Deuteriumoxid über ca. 10 mg 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) wurden

durch 15-minütige Ultraschallexposition (50 kHz) mit 16 gesättigt. Von der nach

Zentrifugation (4'000 UpM, 5 min) partikelfreien überstehenden Lösung wurde das UV/vis-

Spektrum und die Totallumineszenzspektren (Anregung 320 nm, Emissonsdetektion 340-520

nm) gemessen.

Ausgehend von diesen 1,4 ml mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gesättigtenDeuteriumoxid wurden durch sukzessives Verdünnen mit jeweils frischen Deuteriumoxid-

Ampullen Verdünnungen von '/2,1/s, '/10,1/so der gesättigten Lösung hergestellt und analog

257

Spektroskopien. Das Hintergrundrauschen wurde für die gewählten Apparaturparameter zu

883 counts/sec bestimmt.

Abbildung 43 zeigt die Lumineszenzintensitäten dieser Lösungen als Funktion der

Konzentration. Die Zahl gemessener Impulse im Photomultiplier war bis zu abs265 nm- 0,60,

entsprechend einer halbgesättigten Lösung, lineare Funktion der Konzentration (Gerade in

Abbildung 43) und wich für höhere Konzentrationen erheblich von der Linearität ab. Die

Abweichung von der Linearität lag für die gesättigte Lösung 21% unter dem Wert, der sich aus

der Extrapolation der Lumineszenzintensitäten als Funktion der Konzentration für weniger als

halbgesättigte Lösungen ergibt.

6.8.1.3 Bestimmung der Löslichkeit von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat(16) in D20

Deuteriumoxid wurde mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gesättigt indem 1,4 ml

D20 mit ca. 10 mg 16 im auf 23,0 + 0,1 °C thermostatisierten Ultraschallbad während 15

Minuten Ultraschall der Frequenz 50 kHz ausgesetzt wurden. Nach Zentrifugation während fünf

Minuten bei 4'000 UpM war die Lösung über dem Festkörper partikelfrei und wurde UV/vis-

spektroskopisch untersucht.

Mit sechs weiteren, analogen Experimenten bestimmte sich die Löslichkeit von 16 zu 1,29-10"4 M ± ca. 4,5 % [e(1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16), D20, 265 nm)= 8'100].

6.8.1.4 Hydrolyse & Stabilität von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat(16) in D20

Eine analog56 gesättigte Lösung von 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) in

Deuteriumoxid wurde a) sofort nach ihrer Bereitung und nach lichtgeschützter Lagerungwährend b> 24 Stunden bei 5 °C sowie c> anschliessenden sieben Tagen bei 23 ± 1 °C 'H-NMR-

(200 MHz) und UV/vis-spektroskopisch untersucht.

Innerhalb der üblichen Messfehler waren sämtliche 'H-NMR- und UV/vis-Spektren mit den

Spektren von reinem 16 identisch und wiesen auch keine Signale hydrolysierter Substanz auf.

6.8.1.5 Totallumineszenz von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat und

Hexanatrium-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat(24 & 21) und Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17 & 19)

a BlindprobeDie Exitationsspektren einer mit Deuteriumoxid gefüllten Messküvette57, Anregung 250-400

nm, Emission delektiert bei 410, 430, 450 nm, und die Emissionsspektren, Anregung 300

und 340 nm, Emissionsbereich 340-520 nm, waren mit max. ca. 330 counts/sec praktischKonstanten und identisch mit dem Hintergrundrauschen.Im UV/vis-Spektrum begann die Absorption entsprechend den Materiaieigenschaften der

eingesetzten Küvette unterhalb 300 nm, auf Werte über 0,001 zu steigen.

56 analog 6.8.1.3

57 Hellma suprasil, dx= 0,100 cm, gereinigt mit Methanol, puriss. und anschliessend mit

Aceton puriss.

258

b. Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat/Hexanatnum-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobynnat (24 & 21)

Ca 0,7 mg (5,82 10 7 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) wurden in 0,7 ml

Deuteriumoxid gelöst (abss7g nm= 0,814, 8,31 10'4 M), in eine 0,100 cm Quartzkuvette

gefüllt, das UV/vis Spektrum und das Totaiiumineszenzspektrum (Exitation 250-450,Emission 430 & 570 nm, Emission 250-800, Exitation 285 nm) gemessen, die

Totallumineszenzmessung als zweidimensionales Exitations-Emissions-Spektrum wiederholt

und zum Schluss das 1 H-NMR-Spektrum (300 MHz) aufgenommen.Mit einer aus 0,4 mg Hexanatnum-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobyrinat(21) und Deuteriumoxid bereiteten 1,20 10 5 M Lösung wurde bis auf den Verzicht auf das

zweidimensionale Totaiiumineszenzspektrum analog verfahren

Die Emissionsspektren der Lösungen (EM 250-750, EX 250-400) (Abbildungen 44 & 45)

zeigten bei konstanter Exitation ab 500 nm minimale, aber signifikante Zunahme der Emission

mit steigender Wellenlänge; bei konstanter Emission in den Exitationsspektren unterhalb 300

nm eine Zunahme der Counts mit fallender WellenlängeDie Fluoreszenzcounts des Probenphotomultiphers lagen mit maximal 400 counts/sec in der

Grössenordnung des Hintergrundrauschens Die UV/vis- und 'H-NMR-Spektren waren

identisch mit den Beschreibungsspektren von 24 und 21

c Heptakalium-dicyano Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)/Hexanatnum-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobamido-N,N',N",N-,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17 & 19)

Ca. 3,0 mg (1,18 10"3 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,

N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)(17) wurden in 0,7 ml Deuteriumoxid gelöst und 'H-

NMR- sowie UV/vis-spektroskopiert (abssso nm« 1,227, 1,30 10 3 M). Der Bereich EX

320, EM 250-700 nm und EM 430, EX 250-450 nm wurde auf Lumineszenz geprüftMit einer aus 1,0 mg Hexanatnum-Coa-aquo-Coß-5'-(1",N6-etheno)adenosyl-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (19) und Deuteriumoxid

bereiteten 1,95 10'5 molaren Lösung wurde analog verfahren

Die UV/vis-Spektren waren identisch mit den entsprechenden Beschreibungsspektren von 17

respektive 19.

Die gemessenen Fluoreszenzintensitäten der Dicyano- und 1,N6-Ethenoadenosylverbindung

gingen nicht über das Rauschen, d h ca 400 Counts/sec,hinaus und wiesen keine Maxima auf

(Abbildung 46 & 47) Die ' H-NMR-Spektren waren mit jenen aus den Beschreibungsansätzenbis auf durch Konzentrationsunterschiede bedingte, geringfügige Signalverschiebungenidentisch

259

6.8.1.6 Konzentrationsreihe von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat

(24) und -cobamido-N,N-,N",N-,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-

10'-carboxylat) (17) mit gesättigter, wässriger 1,N6-Etheno-

adenosyl-5'-0-tosylat-Lösung

3,5 ml Deuteriumoxid mit 5,1 mg (1,04-10'4 mol) 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)wurden während 15 Minuten Ultraschall ausgesetzt (50 kHz), die Suspension zentrifugiert(4'000 UpM, 5 min) und die partikelfreie Lösung vom Niederschlag abpipettiert.Man löste sodann 2,3 mg (1.91-10'6 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24)bzw. 5,2 mg (2,04-106 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) in jeweils 0,5 ml der mit 1,N6-

Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gesättigten Deuteriumoxidlösung und verdünnte für die

nachfolgenden Messungen die Probe jeweils mit dergleichen 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat-Stammlösung, sodass Lösungen der approximativen Konzentration '/2, V3, V5,1/7,5,1'io, 1'20,1/30,1'5o, 1'75,1'ioo der anfänglichen Corrinkonzentration resultierten.

