(rna molecules)conf.agi.nu.ac.th/webnewasp/ereading/gene/unit5.pdf · (rna molecules)...

พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

1

บทที่ 5 โมโลกลุอารเอ็นเอ

(RNA Molecules) คํานํา โมเลกุลอารเอ็นเอ (RNA molecule) ของโปรคารีโอต และยูคารีโอต ที่ไดจากกระบวนการลอกรหัส (transcription) สามารถแบงไดเปน 3 ชนิด คือ 1) mRNA (messenger RNA) ทําหนาทีเ่ปนตัวกลางของยนี (gene) ซ่ึงจะถูกแปรรหัส (translation) ไดผลผลิตของยีน (gene product) คือ โปรตีนหรือสายโพลีเบปไทด (protein หรือ polypeptide) โดยทั่วไปโมเลกุลของ mRNA มีระยะเวลา และคงสภาพอยูภายในเซลลคอนขางสั้น 2) ribosomal RNA (rRNA) เปนองคประกอบสําคัญของไรโบโซมซ่ึงทําหนาที่เกีย่วของกับกระบวนการสังเคราะหโปรตีนหรือการแปรรหัส และ 3) transfer RNA (tRNA) เปนโมเลกุลที่เกี่ยวของกับการนํากรดอะมิโนมาสงให mRNA ทั้ง rRNA และ tRNA สามารถคงสภาพภายในเซลลไดยาวนาน และสามารถทํางานไดทันทีไมตองผานกระบวนการแปรรหัส (final product of expression) แตพบวาทั้ง tRNA และ rRNA มีบทบาทสําคัญโดยตรงกบักระบวนการแปรรหัสของ mRNA (รูปท่ี 5.1)

รูปท่ี 5.1 โมเลกุลอารเอนเอทั้ง 3 ชนิด (Brown, 1992)


2

กระบวนการเริ่มตนการลอกรหัสในโปรคารีโอตและยูคารีโอตมีความแตกตางกัน โดยในโปรคารีโอต พบวามียีนหลายตัวเรียงติดกนัเปนยูนิต (polycistronic gene) และมี RNA polymerase เพียงชนิดเดยีว สวนในยูคารีโอต พบวาตําแหนงโปรโมเตอรมีความหลากหลาย และ RNA polymerase มีความซับซอนมากกวาในโปรคารีโอต ทั้งนี้ขึ้นอยูกบักลุมของยีนที่พบในยูคารีโอต ซ่ึงสามารถแบงกลุมของยนีไดเปน 3 กลุม คือ ยีนกลุมที่ 1 (class I) คือยีนที่เกีย่วของกับ large rRNA ไดแก 18S rRNA, 28S rRNA และ 5.8 S rRNA ในนิวคลีโอลัส โดยยนีในกลุมนี้จะมีตําแหนงอยูใกลกนั ทาํใหมีการการลอกรหัสออกมาอยูบน อารเอนเอสายเดียวกนัทาํใหมีลักษณะคลายกับเปน polycistronic gene ยีนกลุมที่ 2 (class II) คือ ยีนทั้งหมดที่เก็บรหัส (coding sequence) ไวสําหรับการสังเคราะหโปรตีน และ small nuclear RNA (snRNA) บางชนิด คือ อารเอ็นเอที่มีความยาวประมาณ 100-200 ไรโบนิวคลีโอไทด ซ่ึงทาํหนาที่ในการสรางไรโบนิวคลีโอโปรตีนขนาดเล็ก (snRNPs หรือ small nuclear ribonucleoproteins) และ ยนีกลุมที่ 3 (class III) เปนกลุมยีนขนาดเล็กที่มียีนสวนใหญเรียงอยูเปนกลุม (cluster) และมีหลายชุด (copy) เชน snRNA บางชนิด tRNA และ 5S rRNA เชน ในรังไขของกบ พบวามี 5S gene มากกวา 20,000 ชุด ดังนั้นชนดิของโปรโมเตอรและชนิดของ RNA polymerase จึงตองมีความจําเพาะกบัยีนในกลุมตางๆ

Ribosomal RNA (rRNA) โดยทั่วไปโมเลกุลของ rRNA ประกอบรวมอยูกับโปรตนีแลวเกิดเปนสารประกอบเชิงซอน ที่เรียกวา ไรโบโซม (Ribosome) ซ่ึงมีบทบาทสําคัญตอกระบวนการแปรรหัส (รูปท่ี 5.2) โปรคารีโอต สามารถแบงโมเลกุลของ rRNA ไดเปน 3 ชนิด คือ 1. 23S rRNA มีขนาดประมาณ 2,904 นิวคลีโอไทด (nucleotide) ซ่ึงเปนองคประกอบของ หนวยใหญของไรโบโซม ขนาด 50S 2. 16S rRNA มีขนาดประมาณ 1,541 นิวคลีโอไทด เปนองคประกอบของ หนวยใหญของไรโบโซม ขนาด 30S

3. 5S rRNA มีขนาดประมาณ 120 นิวคลีโอไทด ซ่ึงเปนองคประกอบของหนวยใหญของไรโบโซม ขนาด 50S

ไรโบโซมของโปรคารีโอตมีขนาด 70S ซ่ึงประกอบดวยหนวยยอย 2 หนวย คือ 50S และ 30S โดย 1. Large subunit (50S) ประกอบดวย 23S rRNA + 5S rRNA + protein 34 ชนิด 2. Small subunit (30S) ประกอบดวย 16S rRNA + protein 21 ชนิด


3

(S = Sevedberg unit คือ A value used to express the velocity with a molecule or structure sediments when centrifuged in a dense solution.)

