rôle de la déméthylation active de l'adn dans le succès de

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Rôle de la déméthylation active de l’ADN dans le succèsde la reproduction chez Arabidopsis thaliana

Souraya Khouider

To cite this version:Souraya Khouider. Rôle de la déméthylation active de l’ADN dans le succès de la reproduction chezArabidopsis thaliana. Génétique des plantes. Université Paris sciences et lettres, 2019. Français.�NNT : 2019PSLEE082�. �tel-03445982�

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Préparée à l’Ecole Normale Supérieure

Rôle de la déméthylation active de l'ADN dans le succès

de la reproduction chez Arabidopsis thaliana

Soutenue par

Souraya KHOUIDER Le 29 novembre 2019

Ecole doctorale n° 577

Structure et dynamique

des systèmes vivants

Spécialité

Sciences de la vie et de

la santé

Composition du jury :

Pierre, CAPY

PR, Université Paris-Sud Président

Vincent CASTRIC

DR, Université de Lille Rapporteur

Daniel GRIMANELLI

DR, IRD Rapporteur

Martin CRESPI

DR, IPS2 Examinateur

Aline PROBST

DR, GReD Examinateur

Daniel BOUYER

CR, IBENS Directeur de thèse

Vincent COLOT

DR, IBENS Invité

Remerciements

Je tiens, avant toute chose, à remercier les membres de mon jury de thèse. Merci à Daniel Grimanelli

et Vincent Castric d’avoir accepté d’être rapporteurs, ainsi que Pierre Capy, Martin Crespi et Aline Probst, qui ont bien voulu examiner mon travail. J’espère que vous prendrez autant de plaisir à

découvrir ce projet, que j’en ai eu à le poursuivre, tout au long de ma thèse.

Je remercie chaleureusement Vincent Colot, pour m’avoir accueillie dans son laboratoire pendant ces

quelques années de thèse. Un grand merci Vincent d’avoir cru en mes capacités et d’avoir été si

concerné par l’évolution de mes choix de carrière, et par le projet. Tes précieux conseils, ton soutien

et ta reconnaissance ont grandi la confiance que j’ai de moi-même. Merci également d’avoir su parfaitement tutorer la croissance de ce projet qui m’est cher, tout en nous laissant, à Daniel et moi,

la liberté nécessaire pour le mener à bien. Enfin, je te remercie pour ton enthousiasme et ta

bienveillance, Daniel et toi avez été parfaitement complémentaires pour mon encadrement, et j’ai

l’intime conviction d’avoir, grâce à vous deux, poursuivi ma thèse dans des conditions dont je n’aurais osé rêver. Vous avez placé la barre très haut. Merci.

Daniel Bouyer, merci infiniment pour tout ce que tu m’as appris pendant ces années passées à

travailler côte à côte. Merci pour ta présence, ton support et ta confiance. A force de temps et de persévérance, tu as appris à comprendre mon langage et moi le tien, souvent au grand étonnement

de tous. Ta hardiesse scientifique, ta créativité et ton intuition hors norme font de toi un explorateur

incroyable et un chercheur remarquable. C’est pour moi une chance inouïe de t’avoir eu pour directeur de thèse. Merci de m’avoir transmis un peu de ton talent, je l’espère, et beaucoup de ta passion - j’en

suis sur-. Merci également de ne pas m’avoir toujours dit la vérité quand j’arrivais avec mes « nouvelles

idées révolutionnaires » alors que tu y pensais déjà depuis six mois. J’imagine que c’est comme ça

qu’on apprend par soi-même. Merci de m’avoir fait des nœuds au cerveau, tout en me laissant apprendre à les démêler par moi-même. Il faut que je m’arrête, au risque d’être en retard pour rendre

mon manuscrit. En bref, je crois qu’on forme un sacré duo. Merci pour tout.

J’aimerais également remercier tous les gens qui ont participé, de près ou de loin, à cette étude, notamment nos collaborateurs Filipe Borges et Robert Martienssen, pour leur investissement dans ce

projet. Les différents membres de mon comité de thèse, Déborah Bourc’his, Christine Camilleri, Alain

Charcosset, Vincent Castric, et Éric Meyer, qui ont accepté de discuter de ce projet, et ont pu me

donner des retours précieux, avec toujours autant d’enthousiasme et de bienveillance.

Un grand merci à toute l’équipe Colot. Erwann Caillieux (avec deux « i », sinon on ne peut pas

commander de primers) pour sa patience sans égal, sa douceur et son aide si précieuse. Je crois que sans toi le labo collapse... Leandro Quadrana, pour ses conseils toujours pertinents, son esprit

provocateur galvanisant, et son intellect inspirant. Je ne compte plus le nombre de fois où j’ai parlé de

toi en ces termes : « il est trop fort ce mec ». Pierre Baduel (voir chapitre 2 : les Navarro). Barbara

Deprès pour ton caractère bien trempé qui fait un bien fou bien à cette équipe, mais surtout, surtout… pour ton grand cœur bien caché et l’admiration que j’ai pour ton investissement auprès de tes élèves.

Ils ont beaucoup de chance de t’avoir. Merci à Marisol Dominguez pour son sourire et sa bonne

humeur, et à Vipin Singh pour sa bienveillance. Amira Kramdi, toujours prête à venir en aide aux

pauvres petits poussins qui pioupioutent sur R, mais surtout, merci pour ta grande gentillesse. François Roudier, un sacré personnage qui à tout mon respect et toute mon admiration. Merci d'avoir si

activement pris part à ce projet quand tu étais encore au labo. Merci surtout d'avoir été l'un des rare

à me comprendre lors de mes premiers labmeeting, quand j’avais encore du mal à me comprendre

moi-même. Ana Karina Morao, merci pour ton indéfectible joie de vivre et ta force inspirante. Amanda Silveira, merci d’avoir été si honnête et bienveillante. Tu m’as beaucoup appris (tu ne dois même pas

le savoir). Valentina Perrera, petit soleil du labo, merci pour ta bonne humeur inébranlable. J’ai une

pensée tendre pour Claudia Chica et Mercedes, inspirantes et incroyablement charismatiques. Merci pour les ondes que vous envoyez, si apaisantes.

Je remercie également les membres des autres équipes du 4ème étage. Merci aux Bolwer et aux Navarro

pour les pauses déjeuner et les discussions de couloir, les conseils et les échanges de buffer, enzyme, et autres gâteaux/chips/jus abandonnés sur la table ronde du labo de Chris. Je remercie

particulièrement l’équipe de Freddy Barneche pour les labmeeting partagés, leurs conseils et leurs avis

toujours précieux. Merci à Imen Mestiri et Angélique Déléris, votre détermination sans faille est un

exemple. Merci pour vos conseils, et nos discussions qui ont toujours été un bonheur pour moi. Maintenant je dois mélanger les équipes… Un énorme MERCI à Justine, Jérôme, Lionel, Martin, Pierre,

Thierry, Quentin, Nadia, Gianluca et Vinko. Ma thèse n’aurait pas été la même sans vous. Merci pour

les fous rires, les gueules de bois, les embrouilles, les baby, les soirées, le soutien, les coups de gueules,

l’entre-aide, les pauses déj/clopes/café. Je vous jure que je ne sais même plus si c’était un labo, une coloc, ou une colonie de vacance. Merci à vous tous de m’avoir soutenue quand j’étais à bout de

souffle, à Juju et Pierre d’avoir supporté mes coups de fusil quand j’étais stressée, à Jérôme (oooh

Jérôooome), d’être Jérôme, à Lionel d’avoir un si grand cœur, et à Martin Câlin, notre bouée de sauvetage, qui nous communiquait son bonheur quand tout le monde était sous l’eau. Et un grand

merci à Youssef, qui a supporté tout ça !

Merci à tous ceux de l’IBENS que je ne cite pas directement, et qui se reconnaitront !

Pour la famille et les amis.

Nawal, ma sœur, tu es la moitié de mon âme. Tant que tu es avec moi je ne crains rien. Et le monde

entier ne saurait m'ébranler. Tu es le plus grand de mes bonheurs. Maman, les mots qui sauraient exprimer l'amour que j'ai pour toi n'existent pas. Je te rouboubouille. Jusqu'à ma mort je t’invoquerai

dans mes chagrins et mes peines. Merci d'être le refuge de mon âme. Et la mère la plus douce que cet

univers en expansion ait créé. Papa, tu sais à qui je dois tout ça, ceux qui poussent de toutes parts pour

nous faire une place dans ce monde. Tout ce que je fais portera ton nom. Celui de Ba et de Mi, qui

m’accompagnerons à jamais. Avec maman je vous dois tout ce que je suis. Vous êtes ma plus grande

inspiration. Merci pour les valeurs que vous m'avez inculquées, elles sont, et resteront mon bien le plus précieux. Eliott, je t'aime déjà plus que ma propre vie, parce que ta mère est ma sœur et parce

que tu es mon propre fils. Je serai toujours liée à toi. Thomas, merci de m'avoir délestée de ce poids.

Sans toi je n'aurais pu vivre ma vie pour moi-même. Je l'aurais consacrée à protéger la femme qui

partage ta vie. Merci d'être un frère si aimant. Mamet, Papet, Ba et Mi, vous êtes l’essence même de la vie, et le repère de la mienne.

Vic, cette thèse c'est la tienne. Merci de m'avoir soutenue et supportée dans les pires moments, et

d'avoir cru en moi jusqu’à la fin. Merci pour tes yeux qui m’ont laissé croire que j’étais capable de tout, que j'étais la plus forte de l'univers. Merci pour tout cet amour. Merci d'être qui tu es.

Merci à mes amis, ceux qui me sont si cher, et qui ont été à mes côtés pendant tout ce temps : Sadio, Alexis, Margarita, Chris, Zara, Raleb, Frank, Vincent, et les autres.

Écrire tout ça me confirme ce que je savais déjà… Que je suis extrêmement chanceuse de tous vous

avoir auprès de moi. Sans vous je n’en serai pas là. Merci à vous.

Table des matières

INTRODUCTION GÉNÉRALE ............................................................................. 1

1. Reproduction sexuée chez Arabidopsis thaliana ............................................................... 3

1.1 Mécanismes de formation des gamétophytes mâle et femelle ................................... 3 Formation, structure et fonction de l’ovule ................................................................. 3 Formation, structure et fonction du pollen .................................................................. 5

1.2 Interactions parentales régulant la formation et le guidage du tube pollinique ......... 5 Guidage pré-ovulaire du tube pollinique ...................................................................... 6 Guidage ovulaire du tube pollinique ............................................................................ 9

1.3 Mécanismes de terminaison du guidage du tube pollinique ..................................... 11 Réception et rupture du tube pollinique .................................................................... 11 Cessation de l’attraction du tube pollinique et prévention de la polytubey : le devenir des synergides ............................................................................................................ 13

2. Mécanismes de méthylation et de déméthylation de l’ADN chez Arabidopsis thaliana . 15

2.1 Mécanismes d’établissement de novo et de maintenance de la méthylation de l’ADN ................................................................................................................................... 15

Établissement de novo de la méthylation de l’ADN .................................................... 16 Maintenance de la méthylation de l’ADN ................................................................... 18

2.2 Mécanismes de déméthylation de l’ADN chez Arabidopsis thaliana ......................... 19 Déméthylation passive de l’ADN ................................................................................ 19 Mécanismes moléculaires impliqués dans la déméthylation active de l’ADN ............ 20

2.3 Caractéristiques des ADN déméthylases ROS1 et DME ............................................. 21 REPRESSOR OF SILENCING 1 – ROS1 ........................................................................... 21 DEMETER – DME ......................................................................................................... 23

3. Fonctions biologiques et conséquences de la dynamique de méthylation de l’ADN chez Arabidopsis thaliana ......................................................................................................... 26

3.1 Fonctions biologiques de la méthylation de l’ADN .................................................... 26 Régulation de l’expression des gènes ......................................................................... 26 Répression des éléments transposables ..................................................................... 27

3.2 Dynamique de méthylation de l’ADN pendant la phase reproductive chez Arabidopsis thaliana ...................................................................................................................... 28

Dynamique de méthylation de l’ADN pendant le développement du pollen ............. 28 Dynamique de méthylation de l’ADN lors de la formation du gamétophyte femelle. 30

4. Objectifs de la thèse ......................................................................................................... 32

RÉSULTATS ................................................................................................... 35

1. Manuscrit en préparation ................................................................................................ 36

2. Influence maternelle sur la fertilité des mutants de déméthylation dme/+ et dme/+;ros1........................................................................................................................58

DISCUSSION GÉNÉRALE ................................................................................ 61

1. L’activité de DME et ROS1 conduit au remodelage des profils de méthylation de l’ADN dans le pollen ................................................................................................................... 62

2. Régulation par la méthylation de l’ADN de facteurs impliqués dans la fonction du pollen.................................................................................................................................62

3. Impact de DME et ROS1 sur la régulation de l’expression des gènes .............................. 63

4. La déméthylation active de l’ADN régule la communication parentale lors de la reproduction .................................................................................................................... 65

5. Conclusion générale ....................................................................................................... 677

ANNEXE ....................................................................................................... 69

BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................ 73

Liste des figures

Introduction générale

Figure 1 : Formation du pollen et de l’ovule chez Arabidopsis thaliana ................................... 4

Figure 2 : Guidage du tube pollinique dans le tissu de transmission ........................................ 7

Figure 3 : Guidage du tube pollinique par l’ovule ..................................................................... 9

Figure 4 : Attraction du tube pollinique par les peptides LUREs ............................................ 10

Figure 5 : Contrôle de la rupture du tube pollinique par l’interaction ANX/BUPS-RALFs ....... 12

Figure 6 : Inactivation de la synergide persistante ................................................................. 14

Figure 7 : Mécanisme de méthylation de l’ADN par la machinerie du RdDM ........................ 17

Figure 8 : Maintenance de la méthylation des contextes CG et CHG ..................................... 18

Figure 9 : Mécanisme de déméthylation active de l’ADN par les ADN glycosylases: exemple de ROS1 ............................................................................................................................ 20

Figure 10 : Régulation de l’expression de ROS1 par la méthylation de l’ADN ........................ 22

Figure 11 : Dynamique de méthylation de l’ADN pendant le stade reproductif .................... 29

Résultats

Figure 1 : DME and ROS1 act semi-redundantly to promote pollen tube progression .......... 39

Figure 2 : DME and ROS1 are responsible for DNA demethylation of the vegetative cell in pollen ............................................................................................................................... 41

Figure 3 : DME and ROS1 are required for the expression of genes involved in pollen tube function ............................................................................................................................ 43

Figure 4 : DME/ROS1 target genes are required for male fertility ......................................... 45 Figure S1 : DME/ROS1-activity in pollen is specifically required for pollen tube progression.50

Figure S3 : DNA demethylation in the vegetative cell in the upstream region of gene implicated in pollen tube function .............................................................................. 52/53

Figure S4 : Interaction network of DME-ROS1 targets ........................................................... 54

Figure 12 : Effet maternel sur la fertilité paternelle des mutants de déméthylation dme/+ et dme/+;ros1 ....................................................................................................................... 59

Annexe

Figure Annexe 1 ...................................................................................................................... 70

Abréviations

5mC: 5-méthylcytosine

ADN: Acide Désoxyribonucléique

ARN : Acide Ribonucléique

AGO: ARGONAUTE

ANX: ANXUR

AP: apuric/apyrimidic

APE1L: DNA-(apurinic or apyrimidinic site) lyase

BER: Machinerie de réparation par excision de base

BUPS1: BUDDHA’s PAPER SEAL

CC: Central cell

CHX: CATION PROTON EXCHANGER

CLSY1: CLASSY 1

CMT: CHROMOMETHYLASE

CNGC18: CYCLIC NUCLEOTIDE-GATE CHANNEL 18

CRP: Cystein-rich peptide

DCL: DICER-LIKE

DDM1: DECREASE IN DNA METHYLATION

DME: DEMETER

DML2/3: DEMETER-LIKE 2/3

DMR: Differentially Methylated Regions

DRM: DOMAINS REARRANGED METHYLTRANSFERASE

dsARN: ARN doubles brins

EC: Egg cell

EN: EARLY NODULIN-LIKE

FACT: Facilitates chromatin transcription

FER: FERONIA

FIS-PRC2: Fertilization Independent Seed-class Polycomb Repressive Complex 2

FTL: Fluorescent Tagged Line

GABA: Acide γ-aminobutyrique

gbM: Gene body methylation

GLR: Glutamate-Like Receptor

GPI: Glycosylphosphatidylinositol

GPI-AP: Glycosylphosphatidylinositol-anchored protein

H3K9/27me1-2-3 : mono-di-tri-méthylation de la lysine 9/27 de l’histone H3

H3K18/23ac : Acétylation de la lysine 18/23 de l’histone H3

IDM1: INCREASE IN DNA METHYLATION 1

LIG1: DNA LIGASE 1

LIP: LOST IN POLLEN TUBE GUIDANCE

LLG1: LRE-LIKE GPI-AP1

LRE: LORELEI

LRX: Leucine-Rich Repeat Extensin

LTP: Lipid Transfer Protein

LTR: Long Terminal Repeat

MDIS: MALE DISCOVERER

MEG: Maternally Expressed Gene

MEMS: DNA Methylation Monitoring Sequence

MET1: METHYLTRANSFERASE 1

MIK: MDIS1-INTERACTING RECEPTOR LIKE KINASE

MiMC: Microspore Mother Cell

MMC: Megaspore Mother Cell

MPS1: MULTIPOLAR SPINDLE 1

MTase: ADN méthyltransférase

nt: Nucléotide

P4RNAs: ARNs simple brin produit par Pol IV

PEG: Paternally Expressed Genes

PLOU : PLOUTOS

Pol II-IV-V: ARN POLYMERASE II - IV - V

PRK: Pollen-specific Receptor-like Kinase

RALF: RAPID ALKALIZATION FACTOR

RdDM: RNA-directed DNA methylation

RDM3: RNA-DIRECTED DNA METHYLATION 3

RDR2/6: RNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE 2/6

RKF2: RECEPTOR-LIKE SERINE/THREONINE KINASE 2

RLK: Receptor-Like Kinase

RNAi: ARN interférence

ROP1: RHO-RELATED PROTEIN FROM PLANTS 1

ROS1/3: REPRESSOR OF SILENCING 1/3

RRP6L1: RIBOSOMAL RNA-PROCESSING6 LIKE 1

SAH: S-Adenosyl-L-Homocysteine

SAM: S-adenosylmethionine

SAMtase: S-adenosylmethionine Methyltrasferase

SC: Sperm cell

SHH1: SAWADE HOMEODOMAIN HOMOLOG 1

siARN: Petits ARNs interferants

sRNAs: Small RNA

SML: Sexual-lineage-specific Methylated Locus

SUVH: SUPPRESSOR OF VARIEGATION HOMOLOG

TE: Élément transposable

TGS: Transcriptional gene silencing

TRX5: THIOREDOXIN H-TYPE 5

VC: Vegetative cell

VIM: VARIANT IN METHYLATION

ZDP: ZINC FINGER DNA 3ʹ-PHOSPHATASE

1

PREMIÈRE PARTIE

INTRODUCTION GÉNÉRALE

3


1. Reproduction sexuée chez Arabidopsis thaliana

Le cycle de vie d’Arabidopsis thaliana repose sur l’alternance entre une phase diploïde, dite

sporophytique, et une phase haploïde, dite gamétophytique. Le passage d’une phase à l’autre s’opère

au travers de la méiose et de la fécondation, deux processus essentiels pour permettre la succession

des générations. Chez Arabidopsis thaliana, la phase diploïde débute par la formation du zygote,

protégé par les différents tissus formant la graine. Après germination de la graine mature, la plantule

produite entre dans une phase de croissance végétative, jusqu’à la formation des organes

reproducteurs contenus dans les fleurs. C’est dans les fleurs que la méiose se produit, aboutissant à la

formation des gamétophytes mâle et femelle, des structures pluricellulaires contenant les gamètes

haploïdes. Ce chapitre se concentre sur la description des mécanismes moléculaires impliqués dans la

formation des deux gamétophytes, ainsi que ceux conduisant à l’évènement de double fécondation

qui aboutit à la formation de la graine.