Von jeder Verdünnung wurde ein UV/vis-Spektrum und ein Totallumineszenz-Emissions¬

spektrum (Emissionsscan: 340 bis 520 nm, Exitation: 320 nm) aufgenommen sowie je zwei

Proben zusätzlich 'H-NMR-spektroskopisch (300,13 MHz) untersucht.

UV/vis-Spektren

Abbildung 48 zeigt die UV/vis-Spektren der untersuchten gesättigten 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat-Lösungen mit jeweils unterschiedlichem Gehalt an Dicyano-heptakalium-

Co(lll)-cobyrinat (24).

'H-NMR-Spektroskopie

Die Signale der 1 H-NMR-Spektren der Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat-Versuchs¬reihe waren die Summe der Signale aus den Spektren der reinen Substanzen 24 und 16.

Im Falle des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-

decyMO'-carboxylat) (17) fand man das Signal von 4,07 ppm nach 4,06 ppm und von den

Signalen des 1 ,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) jene von 1,90 ppm nach 1,96 ppm und

die des Aromaten von 6,75 ppm und 7,39 ppm nach 6,82 ppm respektive 7,42 ppm geshiftet

(Tabelle 2).Hydrolyse während der Zeitdauer der Versuchsdurchführung trat nicht in 'H-NMR-spektro¬skopisch detektierbarem Ausmasse auf.


Abbildung 49 zeigt die Totallumineszenzintensitäten der Emissionsspektren obiger Lösungenals Funktion der Corrinkonzentration. Die ermittelten Funktionen für Dicyano-heptakalium-

Co(lll)-cobyrinat (24) und Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,

N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) waren ebenso wie die Emissionsspektren der

Stammlösungen identisch. Die Emissionsspektren der corrinhaltigen Proben zeigten im

untersuchten Bereich zwei gut erkennbare Maxima, ca. 410 und 430 nm, und entsprachendamit den Literaturdaten [142, 145, 152]. Neben den Maxima bei 430 und 410 wurde in den

Totallumineszenzspektren der Lösungen von 17 zudem eine Schulter bei ca. 380 nm

beobachtet, welche in Lösungen mit abssao nm> 2 au< 360 nm fiel. Die Breite der

Lumineszenzbanden auf halbmaximaler Höhe schwankte zwischen 90 und 75 nm.

260

6.8.1.7 Sättigung von Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) &

Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobamido- N, N', N", N"-,N"",N ,

N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat) (17) in Deuteriumoxid mit

1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)

A. orientierende Messung von Lösungen vergleichbarer Konzentration

1,6 mg (1,26.10-6 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) bzw. 3,3 mg

(1.30-10-6 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N-",N-'",N ,N -

hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17) wurden mit 0,8 bzw. 1,6 mg 1,N6-Etheno-5'-0-tosyladenosin (16) (1,63-10"6 mol bzw. 3.26.10"6 mol) sowie je 0,7 ml Deuteriumoxid

versetzt (9,29-10-4 M bzw. 1,55-103 M) und während zehn Minuten mit 50 kHz Ultraschall

unter Temperaturkontrolle, T= 23,0 ±0,1 °C, beschallt. Nach Zentrifugation (4'000 Upm, 10

min) liess sich eine klare Lösung vom verbleibenden, farblosen Festkörperanteilabpipettieren.Zur Bestimmung der Lumineszenzeigenschaften wurden bei 300 °K Exitationscans (Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24): von 280 bis 360 nm; Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"-,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17): von 250 bis

400 nm) mit Detektion bei 410/430/450 nm und Emissionsscans (Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24): von 340 bis 520 nm; Heptakalium-dicyano-Co(!ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat): von 300 bis 520 nm) mit

Exitation bei 300/320/340 nm gemessen. Zuletzt wurden die 'H-NMR- und UV/vis-Spektrender Proben aufgenommen. Im Falle von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) wurde ca. 0,1 mg KCN in die

Probe gegeben und erneut das ' H-NMR-Spektrum gemessen.

Aus den Absorptionswerten der UV/vis-Spektren berechnete man gemäss der unter 6.6.2aa

beschriebenen Methode die Konzentration an 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) für die

Lösung von 24 zu 1,40 mM, für die Lösung von 17 zu 1,83 mM.

Die Auswertung der 'H-NMR-Spektren erfolgte entsprechend Methode 6.6.2b. Aus den

Integralen der 'H-NMR-Signale des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16), die oberhalb

5,0 ppm lagen und dem C-10 Signal des Corrinteiles, beim Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) zusätzlich C-3, 19 und 8 bzw. C-3 und 19 bzw. beim Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N'-,N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17),wurden die relativen Konzentrationen der beiden Substanzen bestimmt. Die Konzentration von

[16] betrug mit 2,33 mM das 1,5-fache der Konzentration von 17, und mit 1,39 mM

ebenfalls das 1,5-fache der Konzentration von 24. Gemäss 6.6.2 ergeben sich die

Besetzungsgrade zu 10% für das Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und 60% für

das Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-

10'-carboxylat) (17).

Die 'H-NMR-Spektren lieferten die aufgrund der Charakterisierung der reinen Substanzen

(vgl. 6.4.1, 6.4.5, 6.6.2) erwarteten Signale. Tabelle 4 dokumentiert die Abweichungen der

beobachteten chemischen Verschiebungen im 1H-NMR-Shifts von der Lage der chemischen

Verschiebungen der reinen Substanzen. Hydrolyse des 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)wurde im Zeitraum der Experimentsdurchführung im 'H-NMR-Spektrum nicht beobachtet.

Die Lösung von 16 mit Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -

hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) opaleszierte leicht, doch klarte sie sich bei Zugabevon 0,1 mg KCN sofort auf. Die 1 H-NMR-Signale des Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-

261

N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17), die zuerst schmal

waren, verbreiterten sich auffallend. Bei den Signalen des Gastes verhielt es sich genau

umgekehrt.

Das Exitationsmaximum beider Probenlösungen lag bei ca. 323 nm. Während das

Emissionsmaximum in der Lösung mit 24 bei 435,9 ± 2,7 nm lag und eine Schulter bei 409 ±

2 nm zeigte, befand sich in der Lösung von 17 das Emissionsmaximum bei 434,0 ± 0,8 nm mit

einer Schulter bei 410 ± 2 nm. Die Fehlergrenze der Lage der Maxima wurde graphisch aus

den Lumineszenzspektren abgeschätzt.

Tabelle 3 (Allgemeiner Teil) zeigt die Ergebnisse der Spektrenanalyse in der Übersicht.

B. Konzentrationsreihe der Dicyanocorrine 17 & 24

2,2 mg Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und 5,0 mg Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N",,N,"-,N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17)wurden in je 1,4 ml Deuteriumoxid gelöst, auf ca. 2,8 mM eingestellt, mit je ca. 10 mg 1,N6-

Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) versetzt, während 15 Minuten Ultraschall ausgesetzt (50kHz, Wasserbad 23 °C), zentrifugiert (4'000 UpM, 5 min) und von den partikelfreienLösungen die Fluoreszenz-, die UV/vis- sowie die 'H-NMR-Spektren aufgenommen.Anschliessend verdünnte man die Proben dreimal je auf die Hälfte und wiederholte die Sättigungmit anschliessender spektroskopischer Untersuchung, abgesehen vom 'H-NMR-Spektrum,welches nur für die letzte Verdünnung einer Konzentrationsreihe wieder gemessen wurde.

UV/vis-Spektren

Die 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat-Konzentrationen wurden analog der unter 6.6.2aa

beschriebenen Methode aus den UV/vis-Spektren bei 265 nm berechnet. Tabelle 17 fasst die

Absorptionswerte der Probenlösung bei 578 bzw. 580 nm sowie die Konzentrationen an 16

zusammen (Küvettendicke dx= 0,100 cm).