ยูคารีโอต สามารถแบงโมเลกุลของ rRNA ไดเปน 4 ชนดิ คือ 1. 28S rRNA มีขนาดประมาณ 4,718 นิวคลีโอไทด ซ่ึงเปนองคประกอบของหนวยใหญของ

ไรโบโซม ขนาด 60S 2. 18S rRNA มีขนาดประมาณ 1,874 นิวคลีโอไทด เปนองคประกอบของหนวยใหญของไร

โบโซม ขนาด 40S 3. 5.8S rRNA มีขนาดประมาณ 160 นวิคลีโอไทด ซ่ึงเปนองคประกอบของหนวยใหญของ

ไรโบโซม ขนาด 60S 4. 5S rRNA มีขนาดประมาณ 120 นวิคลีโอไทด ซ่ึงเปนองคประกอบของหนวยใหญของไร

โบโซม ขนาด 60S ไรโบโซมของยูคารีโอตมีขนาด 80S ซ่ึงประกอบดวยหนวยยอย 2 หนวย คือ 1. Large subunit (60S) ประกอบดวย 28S rRNA + 5.8S rRNA + 5S rRNA + protein 45 ชนิด 2. Small subunit (40S) ประกอบดวย 18S rRNA + protein 23 ชนิด

รูปท่ี 5.2 องคประกอบของไรโบโซม (ที่มา : http://departments.oxy.edu/biology/Stillman/bi221/110300/EUrDNA.jpeg, 2547)

http://departments.oxy.edu/biology/Stillman/bi221/110300/EUrDNA.jpeg


4

การสังเคราะห rRNAs (Synthesis of rRNAs) โมเลกุล rRNA ของทั้งในโปรคารีโอตที่มี 3 ชนิด และยคูารีโอตที่มี 4 ชนิด จะถูกผลิตออกมา

ในปริมาณเทาๆ กัน และมปีริมาณมากเพยีงพอ ดังนัน้ rRNA gene ที่ทําหนาที่ควบคุมการสังเคราะห โมเลกุล rRNA ทุกชนิดนั้นจะอยูในสภาพเปนกลุม หรือเปนหนวย ที่เรียกวา rRNA transcription unit ซ่ึงแตกตางกันในโปรคารีโอต และยูคารีโอต ดังนี้ 1. rRNA transcription unit ของโปรคารีโอต ประกอบดวย 16S, 23S และ 5S rRNA gene เรียงตอกัน โดยแตละ rRNA gene ถูกคั่นดวยลําดับเบสขนาดสั้นๆที่ไมใชยีน เรียกวา ชองวาง (spacer) ซ่ึง rRNA ทั้ง 3 ชนิด จะถูกจาํลอกรหัสออกมาพรอมกัน โดยใช promoter รวมกนั (รูปท่ี 5.3)

เชน ใน E. coli มีกลุมของยนีที่มีตําแหนงอยูบนดีเอน็เอซึ่งควบคุมการสังเคราะห rRNA ทั้ง 3 ชนิด ประกอบดวย rRNA transcription unit มี 7 ชุด (copies)

รูปท่ี 5.3 rRNA transcription unit ของโปรคารีโอต (ที่มา : http://www.irn.pdx.edu/~newmanl/SynRRNA.GIF, 2547)

2. rRNA transcription unit ของยูคารีโอต ประกอบดวย 28S, 18S และ 5.8S rRNA gene เรียงตอกันโดยแตละยีนถูกคั่นดวย spacer สวน 5S rRNA gene อยูเปนยีนเดีย่วๆ ที่แยกไปอยูในตําแหนงอ่ืนบนโครโมโซม โดยยูคารีโอตมี rRNA transcription unit ตั้งแต 50-500 ชุด (รูปท่ี 5.4) เชน มนุษย พบวา rRNA transcription unit ของ 28S, 18S และ 5.8S rRNA gene มีตําแหนงอยูบนโครโมโซมแทงที่ 13 14 15 21 และ 22 สวน 5S rRNA gene อยูเปนยีนเดี่ยวๆ บนโครโมโซมแทงที่ 1


5

รูปท่ี 5.4 rRNA transcription unit ของยูคารีโอต

(ที่มา : http://homepages.strath.ac.uk/~dfs97113/BB310/310tRNAs/img014.JPG, 2547)

Transfer RNA (tRNA) โมเลกุล tRNA เปน adapter molecule ที่เกี่ยวของกับกระบวนการแปรรหัส โดยทําหนาที่แปลรหัสของ codon บน mRNA ใหเปนลําดบักรดอะมิโน ซ่ึง tRNA มีโมเลกุลขนาดเล็กประมาณ 74-95 นิวคลีโอไทด ทั้งขึ้นอยูกับชนิดของสิ่งมีชีวิต และเปนกรดนิวคลีอิกสายเดยีว (single strand) คลายกบั RNA ชนิดอื่น คือมีปลาย 3/OH terminus และ 5/monophosphate (มากกวา 5/ tripphosphate) โดย tRNA เกือบทั้งหมดของสิ่งมีชีวิตทุกชนิดมีลักษณะโครงสรางคลายกัน คือ มีโครงสรางคลายใบไม ที่เรยีกวา cloverleaf ซ่ึงเปนโครงสรางที่เกิดจากการจบัคูกันเองของเบสที่อยูภายในสาย tRNA บางบริเวณจะจับคูกันดวยพันธะไฮโดรเจนทําใหไดเปน tRNA สายคู ซ่ึงมีโครงสรางคลาย stem และ open loops ซ่ึงแต loop ที่เชื่อมตอดวย double-stranded stem โมเลกุลของ Cloverleaf หรือ Standard tRNA มีคุณลักษณะ (รูปท่ี 5.5) ดังนี้ 1. tRNA เกือบทุกชนิดมีเบสคงที่ ในหลายตําแหนง 2. บริเวณปลาย 5/P มีเบสมาเขาคูกันเปน double strand เปน stem คาดวาจะเปนสวนชวยใหโมเลกุลของ tRNA มั่นคงแข็งแรง