1.1 Mécanismes de formation des gamétophytes mâle et femelle

Formation, structure et fonction de l’ovule

La formation du gamétophyte femelle, ou ovule, est initiée à partir de cellules issues de la couche sub-

épidermale du méristème apical caulinaire, considérées comme des cellules germinales primordiales.

C’est parmi ces cellules qu’est choisi le Megaspore Mother Cell (MMC), cellule diploïde dont la division

méiotique produit quatre mégaspores haploïdes (Figure 1). Tandis que trois d’entre eux dégénèrent,

le quatrième mégaspore subit trois cycles de mitose, qui aboutissent à la formation de l’ovule mature.

La succession de ces trois mitoses permet la formation d’un syncytium, facilitant ainsi la migration des

noyaux aux deux pôles du sac embryonnaire qui, après cellularisation et différenciation, génère les

sept cellules du gamétophyte femelle mature : la cellule œuf, la cellule centrale, deux synergides et

trois cellules antipodales. Parmi ces sept cellules, la cellule œuf est le gamète femelle responsable de

la formation du zygote après fécondation. La cellule centrale, issue de la fusion de deux noyaux

haploïdes, est également fécondée pour produire l’albumen, un tissu triploïde nourricier qui supporte

la croissance de l’embryon. Les deux synergides sont impliquées dans l’attraction et la réception du

tube pollinique, et sont donc indirectement impliquées dans le processus de fécondation, bien qu’elles


4

n’apportent aucune contribution génétique aux générations suivantes. Concernant les cellules

antipodales, bien que les mécanismes impliqués dans leur différenciation soient de mieux en mieux

décris, leur fonction reste mal comprise (Revu dans Drews and Koltunow. 2011 ; Schmid et al. 2015 ;

Skinner and Sandaresan. 2018).

Figure 1 : Formation du pollen et de l’ovule chez Arabidopsis thaliana (adapté de Huh et al. 2008). MMC, megaspore mother cell; AC, cellules antipodales ; SC, synergide ; EC, cellule œuf ; CCN, noyau de la cellule centrale ; MiMC, microspore mother cell ; GC, cellule générative ; VCN, noyau de la cellule végétative ; SP, cellules spermatiques.

Reproduction sexuée chez Arabidopsis thaliana

5

Formation, structure et fonction du pollen

Le mécanisme d’initiation de la formation du gamétophyte mâle (pollen) est similaire à celui décrit

pour le gamétophyte femelle (Figure 1). L’entrée en méiose du Microspore Mother Cell (MiMC),

analogue du MMC, génère quatre microspores haploïdes, qui subissent chacun une première division

mitotique générant deux cellules, la cellule végétative et la cellule générative. Cette dernière s’engage

dans une seconde division mitotique dont sont issues deux cellules spermatiques, les gamètes mâles

à proprement parler. Ainsi, le pollen mature est composé d’une cellule végétative entourant deux

cellules spermatiques haploïdes, qui participent à la fécondation (revu dans Borg et al. 2009). La cellule

végétative est considérée comme une cellule compagne des gamètes, car sa fonction est essentielle

pour le bon déroulement de la fécondation, bien qu’elle ne participe pas génétiquement à la

production de la génération suivante. En effet, chez les espèces siphonogamiques, la cellule végétative

germe pour produire le tube pollinique, qui croît dans les tissus maternels, et dans lequel les cellules

spermatiques sont transportées passivement jusqu’aux ovules. Chez la plupart des Angiospermes, ce

mode de reproduction permet de compenser la perte de mobilité des cellules spermatiques.

D’un point de vue évolutif, cette fonction du tube pollinique est un exemple classique d’exaptation

(caractère détourné de sa fonction première), puisque l’étude d’espèces possédant à la fois des

gamètes mobiles et un tube pollinique, tel que les Cycadophytes ou le Ginkgo, a permis de mettre en

évidence sa fonction haustoriale primaire (Friedman. 1993).

Il en résulte que chez de nombreux Angiospermes tel que Arabidopsis thaliana, le succès de la

fécondation est largement dépendant de la fonction de la cellule végétative du pollen, notamment de

sa capacité à former un tube pollinique qui permettra la livraison des cellules spermatiques à l’ovule.

1.2 Interactions parentales régulant la formation et le guidage du tube pollinique

Le succès de la reproduction chez Arabidopsis thaliana dépend notamment de la production du tube

pollinique et de son guidage jusqu’à l’ovule. Les mécanismes impliqués dans ce processus sont

généralement regroupés en deux étapes majeures : le guidage dit pré-ovulaire, qui résume les

interactions entre le pollen et les tissus maternels sporophytiques, et ovulaire, qui décrit la

communication moléculaire entre le pollen et l’ovule.


6

Guidage pré-ovulaire du tube pollinique

La reproduction sexuée dépend de la faculté d’adhésion, d’hydratation et de germination du pollen,

suite à son dépot sur le stigmate de la fleur qu’il féconde. Ces trois étapes hautement sélectives,

reposent sur une fine interaction moléculaire entre le pollen et les cellules papillaires qui composent

le stigmate, et représentent les premiers points de contrôles permettant de vérifier la compatibilité

des pollens. L’adhésion du pollen est un processus rapide, dépendant des molécules d’éxines

présentes à sa surface, et se fait avec une meilleure affinité pour les stigmates de sa propre espèce,

interdisant l’accès aux pollens incompatibles (Zinkl et al. 1999). S’il a été proposé que des peptides

sécrétés par le manteau pollinique soient impliqués dans la reconnaissance des pollens compatibles

par les cellules papillaires, le mécanisme général régulant ce processus reste méconnu (Wang et al.

2017).

L’adhésion d’un pollen compatible déclenche les mécanismes responsables de son hydratation, qui

repose sur des interactions moléculaires complexes entre le pollen et le stigmate, utilisé comme source

d’eau. Des études ont démontré que ce processus dépend notamment de la composition lipidique des

deux structures en contact, et fait intervenir différentes protéines qui vont permettrent le transfert de

l’eau du stigmate vers le pollen (revu dans Chapman et Goring 2010).

L’hydratation du pollen permet sa réactivation métabolique, prérequis nécessaire à l’émergence du

tube pollinique. Suite à cette réactivation, on observe rapidement la mise en place d’un gradient de

Ca2+ au site de germination de tube pollinique. De nombreux facteurs impliqués dans l’établissement

de ce gradient calcique, ainsi que dans les voies de signalisation qu’il régule ont été récemment mis en

évidence. Ces études démontrent que la perte de ces facteurs induit un défaut de germination du

pollen, établissant leur rôle essentiel dans la régulation de ce processus (revu dans Zheng et al. 2018).

La germination du pollen dépend également du réarrangement des filaments d’actine dans le

cytoplasme. Cette modification de l’organisation du cytosquelette induit une polarisation du grain de

pollen et modifie la dynamique du transport des vésicules de sécrétion. Ces particularités

métaboliques observées dans le cytoplasme (dynamique des filaments d’actine et mise en place du

gradient calcique), sont caractéristiques de l’organisation cytoplasmique des cellules en expansion, et

aboutissent à la germination et à la croissance du tube pollinique dans le tissu de transmission

maternel. Parallèlement à ces réorganisations cytoplasmiques, on observe des modifications de la

structure externe du pollen. En effet, au site d’émergence du tube pollinique, on observe une déplétion

de l’éxine (Li et al. 2018), une déposition de callose (Johnson et al. 2001), ainsi que la modification

biochimique (estérification) de la pectine de la paroi du pollen (Leroux et al. 2015). Certaines protéines

de la paroi cellulaires sont aussi essentielles au processus de germination (Wang et al. 2018).

Ensembles, ces modifications du métabolisme et de la structure interne et externe du pollen


7

aboutissent à l’établissement un environnement cellulaire permissif à la germination du tube

pollinique (revu dans Zheng et al. 2018).

Le tube pollinique commence alors sa course dans la matrice extracellulaire du tissu de transmission

maternel. Sa progression fait intervenir de nombreux facteurs, et repose sur une communication avec

les tissus maternels, qui vont permettre son guidage jusqu’aux ovules.

L’adhésion du tube pollinique à l’épiderme du tissu de transmission est un phénomène essentiel à sa

progression. Chez Arabidopsis thaliana, les petits peptides sécrétés de la famille des LTPs (LIPID

TRANSFER PROTEIN) semblent être impliqués dans ce processus (Chae et al. 2009 ; Chae et al. 2010),

bien que les mécanismes par lesquels cette adhésion favorise la progression du tube pollinique restent

méconnus.

Le gradient de Ca2+ établi lors de la germination du pollen doit être entretenu pour permettre

l’expansion cellulaire du tube pollinique. La maintenance de ce gradient calcique est dépendante de

l’action de protéines de la famille des GLRs (GLUTAMATE-LIKE RECEPTORS), qui agissent comme des

canaux calciques pour réguler la concentration cytosolique de Ca2+ dans le tube pollinique (Figure 2).

De plus, il a été démontré que ces GLRs sont activés par la D-sérine, un facteur maternel produit par

le pistil (Michard et al. 2011).

Le tissu de transmission maternel est parcouru par un gradient de GABA (acide γ-aminobutyrique)

impliqué dans le contrôle de la progression du tube pollinique (Palanivelu et al. 2003), notamment à

travers son action sur la maintenance du gradient calcique dans le tube pollinique (Yu et al. 2006 ; Yu

et al. 2014).

Figure 2 : Guidage du tube pollinique dans le tissu de transmission (adapté de Li et al. 2018). Schémas représentant les différents facteurs impliqués dans le guidage du tube pollinique à travers le tissu maternel. RE, réticulum endoplasmique.


8

La nature des signaux produits par les tissus femelles, et celle des facteurs impliqués dans la réception

et l’intégration de ces signaux externes par le tube pollinique fait l’objet de nombreuses études.

Parmi ces facteurs, le rôle des protéines de la famille des PRKs (POLLEN-SPECIFIC RECEPTOR-LIKE

KINASES) dans le guidage pré-ovulaire et ovulaire du tube pollinique a récemment été mis en évidence.

Sur les huit PRKs présentes chez Arabidopsis thaliana, six sont fortement exprimées dans le pollen

(PRK1 à PRK6). Il a été démontré que PRK2, un récepteur membranaire retrouvé à l’apex du tube

pollinique, est impliqué, via son activité kinase, dans l’activation de la voie de signalisation ROP1-

dépendante qui contrôle la croissance du tube pollinique (Chang et al. 2013). De plus, l’altération de

l’élongation du tube pollinique observée dans le triple mutant prk1 prk2 prk5, mais pas dans le simple

mutant prk2 met en évidence l’activité redondante de ces protéines, et suggère un rôle pour les autres

PRKs dans le contrôle de la progression du tube pollinique à travers le tissu de transmission (Chang et

al. 2013). Une étude récente a également mis en évidence le rôle de PRK6 dans la régulation de la voie

de signalisation ROP1-dépendante (Yu et al. 2018). En plus de cette fonction, PRK6 est impliqué dans

la régulation du guidage du tube par l’ovule (voir chapitre 1.2.3. sur le guidage ovulaire), démontrant

le rôle clé des PRKs dans la perception et la transduction du signal extracellulaire par le tube pollinique.

La maintenance de l’intégrité du tube pollinique, repose sur une balance finement régulée, nécessitant

la production d’une paroi cellulaire assez flexible pour permettre l’expansion cellulaire, mais assez

robuste pour éviter la rupture du tube. Ces mécanismes sont dépendants de l’intégration de signaux

extracellulaires perçus et intégrés par le tube pollinique. Les deux peptides extracellulaires, RALF4

(RAPID ALKALIZATION FACTOR 4) et RALF19, ont récemment été identifiés pour leur implication dans

le maintien de l’intégrité du tube pollinique pendant sa progression. La liaison de RALF4 et RALF19 à

des récepteurs membranaires de la famille des LRXs (LEUCINE-RICH REPEAT EXTENSIN), et des

récepteurs RLKs (RECEPTOR-LIKE KINASES) active les voies de signalisation qui permettent de réguler

la progression du tube pollinique tout en évitant sa rupture précoce (Boisson-Dernier et al. 2009 ;

Miyazaki et al. 2009 ; Ge et al.2017 ; Mecchia et al. 2017 ; Wang et al. 2017 ; Fabrice et al. 2018).

Ces nombreux exemples illustrent la complexité des mécanismes moléculaires qui régissent la

formation et la progression du tube pollinique à travers les tissus maternels. Ils mettent également en

évidence l’absolue nécessité de percevoir et d’intégrer les signaux extracellulaires, qui permettent aux

tissus maternels de rejeter les pollens incompatibles, et d’orienter la croissance du tube pollinique des

pollens compatibles.


9

Guidage ovulaire du tube pollinique

Aux abords de l’ovule, les mécanismes qui interviennent pour réguler le guidage du tube pollinique

reposent, non plus sur des interactions avec les tissus sporophytiques, mais sur une communication

moléculaire entre le tube pollinique et le gamétophyte femelle. On parle de guidage ovulaire.

De nombreux facteurs essentiels au guidage du tube pollinique sont impliqués dans la régulation de

son homéostasie cellulaire, notamment à travers le contrôle des flux d’ions (Figure 3). On donnera

l’exemple des deux transporteurs de K+, CHX21 (CATION PROTON EXCHANGER 21) et CHX23, localisés

dans le réticulum endoplasmique du tube pollinique, qui permettent la modulation du pH et de la

concentration de potassium dans le tube (Lu et al. 2011). Le canal calcium CNGC18 (CYCLIC

NUCLEOTIDE-GATE CHANNEL 18) est impliqué dans la maintenance du gradient de Ca2+ observé à

l’extrémité du tube pollinique (Gao et al. 2016). Le double mutant chx21;chx23 et le mutant cngc18,

présentent un défaut sévère de guidage ovulaire du tube pollinique, mettant en évidence l’importance

de la maintenance de l’homéostasie cationique (Ca2+, K+, H+) pour le contrôle de l’orientation de tube

pollinique.

Figure 3 : Guidage du tube pollinique par l’ovule (adapté de Li et al. 2018). Schémas représentant les différents facteurs impliqués dans le guidage du tube pollinique par l’ovule. RE, réticulum endoplasmique.


10

Cependant, les mécanismes qui régulent le guidage ovulaire du tube pollinique dépendent largement

d’une étroite communication moléculaire avec l’ovule, qui sécrète des peptides capables d’attirer le

tube pollinique en se liant à des récepteurs situés sur sa membrane plasmique. Chez Arabidopsis

thaliana, les CRPs (CYSTEIN-RICH PEPTIDES) de la famille des defensin-like LUREs exprimés par les

synergides, sont sécrétés dans le milieu extracellulaire, et impliqués dans l’attraction du tube

pollinique (Takeuchi et al. 2012). AtLURE1 est capable de se lier à différents récepteurs membranaires

retrouvés à l’extrémité du tube pollinique (Figure 4). AtLURE1 interagit avec le complexe de récepteur

formé par l’association de PRK6 avec les deux RLKs LIP1 (LOST IN POLLEN TUBE GUIDANCE 1) et LIP2,

permettant l’activation de la voie de signalisation ROP1-dépendante (Liu et al. 2013 ; Takeuchi et al.

2016). La liaison de AtLURE1 au récepteur hétérométrique MDIS1-MIK1/2 (MALE DISCOVERER 1 -

MDIS1-INTERACTING RECEPTOR LIKE KINASE 1/2) induit la transduction du signal d’orientation du tube

pollinique via une phosphorylation médiée par MIK1/2 (Wang et al. 2016). L’interaction de AtLURE1

avec ces récepteurs permet de réguler le guidage ovulaire du tube pollinique. De plus, il est important

de noter que l’expression de AtLURE1 dans les ovules de Torenia fournieri leur confère la capacité

d’attirer les tubes polliniques d’Arabidopsis thaliana (Takeuchi et al. 2012), tandis que les tubes

polliniques de Capsella rubella exprimant AtMDIS1 sont attirés par les ovules d’Arabidopsis thaliana

(Wang et al. 2016). Ainsi, ces peptides et leurs récepteurs semblent être suffisants pour lever les

barrières d’isolement reproductif, suggérant un rôle des peptides LUREs dans les processus de

spéciation.

Figure 4 : Attraction du tube pollinique par les peptides LUREs (adapté de Higashiyama and Yang, 2017). Le peptide maternel LURE1 se lie au domaine extracellulaire du récepteur hétérodimérique MDIS1-MIK1/2 et de PRK6. Cette interaction permet d’activer la dimérisation du récepteur MDIS1-MIK1/2, et induit la phosphorylation des domaines kinases par MIK1/2. La liaison de LURE1 au récepteur PRK6, qui interagit avec PRK3 et LIP1/2, active la voie de signalisation dépendante de ROP1, permettant de réguler le gradient de calcium, la dynamique des filaments d’actine, et l’exocytose des vésicules de sécrétions. CNGC18 est une

pompe à calcium impliquée dans la régulation de la trajectoire du tube pollinique. Apex TP, Apex du tube pollinique ; SV, vésicules de sécrétion.


11

Néanmoins, le rôle essentiel des LUREs dans le processus de fécondation est aujourd’hui remis en

question. En effet, une étude récente a permis d’identifier une nouvelle famille de peptides maternels,

les peptides XIUQIU1-4, capables d’attirer les tubes polliniques quel que soit l’espèce à laquelle ils

appartiennent. De plus, la déplétion de tous les gènes de la famille des LUREs ou de leur récepteur

PRK6, n’a pas d’effet sur la fertilité. Leur modèle propose que les tubes polliniques en croissances dans

le tissu de transmission maternel pourraient progresser indépendamment de l’espèce à laquelle ils

appartiennent, via une attraction médiée par les XIUQIUs, tandis que les LUREs permettraient de

favoriser les tubes polliniques conspécifiques en accélérant leur progression (Zhong et al. 2019).