Tabelle 17 i

1

(

Auswertung der UV/vis-Spektren der mit

,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)»sättigten Corrinlösunaen in D?0

I 24 [16]/mM abs 576 nm

0,210 2,408

0,198 1,263

0,271 0,820

0,285 0,604

0,265 0,413

1 7 [16]/mM abs 580 nm

1,504 2,431

1,234 1,630

0,900 0,824

0,372 0,431

262

Lumineszenz

Die Lumineszenzspektren wiesen jeweils zwei Emissionsmaxima auf, eines bei cirka 427 nm,

das zweite bei 408,5 ± 0,5 nm (Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24)) bzw. 410,5

± 0,3 nm (Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"-,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat (17)) (Abbildung 102 und 103). Die Fehlergrenzen wurden wiederum

aus den Spektren graphisch abgeschätzt.

Der Verlauf der Luminszenzintensitäten als Funktion der Corrinkonzentration war identisch

mit jenem bei Verdünnung von Corrinlösungen mit an 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat(16) gesättigtem Deuteriumoxid (vgl. 6.8.1.6). Abbildung 52 (Allg. Teil) stellt die Total¬

lumineszenzintensitäten der Lösungen als Funktion der Corrinkonzentrationen graphisch dar.

Dem innerhalb der Fehlergrenzen identischen Verlauf der Lumineszenzwerte (Abbildung 52)standen deutlich erhöhte Konzentrationen an 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)

gegenüber (Abbildung 51). Die Lumineszenz des durch das Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17) zusätzlich

gelösten 1 ,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat war somit praktisch vollständig gequencht.

H-NMR-Spektroskopie

Die 1 H-NMR-Spektren der Lösungen aus Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und

1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) waren betreffend Lage und Integralintensität bei

allen untersuchten Konzentrationen die Summe der Signale der Spektren der reinen Substanzen

(vgl. z.B. Abbildung 104 sowie Kapitel 6.4.1 & 6.6.2).

Beim Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-

10'-carboxylat) (17) hingegen war neben minimalen Signalshifts (Tabelle 4) sowohl des

Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N' -hepta-(n-decyl-10'-carb-

oxylat) selbst und der extremen Linienbreite (0,2 ppm) der Signale in Lösungen höherer

Konzentration auch ein Shift der meisten Signale des 1 ,N6-Ethenoadenosyleinheit, insbesondere

des Phenylringes, und dem H(C-3) des Corrinringes (8 'H-NMR: 4,03 ppm) zu beobachten.

Mit fallender Konzentration von 17 bildeten sich die Linienverbreiterungen immer mehr

zurück und die Signallagen nahmen die mit den reinen Substanzen identischen Positionen ein.

Die relativen, mit den 1 H-NMR-Spektren entnommenen Intensitätsintegralen der Signale

analog 6.8.1.7A bestimmten Verhältnisse der Konzentrationen von Corrin zu 1,N6-

Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) beliefen sich zu: Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat

(24): abS576= 2,408, 24:16=1,5:1; abs576= 0,413, 24:16=1:4,5; Heptakalium-dicyano-

Co(IM)-cobamido-N,N',N'-,N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (17): abs58o=

2,431, 17:16=1:1,5; abs58o= 0,413, 17:16=1:5.

263

4x1 CT

3x10 -

3 2x1(To

1x1(T

yZZ.^CT^"ICN

(24)

0H

OH

VA

zr"v

^.0(16>

2.75x10^ 2.50x10 2.25x1(T 2.00x10

emission /cm-1

0

Abbildung 102: Totaiiumineszenzspektrum einer 2,56-10-3M Lösung von Dicyano-

heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) gesättigt mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16)in Deuteriumoxid, Exitation: 320 nm, Emissionsscan 350-500 nm

2.75X104 2.50X104 2.25x104 2.00x104

emission /cm-1

Abbildung 103: Totaiiumineszenzspektrum einer 2,56-10-3M Lösung von Heptakalium-

dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) (17)

gesättigt mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) in Deuteriumoxid, Exitation: 320'nm,

Emissionsscan 350-500 nm

264

EQ.O.

LO

COOK

KOOC KOOC

Abbildung 104: Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24), 1,32 mM, in

Deuteriumoxid, gesättigt mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16), 300,13 MHz, 300 K,

Vergleichspektren der reinen Substanzen Abbildung 20 (24) und 6.6.2 (16)

265

6.8.2 UV/vis-Experimente

a) mit Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat

2,1 mg Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobynnat (24) wurden in 0,7 ml Deuteriumoxid

gelöst und mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) gesättigt indem die Lösung mit ca. 10

mg 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) versetzt und während 15 Minuten Ultraschall

der Frequenz 50 kHz ausgesetzt wurde. Von der nach Zentrifugation (4'000 UpM, 5 min)

partikelfreien Lösung über dem am Gefässboden niedergeschlagenen Festkörper wurde das 'H-

NMR- sowie das UV/vis -Spektrum aufgenommen.

Die Lösung wurde nach der Spektroskopie wieder mit dem Festkörper vereinigt, einige Zehntel

eines Milliliters Deutenumoxid zugegeben und die Sättigung sowie die spektroskopische

Analyse wiederholt Die Stammlösung wurde derart insgesamt dreimal verdünnt

Die 'H-NMR-Spektren der von suspendiertem Material durch Zentrifugation befreiten

Lösungen waren jeweils identisch mit der Summe der Spektren der reinen

Vergleichssubstanzen

In Tabelle 18 ist das gemäss 6 6.2b aus den 'H-NMR-Spektren berechnete Verhältnis der

Konzentrationen des Cobynnates 24 zum 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat dargestellt

Ebenso enthält Tabelle 18 den aus den UV/vis-Spektren gemäss der unter 6 6 2 beschriebenen

Vorgehensweise bestimmten Besetzungsgrad der Corrine

Tabelle 18 Assoziationsgrad in Prozent der Corrinkonzentration von

Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat (24) und 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat (16) in wässriger Lösung,bestimmt mit 'H-NMR- und UV/vis-Spektroskopie

[24]/mM Cobyrinat e-Adotosylat

(24-16)

aemäss'H-NMRb

Besetzungsgrad

gemäss

UV/vis-SDektruma

2,42 1,00 . 0,67 0

1,89 - 6

1,54 1,00 1,00 5

1,22 - 1 1

a berechnet gemäss der unter 6 6.2aa beschriebenen Methode; b

berechnet gemäss der unter 6 6 2b beschriebenen Methode

266

b) mit Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-


Mit 4,2 mg Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-

decyl-10'-carboxylat) (17) wurde eine dem Experiment 6.8.2a analoge Experimentreihe

durchgeführt.

Die Ergebnisse der ebenfalls analog zu a) erfolgten Auswertung sind in Tabelle 19

zusammengestellt.

Tabelle 19 Assoziationsgrad von Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cob-amido-N,N-,N',,N-,,,N"",N ,N -hepta-(n-decyl-lO'-carboxylat) (17) mit 1,N6-Ethenoadenosyl-5'-0-tosylat(16) in wässriger Lösung, bestimmt mit 'H-NMR- und


[17]/mM Cobamidat:e-Adotosylat

(17:16)

aemäss'H-NMRb

Besetzungsgrad

gemäss

UV/vis-Spektrum8

2,10 1,12 : 1,00 43

1,70 - 135

1,32 1,00 : 1,82 125

1,11 150

a: berechnet gemäss der unter 6.6.2aa beschriebenen Methode; b:

berechnet gemäss der unter 6.6.2b beschriebenen Methode

267

6.9 Reduktionskinetik von Co(ll)-cobyrinat und Co(ll)-cobamidoN,N',N",N";N"';N""',N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)

Herstellung von Co(ll)-cobyrinat und Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",

N"--,N'"",N -hepta-(n-decyMO'-carboxylat)

Ausgehend von den Dicyanoverbindungen 17 und 24 wurden die Co(ll)-corrine

Co(ll)-cobyrinat und Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N"'",N -hepta-(n-decyl-lO'-carboxylat) wie folgt synthetisiert:

Hexakalium-Co(ll)-cobyrinat

In einer Glove-box wurden 20,0 mg (1,59-10-5 mol) Dicyano-heptakalium-Co(lll)-cobyrinat58 (24) in 10 ml Methanol gelöst, mit 10,4 mg Pt02 sowie 15 pl

Essigsäure versetzt und ein Wasserstoffgasballon aufgesetzt. Nachdem gemäss UV/vis-

Spektroskopie innerhalb 3,5 Stunden das Edukt quantitativ zu Co(ll)-cobyrinatreduziert war, filtrierte man die Lösung, trocknete am HV und löste den festen

Rückstand wieder in 10 ml Methanol.