6

3. บริเวณปลาย 3/OH เปน Single stranded region ประกอบดวยเบส 4 ชนิด มีลําดับดังนี้ 5/-XCCA-3/OH ซ่ึง X เปนเบสอะไรก็ได และเรียกบรเิวณนี้วา 5/CCA3/ หรือ acceptor arm โดยเบส A ที่อยูในบริเวณ CCA จะเปนตาํแหนงทีใ่หกรดอะมิโนเขามาเชื่อมตอกันใหเปนสายโพลีเปบไทด ในขณะเกิดกระบวนการสังเคราะหโปรตีน หรือการแปรรหัส 4. เบสในโมเลกุล tRNA หลายตําแหนงจะเปนที่มีการดัดแปลง (modified base) เชน dihydrouirine (DHU), ribosynthymine (rT), pseudouridine (Ψ) และ inosine (I) ซ่ึงเบสเหลานี้จะเกิดในจําเพาะบางบริเวณของโมเลกุล tRNA เทานั้น 5. บริเวณ singe-stranded loop มีอยู 3 บริเวณในโมเลกุล tRNA คือ 5.1 บริเวณของลางสุดของ Cloverleaf คือเปน anticodon loop ซ่ึงประกอบดวยเบสจํานวน 7 เบส ที่มีลําดับดังนี้ 5/ Py-U-XYZ-Pu (modified)-Variable base 3/ 5.2 DHU loop ซ่ึงมีขนาดแตกตางกันใน tRNA แตละชนิด โดย DHU loop เปนบริเวณที่มีโครงสรางเปน Loop ซ่ึงมีตําแหนงอยูบริเวณสวนปลายของแขนดาน 5/ tRNA ซ่ึงบริเวณ Loop นี้ประกอบดวยลําดับเบสจํานวนคงที่ของเบส pyrimidine dihydrouracil 5.3 TΨC loop เปนบริเวณที่ประกอบดวยลําดับเบส 3 ตัวเรียงตอกันเสมอ TΨC มีโครงสรางเปน Loop ซ่ึงมีตําแหนงอยูบริเวณสวนปลายของแขนดาน 3/ tRNA 6. บริเวณ extra หรือ optional หรือ variable arm พบที่บริเวณสวนปลาย 3/ tRNA ซ่ึงมีตําแหนงอยูใกลกับ TΨC loop เปนบริเวณมีลักษณะเปน Loop ซ่ึงมีลําดับเบสที่ไมคงตัวหรือมีความแปรปรวนประมาณ 3-5 เบส แตบางครั้งอาจมีลําดับเบสประมาณ 13-21 เบส ทัง้นี้ขนาดแปรปรวนดังกลาวขึ้นอยูกับชนิดของ tRNA สําหรับหนาที่ของบริเวณนี้ยังไมทราบ 7. มีบริเวณที่เปนสายคู (double-stranded region) อยู 4 บริเวณ เรียก stem หรือ arm ซ่ึงบริเวณนี้จะเบสคงที ่

สวนที่สําคัญของโมเลกุล tRNA ท่ีมีบทบาทตอกระบวนการแปรรหัส มี 2 สวน คือ

1. Anticodon เปนบริเวณทีม่ีลําดับเบส 3 ตัว ที่สามารถจับคูกับ codon บน mRNA ได เนื่องจากเปนเบสคูสม (base complementary) กัน 2. Amino acid attachment site เปนบริเวณปลาย 3-terminus ของ tRNA ที่มีลําดับเบส 5/CCA3/

ซ่ึงทําหนาที่นาํกรดอะมิโนเขามาตอกับ tRNA ที่ตําแหนงเบส A โดยชนิดกรดอะมิโนเหลานี้ตองสอดคลองกับ anticodon ดวย


7

รูปที่ 5.5 โครงสรางโมเลกุลของ tRNA (ที่มา : http://www.usp.br/fm/dim/genquant/tRNA.gif, 2547)

การดัดแปลงโมเลกุล tRNA (tRNA processing) tRNA precursor ของโปรคารีโอต และยูคารีโอต ที่ไดจากกระบวนการกระบวนการลอกรหัส (primary transcription) จะมีเบสสวนเกินทีป่ลาย 5/leader sequence และ 3/tailer sequence สวน mature tRNA อยูตรงกลาง ดังนั้นจงึตองมีกระบวนการดัดแปลง เพื่อใหได mature tRNA ที่สมบูรณกอนที่จะนําไปใชในกระบวนการแปรรหัส (รูปท่ี 5.6)

รูปท่ี 5.6 กระบวนการดัดแปลง primary tRNA ได mature tRNA (ที่มา : http://departments.oxy.edu/biology/Stillman/bi221/111500/RNA_modification.htm, 2547)

http://www.usp.br/fm/dim/genquant/tRNA.gif

http://departments.oxy.edu/biology/Stillman/bi221/111500/RNA_modification.htm


8

tRNA gene ในโปรคารีโอต บางครั้งอาจอยูเปนยีนเดี่ยวๆ กระจายอยูทั่วไปบนตําแหนงตางๆของโครโมโซม หรือบางครั้งอาจมี tRNA หลายๆ ยีนอยูรวมกันเปนกลุมยีน (gene cluster) บนโครโมโซม ทําใหการการลอกรหัส 1 คร้ังได tRNA หลายๆ โมเลกุล ซ่ึง Precursor- tRNA ถูกดัดแปลงโดย RNase P ทําหนาที่ตัดเบสสวนที่เกินปลาย 5/P และ RNase D หรือ Q ตัดเบสสวนเกินที่ปลาย 3/OH สวน tRNA gene ในยูคารีโอต พบวามีการอยูรวมกันเปนกลุมยีน ที่เรียกวา cluster gene เชนเดียวกับโปรคารีโอต แตจํานวน tRNA gene ภายในกลุมยีนมีจํานวนมากกวา สวนกระบวนการ processing ของ tRNA precursor นั้นเกี่ยวของกับกระบวนการดัดแปลงทางเคมี (chemical modification) ของลําดับเบสในนิวคลีโอไทดที่อยูภายใน tRNA ซ่ึงการดัดแปลงทางเคมีอาจแบงไดเปน 6 แบบ (รูปท่ี 5.7) คือ 1. Methylation เปนกระบวนการเติมหมูเมททิล (methyl group ;CH3) ใหกับเบส หรือน้ําตาล ที่เปนองคประกอบของนิวคลีโอไทด โดยอาศัยการทํางานของ tRNA transferase เปนตัวเรงปฏิกริิยาให S-adenosyl methionin นํา CH3 มาตอกับโมเลกุลนิวคลีโอไทด อาทิ การเติม CH3 เขาที่เบส guanosine และ uridine ทําใหเปลี่ยนไปเปน 7– methylguanosine และ ribothymidin ตามลําดับ อยางไรก็ตามบางครั้งอาจมีการเติม CH3 อาจเติมเพยีง 1 หมู หรือมากกวากไ็ด