1.3 Mécanismes de terminaison du guidage du tube pollinique

Réception et rupture du tube pollinique

La réception du tube pollinique repose principalement sur l’activité de FERONIA (FER), un RLK retrouvé

sur la membrane plasmique des synergides. On observe dans le mutant fer une surprolifération du

tube pollinique à l’intérieur de l’ovule, qui rappelle celle observé lors des croisements interspécifiques

entre les femelles Arabidopsis thaliana et les mâles Arabidopsis lyrata ou Cardamine flexuos. Ainsi, FER

régule la voie de signalisation impliquée dans la réception du tube pollinique par les synergides et

semble être impliqué dans la mise en place des barrières d’isolement reproductif (Escobar-Restrepo

et al. 2007).

Différentes protéines ont été décrites pour leur implication dans la réception du tube pollinique par

les synergides (revu dans Johnson et al. 2019). Parmi ces protéines, on notera la fonction essentielle

de LRE (LORELEI), une protéine à ancre GPI (glycosylphosphatidylinositol) nécessaire à l’activité de FER,

puisqu’elle agit à la fois comme une chaperonne, permettant le transfert de FER du réticulum

endoplasmique jusqu’à la membrane plasmique des synergides (Li et al. 2015), et comme corécepteur

de FER, permettant la régulation de la voie de signalisation ROP-dépendante (Duan et al. 2014). Le

complexe formé par FER et LRE interagit également avec EN14 (EARLY NODULIN-LIKE 14) et LLG1 (LRE-

LIKE GPI-AP1), deux autres protéines à ancre GPI récemment identifiées pour leur rôle dans la

réception du tube pollinique (Li et al. 2015 ; Hou et al. 2016). L’activation de la voie de signalisation

dépendante de FER déclenche l’oscillation de la concentration de Ca2+ dans les synergides, phénomène

indispensable à la réception du tube pollinique (Ngo et al. 2014). Cependant, si l’on comprend mieux

la nature du complexe de récepteurs responsable de la détection et l’intégration des signaux menant

à la réception du tube pollinique, les ligands impliqués dans l’activation de la voie de signalisation FER-

dépendante restent inconnus à ce jour.


12

Durant tout son voyage à travers les tissus maternels, différents mécanismes sont mis en place pour

éviter la rupture précoce du tube pollinique (voir chapitre 1.2.1 Guidage pré-ovulaire du tube

pollinique). Suite à la réception du tube par les synergides, ces mécanismes doivent être levés pour lui

permettre de livrer à l’ovule les cellules spermatiques qu’il transporte. Le modèle actuellement établi

repose sur la compétition de différents peptides RALFs pour leurs récepteurs, situés à la surface du

tube pollinique (Figure 5). En effet, tout au long de sa progression dans les tissus maternels, son

intégrité est notamment régulée par l’action des deux peptides RALF4 et RALF19, capables de lier au

complexe de récepteurs formé par quatre RLKs homologues de FER : ANX1 (ANXUR 1), ANX2, BUPS1

(BUDDHA’S PAPER SEAL) et BUPS2. Ainsi, il a été proposé que la liaison de RALF4 et RALF19 au

récepteur hétérodimérique ANX1,2/BUPS1,2 active la cascade de signalisation impliquée dans le

maintien de l’intégrité du tube pollinique. Cependant, lorsqu’il atteint l’ovule, RALF4 et RALF19 entrent

en compétition avec un peptide maternel qui s’accumule au niveau des synergides, RALF34, capable

de lier au récepteur ANX1,2/BUPS1,2 avec une plus grande affinité que RALF4 et RALF19, provoquant

ainsi la rupture du tube pollinique (Ge et al. 2017).

Figure 5 : Contrôle de la rupture du tube pollinique par l’interaction ANX/BUPS-RALFs (adapté de Higashiyama, 2018). Les peptides RALF4/19 produits par le tube pollinique se lient au récepteur ANX/BUPS pour permettent le maintien de l’intégrité du tube pollinique. A l’approche de l’ovule, RALF34 entre en compétition avec RALF4/19, et sa fixation au récepteur ANX/BUPS déclenche la rupture du tube pollinique.


13

Cessation de l’attraction du tube pollinique et prévention de la polytubey : le devenir des synergides

La rupture du tube pollinique permet la livraison des cellules spermatiques à l’ovule, et induit la

dégénérescence de la synergide réceptrice, qui reçoit le tube (Christensen et al. 1997 ; Christensen et

al. 2002 ; Faure et al. 2002). Ce processus est systématiquement observé lors de la décharge des

cellules spermatique. Néanmoins, on observe que cette décharge est dispensable pour la

dégénérescence de la synergide, qui peut également se produire à faible fréquence, en absence de

pollinisation. Ces observations suggèrent la coexistence de deux mécanismes de régulation de la

dégénérescence de la synergide réceptrice ; l’un basal, qui régule ce processus indépendamment de la

présence du tube pollinique, l’autre mettant en jeu une communication physique ou chimique entre

les deux structures parentales, augmentant l’occurrence de ce phénomène (Leydon et al. 2015).

Néanmoins, les facteurs moléculaires impliqués dans la régulation de ce processus restent à

déterminer.

La synergide qui ne reçoit pas le tube pollinique, qualifiée de persistante, est toujours apte à recevoir

un second tube pollinique. La fusion des gamètes est un prérequis à la mise en place des mécanismes

qui permettent de parer ce phénomène, appelé polytubey (Baele et al. 2012). La fécondation de la

cellule centrale par une cellule spermatique conduit à la fusion de la synergide persistante avec

l’albumen nouvellement formé, induisant la dilution des facteurs responsables de l’attraction du tube

pollinique (tel que AtLURE1 et les XIUQIUs), et le blocage rapide de la polytubey (Figure 6). La

fécondation de la cellule œuf par une cellule spermatique active une cascade de signalisation

dépendante de l’éthylène, renforcée par l’action du complexe FIS-PRC2 (FERTILIZATION INDEPENDENT

SEED-CLASS POLYCOMB REPRESSIVE COMPLEX 2) dans l’albumen. Cette voie de signalisation provoque

une désorganisation du noyau de la synergide, qui conduira à l’élimination mitose-dépendante de ce

noyau (Maruyama et al. 2013 ; Völz et al. 2013 ; Maruyama et al. 2015).

Chez Arabidopsis thaliana, les différentes étapes du voyage du tube pollinique à travers les tissus

maternels sont déterminantes pour permettre la rencontre des gamètes. Ce processus est régulé par

des mécanismes complexes, faisant souvent intervenir une communication moléculaire entre les deux

parents, qui doit être finement régulée pour permettre au tube pollinique d’atteindre l’ovule, et de

livrer les précieuses cellules spermatiques, qui participent à la formation des générations à venir. Les

exemples (non exhaustifs) de mécanismes décrits dans ce chapitre, illustrent l’importance de cette

interaction entre les gamétophytes mâle et femelle pour le succès de la reproduction.


14

Figure 6 : Inactivation de la synergide persistante (adapté de Maruyama et al. 2015). La fécondation de la cellule centrale déclenche la fusion entre la synergide persistante et l’albumen (S/A), qui permet de diluer le contenu de la synergide. Les signaux mitotiques et le complexe FIS-PRC2 sont impliqués dans l’activation de la désorganisation nucléaire de la synergide persistante qui, renforcé par la cascade de signalisation dépendante de l’éthylène, conduit à l’élimination de son noyau.

15

2. Mécanismes de méthylation et de déméthylation de l’ADN chez Arabidopsis thaliana

Suite à la découverte de la chromatine par Walther Flemming à la fin du 19ème siècle, de nombreuses

recherches ont permis de mettre en évidence son caractère dynamique, et de lever le voile sur les

mécanismes moléculaires qui la régule. La découverte de l’existence des nombreuses marques

chromatiniennes, ainsi que la récente compréhension de certaines de leurs fonctions biologiques, nous

permettent aujourd’hui de répondre à des questions longtemps restées insolubles, notamment

concernant l’établissement de l’identité cellulaire ou encore le contrôle développemental des

organismes pluricellulaires.

Parmi les différentes marques épigénétiques, la méthylation des cytosines de l’ADN est retrouvée dans

de nombreux organismes vivants. Elle est impliquée dans la régulation de différents processus

biologiques, notamment à travers le contrôle de l’expression des gènes, la répression des éléments

transposables (TEs), et la maintenance de l’intégrité du génome.

Bien qu’un nombre croissant d’études indique que les différentes marques épigénétiques agissent de

concert pour permettre le contrôle de la dynamique chromatinienne, je me concentrerai dans ce

manuscrit sur le rôle spécifique de la méthylation des cytosines de l’ADN dans la régulation de

l’expression des gènes au cours du développement reproductif chez l’organisme modèle Arabidopsis

thaliana.

2.1 Mécanismes d’établissement de novo et de maintenance de la méthylation de l’ADN

La méthylation de l’ADN est une modification stable et réversible, retrouvée chez de nombreux

organismes vivants. Elle consiste en l’ajout d’un groupement méthyl (CH3) sur le carbone 5 de la

cytosine de l’ADN (5mC). La réaction de méthylation (transfert du groupement méthyl du substrat

donneur S-adénosylméthionine - SAM - vers une cytosine) est catalysée par des ADN

méthyltransférases, tandis les cytosines méthylées peuvent être passivement perdues, ou activement

remplacées selon différents processus (voir chapitre 2.2). Chez la plante Arabidopsis thaliana, la

méthylation de l’ADN est retrouvée dans trois contextes génétiques : les contextes symétriques CG et

CHG, ainsi que le contexte asymétrique CHH (H = A, T, ou C). Les voies d’établissement et de

maintenance de la méthylation de l’ADN sont aujourd’hui bien décrites, et diffèrent selon les contextes

de séquence.


16

Établissement de novo de la méthylation de l’ADN

Chez Arabidopsis thaliana, l’établissement de novo de la méthylation de l’ADN dépend notamment de

l’action conjointe de l’ADN méthyltransférase DOMAINS REARRANGED METHYLTRANSFERASE 2

(DRM2), de la machinerie d’ARN interférence (RNAi), et des ARN polymérases IV et V (Pol IV et Pol V),

spécifiques des plantes. Cette machinerie de méthylation de novo de l’ADN, décrite sous le nom de

RdDM (pour RNA-directed DNA methylation) (Wassenegger et al. 1994), repose sur la production de

petits ARNs non codants de 24 nucléotides (nt) capables de reconnaitre les séquences homologues

présentes dans le génome, permettant le ciblage de ces séquences par DRM2 (Figure 7) (revu dans

Law and Jacobsen. 2010 ; Matzke and Mosher. 2014 ; Zhang, Lang and Zhu. 2018).

La biogénèse des petits ARNs interférents de 24nt (siARNs) dépend de la production de transcrits

d’ARNs simple brin par Pol IV (P4RNAs) (Blevins et al. 2015 ; Zhai et al. 2015 ; Yang et al. 2016). A partir

de ces ARNs simple brin, l’ARN polymérase RDR2 (RNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE 2) génère des

ARNs double brins (dsARNs), qui sont clivés par l’endonucléase DCL3 (DICER-LIKE 3) pour produire des

siARNs de 24nt, puis chargés dans AGO4 et/ou AGO6 (ARGONAUTE 4 et 6). AGO4 peut interagir avec

Pol V (Li et al. 2006 ; El-Shami et al. 2007) et DRM2 (Zhong et al. 2014), permettant l’appariement entre

les transcrits naissants produits par Pol V et les siARNs chargés dans AGO4, conduisent à

l’établissement de la méthylation de l’ADN dans les trois contextes génétiques, via le recrutement de

DRM2 aux locus ciblés par Pol V.

Néanmoins, l’établissement de novo de la méthylation de l’ADN s’inscrit dans un contexte

chromatinien qu’il est essentiel de prendre en compte. Ainsi, de nombreuses protéines nécessaires au

fonctionnement de la machinerie RdDM sont impliquées dans la régulation de la structure

chromatinienne. On citera l’exemple de SHH1 (SAWADEE HOMEODOMAIN HOMOLOGUE 1), qui

recrute de Pol IV aux locus ciblés par la machinerie RdDM, et se lie à la lysine 9 diméthylée de l’histone

H3 (H3K9me2) via un domaine TUDOR. SHH1 interagit également avec le remodeleur chromatinien

CLSY1 (SNF2 DOMAIN-CONTAINING PROTEIN CLASSY 1), essentiel pour la production des siARNs de

24nt dépendants de Pol IV (Law et al. 2013 ; Zhang et al. 2013).

Des études récentes ont mis en évidence l’existence de plusieurs voies RdDM non-canoniques, où la

biogénèse des siARNs implique une machinerie distincte de la voie canonique. Pour exemple, on citera

la voie indépendante de l’activité des protéines DCL (Yang et al. 2016), ou encore la biogénèse des

siARNs de 24nt dépendants de l’activité de l’ARN polymérase II (Zheng et al. 2009 ; Wu et al. 2012 ;

Nuthikattu et al. 2013 ; McCue et al. 2015).

Mécanismes de méthylation et déméthylation de l’ADN chez Arabidopsis thaliana

17

Figure 7 : Mécanisme de méthylation de l’ADN par la machinerie du RdDM (extrait de Zhang, Lang, et Zhu 2018). Dans la voie du RdDM canonique (à gauche), SSH1 et CLSY1 induisent le recrutement de l’ARN polymérase IV (Pol IV), qui génère un ARN simple brin qui sert de matrice pour la production d’ARN double brin par RDR2. La production des siARNs de 24nt se fait par clivage des ARNs dépendant de Pol IV par DCL2, DCL3, et DCL4 (étape 1), ou par un autre mécanisme inconnu (étape2). Ces siARNs sont chargés dans AGO4 et AGO6, et s’apparient avec les transcrits naissant de Pol V ou Pol II, permettant le recrutement de l’ADN méthyltransférase DRM2. La machinerie RdDM non canonique (à droite) utilise des transcrits générés par Pol II pour produire des siARNs de 24nt (étape 3) ou 21-2nt (étape4), après l’action de DCL3, ou RDR6, DCL2 et DCL4, respectivement. Ces siARNs seront chargés dans AGO4 ou AGO6 pour permettre le recrutement de DRM2 au loci complémentaires. Le complexe IDN-IDP, SWI-SNF, ainsi que la protéine RRP6L1 (RIBOSOMAL RNA-PROCESSING 6 LIKE 1), permettent la rétention du transcrit naissant de Pol V. L’interaction du complexe DDR avec SUVH2 et SUVH9 permet le recrutement de POLV, tandis que RDM3 (RNA-DIRECTED DNA METHYLATION 3) facilite l’association entre AGO4/6 et POL V.


18

Maintenance de la méthylation de l’ADN

Contrairement à son établissement de novo, les voies impliquées dans la maintenance de la

méthylation de l’ADN sont dépendantes du contexte de séquence des cytosines.

La maintenance des cytosines du contexte CG est dépendante de l’action de l’ADN méthyltransférase

MET1 (METHYLTRANSFERASE 1), qui catalyse, en couplage avec la réplication, la réaction de

méthylation des cytosines du brin nouvellement synthétisé (Figure 8). Il a également été démontré

que la famille de protéines VIM (VARIANT IN METHYLATION), capable de se lier aux cytosines

méthylées des doubles brins hemi-méthylées dans le contexte CG, est impliquée dans le recrutement

de MET1 à l’ADN (Vongs et al. 1993 ; Kankel et al. 2003 ; Woo et al. 2007 ; Woo et al. 2008).

Figure 8 : Maintenance de la méthylation des contextes CG et CHG (adapté de Kim and Zilberman. 2014). Dans les régions compactées riches en histone linker H1, la maintenance de la méthylation de l’ADN est assurée par MET1-VIM et SuvH-CMT3/CMT2. L’activité de DDM1 facilite l’accès à la chromatine aux ADN méthyltransférases. La méthylation de l’ADN est représentée par les sphères rouges, les sphères noires représentent H3K9me2. TSS, site d’initiation de la transcription.

La méthylation CHG est principalement maintenue par l’activité de CMT3 (CHROMOMETHYLASE 3),

une ADN méthyltransférase spécifique des plantes. CMT3 possède un chromodomaine capable de se

lier aux H3K9 méthylés (Lindroth et al. 2004), et de nombreuses études démontrent l’existence d’une

boucle de rétroaction entre la maintenance de la méthylation CHG, et la méthylation de H3K9 (revu

dans Du et al. 2015). Néanmoins, une étude suggère que l’ADN méthyltransférase CMT2 est également

impliquée dans la maintenance de la méthylation CHG (Stroud et al. 2014).


19

DRM2 est impliquée dans la maintenance de la méthylation du contexte asymétrique CHH au niveau

des cibles du RdDM, et dépend de la présence des petits ARNs (Cao et al. 2003). La méthylation CHH

indépendante du RdDM est maintenue par CMT2, et nécessite de l’action du remodeleur chromatinien

DDM1 (DECREASE IN DNA METHYLATION) (Zemach et al. 2013). De plus, la maintenance de la

méthylation CHH est indirectement régulée par l’activité de MET1 et CMT3, à travers leurs effets sur

la méthylation de H3K9. En effet, la méthylation dépendante de MET1 induit le recrutement de SUVH2

(SUPRESSOR OF VERIEGATION HOMOLOG 2) et SUVH9 - impliquées dans la méthylation de H3K9 - qui

permettent le recrutement de Pol V et donc de la machinerie RdDM à ces locus (Johnson et al. 2014).

La méthylation CHG dépendante de CMT3 induit une augmentation du niveau de méthylation de H3K9

qui permet de faciliter l’action de CMT2 (Stroud et al. 2014).

2.2 Mécanismes de déméthylation de l’ADN chez Arabidopsis thaliana

Déméthylation passive de l’ADN

La méthylation de l’ADN peut être progressivement perdue si sa maintenance ne se fait pas

correctement après la réplication. On citera l’exemple du gamétophyte mâle (pollen), dans lequel

l’inactivation de la machinerie RdDM induit une baisse de la méthylation des cytosines du contexte

CHH (Slotkin et al. 2009). Lors du développement de l’ovule (gamétophyte femelle), il a été proposé

que la répression transcriptionnelle de MET1, induise une déméthylation passive de l’ADN dans la

cellule centrale (Jullien et al. 2008). Cependant, ce résultat a récemment été remis en cause, et l’état

d’expression de MET1 dans la cellule centrale reste sujet à controverse (Park et al. 2016 ; Schmidt et

al 2013).

Certaines études pointent également du doigt l’importance de maintenir l’intégrité des voies

responsables de la production du substrat SAM (donneur de groupements méthyl), et de l’hydrolyse

du sous-produit de la réaction de méthylation, le S-Adenosyl-L-Homocysteine (SAH), un important

inhibiteur des ADN méthyltransférases SAM-dépendantes (Moffatt and Weretilnyk. 2001). En effet,

l’altération de ces voies provoque, le plus souvent, une importante modification des profils de

méthylation de l’ADN, due à la déméthylation passive et progressive de l’ADN induite par l’absence

d’une machinerie de maintien de la méthylation fonctionnelle (Rocha et al. 2005 ; Zhang et al. 2012 ;

Zhou et al. 2013 ; Groth et al. 2016).