UV/Vis (CH3OH, c= 2,82-10-* M)

465 ( 7'160), 398 ( 5'180), sh 358 ( 6'200), sh

314 (17'560), 266 ( 13'960)

Hexakalium-Co(ll)-cobamido- N, N', N", N"\ N"", N'"",N -hepta-(n-decyl-10'-

carboxylat)

Analog 24 wurden 55,5 mg (2,20-10"5 mol) Heptakalium-dicyano-Co(lll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat)59 (17) mit

41,0 mg Pt02, 10 pl Essigsäure in 4 ml Methanol innerhalb 1,5 Stunden in Wasser¬

stoffatmosphäre zu Hexakalium-Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N'-,N ,N -

hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) reduziert (UV/vis-spektroskopische Kontrolle),die Lösung filtriert, am HV getrocknet und der Rückstand in 10 ml Methanol gelöst.

UV/Vis (CH3OH, c= 1,80-10-* M)

469 ( 7'310), 403 ( 4'510),sh 365 ( 6'330), sh

315 ( 17'710), 267 ( 13'200)

Die UV/vis-Spektren bei Reaktionsende zeigten keine Absorptionsmaxima oder

Schultern oberhalb 469 nm. Die erhaltenen methanolischen Lösungen der Co(ll)-corrine wurden als Stammlösungen für die nachfolgend beschriebenen

Alkylierungsexperimente eingesetzt.

Material des BeschreibungsansatzesMaterial des Beschreibungsansatzes

268

Messung der Reduktionskinetik

1. Experiment (Cofllj-cobyrinat/NaBH^Phosphatpuffer)

Zur Bestimmung der Reduktionskinetik wurde von einer 0,625 ml-Portion der

methanolischen Co(ll)-cobyrinat-Stammlösung am Rotationsverdampfer das

Lösungsmittel abgezogen und der braune Rückstand zwei Stunden am HV getrocknet.Dieser wurde anschliessend in 2,0 ml 1M Phosphatpuffer, pH 9, gelöst, in die

Messapparatur gemäss Abbildung 56 pipettiert, in den oberen Teil der Messapparatur11,4 mg (3,02-10'4M) Natriumborhydrid eingefüllt, die Apparatur unter

Verwendung von Schliffett gut verschlossen, der Schliff durch Umwickeln mit

Parafilm gesichert und die Apparatur der Glove-box entnommen.

Die Apparatur wurde in die Küvettenhalterung eines UV/vis-Spektrophotometers, das

auf 23,0 ± 0,2 °C thermostatisiert war, verbracht und nach einigen Minuten der

Temperaturangleichung ein Übersichtsspektrum der Probe gefahren:

UV/Vis (Hexanatrium-Co(ll)-cobyrinat, Phosphatpuffer, c= 1,80-10-* M)

468 ( 7-390), 403 ( 4'760), Sh 360 ( 6'200), Sh

316 ( 17'500), 267 ( 13'200)

Die Apparatur wurde dann dem Probenraum wieder entnommen, mit der Co(ll)-cobyrinat Lösung das Natriumborhydrid aus dem oberen, abgebogenen Kolben gespültund die optische Dichte der Lösung bei X= 388 nm als Zeitreihe gemessen.

Die Auswertung der experimentellen Daten (Methodik vgl. nächsten Abschnitt) ergabfür die Regression über ca. fünf Halbwertzeiten einen Wert von y=-0,019+1,706xmit R2= 0,998 aus dem sich k zu k= 11,34 min-1 M-1 errechnete.

Variierte man den Auswertungszeitraum um eine approximative Halbwertzeit

(Verlängerung bzw. Verkürzung) so änderte sich k ca. ± 1%.

2. Experiment (Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N"'",N -hepta-(n-decyl-W-carboxylatyNaBH^Phosphatpuffer)

Analog dem ersten Experiment (Cofllj-cobyrinat/NaBH^Phosphatpuffer) wurden

0,625 ml der methanolischen Stammlösung von Hexakalium-Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) am Hochvakuum

getrocknet und nach Lösen in 2,5 ml 1M Phosphatpuffer, pH 9 in die Apparatur von

Abbildung 56 (Allgemeiner Teil) transferiert. In das Reservoir füllte man 15,8 mg

(4,16.10"4 mol) Natriumborhydrid.Die Eduktlösung wurde vor Beginn der Reaktion einige Minuten im auf 23 °C

thermostatisierten UV/vis-Spektrophotometer belassen bevor das UV/vis-Spektrumgemessen wurde.

Die Reaktion wurde analog dem Experiment 1 initiiert und die Absorption bei 388 nm

verfolgt.Die Auswertung der experimentellen Daten (Methodik vgl. nächsten Abschnitt) ergabmit dem Datensatz der ersten vier Halbwertzeiten ein k von k= 35,6 min-'M-'.

Variierte man den Auswertungszeitraum um eine approximative Halbwertzeit

(Verlängerung bzw. Verkürzung) so änderte sich k um ca. ± 5%.

269

Auch hier zeigte sich, dass während der Experimentsdauer anscheinend keine

Rückoxidation stattfindet. Das UV/vis-Spektrum des Produktes wies nämlich selbst

eine Stunde nach Konstanz des Absorptionswertes bei 388 während einiger Minuten

folgende Maxima auf:

UV/Vis (Pentanatrium-Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N""',N' -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat), Phosphatpuffer, qualitativ, dx= 0,100 cm)

687 ( 0,026) 558 ( 0,081) 463 ( 0,179),390 ( 1,000) 295 ( 1,018)

3./4. Experiment (Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-

decyl-IO'-carboxylatyNaBH^Phosphatpuffer)

Das Experiment 2 wurde noch zweimal wiederholt (3. Experiment: 0,625 ml

Stammlösung, 2,5 ml Phosphatpuffer, 30,7 mg (8,1 MO4 mol) Natriumborhydrid;4. Experiment: 0,625 ml Stammlösung, 2,5 ml Phosphatpuffer, 15,0 mg (4,01 -10-4

mol) Natriumborhydrid).Die den ersten beiden Experimenten analog ausgewerteten experimentellen Daten der

Absorption bei 388 nm lieferte für das 4. Experiment k= 36,4 min-'M'1. Aus dem 3.

Experiment konnte k nur zu grösser als 21,4 min'M'1 abgeschätzt werden, da zu spätmit der Datenakkumulation begonnen wurde.

5. Experiment (Co(ll)-cobyrinat/NaBH4/Methanol)

Es wurde wiederum eine 0,625 ml-Portion aus der Co(ll)-cobyrinat Stammlösungabpipettiert, direkt mit 1,875 ml Methanol verdünnt in die Apparatur gemäss

Abbildung 56 gefüllt und das obere Reservoir mit 29,0 mg Natriumborhydrid beladen.

Nach dem Start der Reaktion analog den übrigen Reduktionsexperimenten wurde

wiederum die Absorption bei 388 nm beobachtet. Sie war lineare Funktion der Zeit mit

einer Steigung von 360 min'1.