2. Base rearrangement เปนการสลับ หรือเปลี่ยนตําแหนงอะตอมทีอ่ยูภายในวงแหวนเบสพิวรีน หรือไพริมีดีน ตัวอยางเชน การเปลีย่นแปลงเบส uridine ไปเปน pseudouridine 3. Double-bond saturation เปนการเปลี่ยนตําแหนงพันธะคูที่อยูในเบส ไปเปนพันธะเดีย่ว เชน การเปลีย่นแปลงพนัธะคูของเบส uridne ไปเปนพนัธะเดีย่ว dihydrouridine 4. Deamination คือการขจัดหมูอะมิโน (NH2) ออกจากเบส เชน การขจัดหมู NH2 ออกจากเบส guanosine (G) เปลี่ยนไปเปน inosine (I)

5. Sulfur substitution คือการแทนที่ออกซิเจนอะตอมดวยซัลเฟตอะตอม ภายในเบส guanosine หรือเบส uridine ตัวอยางเชน เกิดการแทนที่ออกซิเจนอะตอมภายในเบส uridine ดวยซัลเฟตอะตอม ทําใหเปลี่ยนไปเปน 4-thiouridine 6. Addition of more complex group เปนการเติมหมูสารเคมีที่ซับซอน เขาไปในเบส guanosine ทําใหเปลี่ยนไปเปน queosine


9

จากการศึกษาพบวาการดดัแปลงทางเคมีภายในนิวคลีโอไทดของโมเลกุล tRNA มีมากกวา 50 แบบ ซ่ึงแตละแบบถกูเรงใหเกิดปฏกิิริยาโดยเอนไซมที่ตางชนิดกัน สําหรับเหตุผลที่ตองมีการดัดแปลงทางเคมียังไมสามารถอธิบายได

รูปท่ี 13.7 แสดงการสังเคราะห และการดัดแปลงโมเลกุล tRNA

(ที่มา : http://www.cmb.usc.edu/cbmp/2001/tRNA/modbases1_files/image001.jpg, 2547)

http://www.cmb.usc.edu/cbmp/2001/tRNA/modbases1_files/image001.jpg


10

Messenger RNA (mRNA) โครงสรางโดยทั่วไปของโมเลกุล mRAN ทั้งในโปรคารีโอต และ ยูคารีโอต ประกอบดวยสวนที่สําคัญ 3 สวน คือ (รูปท่ี 13.8) 1. Leader sequence หรือ 5/untranslated leader sequence (5/ULR) เปนลําดับเบสจําเพาะที่อยูบริเวณปลาย 5/P ของ mRNA ที่เปนตําแหนงจดจําของใหไรโบโซมหนวยขนาดเล็ก (small subunit ribosomeไดแก 30 S และ 40 S ) เขาเกาะกับสาย mRNA เพื่อเร่ิมกระบวนการแปรรหัส โดย 5/ULR ในโปรคารีโอตมีตําแหนง Shine dalgano sequence สวนในยูคารีโอตมีตําแหนง 7–methylguanylate cap

2. Coding sequence เปนบริเวณที่มีลําดับเบสที่เรียกวา codon ซ่ึงกําหนดชนิดของกรดอะมิโนในการสังเคราะหสายโพลีเปบไทดในกระบวนการแปรรหัส

3. Tailer sequence หรือ 3/untranslated tailer sequence (3/UTR) คือ ตําแหนงปลาย 3/ ที่มีละดับเบสที่ไมสามารถแปรรหัสเปนกรดอะมิโนไดเลย

รูปท่ี 5.8 แสดงโครงสรางโมเลกุล mRNA ที่สมบูรณ ที่พบทั้งในโปรคารีโอต และยูคารีโอต

(ที่มา : Russell, 1996)

จากการศึกษาโมเลกุลของ mRNA ในโปรคารีโอต พบวาเปนแบบ polycistronic mRNA หมายถึง mRNA 1โมเลกุล ประกอบดวยยีนหลายยีนที่ไดจากการลอกรหัสโดยใชโปรโมเตอร (promoter) รวมกัน ทําใหสามารถแปลรหัสออกมาไดสายโพลีนิวคลีโอไทดหลายสาย โดยแตละ cistronic ถูกขึ้นดวย intercistronic region หรือ Spacer (รูปท่ี 5.9) ซ่ึงเปนสวนที่มีลําดับเบสที่ไมมีการแปรรหัสเกิดขึ้น


11

รูปท่ี 5.9 Polycistronic mRNA ของโปรคารีโอต (ที่มา : http://cats.med.uvm.edu/cats_teachingmod/microbiology/courses/gene_regulation/images/csm.polycist.gif , 2547)

สวนโมเลกุล mRNA ในยูคารีโอต พบวามีลักษณะเปน monocistronic คือ mRNA 1 โมเลกุล

ประกอบดวย 1 ยีน ทําใหสามารถแปรรหัสไดโปรตีน 1 ชนิด หรือสายโพลีเปบไทด 1 สาย ((รูปท่ี 5.10)

รูปท่ี 5.10 Monocistronic คือ mRNA ของ ยูคารีโอต

(ที่มา : http://www.phschool.com/science/biology_place/biocoach/images/tRNAscription/eunotcol.gif, 2547)