20

Mécanismes moléculaires impliqués dans la déméthylation active de l’ADN

Dans la mesure où aucune enzyme capable de catalyser le retrait direct du groupement méthyl apposé

sur les cytosines n’a été identifiée à ce jour, la déméthylation active de l’ADN nécessite l’action d’un

groupe d’enzymes permettant le remplacement des cytosines méthylées par des cytosines non

méthylées, en utilisant la machinerie de réparation par excision de base (BER). L’initiation de ce

processus étant dépendant de l’action d’ADN glycosylases capables d’exciser la base méthylée, ces

enzymes ont été qualifiées d’ADN déméthylases (revu dans Zhu. 2009 ; Zhang et Zhu. 2012 ; Zhang,

Lang and Zhu. 2018 ; Li et al. 2018).

Figure 9. Mécanisme de déméthylation active de l’ADN par les ADN glycosylases: exemple de ROS1 (adapté de Zhang, Lang et Zhu.. 2018). L’action du complexe IDM conduit au recrutement de ROS1, qui catalyse successivement les réactions de glycosylases et d’AP lyase, conduisant à la libération de la cytosine méthylée. Le site abasique produit subit une réaction de β-élimination ou β,δ-élimination qui fournissent des sites de terminaison pris en charge par APE1L et ZDP. La réparation du site abasique dépend de l’action de l’ADN ligase LIG1.

Chez Arabidopsis thaliana, quatre ADN glycosylases REPRESSOR OF SILENCING 1 (ROS1), DEMETER

(DME), DEMETER-LIKE 2 (DML2) et DEMETER-LIKE 3 (DML3) sont capables de reconnaitre directement

les cytosines méthylées, indépendamment du contexte de séquence, et d’initier la réaction de

déméthylation (Gong et al. 2002 ; Agius et al. 2006 ; Gehring et al. 2006 ; Morales-Ruiz et al. 2006 ;

Ortega-Galisteo et al. 2008). Ces enzymes sont dites bi-fonctionnelles car elles possèdent à la fois une


21

activité glycosylase, qui hydrolyse la liaison glycosidique entre le désoxyribose et la base, et une

activité AP (apurique/apyrimidique) lyase, qui permet l’excision de la cytosine, produisant un site

abasique. S’en suit une réaction de β-élimination ou β,δ-élimination, qui produit une terminaison

aldéhyde 3’phosphor-α,β-insaturée ou 3’phosphate (Figure 9) (revu dans Zhu, 2009). Ces terminaisons

sont prises en charge par l’endonucléase DNA-(APURIC/APYRIMIDINIC SITE) LYASE (APE1L) (Lee et al.

2014 ; Li et al. 2015) et l’ADN phosphatase POLYNUCLEOTIDE 3’PHOSPHATASE ZDP (Martinez-Macias

et al. 2012), respectivement, pour produire des terminaisons 3’OH, prises en charge par la machinerie

de réparation de l’ADN. Si certaines études proposent que LIG1 (DNA LIGASE 1) est l’ADN ligase

impliquée dans la réparation de l’ADN lors du processus de déméthylation (Andreuzza et al. 2010 ; Li

et al. 2015), l’identité de l’ADN polymérase responsable de la polymérisation de la cytosine non

méthylée reste à découvrir.

2.3 Caractéristiques des ADN déméthylases ROS1 et DME

REPRESSOR OF SILENCING 1 – ROS1

L’ADN glycosylase REPRESSOR OF SILENCING 1 (ROS1) a été identifiée dans un crible génétique

cherchant à mettre en évidence des nouveaux facteurs impliqués dans le Transcriptional gene silencing

(TGS) (Gong et al. 2002). Cette étude fut la première à souligner la fonction anti-silencing de ROS1, et

à décrire son activité d’ADN déméthylase, faisant de ROS1, la première ADN déméthylase identifiée

chez les eucaryotes. Dans les années qui suivirent son identification, de nombreuses études

participèrent à la caractérisation biochimique et fonctionnelle de ROS1 (Agius et al. 2006 ; Morales-

Ruiz et al. 2006 ; Penterman et al. 2007 ; Zhu et al. 2007, revu dans Zhu et al. 2009).

La déméthylation de l’ADN médiée par ROS1 se produit dans les trois contextes de méthylation CG,

CHG, et CHH (Penterman et al. 2007). Cependant, deux études ayant montré des résultats

contradictoires quant à une potentielle préférence de ROS1 pour un contexte de méthylation, cette

question reste discutée (Agius et al. 2006 ; Morales-Ruiz et al. 2006).

ROS1 est exprimé dans toute la plante végétative, ainsi que dans la cellule végétative du pollen (Gong

et al. 2002 ; Schoft et al. 2011). De plus, l’expression de ROS1 est soumise à une régulation dépendante

de l’état de méthylation de l’ADN (Figure 10). En effet, des études ont mis en évidence l’existence

d’une séquence sensible à la méthylation de l’ADN dans le promoteur de ROS1. La déméthylation de

cette séquence (appelée MEMS pour DNA Methylation Monitoring Sequence), induit une répression

transcriptionnelle de ROS1 (Lei et al. 2015 ; Williams et al. 2015). En conséquence, on observe une

diminution de l’expression de ROS1 dans le mutant met1 (Mathieu et al. 2007), et dans tous les

mutants des composants du RdDM (revu dans Zhang, Lang and Zhu. 2018). L’état de méthylation du


22

MEMES est augmenté dans le mutant ros1 (Lei et al. 2015). Ces observations ont conduit au postulat

que la séquence régulatrice MEMS, agit comme un thermostat, capable de percevoir l’état global de

méthylation, et d’adapter l’expression de ROS1 pour permettre la stabilité des profils de

méthylation de l’ADN : On parle de « Methylstat » (Williams et al. 2015).

Figure 10 : Régulation de l’expression de ROS1 par la méthylation de l’ADN (adapté de Zhang, Lang et Zhu. 2018). La méthylation de la séquence MEMS contenu dans le promoteur de ROS1 influence son expression. L’état de méthylation du MEMS est modulé par l’activité de MET1, de la machinerie RdDM, et de ROS1, permettant à la plante d’estimer l’état de méthylation globale du génome: on parle de «methylstat».

De nombreuses études se sont penchées sur la manière dont ROS1 cible les locus qu’elle déméthyle.

ROS3 code pour une protéine capable de se lier aux petits ARNs simple brin, colocalise avec ROS1, et

sa mutation induit une hyperméthylation de l’ADN aux locus ciblés par ROS1. Il a donc été proposé que

ROS3 soit impliqué dans le recrutement de ROS1 à ses cibles (Zheng et al. 2008). Cependant,

l’implication des petits ARNs dans le recrutement de ROS1 reste à déterminer. Des études récentes

montrent également que le recrutement de ROS1 est dépendant de l’environnement chromatinien.

En effet, les régions ciblées par ROS1 sont caractérisées par un enrichissement en certaines marques

d’histones, tel que l’acétylation de la lysine 18 et 23 de l’histone H3 - H3K18ac/H3K23ac - (Tang et al.

2016). IDM1 (INCREASE IN DNA METHYLATION 1), qui code pour une histone acétyltransférase capable

de se lier à l’ADN méthylé, a été décrite pour faciliter l’accès de ROS1 à ses locus cibles (Li et al. 2012 ;

Qian et al. 2012). IDM1 agit au sein d’un complexe protéique récemment identifié (le complexe IDM),

dont certains composants sont capables de se lier aux cytosines méthylées, induisant le recrutement

de IDM1 (Qian et al.2014 ; Lang et al. 2015 ; Wang et al. 2015 ; Duan et al. 2017 ; revu dans Zhang,

Lang, et Zhu. 2018). Ainsi, l’action du complexe IDM permet l’établissement d’un environnement

chromatinien permissif pour la déméthylation de l’ADN dépendante de ROS1. Cependant, le

mécanisme par lequel l’acétylation médiée par IDM1 induit le recrutement ROS1 reste à déterminer.

Puisque ROS1 cible préférentiellement les transposons proches des gènes, il a été proposé que son

action permette de marquer la limite entre transposons et gènes, en évitant le spreading de la


23

méthylation des TEs sur les gènes. L’action de ROS1 permet également de contrer l’activité du RdDM,

comme suggéré par l’important nombre de cibles partagées entre ROS1 et la machinerie RdDM

(Williams et al. 2017 ; Tang et al. 2016). Néanmoins, ROS1 est également capable de déméthyler des

locus indépendants du RdDM (Gong et al. 2002 ; He et al. 2009 ; Gao et al. 2010 ; Tang et al. 2016).

DEMETER – DME

DEMETER a d’abord été identifiée pour son rôle dans le développement de la graine. En 2002, Choi et

al. mettent en évidence l’activité d’ADN glycosylase de DEMETER, et son implication dans la régulation

de l’expression des gènes soumis à l’empreinte parentale (expression préférentielle d’un allèle en

fonction de son origine parentale). S’ils sont les premiers à suggérer une fonction de DME dans la

déméthylation active de l’ADN, l’absence de preuves expérimentales empêche de conclure sur la

fonction déméthylase de l’enzyme. Quatre ans plus tard, Gehring et al. démontrent que la double

activité d’ADN glycosylase/lyase de DEMETER permet d’initier le processus de déméthylation des

cytosines de l’ADN, indépendamment du contexte de méthylation (CG, CHG, CHH) (Gehring et al.

2006). Ils confirment également que cette fonction de déméthylase permet à DME de réguler

épigénétiquement les gènes soumis à l’empreinte parentale, en assurant la déméthylation de ces locus

dans la cellule centrale de l’ovule.

Contrairement à ROS1, DME est principalement connue pour son activité gamétophytique. En effet,

DME est principalement exprimée dans la cellule centrale et les synergides de l’ovule, ainsi que dans

la cellule végétative, au stade bicellulaire du pollen en formation, mais est réprimé dans le pollen

mature et après fécondation de la cellule centrale. Bien qu’aucune fonction de DME n’ai encore été

décrite en dehors du stade reproductif, DME s’exprime également dans certains tissus sporophytiques,

tel que les méristèmes apicaux caulinaires et racinaires, ainsi que dans les primordia foliaires et les

racines primaires (Choi et al. 2002 ; Kim et al. 2008 ; Schoft et al. 2011 ; Park et al. 2017).

L’expression de DME dans la cellule centrale requiert l’activité du facteur de transcription AGL80

(AGAMOUS LIKE 80) (Portereiko et al.2006) et une étude récente propose la potentielle implication de

40 autres facteurs de transcription dans la régulation transcriptionnelle de DME, bien qu’aucune

caractérisation fonctionnelle n’ait été réalisée à ce jour (Park et al. 2017).

Le mécanisme par lequel DME cible les locus qu’il déméthyle reste, à ce jour, largement méconnu.

Néanmoins, deux études démontrent que l’expression des gènes cibles de DME requiert la fonction du

complexe FACT (FACILITATES CROMATIN TRANSCRIPTION) et de l’histone H1, tous deux impliqués dans

la régulation de l’environnement chromatinien. Il semble également que DME et H1 puissent interagir,

suggérant un rôle potentiel de ces facteurs dans le recrutement de DME à ses cibles (Ikeda et al. 2011 ;


24

Rea et al. 2012). Néanmoins, l’implication de H1 dans le recrutement de DME reste débattue, puisqu’il

a récemment été démontré que la déplétion naturelle de H1 observée dans la cellule végétative du

pollen est essentielle pour permettre à DME d’accéder à la chromatine (He et al. 2019).

Dans les cellules compagnes des gamètes, il a été démontré que DME cible préférentiellement les

petits TEs euchromatiques, riche en AT. Ainsi, en plus de son rôle dans la régulation de l’expression

des gènes soumis à l’empreinte parentale, il a été proposé que l’activité de DME dans la cellule

végétative et la cellule centrale soit indirectement responsable d’un renforcement du silencing des TEs

dans les gamètes (Huh et al. 2008 ; Gehring et al. 2009 ; Hsieh et al. 2009 ; Slotkin et al. 2009 ; Ibarra

et al. 2012 ; Calarco et al. 2012) (voir chapitre 3.2). Certaines études suggèrent que DME permet la

dérépression des TEs dans les cellules compagnes, induisant la production de petits ARNs mobiles,

capables de cibler les TEs de séquence complémentaire dans les gamètes. En conséquence, il semble

que l’action de DME dans les gamétophytes mâle et femelle puisse intervenir dans le maintien de

l’intégrité du génome des gamètes, en renforçant la répression des TEs dans ces cellules transmises à

la génération suivante (Slotkin et al. 2009 ; Ibarra et al. 2012 ; Calarco et al. 2012 ; Martínez et al. 2016).

Enfin, si l’on comprend l’effet de DME sur le contrôle transcriptionnel des gènes soumis à l’empreinte

parentale dans l’ovule, les conséquences de la régulation de l’expression des gènes par DME dans le

pollen restent méconnues.

Les phénotypes observés dans le mutant dme reflètent l’importance de cette déméthylase de l’ADN

dans le fonctionnement des gamétophytes mâle et femelle. En l’absence de DME dans le gamétophyte

femelle, la dérégulation de l’expression des gènes soumis à l’empreinte parentale induit une

surprolifération et une absence de cellularisation de l’albumen, conduisant à l’avortement précoce des

graines après fécondation. Ainsi, la mutation dme induit une stérilité totale du côté femelle. Il en

résulte que l’allèle mutant dme est transmis exclusivement par le côté paternel : un mutant nul à l’état

homozygote ne peut pas être établi (Choi et al. 2002). On observe également une diminution de la

fertilité du côté paternel, puisque lorsque le mutant dme est utilisé comme donneur de pollen, la

transmission de l’allèle dme est d’environ 15%, contre 50% attendus (Xiao et al. 2003 ; Schoft et al.

2011). Il a été proposé que cette diminution de la fertilité du mâle dme soit due à un défaut de

germination du pollen, et donc à l’incapacité du pollen mutant à produire un tube pollinique, bien que

les mécanismes moléculaires impliqués dans ce phénotype n’aient pas encore été identifiés (Schoft et

al. 2011).

En plus de l’activité essentielle de DME dans les gamétophytes mâle et femelle, une étude récente

propose que DME pourrait être constitutivement exprimée pendant la phase sporophytique, et

participerait aux mécanismes de défense en réponse aux pathogènes, à travers la déméthylation de

l’ADN de gènes et transposons dans les tissus somatiques, et à la suppression de la méthylation de


25

l’ADN ectopique induite par l’environnement dans le gamétophyte mâle (Schumann et al. 2019 ;

Wibowo et al. 2016).

26

3. Fonctions biologiques et conséquences de la dynamique de méthylation de l’ADN chez Arabidopsis thaliana

Chez Arabidopsis thaliana, la méthylation de l’ADN agit de concert avec d’autres marques

chromatiniennes pour moduler l’environnement chromatinien. Cette marque régule de nombreux

processus biologiques essentiels, tel que la réponse immunitaire aux agents pathogènes et le

développement reproductif, notamment à travers son implication dans la régulation de l’expression

des gènes. Ce chapitre se concentre sur la fonction et la dynamique de la méthylation de l’ADN qui se

produit pendant le stade reproductif chez Arabidopsis thaliana.

3.1 Fonctions biologiques de la méthylation de l’ADN

Régulation de l’expression des gènes

La méthylation de l’ADN est impliquée dans la régulation de l’expression des gènes. Chez Arabidopsis

thaliana, on la retrouve aussi bien au niveau des promoteurs, que dans le corps des gènes.

La méthylation de l’ADN associée aux promoteurs est principalement impliquée dans la répression

transcriptionnelle. Elle concerne environ 5% des gènes, et résulte le plus souvent du spreading de la

méthylation des TEs avoisinants (Zhang et al. 2006). La méthylation de l’ADN au niveau des promoteurs

est principalement associée à une répression transcriptionnelle, bien qu’elle puisse également induire

une activation de l’expression de certains gènes - comme décrit plus haut pour ROS1 - (Zhang et al.

2006 ; Lei et al.2015 ; Williams et al. 2015).

L’ADN peut également être méthylé au niveau du corps des gènes, on parle de gene body methylation

(gbM). Contrairement aux promoteurs, qui sont méthylés dans les trois contextes de séquence, la gbM

est principalement observée dans le contexte CG, maintenu par MET1. Bien que cette gbM concerne

un tiers des gènes - notamment ceux constitutivement exprimés - sa fonction reste mal comprise

(Zhang et al. 2006 ; Zilberman et al. 2007 ; Cokus et al. 2008 ; Lister et al. 2008 ; Takuno et al. 2013 ;

Niederhuth et al. 2016 ; revu dans Law and Jacobsen. 2010 ; Zhang, Lang and Zhu. 2018). Néanmoins,

des études récentes ont permis de lever le voile sur le rôle essentiel de CMT3 dans l’établissement de

la gbM (Bewick et al. 2017 ; Bewick and Schmitz. 2017 ; Wendte et al. 2019).

La dynamique de méthylation de l’ADN présent dans le corps des gènes semble intimement liée aux

variant d’histones. En effet, la gbM est principalement retrouvée dans les régions où la chromatine est

ouverte, riche en H3.3 (variant de l’histone H3 associé avec les gènes activement exprimés), et

Fonctions biologiques et conséquences de la dynamique de méthylation de l’ADN

27

déplétée en H1 (histone linker impliqué dans la compaction de la chromatine), permettant de faciliter

l’accès des ADN méthyltransférases (Wollmann et al. 2017).

L’un des premiers rôles proposés pour la gbM est la répression de la production de transcrits anti-sens

à partir de promoteurs cryptiques internes (Tran et al. 2005 ; Zilberman et al. 2007, 2008 ; Takuno et

al. 2012). Cependant, les faibles conséquences de la perte de la gbM sur le niveau global de l’expression

des gènes, ainsi que sur la production de transcrits anti-sens semble remettre en question cette

hypothèse (Zhang et al. 2006 ; Roudier et al. 2009 ; Teixeira et Colot. 2009 ; Zemach et al. 2010). Il a

également été proposé que la gbM pourrait réguler l’expression des gènes en permettant l’exclusion

du variant d’histone H2A.Z de la chromatine (Zilberman et al. 2008 ; Coleman-Derr et al. 2012). Enfin,

la gbM pourrait être impliquée dans la régulation de l’épissage des ARNs messagers (Zilberman et al.

2008). Cependant, si quelques exemples ont déjà été décrits chez le riz (Wang et al. 2016), ce rôle de

la gbM chez Arabidopsis thaliana reste à établir chez Arabidopsis thaliana.

On observe également la présence de TEs dans les introns de certains gènes, qui induisent une gbM

dans les trois contextes génétiques. Ce phénomène est impliqué dans la régulation de la modification

des ARNs messagers produits, et conduit à la polyadénylation des transcrits (Saze et al. 2013 ; Wang

et al. 2013).