Auch bei diesem Experiment war die Kinetikapparatur in der beschriebenen Form

über den Zeitraum der Kinetikmessungen anscheinend genügend dicht; selbst nach

einigen Stunden blieb das UV/vis-Spektrum der Co(l)-Lösungen der

Reduktionsexperimente unverändert:

UV/Vis (Pentanatrium-Co(l)-cobyrinat, CH3OH, c= 2,82-10-* M)

730 ( 320), 558 ( 745), 465 ( 710),sh388 (10'375), 292 ( 10'270), 244 ( 6'900)

Auswertung der Reduktionskinetik

Tabelle 5 zeigt die isobestischen Punkte der untersuchten Reaktionen. Die

Wellenlängen der maximalen Differenzen der Extinktionskoeffizienten zwischen Edukt

und Produkt sind in Tabelle 6 aufgeführt (Tabellen im Allgemeinen Teil).

270

Zur Berechnung der Geschwindigkeitskonstanten wurde, da angesichts der

Reaktionsgeschwindigkeiten nur eine Wellenlänge gemessen werden konnte, die

Wellenlänge absolut grösster Differenz der Extinktionskoeffizienten, 388 nme°,gewählt. Das Zeitintervall zwischen zwei Messungen betrug 1 sec. Sekundäre Faktoren

wie die starke Blasenentwicklung bei der Reduktion der Co(ll)-corrine streuen

statistisch und störten aufgrund der grossen Anzahl Messwerte nicht.

Die Berechnung der Geschwindigkeitskonstante k erfolgte auf der Basis des Modells

einer Reaktion pseudo-erster Ordnung. Der natürliche Logarhythmus des Quotienten

von Eduktkonzentration und Gesamtcorrinkonzentration entspricht dabei k\ der

Geschwindigkeitskonstanten pseudo-1.Ordnung, multipliziert mit der Zeit und ist'überdie Differenzen der momentanen optischen Dichte mit den optischen Dichten bei t= 0

und t= ~ zugänglich.

[Edukt]t-t-k'x t = In ( )

[Edukt]'-0

abst.o- abst-k'x t = In (1+ l 1)

abst-abst.°o

Als Werte für t= 0 und t= ~ wurden die experimentellen Daten vor Beginn und nach

Abschluss der Reaktion eingesetzt. Aus den derart erhaltenen Datensatz wurden für die

ersten vier approximativen Halbwertzeiten x1/2 lineare Regressionen berechnet.

Abbildung 105: Reduktionskinetik von Co(ll)-cobyrinat mit Natriumborhydrid in

Phosphatpuffer, 1M, pH 9; [Co(ll)-cobyrinat]= 1,08 mM, T= 23,0±0,2 °C, dx=

0,100 cm

(a) UV/vis-Spektren von Produkt und Edukt

60 Im Falle des Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-

carboxylat)

271


4 5 6

Zeit / min

(c) Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte bei 388 nm gemäss Ansatz

pseudo-erster-Ordnung

O

o o

00 orao/o oo

0° o ^OooQo <fc

4 5

Zeit / min

10

272

Abbildung 106: Reduktionskinetik von Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N

-hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) mit Natriumborhydrid in Phosphatpuffer, 1M, pH9; [Co(ll)-cobyrinat]= 0,91 mM, T= 23,0 ± 0,2 °C, dx= 0,100 cm

(a)

(b)

UV/vis-Spektren von Produkt und Edukt;

optische Dichte bei 388 nm

(c) Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte bei 390 nm gemäss Ansatz

pseudo-erster-Ordnung

4Zeit / min

273

6.10 Alkylierungskinetik von in situ hergestelltem

Co(l)-cobyrinat und Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N'"",N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)

In situ Herstellung der Co(l)-corrine und Durchführung der Alkyl¬

ierungskinetik

Experiment 1 a

In einer Glove-box wurden 0,625 ml der (22,0 mM) Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)-Stammlösung61 mit

1,67 ml Methanol verdünnt in den unteren Birnkolben der Kinetikapparatur(Abbildung 56) eingefüllt und durch Zugabe von 39,4 mg (1,04 mmol)

Natriumborhydrid unter heftiger Blasenentwicklung die nun 6,0 mM Lösung des

Co(ll)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) zu

Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) re¬

duziert62. Nach dem Abklingen der Gasentwicklung wurde die Apparatur mit dem

abgebogenen Kolben, der 4,60 mg 5'-0-Tosyladenosin63 (15) als Alkylierungsmittelenthielt, verschlossen, der Schliff durch Umwickeln mit Parafilm gesichert,anschliessend die Apparatur der Glove-Box entnommen und die Lösung durch ihr

UV/vis-Spektrum im Bereich von 190 bis 850 nm charakterisiert.

Zur Initialisierung der Umsetzung des Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -

hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) mit dem festen S'-O-Tosyladenosin (15) spülteman durch Umschwenken das Alkylierungsmittel 15 mit der Corrinlösung aus dem

oberen Teil der Kinetikapparatur und rührte während 15 sec mit dem Magnetrührerbevor die UV-Küvette mit der Lösung gefüllt und mit der Messung begonnen wurde. Zu

Beginn der Messung war das 5'-0-Tosyladenosin (15) bereits gelöst.

Der Reaktionsforlschritt wurde während 90 Minuten anhand der Absorption bei einer

fixen Wellenlänge, derjenigen des Absorptionsmaximums des jeweiligen Co(l)-cobamido-N,N',N",N'", N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) (388 nm)dokumentiert und anschliessend das Produkt aufgearbeitet (siehe unten). Nach 6, 17

und 90 Minuten wurde nochmals ein vollständiges UV/vis-Spektrum aufgenommen(Abbildung 57). Die Küvettenhalterung des UV/vis-Spektrophotometers wurde über

die ganze Experimentdauer auf 23,0 ± 0,5 °C thermostatisiert.

Das UV/vis-Spektrum bei Abschluss der Alkylierungskinetik war identisch mit dem

UV/vis-Spektrum des Hexakalium-Coa-aquo-Coß-5'-adenosyl-cobamido-N,N',N",N'", N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) aus dem Beschreibungsansatz.

61 Material aus 7.9

62 Farbumschlag nach grün63 Gewaschen analog Assoziationsexperimenten

274

Experiment 1 b

Ca. 0,5 ml der (15,9 mM) Co(ll)-cobynnat-Stammlösung64 wurden in einer Glove-

box mit 3,1 ml Methanol auf 3,6 ml einer 2,1 mM Lösung verdünnt und mit 40,6 mg

(1,08 mmol) Natriumborhydrid in der Kinetikapparatur (Abbildung 56) reduziert

Nach Abklingen der zunächst heftigen Gasentwicklung (drei Minuten) wurde der

Schliff gefettet, der mit 21,5 mg (0,051 mmol) 5'-0-Tosyladenosm (15) gefüllteobere Kolben aufgesetzt und mit Parafilm umwickelt

Das Eduktspektrum wurde in dem auf 23,0 ± 0,5 °C thermostatisierten

Spektrophotometer gemessen und nach Vermischung der Lösung mit dem

Alkylierungsmittel, welches sofort vollständig in Lösung ging, mit der

Absorptionsmessung bei 384 nm begonnen Nach 3, 9, 21, 95, 138 und 987 Minuten

wurde nochmals ein vollständiges UV/vis-Spektrum aufgenommen (Abbildung 107)Nach 1000 Minuten brach man die Messung ab und wertete aus. Dieser Ansatz wurde

aufgrund der geringen absoluten Substanzmenge nicht aufgearbeitet

Experiment 2 a

Ca 0,650 ml Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)-Stammlösung65 wurden in der Glove-box am Hochvakuum bei

Umgebungstemperatur während drei Stunden getrocknet, der Ruckstand in 2,2 ml

Phosphatpuffer (0,1 M, pH 9) aufgenommen, mit 39,4 mg Natriumborhydrid(1,04-103 mol) reduziert und mit 4,60 mg (1,09 10 5 mol) 5'-0-Tosyladenosin(15) im auf 28,0 ± 0,5 °C thermostatisierten Spektrophotometer die Absorption bei