12

กระบวนการหลังการลอกรหัสของ mRNA (Post-transcriptional RNA processing) ส่ิงมีชีวิตพวกโปรคารีโอต พบวาโมเลกุล mRNA เกือบทั้งหมดที่ไดจากกระบวนการลอกรหสันั้นจะถูกนําไปใชในกระบวนการแปรรหัสไดโดยตรงไมตองผานกระบวนการการดัดแปลงโมเลกุลอารเอ็นเอ (RNA processing) ทั้งนี้เนื่องจากเซลลของโปรคารีโอตไปมีเยื่อหุมนิวเคลียส (nuclear membrane) ดังนั้นขณะที่เกิดกระบวนการลอกรหัสดําเนินไปอยางตอเนื่องนั้น และกอนที่กระบวนการ ลอกรหัสจะเสร็จส้ินสมบูรณ ไรโบโซมจะเขาเกาะกับโมเลกุล mRNA ที่สังเคราะหออกมา เพื่อเร่ิมกระบวนการแปลรหัสไดทันที ทําใหเกิดทั้งกระบวนการลอกรหัสและกระบวนการแปลรหัสเกิดขึ้นควบคูกันไป ซ่ึงเรียกกระบวนการนี้วา coupled transcription and translation (รูปท่ี 5.11) แตในยูคารีโอตนั้นโมเลกุล mRNA ที่ไดจากกระบวนการลอกรหัสประกอบดวยทั้ง intron และ exon ดังนั้นจําเปนตองผานกระบวนการดัดแปลงกอนที่จะถูกนําไชในการบวนการแปรหัส ซ่ึงขั้นตอนการดัดแปลงโมเลกุล mRNA จะเกิดขึ้นภายในนิวเคลียสจนไดโมเลกุล mRNA ที่สมบูรณ คือมีแตสวนของ Exon เทานั้น จากนั้นจึงถูกสงออกมาภายนอกนิวเคลียสไปยังไซโตพลาสซึม (cytoplasm) แลวจึงถูกแปลรหัสตอไป (รูปท่ี 5.12)

รูปท่ี 5.11 กระบวนการ Coupled transcription and translation ในโปรคารีโอต

(ที่มา : http://opbs.okstate.edu/~petracek/Chapter%2027%20Figures/Fig%2027-30.GIF, 2547)

http://opbs.okstate.edu/%7Epetracek/Chapter%2027%20Figures/Fig%2027-30.GIF


13

รูปท่ี 5.12 กระบวนการ transcription and translation ในยูคารีโอต (ที่มา : http://www.bergen.org/ACADEMY/Bio/cellbio/cellbio1eukaryprot.jpg, 2547)

RNA precursor ของยูคารีโอต ประกอบดวย intron หรือ intervening sequences (IVSS) และ exon หรือ coding region หรือ expressed region ซ่ึงในบางยีน พบวาไมมีสวนของ intron แตบางยีนอาจมีถึง 60 introns เชน human dystrophin gene จากการศึกษาพบวา mRNA มีสวนของ introns ประมาณ 0-60 intron สวน tRNA อาจไมม ี intron หรือมีเพียง 1 เทานั้น ซ่ึงพบ intron อยูบริเวณใกลกับตําแหนง anticodon แตมีเพียงสวนนอยของ rRNA genes ที่มี introns กลาวคือ ไมพบ intron ในโมเลกุล rRNA

นอกจากนี้ยังพบวา ยนีที่อยูในไมโตคอนเดีย (mitochondia) และคลอโรพลาส (chloroplast) ก็มีสวนของ intron ดวย ซ่ึงบริเวณรอบ ๆ สวนของ intron ประกอบดวย exons เชน β -globin พบวาเมื่อผานกระบวนการลอกรหัส (primary transcription) ได mature RNA product ที่มีลําดับเบสจํานวน 1500 เบส แต mature globin mRNA ประกอบดวย 750 เบส

เนื่องจาก RNA precursor ของยูคารีโอตประกอบดวยสวนของ intron และ exon ดังนั้นจึงตองมีกระบวนการ RNA splicing และ RNA processing กอน เพือ่ใหไดเปน mature mRNA แลวจึงถูกสงผานจากนิวเคลียสไปสูไซโตพลาซึมเพื่อเร่ิมกระบวนการสังเคราะหโปรตีน หรือการแปลรหัส


14

ตอไป ซ่ึงกระบวนการ processing ที่เกิดกบั hnRNA (heterogeneous nuclear RNA) ของยูคารีโอตมี 3 กระบวนการ (รูปท่ี 5.13) ดังนี้

1. มีการเติม cap ที่ปลาย 5/ ของ mRNA 2. Polyadenylation (การเตมิ poly (A) tails) 3. การตัด Intron (Splicing หรือ RNA splicing)

รูปท่ี 5.3 กระบวนการ mRNA processing ของยูคารีโอต (ที่มา : http://departments.oxy.edu/biology/Stillman/bi221/111300/processing_of_hnrnas.htm, 2547)

การเติม Cap ท่ีปลาย 5/ ของ mRNA

คือ เติม methyl group (CH3) ที่ N ตําแหนงที่ 7 ของเบส guanine ตัวสุดทายที่ปลาย 5/mRNA หรือ/และเติม methyl group ที่ C ตําแหนงที่ 2 น้ําตาลไรโบส ที่เปน triphosphate nucleotide ตัวรองสุดทาย (penultimate nucleotide) (รูปท่ี 5.14) นิวคลีโอไทดที่ผานกระบวนการดัดแปลงมาแลวจะไดเกิดเปนโครงสรางของ Cap คือ 7– methylguanylate หรือ m7 G ซ่ึงจะใชดานปลาย 5/ ของ 7 methylguanylate ของ Cap เขาจับกับ

ปลาย 5/-triphosphate ของ mRNA ทําใหเกิดการเชื่อมตอกันในทิศทาง 5/ → 5/ จะสังเกตไดวาเปนการเชื่อมตอของนิวคลีโอไทดที่กลับทิศกัน เพราะโดยปกติแตละนิวคลีโอไทดจะเชื่อมตอกันจาก

ทิศทางดานปลาย 5/ → 3/ เสมอ อยางไรก็ตามโครงสรางของ Cap นี้อาจขึ้นหลายโมเลกุลก็ได ทั้งนี้อยูกับวามีการเติมหมู CH3 เขาไปที่นิวคลีโอไทดลําดับที่ 1 และ 2 ของ mRNA หรือไม ตัวอยางเชน Cap 0 เกิดขึ้นเมื่อมีการเติม 7– methlganylate เพียงหมูเดียว เขาไปที่ปลาย 5/ ของสาย mRNA สวน Cap 1 เกิดขึ้นเมื่อมีการเติมหมู CH3 เขาไปในน้ําตาลไรโบสของนิวคลีโอไทดตัวแรกของสาย mRNA ที่ตอจาก 7- methylguanylate และ Cap 2 เกิดขึ้นเมื่อมีการเติมหมู CH3 เขาไปในน้ําตาลไรโบสของนิ