Répression des éléments transposables

Le génome d’Arabidopsis thaliana est composé d’environ 10% de séquences de TEs. Hautement

mutagéniques, elles sont souvent considérées comme des éléments parasites, en raison des effets

parfois délétères induits par leur transposition (Hollister and Gaut, 2009). Les moyens mis en œuvre

par l’organisme pour permettre la répression des TEs reposent principalement sur l’action conjointe

des différentes marques chromatiniennes, parmi lesquelles la méthylation de l’ADN joue un rôle clé

chez Arabidopsis thaliana (Revu dans Slotkin and Martienssen. 2007 ; Inagaki and Kakutani. 2012 ; Kim

and Zilberman. 2014 ; Sigman and Slotkin. 2016).

La méthylation de l’ADN observée au niveau des TEs concerne les trois contextes de séquence; son

dépot et sa maintenance sont largement dépendantes des voies métaboliques décrites dans le

chapitre précédent (voir chapitre 2.1). A titre d’exemple, on notera le rôle essentiel de DDM1 dans la

méthylation de l’ADN au niveau des TEs, qui permet l’accès aux machineries de méthylation

dépendantes de MET1, CMT2 et CMT3, en contrant l’action de l’histone linker H1. On peut également

citer l’importance de l’activité de la machinerie RdDM dans la méthylation de nombreux TEs.

Néanmoins, les effets de l’absence de ces facteurs sur la dérépression transcriptionnelle et la

remobilisation des TEs sont diverses, puisque si certains mutants des voies de méthylation de l’ADN


28

induisent une importante réactivation transcriptionnelle de ces séquences qui peut conduire à la

remobilisation de certains TEs - comme c’est le cas du mutant ddm1 -, on observe un effet limité des

mutants de la machinerie RdDM sur la réexpression des transposons chez Arabidopsis thaliana (Kato

et al. 2003 ; Lippman et al. 2004 ; Xie et al. 2004 ; Huettel et al. 2006 ; Lister et al. 2008 ; Mirouze et al.

2009 ; Tsukahara et al. 2009 ; Zemach et al. 2013 ; Stroud et al. 2014).

La présence de TEs au voisinage des gènes nécessite la mise en place de mécanismes permettant

d’éviter le spreading de la méthylation des TEs jusqu’aux séquences régulatrices des gènes (Hollister

et al. 2011). Les ADN glycosylases impliqués dans la déméthylation active de l’ADN tel que DME et

ROS1 jouent un rôle essentiel dans l’établissement des limites entre TEs méthylés situés dans les bras

chromosomiques euchromatiques et gènes transcriptionnellement actifs non méthylés,

principalement en contrant l’action de la machinerie RdDM, permettant ainsi de limiter son impact

indirect sur l’expression des gènes. (Penterman et al. 2007 ; Lister et al. 2008 ; Ibarra et al. 2012 ; Tang

et al. 2016).

3.2 Dynamique de méthylation de l’ADN pendant la phase reproductive chez Arabidopsis thaliana

Dynamique de méthylation de l’ADN pendant le développement du pollen

Les mécanismes de formation du gamétophyte mâle conduisent à la production du pollen, composé

de deux cellules spermatiques, et d’une cellule compagne des gamètes, la cellule végétative (Figure

11). Ces deux types cellulaires présentent des caractéristiques nucléaires divergentes, et sont le siège

de modifications des profils de méthylation de l’ADN, qui s’établissent dès les premières étapes de la

formation de la lignée sexuelle. On observe dans le MiMC, cellule précurseur du pollen mature, un

haut niveau de méthylation CG et CHG, transmis aux microspores, puis aux cellules spermatiques. Le

taux global de méthylation CHH est très bas dans le MiMC, et augmente progressivement dans le

méiocyte et les cellules spermatiques. Cependant, le pourcentage de méthylation CHH observé dans

les cellules spermatiques reste bas en comparaison des cellules somatiques et de la cellule végétative,

ou l’on observe un fort taux de méthylation CHH, principalement du à l’activité combinée de CMT2 et

de la machinerie RdDM. De plus, l’expression de DME et l’absence de DDM1 dans la cellule végétative

conduit à une baisse du taux de méthylation CG et CHG (Slotkin et al. 2009 ; Calarco et al. 2012 ; Ibarra

et al. 2012 ; She and Baroux. 2015 ; Hsieh et al. 2016 ; Walker et al. 2017).

Ainsi on observe dans le pollen mature, des profils de méthylation de l’ADN différents entre les cellules

spermatiques et la cellule végétative. Ces différences concernent également d’autres caractéristiques

chromatiniennes qui vont conduire, ensemble, à la mise en place d’un environnement chromatinien

opposé entre ces deux types cellulaires. Pour exemple, on observe dans le noyau végétatif, une


29

déplétion en H3K9me2, et une absence du linker histone H1, tous deux présents dans le noyau des

cellules spermatiques. Il en résulte que la cellule végétative possède un noyau large, fortement

décondensé, et dépourvu de foyers hétérochromatiques, tandis que les noyaux des cellules

spermatiques sont petits, condensés et contiennent des foyers hétérochromatiques (Schoft et al.

2009 ; Hsieh et al. 2016 ; He et al. 2019).

Fig 11. Dynamique de méthylation de l’ADN pendant le stade reproductif (adapté de Gehring, 2019). Schémas représentatif des modifications des profils de méthylation observés pendant le développement des gamétophytes mâle et femelle, et après fécondation. MMC, Megaspore Mother Cell; MiMC, Microspore Mother Cell; CC, cellule centrale; EC, cellule oeuf; EN, albumen; EMB, embryon.

Ces différentes caractéristiques chromatiniennes jouent un rôle essentiel dans la fonction du pollen,

et sont impliquées dans la régulation de l’expression des gènes et des TEs. En effet, il a été proposé

que les profils de méthylation de l’ADN observés dans le VN (noyau de la cellule végétative) induisent

une réexpression transcriptionnelle des transposons hétérochromatiques, qui conduit à leur

remobilisation, et à la production de siARNs (Slotkin et al. 2009 ; Martínez et al. 2016). Ces études


30

suggèrent que déméthylation de l’ADN observée dans la cellule végétative pourrait être impliquée

dans le maintien de l’intégrité du génome des gamètes (Slotkin et al. 2009 ; Martínez et al. 2016).

Si de nombreuses études se sont intéressées à l’impact de cette dynamique de méthylation de l’ADN

sur le contrôle des TEs dans le pollen, on sait peu de choses sur son rôle dans la régulation de

l’expression des gènes. Walker et al. (2017) ont récemment mis en évidence l’existence de locus

hyperméthylés, spécifiques de la lignée sexuelle mâle : les SMLs (Sexual-lineage-specific Methylated

Loci). Ces locus sont décrits comme des cibles inhabituelles de la machinerie RdDM, qui induit leur

méthylation dans les trois contextes de séquences, pendant le développement du pollen. Le

chevauchement entre SMLs et gènes est plus fréquemment observé que pour les autres cibles du

RdDM, et résulte d’un spreading de RdDM des TEs sur les gènes. Les SMLs sont impliqués dans la

régulation transcriptionnelle d’un sous-ensemble de gènes dans les méiocytes mâles, et il a été

démontré que la présence d’un SML dans l’intron du gène MPS1 (MULTIPOLAR SPINDLE 1), est

impliquée dans la régulation du processus d’épissage de l’ARNm produit. MPS1 est impliqué dans

l’organisation du fuseau méiotique, et l’absence du SML intronique conduit à une altération de

l’épissage de l’ARNm et à un défaut partiel de la progression de la méiose.

Dynamique de méthylation de l’ADN lors de la formation du gamétophyte femelle

Durant tout le processus de formation du gamétophyte femelle, on observe une importante

dynamique de la méthylation de l’ADN, qui participe à la modification des états chromatiniens dans

les différentes cellules de l’ovule. Lors de la différenciation du MMC (précurseur de l’ovule), bien que

la méthylation CG soit stable, on observe une forte diminution de la méthylation CHH. Cependant, la

fonction biologique et les mécanismes qui conduisent à cette baisse de méthylation transitoire restent

inconnus à ce jour (Ingouff et al. 2017). Dans l’ovule mature, les profils de méthylation de l’ADN

observés dans les cellules qui le composent, notamment la cellule centrale et la cellule œuf, présentent

des caractéristiques différentes. En effet, dans la cellule centrale, l’expression de DME et le faible

niveau d’expression des ADN méthyltransférases responsables de la maintenance et de la méthylation

de novo (Choi et al. 2002 ; Jullien et al. 2012), conduisent à une hypométhylation globale du génome

dans les trois contextes de séquence (Jullien et al. 2008 ; Ibarra et al. 2012 ; Jullien et al. 2012 ;

Rodrigues et al. 2013 ; Park et al.2016). Cette hypométhylation s’associe à une déplétion en marques

chromatiniennes répressives, et conduit à la décondensation du noyau de la cellule centrale, comparé

à la cellule œuf (Pillot et al. 2010). Dans l’ovule, la présence des ADN méthyltransférases responsables

de la maintenance de la méthylation de l’ADN est réduite comparée aux cellules somatiques (Jullien et

al. 2012). Ainsi, il a été démontré que les profils de méthylation de l’ADN observés dans la cellule œuf

sont relativement stables par rapport à la cellule centrale, principalement dans le contexte CHH,


31

maintenu par l’action d’une machinerie RdDM non canonique dépendante de Pol V. Si la méthylation

CG diminue légèrement dans la cellule œuf comparée au méiocyte femelle, cette baisse de

méthylation CG est vite rétablie après fécondation (Ingouff et al. 2017).

32

4. Objectifs de la thèse

Chez Arabidopsis thaliana, les profils de méthylation de l’ADN restent majoritairement stables tout au

long du développement de la plante. Néanmoins, on observe pendant la phase reproductive un

remodelage des profils de méthylation de l’ADN, qui dépend notamment de l’activité des ADN

glycosylases. DME est principalement impliquée dans la déméthylation active de l’ADN dans les

gamétophytes mâle et femelle. Le défaut de fertilité du mutant dme/+ observé aussi bien du côté

paternel que du côté maternel (décrit dans le chapitre 2.3. DEMETER), nous renseigne sur l’importance

de la fonction de DME pour le succès de la reproduction. S’il a été proposé que le phénotype observé

du côté femelle repose sur un défaut de régulation des gènes soumis à l’empreinte parentale, les

facteurs précis responsables de ce phénotype n’ont toujours pas été identifiés.

Du côté mâle, le défaut de fertilité de dme/+, semble s’expliquer par une baisse du taux de germination

du pollen mutant (Schoft et al. 2011), suggérant un rôle de DME dans la régulation de la fonction de la

cellule végétative. Néanmoins, le défaut de germination du pollen dme n’explique que partiellement

la baisse de fertilité paternelle du mutant, suggérant que d’autres étapes du processus de reproduction

pourraient être altérées dans le mutant.

S’il a été démontré que DME est essentiel pour la dynamique de méthylation de l’ADN observée dans

la cellule végétative (Ibarra et al. 2012), on sait peu de chose sur la fonction de ROS1 dans le pollen.

En effet, bien que ROS1 soit exprimé dans la cellule végétative (Schoft et al. 2011), le profil de

méthylation de l’ADN du mutant ros1 n’a jamais été établi dans le pollen, probablement en raison de

l’absence de phénotype gamétophytique de ros1.

L’initiation de ce projet de thèse repose sur l’établissement et l’étude du double mutant de

déméthylation dme/+;ros1. Comme pour le simple mutant dme/+, on observe chez le double mutant

dme/+;ros1 une stérilité totale du côté maternel. De manière remarquable, on constate une

importante aggravation de la baisse de fertilité du mâle double mutant, puisque l’allèle paternel dme

ne se transmet plus qu’à hauteur d’environ 1-3% (contre 17% pour le simple mutant dme/+). Cette

aggravation du phénotype indique une fonction semi-redondante des deux déméthylases dans le

pollen et suggère une fonction gamétophytique de ROS1.

Mon projet de thèse a pour but de mesurer l’impact global de DME et ROS1 sur la modification des

profils de méthylation de l’ADN dans les différentes cellules de pollen. Cette étude se concentre

également sur la caractérisation des mécanismes physiologiques et moléculaires impliqués dans la

baisse drastique de fertilité paternelle observée chez les mutants de déméthylation. Pris ensembles,

les résultats que j’ai obtenu pendant ma thèse devraient permettre de mieux comprendre les

Objectifs de la thèse

33

processus par lesquels la déméthylation active de l’ADN contrôle le succès de la reproduction chez la

plante modèle Arabidopsis thaliana.

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DEUXIÈME PARTIE

RÉSULTATS

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Résultats

1. Manuscrit en préparation Male fertility in plants requires active DNA demethylation of genes

controlling pollen tube function

Souraya Khouider1, Filipe Borges2,3, Chantal LeBlanc2,4, Alexander Ungru5, Arp Schnittger5,6,7,

Robert Martienssen2, Vincent Colot1,*, and Daniel Bouyer1,6,8,*

1) Institut de Biologie de l’Ecole Normale Supérieure (IBENS), Centre National de la Recherche

Scientifique (CNRS), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Ecole

Normale Supérieure, PSL Research University, Paris 75005, France.

2) Howard Hughes Medical Institute; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 11724,

USA

3) Current address: Institut Jean-Pierre Bourgin, INRA-AgroParisTech, INRA Centre de Versailles-

Grignon, 78026 Versailles, France

4) Current address: Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, Faculty of Arts

and Sciences, Yale University, New Haven, CT, 06511, USA.

5) Max Planck Institute for Plant Breeding Research, 50829 Cologne, Germany

6) Institut de Biologie Moleculaire des Plantes (IBMP), CNRS, 67084 Strasbourg, France

7) Current address: University Hamburg, 22609 Hamburg, Germany

8) Current address: Laboratoire Reproduction et Développement des Plantes (RDP), UnivLyon, Ecole

Normale Supérieure de Lyon, Université Claude Bernard Lyon1, CNRS), INRA, Lyon, France

* Lead contacts: [email protected]; [email protected]

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Male fertility in plants requires active DNA demethylation of genes

controlling pollen tube function

Souraya Khouider1, Filipe Borges2,3, Chantal LeBlanc2,4, Alexander Ungru5, Arp

Schnittger5,6,7, Robert Martienssen2, Vincent Colot1,*, and Daniel Bouyer1,6,8,*

1 Institut de Biologie de l’Ecole Normale Supérieure (IBENS), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Ecole Normale Supérieure, PSL

Research University, Paris 75005, France. 2 Howard Hughes Medical Institute; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 11724, USA 3 Current address: Institut Jean-Pierre Bourgin, INRA-AgroParisTech, INRA Centre de Versailles-Grignon,

78026 Versailles, France 4 Current address: Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, Faculty of Arts and

Sciences, Yale University, New Haven, CT, 06511, USA. 5 Max Planck Institute for Plant Breeding Research, 50829 Cologne, Germany

6 Institut de Biologie Moleculaire des Plantes (IBMP), CNRS, 67084 Strasbourg, France 7 Current address: University Hamburg, 22609 Hamburg, Germany

8 Current address: Laboratoire Reproduction et Développement des Plantes (RDP), UnivLyon, Ecole Normale Supérieure de Lyon, Université Claude Bernard Lyon1, CNRS), INRA, Lyon, France

* Lead contacts: [email protected]; [email protected]

Abstract Active DNA demethylation is required for sexual reproduction in plants but the molecular determinants underlying this epigenetic control are not known. Here, we show in Arabidopsis thaliana that the DNA glycosylases DEMETER (DME) and REPRESSOR OF SILENCING 1 (ROS1) act semi-redundantly in the vegetative cell of pollen to demethylate DNA and ensure proper pollen tube progression. Moreover, we identify four pollen-specific genes with increased DNA methylation as well as reduced expression in dme and dme;ros1 and report that the reinstalling expression of any of these genes in mutant pollen is sufficient to improve fertility. Our findings demonstrate an essential gene regulatory function of active DNA demethylation in controlling pollen function and male fertility. Introduction DNA cytosine methylation (5mC) is an epigenetic mark that plays a critical role in the silencing of transposable elements (TEs) as well as the regulation of genes in plants and mammals 1-3. In plants, methylation affects cytosines in the three possible contexts, CG, CHG and CHH (where H=A, C or T) through different molecular pathways and DNA methyltransferases (MTases). Thus, in A. thaliana, DRM1 and DRM2, which are related to the mammalian de novo DNA MTase Dnmt3, establish DNA methylation in all sequence contexts in

an RNA-dependent manner (RNA-directed DNA methylation or RdDM; 4). DRM1 and 2, together with CMT2, a plant-specific chromomethylase, are also essential for the maintenance of CHH methylation. In addition, MET1, which is the plant homolog of the maintenance DNA MTase Dnmt1 and the chromomethylase CMT3 are responsible for maintaining CG and CHG methylation, respectively 1,5. While in mammals DNA methylation is extensively lost in the early embryo and even more so in the primordial germlines, such

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extensive DNA demethylation has not been observed in the gametes or the embryo of plants, except in the CHH context 6-8. However, flowering plants have gametes that are embedded within post-meiotic multicellular structures called gametophytes and which contain gamete companion cells that undergo extensive DNA demethylation. Specifically, pollen, which is the male gametophyte, contains a vegetative cell (VC), which is hypomethylated at specific genomic regions compared to the two sperm cells (SCs) that it encapsulates 9,10. On the female side, the ovule includes two synergids, which play important roles for pollen tube attraction, and the central cell (CC), which is globally hypomethylated, in addition to the egg cell (EC) ) 11. In both the VC and CC, DNA demethylation mainly depends on the activity of the DNA glycosylase DEMETER (DME) 9. Loss of DME leads to complete seed abortion when maternally inherited 12, likely as a result of defects in genomic imprinting 13, but direct evidence is lacking. On the paternal side, loss of DME leads to partial sterility, the degree of which varies between genetic backgrounds 14. DNA demethylation in the VC correlates with the reactivation of TEs and the production of small RNAs (sRNAs), which may be transported to the SCs. Based on these observations, it was proposed that demethylation in the VC serves to reinforce silencing of TEs, via sRNAs, in the SCs 9-

11,15-18. However, few TEs are reactivated in the VC 19 and it is unclear how the only partial absence of this reactivation in DME-deficient pollen would cause male sterility. Thus, an important gene regulatory function of active DNA demethylation in the VC has been suggested to determine pollen fertility 14,19. To investigate the role of active DNA demethylation in male fertility, we analyzed pollen defective in DNA demethylase

activity. We extended our analyses to situations where both DME and ROS1, which encodes the main DNA demethylase in somatic tissues 20,21, were mutated in pollen. Our findings indicate that ROS1 acts together with DME in the VC to ensure complete DNA demethylation and proper activation of a small number of key genes that define a novel signaling complex essential for pollen tube function. Results DME and ROS1 act together to ensure male fertility We first measured the transmission rate of the dme mutant allele in crosses with wild-type mothers of the reference strain Columbia (Col-0). Fathers used in these crosses were heterozygous for dme (dme/+, and either wild-type or homozygous for ros1 (the latter designated dme/+;ros1). Consistent with previous observations 14, dme transmission was reduced to 17.4% instead of the 50% expected by Mendelian segregation of a single locus (Fig. 1A). In addition, we found that dme transmission was much further reduced when the dme/+;ros1 double mutant was used as pollen donor (3.2% vs 50%; Fig. 1A), suggesting that ROS1 activity compensates partially the lack of DME. Crosses involving double heterozygous dme/+;ros1/+ fathers confirmed these results, with a reduced transmission of dme to 11.4% when alone and to only 1.4% when combined with ros1, compared to 25% expected under Mendelian segregation in both cases. In contrast, transmission of ros1 alone (i.e. in combination with the DME allele) was not affected (Fig. 1A). Together, these findings indicate that DME and ROS1 have partially redundant functions in male fertility, with DME playing a more prominent role.