388 nm beobachtet Nach 13, 27, 41, 54, 69 und 150 Minuten wurde nochmals ein

vollständiges UV/vis-Spektrum aufgenommen (Abbildung 108)Nach drei Stunden wurde aufgearbeitet und das Produkt 18 1H-NMR-spektroskopischidentifiziert

Die übrigen beiden Kinetikmessungen wurden analog mit sehr ähnlichen

Konzentrationen und absoluten Substanzmengen durchgeführt

Experiment 2 b

0,625 ml Co(ll)-cobynnat in Methanol (1,103-10'6 mol) wurden in einer Glove-

box am Hochvakuum während 4 Stunden bei Umgebungstemperatur getrocknet Der

braune Lack wurde in 2,0 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH 9) aufgenommen und mit

9,2 mg (2,43 10'4 mol) Natriumborhydrid reduziert Sobald die heftige

Blasenentwicklung nachhess wurde die Kinetikapparatur mit einem 4,03 mg

(9,56 10-6 mol) 5'-Tosyladenosin (15) enthaltenden abgebogenen, am Schliff

gefetteten Birnkolben verschlossen Den Schliff umwickelte man noch mit Parafilm

Die Apparatur wurde in ein auf 23,0 ± 0,5 °C thermostatisiertes Spektrophotometerverbracht und das UV/vis-Spektrum der Lösung aufgenommen Die Reaktion wurde

sodann initialisiert, indem man mit der Lösung das Reservoir rasch durchspülteDie Absorption bei 384 nm wurde beobachtet, nach 3, 17, 68, 132, 225 und 3617

Minuten zudem ein vollständiges UV/vis-Spektrum aufgenommen (Abbildung 109)Nach sechs Stunden brach man die Messung ab. Dieser Ansatz wurde sodann analog dem

Beschreibungsansatz aufgearbeitet

64 Material aus 7 9

65 Material aus 7 9

275

Experiment 3

In einer Glove-box wurde ca. 0,2 ml Co(ll)-cobyrinat (Material aus 6.9) während

vier Stunden am Hochvakuum bei Raumtemperatur getrocknet und der dunkelbraune

Rückstandin 5,0 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH 9) aufgenommen. Die Co(ll)-cobyrinat-Lösung (1,0 mM gemäss UV/vis-Spektrum) wurde mit ca. 25 mg 5'-0-

Tosyladenosin (15) versetzt, die Probe 15 Minuten lang mit Ultraschall beschallt,

zentrifugiert und die klare Lösung abpipettiert, um sie in die Kinetikapparatur zu

füllen.

In das obere Reservoir gab man 4,6 mg (1,22-10 4 mol) Natriumborhydrid und

verschloss die Apparatur, die dann der Box entnommen wurde, mit Schliffe« und

Parafilm.

Nach der Charakterisierung des Eduktes durch ein UV/vis-Spektrum im auf 23,0 ±

0,5 °C thermostatisierten Spektrophotometer wurde das Natriumborhydrid durch

einmaliges Schwenken der Glasgefässes gelöst und sofort mit der Messung der

Absorption bei 388 nm begonnen, da die sofort einsetzende heftige Blasenentwicklungeine mechanische Durchmischung erübrigte.Nach sechs Stunden wurde das Gefäss geöffnet und das Produkt aufgearbeitet. Das 'H-

NMR-Spektrum in Deuteromethanol wurde gemessen.

Ein zweites Experiment führte man analog mit den gleichen Substanzmengen durch.

Experiment 4

In einer Glove-box wurde 0,650 ml der Co(ll)-cobyrinat-Stammlösung66 während

vier Stunden am Hochvakuum bei Raumtemperatur getrocknet, der Rückstand in 2,00

ml Phosphatpuffer (pH 9, 1 M) aufgenommen, in die Kinetikapparatur gemäss

Abbildung 56 eingefüllt und mit 54,8 mg (1,45 mmol) Natriumborhydrid zu Co(l)-cobyrinat reduziert. Nach ca. einer Minute, nachdem die Gasentwicklung nur noch sehr

schwach war, wurde die Apparatur mit dem abgebogenen Birnkolben, in dem sich 17,0

mg (0,056 mmol) 5'-Chloro-5'-desoxyadenosin befanden, verschlossen. Der Schliff

wurde nochmals mit Parafilm umwickelt.

Die Eduktlösung wurde durch sein UV/vis-Spektrum charakterisiert und die im auf 18

± 2 °C thermostatisierten Spektrophotometer nach 30 Sekunden langer

Durchmischung der vorgelegten Lösung mit dem 5'-Chloro-5'-desoxyadenosin die

Absorption bei 388 nm als Zeitreihe gemessen. Nach 6, 15, 22, 29, 45 und 180

Minuten wurde zudem nochmals ein vollständiges UV/vis-Spektrum aufgenommen

(Abbildung 110).Nachdem sich die Absorption nicht mehr änderte wurde noch ein letztes vollständiges

UV/vis-Spektrum aufgenommen und sofort anschliessend der Ansatz wie nachfolgendbeschrieben aufgearbeitet.

Experiment 5

In einer Glove-box wurden 0,625 ml einer 2,64 mM Lösung von Co(ll)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) in Methanol während

vier Stunden am Hochvakuum bei Raumtemperatur getrocknet, mit 2,00 ml

Phosphatpuffer (pH 9, 1 M) aufgenommen und in die Kinetikapparatur gefüllt

66 6.9

276

(Endkonzentration gemäss UV/vis-Spektrum 0,72 mM). Nach Zugabe von 44,2 mg

(1.16.10-3 mol) Natriumborhydrid wurde heftige Blasenentwicklung beobachtet, die

nach zwei bis drei Minuten weitestgehend abgeklungen war und das Aufsetzen des mit

21,7 mg (1.16.10-4 mol) Methyltosylat gefüllten Reservoirs ermöglichte.Der Schliff wurde noch mit Parafilm gesichert und die Apparatur der Glove-box zur

sofortigen Messung entnommen.

Nach Aufnahme des UV/vis-Spektrums im auf 23,0 ± 0,5 °C thermostatisierten

Spektrophotometer wurde die Probenlösung in das Reservoir gespült und das

Alkylierungsmittel augenblicklich gelöst. Die Absorption bei 388 nm wurde

beobachtet. Nach 20 Minuten wurde zudem nochmals ein vollständiges UV/vis-

Spektrum aufgenommen (Abbildung 111).Ob das Methyltosylat sich bei Beginn der Reaktion homogen in Lösung befand Hess sich

aufgrund der immer noch leichten Blasenentwicklung und dem Übergang des

Methyltosylates in die flüssige Phase nicht abschätzen.

Die Reaktion war auf jeden Fall so schnell, dass zum Zeitpunkt der Erfassung des

ersten Messpunktes nach der Vermischung die Methylierung schon weitestgehendabgeschlossen war. Es wurde nur noch die Ervdphase der Alkylierung beobachtet, deren

Geschwindigkeitskonstante, wie sich aus dem grossen Achsenabschnitt der Auswertungder Daten gemäss einem Ansatz pseudo-erster Ordnung ergibt, wesentlich geringerwar als die Geschwindigkeitskonstante zu Beginn der Alkylierung.Nach fünf Stunden wurde das Gefäss geöffnet und zur Aufarbeitung des Produktes die

Lösung am Rotationsverdampfer lichtgeschützt getrocknet. Nachdem der braune

Rückstand in Phosphatpufler (1M, pH 4,5) aufgenommen worden war wurde er wie

weiter unten beschrieben aufgearbeitet und zum Schluss mit 'H-NMR Spektroskopien.