15

วคลีโอไทดตัวที่ 2 บนสาย mRNA โครงสราง Cap มีหนาที่ 2 ประการ คือ 1) จากการศึกษาพบวาโมเลกุล mRNA ที่มีการเติม Cap จะถูกนําไปแปรรหัสไดอยางมีประสิทธิภาพมาก และ 2)โครงสราง Cap ชวยใหโมเลกุล mRNA คงสภาพอยูภายในเซลลไดอยางมีประสิทธิภาพ เพราะทําหนาที่ปองกันไมใหถูกยอยสลายโดยเอนไซม Ribonuclease

รูปท่ี 5.14 โครงสราง Cap ที่ N ตําแหนงที่ 7 ของ guanine ตัวสุดทายที่ปลาย 5/ mRAN ของยูคารีโอต

ขั้นตอนการเกิด Cap อาจเกิดขึ้นพรอมๆ กับกระบวนการลอกรหสั หรือเกิดขึน้ทันทีเมื่อส้ินสุดกระบวนการลอกรหสั ซ่ึงมีหลายขั้นตอน และปฏิกิริยาการเกดิ Cap (รูปท่ี 5.15) ดังนี ้ 1. เอมไซม Nucleotide phospho transferase ทําหนาท่ีดึง ϒ- phosphate 1 โมเลกุล ออกจาก triphospate group ของนิวคลีโอไทดที่ปลาย 5/ mRNA ทําใหไดนิวคลีโอไทดเปน diphosphate group 2. มีการเติม GTP ประมาณ 50 นิวคลีโอไทดที่ปลาย 5/mRNA ซ่ึงปฏิกิริยาไมเหมือนกับการทํางานของ RNA polymerase reaction โดยมีขั้นตอนดงันี้ 2.1 นํานิวคลีโอไทด GTP เขาเติมท่ีปลาย 5/ mRNA (โดยปกต ิ RNA polymerase จะนํานิวคลีโอไทดตัวใหมเขาเติมทีต่ําแหนงปลาย 3/OH)


16

2.2 การเชื่อมตอระหวางนิวคลีโอไทด 2 นิวคลีโอไทดท่ีอยูติดกนั โดยสราง triphosphate linkage forming (ปกติมีการสราง phosphodiester bond ระหวางปลาย 5/ กับ 3/ ของนิวคลีโอไทด) 2.3 สรางพนัธะ Phosphodiester bond ของ triphosphate linkage forming นั้นเกดิระหวาง ปลาย 5/ ของนิวคลีโอไทดหนึ่ง กับปลาย 5/ ของอีกนิวคลีโอไทดหนึ่ง (ปกติเปน 5/ - 3/ phosphodiester bond) 3. เกิดกระบวนการ methylation โดยเอมไซม methyl transferase ทําหนาที่นํา methyl group จาก S-adenosyl methionine (SAM) เขาเติมที่ N ตําแหนงที่ 7 ของเบส G ที่ปลาย 5/ mRNA (Cap0) 4. เกิดกระบวนการ Methylation โดยเอมไซม methyl transferase นํา methyl group เขาเติมที ่ C ตําแหนงที ่ 2 ของน้ําตาลไรโบสของนิวคลีโอไทดที่อยูตําแหนงรองสุดทายของปลาย5/ mRNA (Cap1)

รูปท่ี 5.15 ขั้นตอนการเติม cap ที่ปลาย 5/mRNA


17

Polyadenylation (การเติม poly A tail) บริเวณปลาย 3/ ของ mRNA Precursor mRNA ในยูคารีโอตเกิดปฏิกริิยา polyadenylation โดยเติมเบส A จํานวนมาก

ประมาณ 200-300 นิวคลีโอไทดที่ปลาย 3/ mRNA ซ่ึงเรียกตําแหนงนีว้า poly A tail โดยมีปฏิกิริยาการเกิด polyadenylation (รูปท่ี 5.16) มีดังนี ้ 1. mRNA precursor ที่ถูกสังเคราะหจากกระบวนการลอกรหัส โดยการทํางานของเอมไซม RNA polymerase II นั้น จากการศึกษาพบวากระบวนการลอกรหัสยงัคง ดําเนินตอไปเรื่อยๆ ถึงแมวาจะผานตําแหนงจุดสิ้นสุดการลอกรหัส (termination signal) ไปแลวก็ตาม 2. เกิดกระบวนการ RNA clipping โดยอาศัยการทํางานของ clipping enzyme (endonuclease) ทําหนาที่ตัดนิวคลีโอไทดที่อยูภายในสาย mRNA precursor ที่ตําแหนงของนิวคลีโอไทดซ่ึงอยูไกลออกไปจากจุดสิ้นสุดการลอกรหัสทางปลาย 3/mRNA ประมาณ 20 เบส Base downstream) เรียกลําดับเบสตําแหนงนี้วา clipping site พบวามีลําดับเบสสวนมากเปนเบส G และ U (GU- rich)

จากการศึกษาพบวา หลังตําแหนงจุดสิ้นสดุการลอกรหสั จะเปนตําแหนงของ polyadenylation signal หรือ consensus region คือ มีลําดับเบสที่จําเพาะเปน 5/A98 A86 (หรือ U12)U98A98A95A96 3

/ ซ่ึงเปนตําแหนงจดจําของ endonuclease ตอจากนั้นตําแหนงถนัดไปคือตาํแหนงของ clipping site ที่อยูบริเวณ down stream ของ polyadenylation signal ทางดานปลาย 3/mRNA 3. การเติม poly (A) tail โดยการทํางานของ poly (A) polymerase ซ่ึงทําหนาทีน่ํา AMP เขามาเติมที่ปลาย 3/ mRNA ประมาณ 200-300 นิวคลีโอไทด อยางไรก็ตามตําแหนงของ termination signal ของยีนทีถู่กลอกรหัสโดย RNA polymerase II ยังไมทราบขั้นตอนการทํางานที่แนชัด