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Figure 1

Figure 1. DME and ROS1 act semi-redundantly to promote pollen tube progression. (A) Transmission frequency of the dme and ros1 alleles in crosses between Col-0 wild-type mothers and ros1/+, dme/+, dme/+;ros1/+ and dme+;ros1 pollen donors. Number of tested progeny is given on top and pairwise comparisons of dme transmission rate between the different crosses revealed significant differences (p<0.01; Fisher exact). (B) Fluorescent microscopy of aniline blue stained pistils 24h after crosses of wild-type Col-0 mothers with Col-0, dme/+ and dme/+;ros1 fathers, respectively, revealing pollen tubes in the transmitting tract. Red channel shows autofluorescence of maternal tissues, including the ovules. White arrow indicates aberrant pollen tube trajectory in the mutants. White bar upper panel = 100 μm, lower panel = 20 μm. (C) Transmission frequency of the dme allele in crosses between wild-type Col-0 mother plants and dme/+ as well as dme/+;ros1 fathers with either excess of pollen or excess of ovules (few pollen grains used in the respective cross). Median value is indicated as black line, mean value as a red rhomb together with the number (in red). Number of tested progeny is given and pairwise comparison revealed significant difference (T-test ** = p<0.01; *** p<0.001).

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DME and ROS1 are both required for proper pollen tube orientation To identify the origin of the transmission deficiency of dme, we first examined the possibility of a meiotic defect. To this end we made use of a Fluorescent Tagged Line, FTL_1311, which harbors a transgene encoding pollen-specific fluorescent marker in combination with the quartet (qrt) mutation that allows to verify the integrity of the four haploid cells that result from meiosis 22. This transgene is closely linked (973kb and 1.5 cM) to the DME locus (Fig. S1A) and was first introgressed in the hemizygous state through crosses into the dme/+ and dme/+;ros1 backgrounds. The resulting lines were selected to also carry the qrt mutant allele, and the proportion of fluorescent pollen that should reflect the proportion of DME-WT pollen, was then determined (Fig. S1A,B). The tetrads were intact and had two fluorescent pollen (Fig. S1B), indicating no loss of the dme mutant allele through meiotic drive. In addition, pollen viability was not affected in the single mutant, consistent with previous observations 14, nor in dme/+;ros1 (Fig. S1C). As pollen germination deficiency can only explain part of the dme transmission defect 14, we next investigated if pollen tube elongation is impaired in dme/+ and dme/+;ros1. Were this the case, we would expect less seeds carrying the dme allele in the distal part of the silique, as pollen tubes need to grow further to reach it. However, we did not detect significant differences in dme transmission rates between the upper and the lower part of siliques (Fig. S1D), confirming previous observations for dme single mutants 14 and indicating that pollen tube growth per se is not reduced in dme/+ or dme/+;ros1. As reported previously 12, we also did not observe any post-fertilization defects such as seed abortion in crosses with dme/+ or dme/+;ros1-derived pollen (Fig. S1E). Rather, many pollen tubes followed

aberrant trajectories in the transmitting tract of the pistil in crosses involving mutant fathers (Fig. 1B). Closer examination suggested that dme and dme;ros1 pollen tubes fail to orient properly in the maternal transmitting tract and thus rarely reach ovules before wild-type pollen. To determine if dme pollen is indeed outcompeted by wild-type pollen, we applied limited amount of pollen grains to emasculated flowers, thereby providing an excess of ovules. As predicted, dme transmission was ameliorated under these conditions and increased dramatically from around 2% to over 12% in crossed with dme/+;ros1 fathers (Fig. 1C). However, mutant pollen remains less efficient compared to wild-type pollen at fertilizing ovules, irrespective of the number of ovules fertilized per silique (Fig. S1F). Taken together, these observations suggest that DME and to a lower extent ROS1 are required for the proper journey of the pollen tube to reach the ovule. DME and ROS1 together are responsible for DNA demethylation of the vegetative cell To establish how DNA demethylation carried out by DME and ROS1 may affect pollen tube function, we analyzed the methylome of the VC and SC of wild-type, single and double mutant pollen using whole genome sequencing of bisulfite-converted genomic DNA (WGBS; Table S1). Consistent with previous results 9,10, methylation in wild-type pollen is lower at many CGs in the VC compared to the SC (CG-hypomethylated regions, CG-hypo DMRs), almost identical at CHGs in the two cell types and much reduced at CHHs in the SC (CHH-hyper DMRs in the VC compared to the SC; Fig. 2A; Table S2). Pollen produced from single and double mutant plants exhibited similar CHH hypermethylation in the VC compared to the

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Figure 2

Figure 2. DME and ROS1 are responsible for DNA demethylation of the vegetative cell in pollen. (A) Number of DMRs detected in the comparison between the VC and the SC in pollen of Col-0 (WT), dme/+ and dme/+;ros1. CG-DMRs are indicated in red, CHH-DMRs are shown in green; TEs, genes and intergenic regions indicated by the respective color code. Hyper-DMRs (= higher DNA methylation level in the VC) are shown below the 0-line and hypo-DMRs (= lower DNA methylation level in the VC) are shown above the 0-line. (B) Venn diagram showing the overlap of CG-hypo DMRs detected between the VC and the SC of wild-type, dme/+ and dme/+;ros1. (C) Absolute CG methylation level in SC and VC of CG hypo-DMRs detected between VC and SC in Col-0 wild-type, given for Col-0 (WT), dme/+ and dme/+;ros1.

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SC but few and almost no CG-hypo DMRs, respectively (Fig. 2A,B; Tables S2-8). As pollen from dme/+ and dme/+;ros1 is an equal mix of DME wild-type and dme mutants (Fig. S1C), these results suggest that the DNA methylation changes at CGs caused by the single and double mutants in the VC were strong enough to prevent the detection of the VC vs. SC CG-hypo DMRs. Indeed, VC vs. SC CG-hypo DMRs detected in the wild type had much higher CG methylation in mutant than in the wild-type VCs (Fig. 2C; Table S6-8). However, genes associated with such CG hypermethylation in mutant VC did not reveal any enrichment for specific GO-terms. DME and ROS1 are essential for expression of genes involved in pollen tube function To test if active DNA demethylation affects factors involved in pollen tube function, we carried out a literature search and defined a list of 194 candidate genes (see Table S9). Visual inspection of our methylome data revealed higher DNA methylation for 74 genes in the VC of dme/+;ros1 compared to wild-type (Fig. 3A; Table S9). Moreover, we also detected higher DNA methylation in dme/+ VC for 27 of these genes, which we corroborated for the vast majority using published dme/+ VC methylome data 9 (Fig. 3A; Table S9; Fig. S3). The gain of DNA methylation was most often over promoter regions not methylated in wild-type, except sometimes in SCs, in agreement with the observation of elevated RdDM activity in the male germline in A. thaliana 23 (Fig. 3B; Table S9; Fig. S3, Class I). In a small number of cases, gain of DNA methylation in mutant VCs was over promoter regions which were specifically demethylated in the wild-type VC (Fig. 3B; Table S9; Fig S3, class II). To determine if this gain of DNA methylation over promoter sequences in

mutant VCs was linked to transcriptional down-regulation of the cognate genes, we measured transcript levels by RT-qPCR in wild-type as well as mutant pollen for all 27 genes (Table S9). As dme/+ and dme/+;ros1 mutants carry 50% DME wild-type pollen, we expected to observe at most a 50% reduction in transcript levels compared to Col-0 if promoter hypermethylation leads to full gene repression in mutant VCs. Six genes showed reduced transcript levels in mutant pollen, with repression being more pronounced and almost complete (half of the transcript level detected in wild-type) in the double mutant for three genes (Fig. 3C). These six genes encode signaling components or are associated with receptor-like proteins 24-30, pointing to a role for DME and ROS1 in enabling VC-specific expression of genes involved in pollen tube guidance. A novel pollen tube signaling network, co-regulated by active DNA demethylation To confirm that repression of these six genes in mutant VC is responsible for paternal sterility, we performed functional complementation assays using transgenes containing a pollen-specific promoter that is not targeted by DNA methylation (see Fig. 4A for a schematic description). Two promoters of different strength were chosen so as to adjust as much as possible transgene expression levels in mutant pollen with those of the native genes in wild-type pollen (Table S9). Wild-type and ros1 plants were transformed and for each construct two independent transgenic progeny (T1) were crossed with dme/+ or dme/+;ros1 to obtain single and double mutant T2 progeny, which was then crossed with wild-type mothers to measure paternal transmission of dme in the presence of the transgene (Fig. 4B). Control crosses without the transgene lead, as expected, to low dme transmission (12.8% in case of the dme/+ single mutant and 1.94%

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Figure 3

Figure 3. DME and ROS1 are required for the expression of genes involved in pollen tube function. (A) Venn diagram giving the number and overlap of genes showing ectopic DNA methylation in the respective mutant VCs compared to the wild-type VC. (B) Genome-browser view of two genes implicated in pollen tube guidance (PRK4/AT3G20190 and PLOU/AT2G16030), showing the absolute DNA methylation level for each cytosine context (CG=red, CHG=blue, CHH=green) for five samples (wild-type [Col-WT] seedlings and VC of Col-0 wild-type, ros1, dme/+ and dme/+;ros1). (C) RT-qPCR of genes showing lower expression level in dme and dme/+;ros1 compared to wild-type (Col-0) pollen. For each sample four biological replicates have been used and relative expression level calculated with respect to the reference genes shown on the left. Bars represent mean values with standard error.

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in case of the dme/+;ros1 double mutant; Fig. 4B). Low dme transmission was also obtained when the pFIS2-mCherry transgenic line carrying the same vector backbone as for the DME/ROS1-target transgenes was used as control (12.2% for dme/+ and 2.7% for dme/+;ros1; Fig. 4B). In contrast, re-establishing expression of PRK2, PRK4 or AT2G16030 was sufficient to increase significantly dme transmission in the single and double mutant backgrounds (Fig. 4B). In addition, while forced expression of RKF2 had no detectable effect in dme/+, it lead to a sharp fertility increase in dme/+;ros1, similar to that observed with the other three genes. PRK2 and PRK4 encode Pollen-specific Receptor-like Kinases (PRKs). Whereas PRK2/AT2G07040 regulates the ROP1 signaling pathway for polarized cell expansion 24, PRK4/AT3G20190 is thought to mediate the extracellular signals organizing cytoskeleton orientation in polar pollen tube growth 25. RKF2/AT1G19090 encodes a putative receptor-like serine threonine kinase that interacts with CATION/H+ EXCHANGER10 (CHX10), implied in targeting of pollen tubes to ovules 27,31. Finally, AT2G16030 encodes a putative pollen-specific S-Adenosyl-Methyltransferase (SAMtase) 32,33, which we have named PLOUTOS (PLOU, see Discussion). Remarkably, these four genes show strong pollen-specific co-expression (Fig. S4A) and define a protein interaction network based on publicly available membrane-bound protein-interactome surveys (Fig. S4B) 34,35. Thus, we conclude that DME/ROS1-mediated DNA demethylation plays an essential role in the regulation of key genes necessary for pollen tube progression. Discussion Our results reveal that the activity of the DNA glycosylase ROS1 is not confined to

somatic tissues and that it contributes to the demethylation of the genome in the VC. Moreover, we demonstrate that the concerted action of DME and ROS1 is required for the DNA demethylation and activation of genes involved in pollen tube function, thus providing a molecular explanation for the male sterility phenotypes observed in dme and dme;ros1 mutants. It has been reported that the pollen sterility in dme mutants is more pronounced in Col-0 background than in the strain Ler 12,14. It is noteworthy that the ROS1-dependent DNA demethylation varies between strains in vegetative tissues 36, and moreover, that DNA methylation level in the VC is higher in Col-0 compared to Ler 37. This is mainly due to differences in CHH methylation, which relies to a large extent on RdDM activity 38. As RdDM is especially "aggressive" in male sex cells, targeting numerous genes 23, demethylase activity may be more critical in Col-0 than Ler to counterbalance the potential silencing of genes required for pollen function. Moreover, genes with strain-independent dense, TE-like DNA methylation tend to be silenced during vegetative growth and expressed specifically in pollen and seeds, presumably as a result of active DNA demethylation in the respective gametophytes (39,40). Remarkably, three of the genes that are required for male fertility (AT2G16030/PLOU, PRK2, RKF2) show dense TE-like DNA methylation outside the VC (Figure 3, S3), and are specifically activated in pollen (Figure S4A). Therefore, whether the demethylation of TEs during reproduction is a side-effect of a gene regulatory role or vice versa needs to be determined. Among the four pollen-specific genes regulated by DME and ROS1, AT2G16030/PLOU was previously uncharacterized. However, its protein product is thought to interact with MALE

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Figure 4

Figure 4. DME/ROS1 target genes are required for male fertility. (A) Strategy to functionally validate the role of DME/ROS1 target genes for pollen tube function. In the wild-type DME/ROS1 target genes become demethylated in the VC, a prerequisite for proper gene activation. In dme mutant VC the demethylation is absent and hence prevents gene expression of the underlying gene. By introducing DME/ROS1 target genes under the control of a DNA methylation-independent, pollen specific promoter, the gene activity is restored in dme VC and should, at least partially, rescue the male dme transmission defect. (B) Box plot showing male dme mutant allele transmission frequency of crosses with wild-type (Col-0) mothers with dme/+ (left graph) and dme/+;ros1 (right graph) fathers, carrying transgenes to express DME/ROS1 targets independently of DNA methylation in pollen. Transgenes are indicated below the X-axis, together with the number of descendants of the respective crosses. pFIS2:RFP is a negative control, containing a FIS2 promoter expressing a reporter gene in the same vector backbone as the other constructs. Black lines in the boxes indicate the median level, red dots the mean level with numbers given in red. Grey dots represent dme transmission frequencies of individual crosses (single siliques in the case of dme/+ or 1-4 siliques in the case of dme/+;ros1) for each cross. Pairwise comparison with the dme-only crosses revealed significantly elevated dme transmission in the case of AT2G16030, PRK4 and PRK2 in the dme/+ and dme/+;ros1 mutant background and RKF2 in the dme/+;ros1 background (stars indicate statistical significance in pairwise comparison with control crosses without transgene - *** p<0.001; * p<0.05; T-test).

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DISCOVERER 2 (MDIS2), a receptor-like kinase involved in pollen tube guidance 29,30 and because dme mutant pollen tube appear to be blind to maternal signaling, we chose to name this gene PLOUTOS (PLOU), after the Greek god of wealth, son of Demeter, who was blinded by Zeus 41. Pollen tube progression is governed by multiple molecular interactions with female tissues, through preovular (sporophytic) and ovular (gametophytic) signaling 42-44 and it has been hypothesized that DNA demethylation is required for the ovule-specific expression of genes encoding cysteine-rich peptides (CRPs) that could act as pollen tube attractants 40. Thus, it is tempting to speculate that active DNA demethylation has been co-opted in the male and female reproductive organs to enable the expression of genes underpinning parental communication and reproductive success. Acknowledgements We would like to thank members of the Colot lab for helpful discussions and critical reading of the manuscript. Gregory Copenhaver is kindly acknowledged for providing the FTL1311 line. Funding This work was supported in part by the European Union Seventh Framework Program Network of Excellence EpiGeneSys (HEALTH-F4-2010-257082) and the Investissements d’Avenir ANR-10-LABX-54 MEMOLIFE, ANR-11-IDEX-0001-02 PSL*Research University (both to Vincent Colot). Souraya Khouider was supported by supported by a PhD studentship from PSL University, with additional funding provided by MEMOLIFE. Research in the Martienssen laboratory is supported by the US National Institutes of Health (NIH) grant R01 GM067014, and by the Howard Hughes Medical Institute. The authors acknowledge

assistance from the Cold Spring Harbor Laboratory Shared Resources, which are funded in part by the Cancer Center Support Grant (5PP30CA045508). Further financial support includes a European Research Council Starting Independent Researcher Grant (210867-2) to AS. Author contributions D.B. and S.K. designed the study. S.K., F.B., A.U., C.L. and D.B. performed experiments, and D.B., S.K. as well as F.B. analyzed the data. All authors contributed with ideas and discussion. S.K., D.B. and V.C. prepared the manuscript. Supplemental Information Material and Methods Plant material and growth conditions Mutant alleles dme-6 (GK-252E03-014577) and ros1-3 (WiscDsLox469C11) used in this study have been described previously(1, 2). Seeds where surface-sterilized and sowed on 1/2 MS plates containing sulfadiazin in case of dme-6/+ mutant lines or plates without antibiotic selection under sterile conditions. After few days of 4°C stratification the plates where transferred to 22.5°C/16h light - 17°C/8h dark growth conditions for 10-15 days before transfer to soil under the same growth conditions with 75% humidity control. Quantification of dme transmission rate Pre-emasculated WT flowers were pollinated with pollen from either dme/+, ros1/+ or dme/+;ros1 mutants. As the T-DNA insertion responsible for the dme mutation confer resistance to sulfadiazine, mature seeds derived from these crosses were sterilized and sowed on ½ MS medium containing sulfadiazine, for selection of the dme-allele containing plants. The ros1 mutant allele segregation was measured by

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genotyping (s. Table S20 for primer information). When only few pollen grains were applied to the pistil in order to test the competition between DME-WT and dme-mutant pollen, only siliques with less than 30 seeds were taken into account (each silique in Col-0 contains around 60 ovules on average). In vivo pollen tube visualization Pistils from 24h fertilized flowers were fixed for 2 hours in acetic acid/EtOH (1:3) solution, under vacuum at room temperature. Then, pistil was washed with successive bath of 70%EtOH, 50%EtOH, 30%EtOH and distilled water. Pistil were then put into 8M NaOH overnight, and washed 3 times with distilled water. Staining were then performed by incubate pollinated pistils in Methyl-Blue solution (0.2mg/mL methyl blue in 100 mM KH2PO4, pH11), 2 hours, under dark condition at room temperature. Pistils were transferred on microscopic slide in 50% glycerol, and observed under UV light. Microscopy acquisition were performed on a Zeiss Axioskop 2 plus microscope and images were treated using ImageJ. Pollen viability assay Alexander’s staining were performed to assess pollen viability. Stamen containing mature pollen were treated with few microliter of Alexander solution and observed under light microscope. Pollen isolation and RT-qPCR analysis We used a protocol after (3), published on BioProtocols site: RNA Isolation from Arabidopsis Pollen Grains. Bio-101: e67. DOI: 10.21769/BioProtoc.67. Mature flower were collected and put into 150mL of cold mannitol (0.3M) for quadruplicates of Col-0, ros1, dme/+ and dme/+;ros1, each. After 2 minutes of agitation by thorough shaking, the solution was filtered using a 100µm

nylon mesh. Isolated pollen was collected after 5 minutes centrifugation (3500g at 4°C) and the material was homogenized with metallic beads using a Qiagen tissue-lyser (2x30Hz) to perform total RNA extraction using a Qiagen RNeasy Mini Kit, following the manufacturer's instruction and RNA integrity was verified on gel after spectrometric quantification. cDNA synthesis was carried out with 10μg of RNA for all samples using the Invitrogen Superscript IV Reverse Transcriptase kit, following the manufacturer's instructions. qPCR was done employing a Roche Lightcycler 480 with technical duplicates for each sample and primers were tested for specificity and >90% efficiency beforehand. Cell sorting of VC and SC Pollen nuclei of wild-type (Col-0) and mutant dme/+, ros1 and dme/+,ros1 plants were purified by FACS using SYBR Green staining as previously described (4, 5). Briefly, open flowers were collected into a 50 ml falcon tubes, and vortexed in 10 ml of Galbraith buffer (45 mM MgCl2, 30 mM Sodium Citrate, 20 mM MOPS, 1% Triton-100, pH to 7.0) for 3 minutes, at room temperature. This crude fraction was then filtered through Miracloth (Calbiochem) and centrifuged for 1 minute at 2600 g to concentrate the pollen fraction. The pollen was then transferred to a 1.5 ml eppendorf tube containing approximately 100 μl of acid-washed glass beads (425–600 μm, Sigma), and vortexed continuously at maximum speed for 3 minutes in order to break the pollen cell wall. The fraction containing the released nuclei was then filtered through a 10μm mesh (Celltrics, Sysmex-Partec) to exclude pollen debris, and stained with SYBR Green dye (Lonza). FACS was performed using a FACSAria IIU cell sorter (BD Biosciences), with 70µ nozzle at 70psi. A 488-nm laser was used for SYBR Green excitation, which was detected by a 530/30 nm band-pass filter. Approximately 500,000 nuclei from each cell type were purified, and genomic DNA was extracted using the Masterpure kit (Epicenter).