In einem zweiten Experiment wurden in einer Glove-box 0,625 ml derselben Co(ll)-

cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)-Stammlös-ung analog getrocknet, in Phosphatpuffer (pH 9, 1 M) aufgenommen und in die

Kintikapparatur gefüllt, jedoch mit 8,3 mg (1,28-10-3 mol) Natriumborhydrid und

9,8 mg (5,26-10'5 mol) Methyltosylat umgesetzt. Ansonsten führte man diese zweite

Messung mit anschliessender Aufarbeitung völlig analog durch.

Experiment 6

Man trocknete in einer Glove-box 0,625 ml der 2,64 mM Stammlösung von Co(lt)-

cobamido-N,N',N",N"',N"",N"'",N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) in Methanol

aus Experiment 5 während vier Stunden am Hochvakuum, nahm den braunen Rückstand

in Phosphatpuffer (0,1 M, pH 9) auf, pipettierte ihn in die Kinetikapparatur und

reduzierte mit 8,4 mg (1.30-10"3 mol) Natriumborhydrid.Nach Beendigung der Blasenentwicklung (zwei bis drei Minuten) verschloss man die

Apparatur mit dem Reservoir, in dem sich 2,40 mg (1,29-10"B mol) Methyltosylatbefanden, und sicherte den gefetteten Schliff zusätzlich mit Parafilm.

Das UV/vis-Spektrum der Edukt-Probenlösung wurde im auf 23,0 ± 0,5 °C

thermostatisierten Spektrophotometer gemessen und die Reaktion durch möglichstrasche Durchmischung der vorgelegten Lösung mit dem Methyltosylat eingeleitet. Man

beobachtete die Absorption bei 388 nm. Das Methyltosylat wurde anscheinend sofort

vollständig gelöst.Auch in diesem Experiment war die Reaktion so schnell, dass zum Zeitpunkt der

Erfassung des ersten Messpunktes nach der Vermischung die Methylierung schon

weitestgehend abgeschlossen war und nur noch die Endphase der Alkylierung beobachtet

wurde. Analog wurde ein beträchtlicher Achsenabschnitt der Auswertung der Daten

gemäss einem Ansatz pseudo-erster Ordnung erhalten (Abbildung 112).

Die Reaktionslösung konnte bereits nach einer Stunde aufgearbeitet werden.

277

Aufarbeitung und Isolation der Alkylierungsprodukte

Tabelle 8 zeigt die isobestischen Punkte der untersuchten Reaktionen. Die

Wellenlängen der maximalen Differenzen der Extinktionskoeffizienten zwischen Edukt

und Produkt sind in Tabelle 9 aufgeführt (Tabellen im Allgemeinen Teil).

Überschüssiges NaBH4 wurde mit 2,0 ml Phosphatpuffer, 1M, pH 4,5, hydrolysiertund im Falle der Reaktionsführung in Methanol das organische Lösungsmittel am

Rotationsverdampfer abgezogen. Die verbleibende Lösung wurde mit kristallinem

KHC03 gesättigt und solange durch 3 ml XAD geleitet bis das Eluat vollständig entfärbt

war (ca. 2 bis 3 Durchläufe). Man wusch mit 10 ml gesättigtem KHCO3 in Wasser, 50

ml H20 und eluierte die Substanz vollständig mit 30 ml MeOH.

Das Alkylierungsprodukt wurde mit 8,0 ml Aceton aus 0,05 ml MeOH gefällt. Nach

fünfminütiger Zentrifugation bei 4000 Upm konnte die farblose Mutterlauge

abpipettiert werden. Der Niederschlag wurde mit 8 ml Aceton gewaschen und analog

abzentrifugiert. Man wiederholte die Fällung dreimal. Der Niederschlag erfolgte bei

der dritten Fällung oft nicht mehr quantitativ und hinterliess eine braune Mutterlauge.Das Produkt wurde in 0,5 ml Deuteromethanol gelöst und mit 'H-NMR (300 MHz)

Spektroskopien.Sämtliche 'H-NMR-Spektren wiesen die Signale der alkylierten Corrine entsprechendden Lagen in den Beschreibungsansätzen auf. Zusätzlich erschienen die Signale des

jeweiligen Alkylierungsmittels zu verschiedenen Anteilen, maximal jedoch in zwei

Äquivalenten.Die UV/vis-Spektren waren identisch mit den Spektren der Substanzen aus den

Beschreibungsansätzen.

Auswertung

Zur Berechnung der Geschwindigkeitskonstanten wurde, da angesichts der Reaktions¬

geschwindigkeiten nur eine Wellenlänge gemessen werden konnte, analog den

Experimenten zur Reduktionskinetik der Co(ll)- zu Co(l)-corrinen, die Wellenlängeabsolut grösster Differenz der Extinktionskoeffizienten, 388 nm67, gewählt.Nur jene Datensätze wurden ausgewertet, die nicht von einer vor zehn Minuten nach

Beginn des Experimentes einsetzten Trübung oder von Reoxidation68 begleitet waren.

Halbwertzeiten wurden als halbe Differenzen zwischen den Extremwerten der UV/vis-

Spektren vor und nach der Reaktion abgeschätzt. Ausgewertet wurden die Datensätze

für die ersten 4,5 approximativen Halbwertzeiten t1/2 bei Methylierungen und eine

bis sechs approximative Halbwertzeiten bei Adenosylierungen.

67 Im Falle des Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-

carboxylat)68 Beim KCN-Test nach Stabilisierung des UV/vis-Spektrums erscheint ein Maximum

bei 367 nm (Heptakalium-dicyano-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-

decyi-lO'-carboxylat) (17) oder -cobyrinat (24)).

278

Die Messintervalle für die in der Regel über 100 Datenpunkte wurden der

Reaktionsgeschwindigkeit angepasst. Zu Reaktionsbeginn betrug das Zeitintervall

zwischen zwei Messungen jeweils 1 sec.

Die Berechnung der Geschwindigkeitskonstante k erfolgte auf der Basis des Modells

einer Reaktion pseudo-erster Ordnung analog der Bestimmung der Geschwindigkeits¬konstanten der Reduktion (vgl. 6.9).Die Berechnung der Geschwindigkeitskonstante k erfolgte auf der Basis des Modells

einer Reaktion pseudo-erster Ordnung. Analog der Auswertung der Reduktionskinetik

entsprach der natürliche Logarhythmus des Quotienten von Eduktkonzentration und

Gesamtcorrinkonzentration k', der Geschwindigkeitskonstanten pseudo-1.Ordnung,

multipliziert mit der Zeit und ist über die Differenzen der momentanen optischenDichte mit den optischen Dichten bei t= 0 und t= °° zugänglich.

[Edukt]1-* I

-k'x t = In ( ) = In (—)

[Edukt]1-0 b

abs«)- abst-kx t = In (1+ I 1)

abst-abst^o

Als Werte für t= 0 und t= °° wurden die experimentellen Daten vor Beginn und nach

Abschluss der Reaktion eingesetzt.

Die Korrelationen der linearen Regressionen betrugen bei Wirt-Gast-Alkylierungenmindestens 0,953; bei Adenosylierungen des Pentanatrium-Co(l)-cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N"""-hepta-(n-decyl-10'-carboxylat) in Wasser mindestens

0,976; bei den sonstigen Alkylierungen mindestens 0,992. Der Linearitätsbereich

erstreckte sich mit Ausnahme der Methylierung in Methanol und Posphatpuffer des

Cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat), bei denen

aufgrund der hohen Alkylierungsgeschwindigkeit nur die Endphase der Alkylierunggemessen werden konnte, auf praktisch den gesamten Reaktionsverlauf.

Die Fehlergrenzen ergaben sich durch Vergleich der ausgewählen Regressionsgeradenmit jenen, welche aufgrund 1,5 x längerer Stichprobenzeiten berechnet wurden.

Bei den extrem schnellen Methylierungen wird die Geschwindigkeitskonstante aus dem

Umsatzanteil und der Zeit bis zum erstem Messwert approximiert. Die Angabe eines

Regressionskoeffizienten ist dementsprechend nicht möglich.