หนาที่ของ Poly A tail คือเปนโครงสรางที่ชวยให mRNA ของยูคารีโอตมีความคงตัวมากเพราะในขณะที่โมเลกุล mRAN ถูกสงออกจากนวิเคลียสมายังไซโตพลาสมนั้น โครงสรางของ poly A tail จะถูกตัดใหส้ันลงอยางชา ๆ โดยเอนไซม Ribonuclease และเมื่อ poly A tail ถูกขจัดออกไปหมดโมเลกุล mRAN ถูกยอยสลายไปอยางรวดเร็ว


18

รูปท่ี 5.16 แสดงการเติมและการสราง Poly A tail ปลาย 3/ โมเลกุล mRNA ของยูคารีโอต (ที่มา : Davidson และ Sittman, 1994)

การตัด Intron (splicing หรือ RNA splicing)

ยีนในยูคารีโอต เมื่อผานกระบวนการลอกรหัสจะไดโมเลกุลของ precursor mRNA หรือ primary transcription large nuclear RNAs หรือ heterogeneous nuclear RNA (hnRNA ประกอบดวย 2 สวน คือ intron และ exon โดย intron เปนสวนของยนีที่ไมสามารถแสดงออกได แต exon เปนสวนของยีนที่สามารถแสดงออกได หรือใชในกระบวนการแปรรหัส ดังนั้นกอนที่จะเขาสูกระบวนการแปร


19

รหัสจําเปนตองมีการตัดสวนของ intron จากโมเลกุลของ precursor mRNAใหเหลือเฉพาะเพยีงสวนของ exon ที่เรียกวา mature mRNA โดยผานกระบวนการ intron splicing (“cut and plate”) ของยีนในยูคารีโอต ซ่ึงเกิดขึ้นอยางรวดเร็วมากภายในนิวเคลยีส ซ่ึงปจจัยทีเ่กี่ยวของกับการตัด intron หรือ RNA splicing (รูปท่ี 5.17) มีดังนี้ 1. Splicing signal Chambon กลาววาลําดับเบสของ intron เกือบทั้งหมดทีพ่บใน mRNA precursor มีสวนเริ่มตนและสวนทายที่คลายกัน หรือเปน Consensus sequences โดยมีลําดับเปน 5/ -exon /GU -intron–AG/exon –3/ หรือ 5/ - GU–AG–3/ moifs โดย ภายใน intron ประกอบดวย 1) สวนแรกมี 2 เบส คือ GU ที่ปลาย 5/ และมี GU’s (ซํ้า ๆ กัน) 2) สวนหลังมี 2 เบส คือ AG ที่ปลาย 3/ และมี AG’s (ซํ้า ๆ กัน)

มี Consensus sequence คือ 5/ –A/C AG/GU A/G AGU – intron – YN AG/G – 3/

(exon) (intron) (exon) เมื่อ YN = เบสไพริมิดีนจํานวน 9 ตวั ( U’s and C’s) N = เบสพิวรีนหรือไพริมิดีน นอกจากนี้ยังม ี consensus sequence อีกหนึง่แหงที่เรียกวา branch site เปนลําดับเบสที่จําเพาะ 7 ตัว คือ 5/-UACTAAC-3/ ซ่ึงมีตําแหนงอยูกอนถึงตําแหนง 3/ splice site ของ intron ประมาณ 40 นิวคลีโอไทด แลวเปนตําแหนงที่กําหนดใหเกิดการตัดสวนของ intron 2. กลไกการ Splicing ใน Small nuclear RNA S ( snRNAS) กลไกการเกิด splicing ของ mRNA precursors ภายในเซลลสามารถอธิบายดวย lariat model ซ่ึงมี 2 ขั้นตอน คือ

2.1 มีการ form looped intermediate ที่มีลักษณะคลาย lariat หรือ lasso โดยมีการทําลายพันธะ phosphodiester bond ระหวาง exon และ intron ที่ตําแหนง branch site ของ intron ที่ปลาย 5/ splice site จากนั้น ปลาย 5/ ของ intron ที่มีเบส G จะเขาเกาะ และสรางพันธะ 5-2 phosphodiester กับเบส A ที่อยูภายใน intron เดียวกัน ( โดยใช P ของ C5 ของเบส G เขาสรางพันธะกับ OH ของ C2 ของเบส A) เพื่อเกิดเปนโครงสราง Lariat–shape intermediate 2.2 ตัดสวนของ Lariat–shape ของ intron ทิ้ง โดยทําลายพันธะฟอสฟอไดเอสเทอรที่ตําแหนงปลาย 3/ ของ Intron แลวจึงเชื่อมตอระหวาง exon ที่อยูใกลกันดวยพันธะฟอสฟอไดเอสเทอร (3/ - end of the first exon attacks the 5/- end of the second exon)


20

รูปท่ี 5.17 ขั้นตอนของ RNA splicing

(ที่มา : http://ntri.tamuk.edu/cell/splicing.gif, 2547)

กระบวนการ processing ของโมเลกุล pre-mRNA จะเกิดขึ้นภายในนิวเคลียสของยูคารีโอต

ซ่ึงคาดวานาจะเกีย่วของกับโมเลกุล U-RNA (uracil–rich RNA ) หรือ small nuclear RNA (snRNA) ซ่ึงพบไดในนวิเคลียสของสัตวมีกระดูกสนัหลัง (vertebrate) โดยโมเลกุลของ snRNA มีคุณสมบัติดังนี ้

1. มี 6 ชนิด คือ U1 snRNA, U2 snRNA, U3 snRNA, U4 snRNA, U5 snRNA และ U6 snRNA โดยโมเลกุล snRNA เหลานี้ประกอบดวยจํานวนนิวคลีโอไทดไมมาก เชน U6 snRNA และ U3 snRNA มีลําดับนิวคลีโอไทดยาวเพยีง 106 และ 207 นิวคลีโอไทด ตามลําดบั