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Whole genome bisulfite sequencing and DMR calling Genomic DNA was fragmented by Covaris to approximately 300bp, and fragments were end-repaired, A-tailed, and ligated to methylated Illumina adaptors (Bioo Scientific). Ligated fragments were bisulfite treated with the EZ DNA Methylation-Gold Kit (Zymo) and PCR-enriched with KAPA high-fidelity Uracil+ polymerase (Roche). Reads were preprocessed with Trimmomatic(6) to remove adaptors, and Bismark(7) was used to map filtered reads to the Arabidopsis TAIR10 genome reference, in order to calculate methylation at each individual cytosine. DMRs were then defined as 100-bp bins containing at least 4, 6 or 8 differentially methylated mCGs, mCHGs or mCHHs, respectively, and with an absolute methylation difference of 0.35. DMRs localizing within 200 bp of each other were merged. A summary of all genome-wide bisulfite sequencing data generated in this study is presented in Table S1 and is accessible through the NCBI’s Gene Expression Omnibus (GSE141154). Plasmid Construction and Plant Transformation Functional complementation assay was performed by using the Multisite Gateway Technology (Invitrogen). Promoters were PCR-amplified from genomic DNA and insert into the pENTR5'-TOPO vector using the pENTR5′-TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen). CDS of candidate genes were amplify by PCR on cDNA extracted from mature pollen, using forward and reverse primers containing attB1 and attB2 sites respectively (Table S10). BP reaction was used to insert amplified CDS into the pDONR207 vector. We used LR reaction to clone the ANX2 (AT5G28680) promoter region in combination with the CDS of PRK2, PRK4 and RALFL15 as well as the regulatory sequence of Raba4D

(AT3G12160) in front of RKF2, TRX5 and PLOU (AT2G16030) into the pDestination vector pB7m24GW3. Transformation of Agrobacterium tumefaciens (strain GV3101) were then performed by incubation with 1 µg of the produced vector (5 minutes on ice), followed by 5 minutes freezing in liquid nitrogen. After 1 minute recovery at 37°C, 1mL of LB were added for a 2 hours’ incubation at 28°C (with shaking), then plate on LB containing gentamycin (25µg/mL), rifampicin (50µg/mL) and spectinomycine, and incubated 48h at 28°C. Arabidopsis thaliana plants were transformed by dipping in Agrobacterium tumefaciens solution. Accession Numbers WGBS data have been deposited at NCBI’s Gene Expression Omnibus (GSE141154). Sequence data from this article can be found in the Arabidopsis Genome Initiative or GenBank/EMBL databases under accession numbers AT1G45145 (TRX5); AT1G19090 (RKF2); AT2G07040 (PRK2); AT2G16030 (PLOU); AT2G22055 (RALFL15); AT2G36490 (ROS1); AT3G20190 (PRK4); AT5G04560 (DME). Additional Files Table_S1_WGBS_General_data. Excel file containing information concerning the whole genome bisulfite sequencing samples generated in this study. Table_S2_DMRs_SC_vs_VC_Col. Excel file containing all DMRs detected between SC and VC of wild-type Col-0 pollen for all sequence contexts, indicating its genomic position and overlap with annotation (gene or TE). Table_S3_DMRs_SC_vs_VC_ros1. Excel file containing all DMRs in all sequence contexts detected between SC and VC of ros1-3 pollen for all sequence contexts,

49

indicating its genomic position and overlap with annotation (gene or TE). Table_S4_DMRs_SC_vs_VC_dme. Excel file containing all DMRs in all sequence contexts detected between SC and VC of dme-6/+ - derived pollen for all sequence contexts, indicating its genomic position and overlap with annotation (gene or TE). Table_S5_DMRs_SC_vs_VC_dme-ros1. Excel file containing all DMRs in all sequence contexts detected between SC and VC of dme-6/+;ros1 - derived pollen for all sequence contexts, indicating its genomic position and overlap with annotation (gene or TE). Table_S6_DMRs_VC_Col_vs_ros1. Excel file containing all DMRs in all sequence contexts detected between VC of Col-0 wild-type and ros1-3 - derived pollen for all sequence contexts, indicating its genomic position and overlap with annotation (gene or TE). Table_S7_DMRs_VC_Col_vs_dme. Excel file containing all DMRs in all sequence contexts detected between VC of Col-0

wild-type and dme-6/+ - derived pollen for all sequence contexts, indicating its genomic position and overlap with annotation (gene or TE). Table_S8_DMRs_VC_Col_vs_dme-ros1. Excel file containing all DMRs in all sequence contexts detected between VC of Col-0 wild-type and dme-6/+;ros1-3 - derived pollen for all sequence contexts, indicating its genomic position and overlap with annotation (gene or TE). Table_S9_Pollen-genes_RTqPCR. Excel file with genes directly or potentially implicated in pollen function and their references as well as DMR detection in the comparison between wild-type Col-0 and mutant VCs. RNA-seq data from pollen and seedling are indicated14. In the second part qRT-PCR data are shown. Table_S10_Primer-sequences. Excel file containing all Primer sequences used in this study for (1) genotyping; (2) qRT-PCR; (3) construction-cloning.

50

Supplementary Figures Figure S1

51

Figure S1. DME/ROS1-activity in pollen is specifically required for pollen tube progression. (A) Schematic representation of the DME locus and FTL1311 fluorescent marker4 position on chromosome 5 (left) and fluorescent images of F2 lines segregating after crosses with dme or dme/+;ros1. Pictures show pollen tetrads instead of free floating pollen grains due to the qrt mutant background, leaving the haploid tetrad after meiosis attached together4. (B) Quantification of fluorescent/non-fluorescent pollen grains in the progeny of the parental FTL1311 line and the dme and dme;ros1-containing F2s. All F2 selected for dme showed fluorescence in approximately half the pollen grains, indicating physical coupling and absence of meiotic distortion. (C) Percentage of positively stained pollen grains after Alexander staining, used to measure pollen viability; number of counted pollen indicated below the bars. (D) Comparison of dme mutant allele transmission frequency in seeds in the top or the bottom half of dme/+ and dme/+;ros1-pollinated siliques. Median value is indicated by a black line and the mean by a red rhomb together with the value in %. The number of individuals in the progeny is given below the bars and pairwise comparison did not reveal significant differences. (E) Example of siliques containing seeds after crosses with either Col-0 wild-type, dme/+ or dme/+;ros1. (F) Correlation of seed set and dme transmission rate in crosses with either pollen excess (red dots) or ovule excess (blue dots). In the case of ovule excess there is no difference in seed set between crosses showing high or low dme transmission rates (blue line), whereas there is a slight positive correlation between seed set and dme transmission rates in crosses with pollen excess (red line).

52

Figure S3

53

Figure S3. DNA demethylation in the vegetative cell in the upstream region of gene implicated in pollen tube function. Genome-browser views showing absolute DNA methylation levels for all three contexts (as in Fig. 3A) of genes involved in pollen tube function with elevated DNA methylation in dme/+;ros1 compared to wild-type VC. Beside the VCs samples the DNA methylation of wild-type seedlings and SC as well as the SC of dme/+;ros1 and the VC of published dme/+ mutant VC6 is shown [dme/+ (2)].

54

Figure S4

Figure S4. Interaction network of DME-ROS1 targets. (A) Relative gene expression pattern for 4 DME/ROS1 target genes implicated in pollen tube function using the Expression Angler online tool (http://bar.utoronto.ca/ExpressionAngler). (B) Protein-protein interaction of 5 DME/ROS1 target genes (PLOU, PRK2, PRK4 and RKF2; big nodes) with color-coded relative expression level in mature pollen. Only published interactions are shown, based on the implemented data base of the Arabidopsis Interactions Viewer site (http://bar.utoronto.ca/interactions/cgi-bin/arabidopsis_interactions_viewer.cgi). Bold grey node-connecting lines indicate experimentally validated interactions. DME/ROS1 targets (big nodes) are labeled as well as putative membrane-bound signaling components bridging DME/ROS1 targets with each other.

55

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58

2. Influence maternelle sur la fertilité des mutants de déméthylation dme/+ et dme/+;ros1

Lors du croisement entre dme/+;ros1 et une femelle sauvage, la transmission de l’allèle dme paternel

est plus réduite que lors de l’autofécondation d’une plante dme/+;ros1 (données non montrées). Les

plantes doubles mutantes produisent 50% d’ovules dme;ros1, qui avortent tôt après fécondation, et

50% d’ovules DME-WT;ros1, qui produisent la prochaine génération. Ainsi, lors de l’autofécondation

d’une plante dme/+;ros1, la transmission de l’allèle paternel dme repose sur la fécondation d’un pollen

double mutant et d’un ovule ros1. Dans ces conditions, la transmission élevée de l’allèle paternel dme

comparé aux croisements avec une femelle sauvage, nous conduit à proposer que l’état de

méthylation de l’ADN du génome maternel – ici induit par le mutant ros1 - pourrait influencer la

fertilité des mâles mutants dme/+ et dme/+;ros1.

Pour tester cette hypothèse, les mutants dme/+ et dme/+;ros1 ont été croisés avec des femelles

mutantes des différentes voies de la méthylation de l’ADN, puis le taux de transmission de l’allèle

paternel dme a été mesuré. Cela permet de déterminer l’impact du côté femelle sur la fertilité des

mâles mutants lors de ces croisements (Figure 11. A et B). Les femelles utilisées sont mutées au niveau

de gènes impliqués aussi bien dans la maintenance de la méthylation de l’ADN (met1, ddm1, cmt2,

cmt3), que dans la machinerie du RdDM (ago4, nrpd4, rdr6, drm1-2) ou la déméthylation active de

l’ADN (ros1). On observe que le taux de transmission de dme des mâles simples mutants reste stable

indépendamment de la femelle utilisée pour les croisements - compris entre 15,6% et 18,2% -, excepté

pour les femelles rdr6 qui permettent d’augmenter significativement la transmission de dme de 17,5%

avec une femelle sauvage Col-0 à 26,7% avec une mutante rdr6 (Figure 11.A). Néanmoins, on remarque

une importante réduction du nombre de graines par silique lors de ces croisements (Figure Annexe 1),

indiquant que le résultat obtenu avec les femelles rdr6 pourrait être dû à un effet délétère de la

mutation sur le gamétophyte femelle (voir discussion). Ainsi, il semble difficile de conclure à un effet

maternel sur la fertilité du mâle simple mutant dme/+.

Pour les croisements avec les mâles doubles mutants dme/+;ros1, la transmission de dme augmente

significativement lors des croisements avec les femelles cmt2, nrpd4, cmt3, ros1 et met1.

Respectivement 2,9% ; 3,2% ; 3,7% ; 4,0% ; 5,1%, contre 1,9% avec une femelle sauvage Col-0 (Figure

11.B). Ces résultats démontrent l’influence du côté maternel sur la fertilité paternelle des mutants de

déméthylation de l’ADN, et suggère que l’état de méthylation des femelles mutantes pourrait être

impliqué dans le phénomène observé. Néanmoins, contrairement aux effets des différents mutants

maternels sur le mâle dme/+;ros1, la fertilité du simple mutant n’est influencé que par les femelles

rdr6. Ainsi, il est possible que les effets maternels observés chez le simple et le double mutant reposent

Influence maternelle sur la fertilité des mutants de déméthylation

59

Figure 12 : Effet maternel sur la fertilité paternelle des mutants de déméthylation dme/+ (A) et dme/+;ros1 (B et C). Quantification du taux de transmission de l’allèle paternel dme (%) en fonction de l’origine des femelles. (** p>0.001; * p>0.05, Fisher exact)

Résultats

60

sur des mécanismes distincts, notamment sur un effet indirect de la mutation rdr6 sur les femelles

mutantes (voir discussion).

Pour explorer l’impact de la variabilité (épi)génétique naturelle des femelles sur la fertilité du mutant

dme/+;ros1, des plantes issues de différentes accessions ont été utilisées lors de croisements avec des

mâles doubles mutants dme/+;ros1 (Figure 11.C). Les pourcentages de transmissions de dme obtenus

avec des femelles issues de 30 accessions différentes ont été comparés avec ceux des croisements

avec des femelles sauvages Col-0, l’accession du double mutant dme/+;ros1. On observe une

importante variabilité du taux de transmission de dme en fonction de l’accession maternelle utilisée.

Sur les 30 accessions testées, deux diminuent, tandis que onze augmentent la transmission paternelle

de dme de manière statistiquement significative. Ces résultats démontrent que la variabilité naturelle

des accessions maternelles influence la fertilité du mâle double mutant dme/+;ros1.

Pris ensemble, ces résultats confirment que la communication moléculaire qui s’établit entre les

structures mâle et femelle lors de la reproduction est perturbée chez les mutants de déméthylation

de l’ADN, et suggèrent une régulation (épi)génétique des facteurs maternels impliqués dans cette

interaction parentale.

61

TROISIÈME PARTIE

DISCUSSION GÉNÉRALE

62

Discussion générale

1. L’activité de DME et ROS1 conduit au remodelage des profils de méthylation de l’ADN dans le pollen

Ce projet de thèse a permis de démontrer que la déméthylation active de l’ADN médiée par des ADN

glycosylases conduit à une importante modification des profils de méthylation de l’ADN dans la cellule

végétative du pollen. L’étude des mutants de déméthylation de l’ADN confirme l’importance de DME

et ROS1 dans l’établissement de la déméthylation des petits TEs euchromatiques dans la cellule

végétative. Cette méthylation de l'ADN différentielle entre la cellule végétative du pollen et les cellules

spermatiques, est fortement réduite dans le mutant dme/+, et presque complètement perdue dans le

double mutant dme/+;ros1. Cependant, de façon inattendue, on observe dans le double mutant un

nombre important de DMRs hypométhylées dans le contexte CHH, principalement au niveau de longs

TEs hétérochromatiques de la super famille gypsy. Cette hypométhylation propose que l’activité de

DME et ROS1 est requise pour permettre l’établissement de la méthylation de l’ADN des éléments

gypsy dans la cellule végétative du pollen.

En dépit de l’absence de phénotype gamétophytique du mutant ros1, nos résultats mettent en

évidence l’action synergique de DME et ROS1 dans la cellule végétative du pollen. Ainsi, ces deux ADN

glycosylases permettent de réguler la dynamique de méthylation de l’ADN et établissent les profils de

méthylation observés dans le pollen, révélant ainsi la fonction gamétophytique de ROS1.

2. Régulation par la méthylation de l’ADN de facteurs impliqués

dans la fonction du pollen Cette étude permet de démontrer l’existence d’une régulation des gènes impliqués dans le contrôle

de la progression du tube pollinique à travers les tissus maternels par la méthylation de l’ADN. La

dérégulation transcriptionnelle de ces gènes dans les mutants de déméthylation de l’ADN perturbe le

processus de fécondation et induit une importante baisse de la fertilité paternelle. Le sauvetage partiel

du phénotype de ces mutants, induite par la complémentation monogénique de PRK2, PRK4 et PLOU

(AT2G16030) démontre l’importance fonctionnelle de l’activation de ces gènes par DME et ROS1 dans

le pollen.

Bien que nous ne puissions pas exclure la possibilité que d’autres gènes soient impliqués dans le

phénotype mutant observé, il est probable que la complémentation multigénique des cibles de


63

DME/ROS1 identifiées permette de restaurer encore plus efficacement la fertilité paternelle des

mutants de déméthylation dme/+ et dme/+;ros1. Ainsi, des combinaisons de plusieurs des six gènes

cibles sont en cours d’établissement par croisement, et permettront de mesurer l’impact du

rétablissement du complexe protéique putatif sur la fertilité des mutants de déméthylation.

Les résultats obtenus nous ont également permis de mettre en évidence l’importance du gène

AT2G16030 (PLOU) pour la fertilité paternelle. PLOU code une S-adénosylméthionine

méthyltransférase putative, et interagit avec PRK2 et MDIS2. PRK2 est impliqué dans le contrôle de la

croissance polarisée du tube pollinique et il a été proposé que MDIS2 prenne part au guidage ovulaire

du tube pollinique par liaison avec des peptides maternels encore inconnus (Chang et al. 2013 ; Wang

et al. 2016). Ainsi, l’interaction entre ces trois protéines suggère que PLOU est probablement impliqué

dans le contrôle de la croissance et la progression du tube pollinique à travers les tissus maternels.

Sur les six gènes cibles de DME/ROS1 identifiés dans cette étude, cinq semblent être impliqués dans la

formation d’un complexe protéique, nous permettant de proposer l’existence d’une nouvelle voie de

signalisation impliquée dans le contrôle de la croissance du tube pollinique et co-régulée par la

méthylation de l’ADN. La caractérisation moléculaire de ces protéines permettra d’établir la fonction

précise de ce complexe dans les voies de guidage du tube pollinique.