279

Abbildung 107: Experiment 1b: Alkylierungskinetik von Co(l)-cobynnat mit S'-

O-Tosyladenosin (15) in Methanol

(a) Overlay der UV/vis-Scans 350-750 nm bei t= 0, 3, 9, 21, 95, 138 und

987 mm, dx= 0,100 cm

abs

1 o

05

optische Dichte bei 388 nm

2 8,

2 6.

2 4,

1

3

2 2,

2.

1 8.

1 6.

O

o

1 4.

1 2.

8.

6,

oo

4.

1500

Zelt / min

2000

Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte gemäss Ansatz pseudo-erster-Ordnung

500 1000 1500Zeit / min

2000 2500 3000

280

Abbildung 108: Experiment 2a: Alkylierungskinetik von Co(l)-cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) mit 5'-0-Tosyladenosin (15)in Phosphatpuffer, pH 9

(a) Overlay der UV/vis-Spektren bei t= 0, 13, 27, 41, 54, 69, 100 Minuten


-T-

60 80 100

Zelt / min120 140 160

c) Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte gemäss Ansatz pseudo-erster-Ordnung

40 60 80 100 120 140 160Zeit / mm

281

Abbildung 109: Experiment 2b: Alkylierungskinetik von Co(l)-cobyrinat mit S'-

O-Tosyladenosin (15) in Phosphatpuffer, 1M, pH 9

(a) Overlay der UV/vis-Spektren bei t= 0, 13, 17, 68, 132, 225, 317

Minuten


(c) Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte gemäss Ansatz pseudo-erster-Ordnung

200'

3Ö0Zert/min

4Ö0' '""ilo

282

Abbildung 110: Experiment 4: Alkylierungskinetik von Co(l)-cobyrinat mit 5'-

Chloro-5'-deoxy-adenosin in Methanol

(a)

-9.teaJ—

Overlay der UV/vis-Spektren bei t= 0, 6, 16, 22, 29, 45 & 180 Minuten

(b) (b) optische Dichte bei 388 nm

—i——i—i i 1 i—i 1 1 i—i 1 1 i

40 60 80 100 120 140 160 180

Zeit / min

(c) Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte gemäss Ansatz pseudo-

erster-Ordnung

i i i— i—i i — • i— i—i i—< i

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180Zeit / min

283

Abbildung 111: Experiment 5: Alkylierungskinetik von Co(l)-cobamido-N,N',N",N'", N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) mit Methyltosylat in

Phosphatpuffer, 1M, pH 9

(a) UV/vis-Spektren bei t= 0 und 35 Minuten


~JsnsMp o o o o

6 8 10

Zeit / min

(c) Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte gemäss Ansatz pseudo-

erster-Ordnung

Zeit / min

284

Abbildung 112: Experiment 6: Alkylierungkmetik von Co(l)-cobamido-N,N',N",

N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-IO'-carboxylat) mit Methyltosylat in Methanol

(a) (a) optische Dichte bei 388 nm

44,

42

38

36.

34.

32

20 40 60

Zert/min

80 100 120

(b) Auswertung des Verlaufes der optischen Dichte gemäss Ansatz pseudo-

erster-Ordnung

7 5.

7.

6 5.

6

5 5.

5

4 5.

4

3 5

3

2 5

20 40 60

Zeit/min

80 100 120

285

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295

8. Anhang

8.1 Nomenklatur der Corrine

1.

Die Metallkomplexe und Organocorrine sind gemäss dem Schema

axiale Liganden-Metall(Oxidationszahl)-corrinligand

benannt.

2.

Die für die Kohlenstoffe des Corrinringes (ohne Seitenketten) gewählte Numerierung

entspricht den Empfehl-ungen der lUPAC-Kommission [153].

Die Acetyl- und Propylseitenketten sind mit zunehmendem Abstand vom Makrozyklus auf¬

steigend nummeriert. Sie erhalten zudem als Stammnamen die Nummer des direkt mit ihnen

verbunden Ringkohlenstoffes, an die die laufende Nummer angehängt wird.

296

3.

Für Cobyrinsäure und Cobamido-N,N',N",N'",N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-

carboxylat) wurde teilweise folgende schematische Darstellung verwendet:

Cobamido-N,N',N",N"',N"",N ,N -hepta-(n-decyl-10'-carboxylat)

Die Endgruppen bestimmen sich aus dem Kontext und sind jeweils im Text explizit erwähnt.

4.

Cobester ist der Trivialname von Dicyano-Co(a,ß)-cobyrinsäure-heptamethylester.

297

8.2 Nomenklatur der Kohlenstoffatome kompletter Corrinoide

Die in der vorliegenden Arbeit gewählte Systematik der Numerierung unterscheidet sich von

der bis anhin von Marzilli et al. [106-108, 154] verwendeten, abgesehen von den

Positionen B 51 und B 61, nur im Cobinsäureteil.

Methylgruppen werden durch die Nummer des direkt gebundenen Kohlenstoffes des Ringsys¬

tems bezeichnet und in Anlehnung an Benn et al. [155] ergänzt durch die Seitenbezeichnung

A für a-seitig bzw. B für ß-seitig, je nachdem welcher Seite des Ringsystems die Methyl¬

gruppe zugewandt sind.

298

8.3 Nomenklatur der 1,N6-Ethenoadenosylverbindungen

OH OH

Der Adenosyl- bzw. 1,N6-Ethenoadenosylrest wird entsprechend der üblichen Zählweise

nummeriert [129]. Zur eindeutigen Identifikation des Adenosyl-/1,N6-Ethenoadenosyl-

restes in Organocobalamin erhält die Numerierung den Zusatz "A".

299

9. Lebenslauf

Persönliche Daten

1963 geboren am 3. Mai in Dortmund, Bundesrepublik Deutschland

Voruniversitäre Ausbildung

1969 -1973 Eichendorff Grundschule, Methler, BR Deutschland

1973 -1982 Städtisches Gymnasium Kamen, Kamen, BR Deutschland

Hochschulausbildung

1982 -1983 Universität Basel, 1. Vordiplom in Chemie

1983 -1986 ETH Zürich, Abschluss mit dipl.chem. ETH, Diplomarbeit bei Prof.

Duglio Arigoni ("Synthese der 8-13C-(9R)-Deutero-10-methylen-stearinsäure")

1988 Abschluss des Nachdiplomstudiums in Technischen Betriebswissen¬

schaften (Diplomarbeit bei Prof. Büchel "Durchlaufzeitverkürzung der

Auftragsabwicklung in der Produktelinie Druckguss", Bühler AG, Uzwil,

Schweiz)1987 -1991 Doktorand am Laboratorium für org. Chemie der ETH Zürich in der

Arbeitsgruppe PD Dr. Bernhard Kräutler, Doktorvater Prof. A.

Eschenmoser

1992 INSEAD, MBA, Fontainebleau / Frankreich

1994 Promotion an der ETH, Doktorvater Prof. Steven Benner

Sonstiges

1 982-1983 Mitglied des Vorstandes der Vereinigung der Chemiestudierenden an der

Universität Basel

1987-1988 Mitglied des Vorstandes der Vereinigung der Assistenten an den

chemischen Laboratorien der ETH Zürich (VAC)1 987-1989 Vize-Präsident der Assistentenvereinigung der ETH Zürich (AVETH)

1987-1989 Vertreter der Assistenten in der Reformkommission/Hochschulver¬

sammlung der ETH Zürich

1987-1990 Vertreter des akademischen Mittelbaus im Schweizerischen Schulrat

1990-1994 Mitglied der Weiterbildungskommission der Schweizerischen Hoch¬

schulkonferenz

1993 Mitglied des Gläubigeraussschusses der SASEA Holding in Konkurs, Genf

Zürich, den 8. April 1994

rights / license: research collection in copyright - non ...39506/eth-39506-02.pdf · ofss....

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