2. แตละโมเลกุลของ snRNA จะรวมอยูกบัโปรตีน ตั้งแต 6 ถึง 10 ชนิด กลายเปน complex ที่เรียกวา ribonucleoproteins ( snRNPS) หรือ “Snurps” ยกเวน โมเลกุล U4 และ U6 RNA จะถูกบรรจุเอาไวในอนุภาคเดยีวกนั 3. แตละโมเลกุลของ U-RNAs มีลําดับนิวคลีโอไทดที่คลายกันภายในเซลล

4. U1 snRNA สามารถเขาจับกัน consensus sequence บริเวณ 5/ splice site และ U2 snRNP สามารถเขาจับกันลําดับนวิคลีโอไทดตรงบริเวณ branch site ภายใน intron


21

ขั้นตอนการตดั Intron อธิบายขั้นตอนการตัด intron ที่เกิดขึ้นภายในนวิเคลียส นักวิทยาศาสตรจึงไดเสนอแบบจําลอง

การตัด intron ที่เกี่ยวของโมเลกุล snRNA (รูปท่ี 5.18) ไวดังนี้คือ 1. U1 snRNP เขาจับกับ consensus sequence ตรงบริเวณ 5/splice site ของ intron เปนขั้นตอนแรกของการเกิดกระบวนการ splicing หรือ U1 snRNP เขารวมกับ pre–mRNA ที่บริเวณปลาย 5/P ของ exon 2. เกิด A– complex โดย U2 snRNP เขาจับกับลําดับเบสที่จําเพาะเฉพาะ (เบส A) ตรงตําแหนง branch site ของ Lariat โดยใชพลังงานจาก (ATP) ซ่ึงเหตุการณที่เกิดหลังจากนีย้ังไมสามารถอธิบายได แตคาดวาโมเลกุลของ U1 snRNP และ U2 snRNP อาจจะเกิดการดึงดดูซึ่งกันและกนั โดย U2 snRNP ชวยกระตุนให U1 snRNP เขามาจับเกิดเปน complex 3. เกิด B2–complex โดยเกดิเหตุการณ ดงันี้ 3.1. U4 snRNP รวมกับ U6 snRNP เปน B1 complex แลวไปรวมกบั A- complex โดย U6 snRNP เขาแทนที่ U1 snRNP ที่ปลาย 5/-splice site โดยใช ATP 3.2 U5 snRNP เขาเกาะทีป่ลายทั้งสองของ exon ซ่ึงเปนตําแหนงทีเ่กิดการตดั intron หรือ splicing 4. เกิด Lariat intermediate form มีการทําลายพันธะฟอสเฟอรไดเอสเทอรระหวาง exon I และ intron โดยใช ATP เพื่อเกิดเปนโครงสราง C1

5. การเชื่อมระหวาง exons เขาดวยกัน จากนั้นจึงปลดปลอยออกจาก Lariat–shape intron ไดเปนโครงสรางที่เรียกวา complex C2 โดยใช ATP 6. เกิด mature mRNA โดยนําหลาย exon เขามาเชื่อมตอกันแลวถูกปลอยออกจาก Lariat–shape intron ที่รวมอยูกับ snRNPs (complex I) 7. snRNPs หลุดออกจาก Lariat–shape intron โดย snRNPs ถูกนําไปใชใน Splicing complex อ่ืน ๆ สวน Lariat–shape intron นั้นถูกยอยทิ้งไปจากเซลล


22

รูปท่ี 5.18 ขั้นตอนของ RNA splicing ที่เกี่ยวของกบั snRNPs

(ที่มา : http://darwin01.bio.uniroma1.it/biomol2did/struttura_imm/image012.jpg, 2547)


23

RNA editing ในยูคารีโอต RNA editing คือกระบวนการการเปลี่ยนแปลงที่ทําลําดับนิวคลีโอไทดภายในโมเลกุล mRNA เชน การเพิ่มนิวคลีโอไทดตัวใหมเขาไปในโมเลกุล mRNA หรือการขจัดนิวคลีโอไทดบางตัวออกไปจากโมเลกุล mRNA หรือการเปลี่ยนแปลงลําดับเบสภายในโมเลกุล mRNA ซ่ึงเปนขึ้นตอนที่เกดิในกระบวนการดดัแปลงโมเลกลุ mRNA ของยูคารีโอตนั้น

1. ในไมโตคอนเดีย ของ Trypanosoma brucei มีกระบวนการ RNA editing โดยการเพิ่มนิวคลีโอไทดของเบสยูราซีล (uracil; U) 1 หรือมากกวา 1 เบส เขาไปในตําแหนงตางๆ ของ โมเลกุล mRNA (รูปท่ี 5.19)

2. กระบวนการ RNA editing โดยการแทนที่นิวคลีโอไทดในโมเลกุล mRNA ของสัตวเล้ียงลูกดวยนม เชน เบสไซโตซีน (cytosine: C) ถูกแทนทีด่วยเบสยูราซีล (uracil; U) (รูปท่ี 5.20)

รูปท่ี 5.19 RNA editing โมเลกุล mitochondria mRNA ของ Trypanosoma brucei

(ที่มา : http://www.mun.ca/biochem/courses/3107/images/Lodish/Lod12-58.jpg, 2547)

http://www.mun.ca/biochem/courses/3107/images/Lodish/Lod12-58.jpg


24 พันธุศาสตรโมเลกุลเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547 กวี สุจิปุลิ

24

รูปท่ี 5.20 RNA editing โมเลกุล mRNA ของ apolipoprotein B รูปท่ี 5.20 RNA editing โมเลกุล mRNA ของ apolipoprotein B

(ที่มา : http://www.web-books.com/MoBio/Free/images/Ch5A9.gif, 2547) (ที่มา : http://www.web-books.com/MoBio/Free/images/Ch5A9.gif, 2547)

(rna molecules)conf.agi.nu.ac.th/webnewasp/ereading/gene/unit5.pdf · (rna molecules)...

Documents