3. Impact de DME et ROS1 sur la régulation de l’expression des gènes

Les résultats obtenus pendant ma thèse démontrent que l’expression tissus-spécifique de gènes

impliqués dans la fonction du pollen est régulée par le déméthylation active de l’ADN médiée par DME

et ROS1. Néanmoins, les mécanismes conduisant au ciblage spécifique de ces gènes par les ADN

glycosylases restent méconnus.

En 2013, Schmitz et al. décrit l’existence de nombreux gènes cibles du RdDM évolutivement conservés,

transcriptionnellement réactivés dans le pollen, et souvent associés avec la présence de TEs à

proximité. Les profils de méthylation de ces gènes sont conservés entre les différentes accessions

naturelles chez Arabidopsis thaliana, et leur activité est principalement associée à des mécanismes de

régulation impliquées dans la fonction du pollen (Schmitz et al. 2013). De plus, les travaux de You et

al. ont permis d’identifier des gènes qui présentent, dans les tissus sporophytiques, un profil de

méthylation TE-like dépendant de l’action de la machinerie RdDM. Cette méthylation atypique des

gènes, - le plus souvent associé à une répression transcriptionnelle - est caractéristique des profils de

méthylation de l’ADN observés au niveau des TEs. You et al. démontrent également que ces gènes

appartiennent à la famille des CRPs (Cystein-rich peptides), sont réactivés dans les synergides et codent

des peptides impliqués dans la fonction de l’ovule, telle que l’attraction du tube pollinique. Si cette


64

étude ne conclut pas sur les mécanismes permettant l’expression de ces gènes dans le gamétophyte

femelle, elle suggère néanmoins un rôle des ADN glycosylases dans la déméthylation de ces locus (You

et al. 2012). Ces résultats proposent que des gènes maternels impliqués dans le guidage du tube

pollinique tel que les CRPs, pourraient être considérés comme des TEs par la machinerie de

méthylation de l’ADN.

Les données obtenues pendant ma thèse viennent démontrer que la déméthylation active de l’ADN

joue un rôle décisif dans la réactivation de six gènes, dont quatre possèdent un TE annoté en 5’ de leur

TSS, et trois présentent un profil de méthylation de l’ADN TE-like. Ainsi, l’état méthylé de ces gènes

dans le sporophyte corrèle avec leur répression pendant la phase végétative, et en conséquence,

l’activité déméthylase de DME et ROS1 est essentielle pour permettre leur réactivation

transcriptionnelle dans le pollen. L’expression spécifique de ces gènes dans le pollen semble être

contrôlée par des mécanismes impliqués dans le ciblage des séquences répétitives.

Il est également probable que l’expression spécifique des CRPs dans le gamétophyte femelle, soit sous

contrôle de l’activité de DME/ROS1, et dépendante de profils de méthylation TE-like et/ou de la

présence de TEs dans le voisinage de ces gènes, renforçant l’idée selon laquelle dans les gamétophytes

mâle et femelle, ces gènes pourraient être reconnus comme des TEs par la machinerie de méthylation

de l’ADN.

L’étude du transcriptome des mutants de déméthylation dme/+ et dme/+;ros1, permettra de

déterminer s’il existe une corrélation entre, d’une part, la présence de TEs aux abords des gènes et/ou

les profils de méthylation TE-like de ces facteurs, et d’autre part, et leur réactivation transcriptionnelle

dépendante de DME/ROS1 dans le pollen.

Les mécanismes moléculaires impliqués dans la reconnaissance mâle-femelle lors du processus de

reproduction, partagent de nombreuses caractéristiques communes avec la reconnaissance hôte-

pathogène responsable du déclenchement de la réponse immunitaire (Sanabria et al. 2008 ;

Dresselhaus and Márton. 2009). En 2017, Mondragón-Palomino et al. démontrent que ces similitudes

reposent principalement sur l’expression spécifique de nombreux gènes, appartenant notamment aux

familles des CRPs et des RLKs (Mondragón-Palomino et al. 2017). Le trade-off entre croissance et

défense est largement impliqué dans la régulation de la fitness chez les plantes, et les effets délétères

en cas d’expression constitutive de certains facteurs impliqués dans la réponse immunitaire révèle

l’importance d’une fine régulation de leur expression (revu dans Huot et al. 2014). Parmi les six gènes

cibles de DME/ROS1 identifiés pendant ma thèse, on remarque que cinq d’entre eux semblent être

exclusivement exprimés dans le pollen (Arabidopsis eFP browser, Winter et al.2007). TRX5, le seul

exprimé pendant la phase sporophytique, a été décrit pour sa fonction essentielle dans la réponse

immunitaire (Kneeshaw et al. 2014). En considérant l’existence des nombreuses similarités entre le

processus de reproduction et la défense immunitaire, il est envisageable que l’expression constitutive


65

de ces gènes pendant le développement du sporophyte soit délétère pour la croissance végétative de

la plante. Ainsi, en régulant la spécificité d’expression de ces gènes, la méthylation de l’ADN pourrait

être impliquée dans la répression de ces gènes vis-à-vis du trade-off entre défense et croissance, et

dans la régulation de ces gènes pendant la reproduction.

Le mutant dme/+ utilisé dans cette étude est établi dans l’écotype Columbia (Col-0). Nos résultats

démontrent que dans cette accession, l’absence de DME induit un défaut de guidage de tube

pollinique qui conduit à une importante baisse de la fertilité paternelle. Bien que DME s’exprime dans

la cellule végétative des pollens de l’accession Lansberg erecta (Ler), la fertilité du mâle est moins

affectée lorsque le mutant dme/+ est établi dans ce fond génétique (Schoft et al. 2011 ; Khouider et

al. unpublished), suggérant que l’impact de DME sur la régulation de l’expression des gènes diffère

selon les accessions. L’étude comparative des gènes cible de DME/ROS1 dans ces deux écotypes,

permettra de mesurer l’impact de la déméthylation active de l’ADN sur l’expression de gènes dans le

pollen en fonction des différentes accessions, et d’améliorer notre compréhension de l’évolution des

mécanismes impliqués dans le ciblage spécifique de ces locus par DME et ROS1.

4. La déméthylation active de l’ADN régule la communication parentale lors de la reproduction

Nos recherches mettent en lumière l’influence du côté maternel sur la fertilité paternelle des mutants

dme/+ et dme/+;ros1. Ces résultats renforcent l’idée que le défaut de guidage du tube pollinique

observé chez les mutants de déméthylation de l’ADN repose sur la perturbation de la communication

moléculaire qui s’établit entre les structures parentales lors de la reproduction. Cette interaction

dépend de l’expression de facteurs spécifiques aussi bien du côté mâle que du côté femelle.

L’amélioration de la fertilité du mâle dme/+;ros1 par des femelles mutantes dans les différentes voies

de méthylation de l’ADN suggère que les facteurs maternels impliqués dans la communication

parentale qui s’établit lors de la reproduction, sont sous contrôle des différentes voies de méthylation

de l’ADN. Sachant que l’expression de ROS1 est réduite dans le mutant met1 (Mathieu et al. 2007), on

peut penser que l’effet observé avec les femelles met1 soit indirectement lié à la diminution de ROS1

dans ce mutant. Néanmoins, cette éventualité ne semble pas pouvoir expliquer cet effet puisque ROS1

est également réprimé dans les mutants drm1-2 et ago4 (Williams et al. 2015), pour lesquels aucune

amélioration de la fertilité paternelle n’est observée. Aux vus des résultats obtenus, il est probable que

différents facteurs maternels impliqués dans le guidage du tube pollinique soient régulés par la

méthylation de l’ADN. L’utilisation de femelles en combinaison de plusieurs mutations des différentes

voies de méthylation de l’ADN lors des croisements avec des mâles dme/+ ;ros1, permettra de mieux

distinguer les redondances ou indépendances des mécanismes par lesquels la méthylation de l’ADN


66

régule l’expression de facteurs maternels, essentiels au fonctionnement de la reproduction.

On remarque cependant que seules les femelles rdr6 permettent d’améliorer la fertilité du mâle simple

mutant dme/+. Cette observation repose probablement sur l’effet délétère de la mutation rdr6 sur

l’ovule, puisqu’il a été démontré que rdr6 induit un renforcement de l’auto-incompatibilité, et que

l’altération de l’architecture des tissus maternels conduit à la réduction du nombre de graines

produites (Peragine et al. 2004 ; Tantikanjana et al. 2009). Cet effet de rdr6 concorde avec nos

observations, puisque lors des croisements avec un mâle simple mutant dme/+, on remarque une

importante réduction du nombre de graines par silique (Figure Annexe 1). Ainsi, contrairement à

l’amélioration de la fertilité paternelle observée pour le double mutant de déméthylation, il semble

difficile de conclure à un effet maternel sur la fertilité du simple mutant dme/+.

Lorsque des femelles sauvages issues de différentes accessions sont croisées avec des mâles doubles

mutants dme/+;ros1, certains écotypes améliorent la fertilité du mutant tandis que d’autres la

diminuent. Cependant le taux de transmission de l’allèle paternel dme obtenu avec les femelles Col-0

- même fond génétique que le double mutant - est intermédiaire. Ainsi, il est possible que la

perturbation des profils de méthylation de l’ADN observés dans le mutant dme/+;ros1 puisse favoriser

la fécondation croisée entre certaines accessions au détriment de l’autofécondation.

En 2015, Huang et al. recherchent la présence de CRPs enrichis dans l’ovule (par analyse

transcriptomique). Ils révèlent que sur les 390 gènes spécifiques du gamétophyte femelle, 53% codent

pour des CRPs. Ce fort enrichissement des CRPs dans le gamétophyte femelle, corrobore avec leur

fonction essentielle pendant la phase reproductive. Ces CRPs semblent être impliqués dans les

différentes étapes de la reproduction (gamétogénèse, guidage tube pollinique, développement

précoce de la graine), et 142 sont susceptibles d’être impliqués dans la communication mâle-femelle

qui régule le guidage du tube pollinique (Huang et al. 2015). A la lumière de cette étude, le faible

nombre de CRPs caractérisées à ce jour pour leurs rôles dans la reproduction suggère fortement que

la fonction de nombreux peptides maternels reste à élucider.

Les peptides maternels d’une même famille sont capables de se lier à différents récepteurs présents

sur la surface du tube pollinique (e.g. LURE1 se lie aux récepteurs MDIS1-MIK1/2, et PRK6), mettant

en évidence un grand nombre de combinaisons d’interactions récepteurs-ligands possible lors du

voyage du tube pollinique jusqu’à l’ovule (Takeuchi et al. 2016 ; Wang et al. 2016).

On remarque également que les peptides maternels LUREs présentent une importante variabilité de

leurs séquences codantes dans les différentes accessions d’Arabidopsis thaliana, qui prédisent pour

certaines, l’apparition d’un codon stop prématuré (Takeuchi et al. 2012).

De plus, Ge et al. démontrent l’existence d’une compétition de différents peptides RALFs - RALF4/9 et

RALF34 - pour la liaison aux récepteurs du tube pollinique ANX1,2/BUPS1,2, qui dépend de leurs

affinités respectives pour les récepteurs, et donc de la concentration des peptides aux abords du tube


67

pollinique (Ge et al. 2017).

Ces nombreux exemples illustrent la complexité et la diversité des combinaisons récepteurs-ligands

possibles impliquées dans la régulation des voies de signalisations qui contrôlent la croissance du tube

pollinique. Ainsi, l’influence des accessions maternelles sur la fertilité du double mutant dme/+;ros1

pourrait reposer sur de nombreux facteurs, tels que la séquence nucléotidique des attractants

maternels, leur taux d’expression, ou encore les multiples combinaisons de peptides exprimés dans le

gamétophyte femelle des différentes accessions.

Enfin, certaines études suggèrent que des facteurs responsables du guidage du tube pollinique par les

tissus maternels pourraient être impliqués dans la mise en place des barrières à l’hybridation (Takeuchi

et al. 2012 ; Wang et al. 2016). Notre étude révèle l’importance de la régulation par la méthylation de

l’ADN de gènes clés impliqués dans le processus de reproduction. Ceci nous permet de proposer que

les mécanismes moléculaires responsables de la dynamique de méthylation de l’ADN observé dans le

pollen, pourraient être impliqués dans la mise en place progressive des barrières d’isolement

reproductif. Ainsi, il est probable que la déméthylation active de l’ADN dépendante de DME et ROS1

puisse jouer un rôle important dans les processus d’adaptation et de spéciation.

5. Conclusion générale

J’ai pu démontrer pendant ma thèse que les ADN glycosylases DME et ROS1 agissent de manière semi-

redondante pour déméthyler de nombreux locus dans la cellule végétative du pollen. Les résultats que

j’ai obtenu ont également permis de lever le voile sur les mécanismes moléculaires responsables du

phénotype de baisse de fertilité paternelle observé chez les mutants de déméthylation dme/+ et

dme/+;ros1. En effet, j’ai pu mettre en évidence un défaut de guidage des tubes polliniques mutants à

travers les tissus maternels, et démontrer le rôle essentiel de DME/ROS1 dans la régulation d’un

complexe de signalisation putatif, essentiel pour la fertilité paternelle chez Arabidopsis thaliana. Ainsi,

nos résultats démontrent que DME et ROS1 jouent un rôle primordial dans la régulation des facteurs

impliqués dans la communication moléculaire qui s’établit entre les tissus mâle et femelle pendant la

reproduction, et proposent une fonction essentielle de la déméthylation active de l’ADN dans le succès

reproducteur chez Arabidopsis thaliana.

69

ANNEXE

70

Figure Annexe 1 : Nombre de graines par silique observé lors des croisements entre des femelles mutantes de la voie de méthylation de l’ADN et un mâle simple mutant dme/+. On remarque une importante diminution du nombre de graine par silique lorsque le mutant paternel dme/+ est croisé avec des femelles rdr6.

71

Complément de matériels et méthodes Matériel végétal Les lignées mutantes utilisées lors des croisements avec les mâles dme/+ et dme/+;ros1 sont établies dans le fond génétique Col-0.

Les accessions utilisées lors des croisements avec des mâles dme/+;ros1 sont issue de la collection de Versailles (Bay-0, Bl-1, Bla-1, Bur-0, Col-0, Cvi-0, Edi-0, Einkeim-T, Gre-0, Im-0, Jea-1, Jm-0, Kn-0, Kondara, Ler-0, Lip-0, Mh-1, Ms-0, Mt-0, Nok1, Oy-0, Pa-1, Pi-0, Pyl-1, Ri-0, Shahadara, Sp-0, Stw-0, Ta-0, Te-0, Tsu-.

Mutant Identifiant Type Référence ago4-3 WiscDSLox338A06 Insertion T-DNA Havecker et al. 2010 cmt2-7 Wisc7E02 Insertion T-DNA Stroud 2014

cmt3-11 SALK14831 Insertion T-DNA Chan et al. 2006 ddm1-2 - Mutation ponctuelle Vongs et al. 1993

drm1, drm2 SALK031705 Insertion T-DNA Chan et al. 2006 drm1, drm2 SALK150863 Insertion T-DNA Chan et al. 2006

met1-3 - Insertion T-DNA Saze et al. 2003 nrpd4-Wisc - Insertion T-DNA -

ros1-3 - Insertion T-DNA Penterman et al. 2007 rdr6-15 SAIL_617_H07 Insertion T-DNA -

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ABSTRACT

In Arabidopsis thaliana, DNA methylation patterns are modified in the gametophytes and in the seed

after fertilization. This changes in DNA methylation are involved in gene imprinting, small RNA

production and protects the genome against transposable element mobilization. Moreover, active

demethylation is crucial for reproductive success in plants, and leads to fertility defects as well as seed

abortion when altered on the paternal and maternal side, respectively. However, the mechanisms and

targets involved are not known and my thesis project aimed at identifying these. I have shown that

defects in DNA demethylation leads to a severe failure in pollen tube guidance that almost completely

prevents fertilization. This and other findings suggest that demethylation regulates key genes involved

in the communication between the pollen and the ovule. Using a variety of approaches, including

transcriptome and methylome analyses, I could show that misregulation of three genes is responsible

for the fertility defects associated with dme and dme;ros1 pollen. Furthermore, fertility can be partially

rescued when ovules are themselves defective in DNA methylation or if the maternal partners are

derived from distinct natural accessions. Collectively, my findings establish a key role for DNA

(de)methylation in plants in the regulation of genes that are essential for reproductive success. The

implication are far reaching, given that reproductive isolation established by pre-fertilization barriers

contributes to speciation processes in plants as well as in animals.

MOTS CLÉS

Dynamique de méthylation de l'ADN, succès reproducteur, régulation épigénétique de l'expression

des gènes, déméthylation, Arabidopsis thaliana

RÉSUMÉ

Chez Arabidopsis thaliana, les profils de méthylation de l’ADN sont modifiés dans les gamétophytes

mâle et femelle, ainsi que dans la graine après fécondation. Ces changements de méthylation de

l’ADN sont impliqués dans la régulation de l’empreinte parentale, la production des petits ARNs non

codant, ainsi que dans la protection du génome contre la mobilisation des éléments transposables. De

plus, la déméthylation active de l’ADN joue un rôle crucial dans le succès reproductif des plantes,

puisque son altération conduit à un défaut de fertilité du côté paternel, ainsi qu’à un avortement

précoce des graines du côté maternel. Toutefois, les mécanismes et gènes cibles impliqués dans ce

phénomène sont encore méconnus. Mon projet de thèse vise à les identifier. Les résultats obtenus

pendant ma thèse montrent que les défauts de déméthylation de l’ADN induisent une défaillance dans

le guidage du tube pollinique, qui entrave fortement la fécondation. Ces observations suggèrent que la

déméthylation active de l’ADN régule des gènes clés impliqués dans la communication entre le pollen

et l’ovule. En utilisant différentes approches, incluant des analyses de transcriptomes et de

méthylomes, j’ai pu démontrer que la dérégulation de trois gènes est responsable du défaut de fertilité

associé aux pollens mutants dme et dme;ros1. Par ailleurs, la fertilité peut être partiellement rétablie

en utilisant des ovules eux-mêmes déficients dans les voies de méthylation de l’ADN, ou si différentes

accessions naturelles sont utilisées du côté maternel. Ensemble, ces résultats permettent de mettre

en évidence le rôle clé de la (dé)méthylation de l’ADN dans la régulation de gènes essentiels pour le

succès de la reproduction chez les plantes. Ces résultats pourraient avoir d’importantes retombées,

puisque l’isolement reproductif établis par la barrière pré-zygotiques contribue aux processus de

spéciation chez les plantes ainsi que chez les animaux.

KEYWORDS

DNA methylation dynamics, reproductive success, epigenetic gene regulation, demethylation,

Arabidopsis thaliana

rôle de la déméthylation active de l'adn dans le succès de

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