rna-seq_r

Expresión diferencial para datos de secuenciación

Introducción

En esta práctica vamos a analizar un experimento muy sencillo de RNA-Seq, usando el paquete edgeR deBioconductor. Este paquete contiene uno de los métodos más populares para analizar expresión diferencial paradatos de secuenciación. Los datos de "cuentas" se modelan usando la distribución Binomial Negativa, que se havisto que se ajusta mucho mejor a este tipo de datos que la Poisson que se usaba en un principio.

El paquete edgeR nos permite analizar experimentos bastante complejos, pero para esta práctica solo usaremos unconjunto sencillo de datos, una comparación entre Hígado y Riñón de humano. Estos fueron secuenciados en unIllumina GA por Marioni, et al. y descritos en el siguiente trabajo:

Marioni JC, Mason CE, Mane SM, Stephens M, Gilad Y. 2008. RNA-seq: an assessment of technicalreproducibility and comparison with gene Genome Res. 18(9):1509-17 (PubMed)

La Tabla Suplementaria 2 contiene las cuentas de lecturas agregadas de acuerdo a su mapeo contra los genes deEnsembl. Para esta práctica usaremos solo las primeras 7 muestras, consistiendo de 3 Riñón y 4 Hígados (el 8vocarril contiene un control).

Por favor descarguen el archivo: Marioni_SuppTable2.txt.zip

Recuerden que este archivo necesita ser descomprimido y colocando en su directorio de trabajo de R.

Se necesita lo siguiente para realizar esta práctica

R Instalado

Bioconductor Instalado

edgeR Instalado

Preparando los datos de cuentas

Primero necesitan iniciar R y cargar el paquete:

library(edgeR)

Vale la pena mencionar que este no es un tutorial muy completo, si no una vista rápida a algunas de lasposibilidades. Es muy recomendable que revisen el manual completo de edgeR, el cual incluye varios ejemplosexplicados y lo pueden abrir así:

edgeRUsersGuide()

# Nota: necesitan tener edgeR version 2.6.5 o superior, de lo contrario usen help.start()

counts = read.table("Marioni_SuppTable2.txt", header=TRUE, row.names=1)

head(counts)

http://www.lcg.unam.mx/~compu2/cei/sesion09.html

1 of 6 05/09/2014 06:23 PM

Kidney.1 Liver.2 Kidney.3 Liver.4 Liver.6 Kidney.7 Liver.8ENSG00000146556 0 0 0 0 0 0 0ENSG00000197194 0 0 0 0 0 0 0ENSG00000197490 0 0 0 0 0 0 0ENSG00000205292 0 0 0 0 0 0 0ENSG00000177693 0 0 0 0 0 0 0ENSG00000209338 0 0 0 0 0 0 0

Pueden ver muchos ceros, pero regresaremos a ello más adelante...

Cuántas muestras hay? Cuántos genes?

dim(counts)

[1] 32000 7

Claramente hay muchos genes que nunca fueron mapeadas, ni siquiera por un fragmento de alguno de lasbibliotecas. Conviene quitar estos genes, al igual que aquellos que fueron secuenciados a niveles muy muy bajos.De todos modos no vamos a poder decir nada interesante (estadísticamente) sobre ellos!

La función cpm nos calcula counts per million, es decir, divide entre el total de cada columna (muestra) y lo multiplicapor 1 millón.

counts = counts[rowSums(cpm(counts) >= 5) >= 2,]

dim(counts)

[1] 13265 7

También tenemos que decirle a edgeR como se encuentran agrupadas las muestras, en nuestro caso queremosdistinguir entre dos tipos de tejido. Podemos definir esto a mano, pero es mas fácil usar una función de R parasustituir (en este caso eliminar) algún texto de otro texto. ('.' significa cualquier caracter, '$' significa final de línea)

colnames(counts)

grp = sub("..$", "", colnames(counts))

grp

[1] "Kidney.1" "Liver.2" "Kidney.3" "Liver.4" "Liver.6" "Kidney.7" "Liver.8"

[1] "Kidney" "Liver" "Kidney" "Liver" "Liver" "Kidney" "Liver"

Ahora podemos combinar todo esto:

dge = DGEList(counts=counts, group=grp)

dge

An object of class "DGEList"$samples group lib.size norm.factorsKidney.1 Kidney 1789440 1Liver.2 Liver 1682034 1Kidney.3 Kidney 1839511 1Liver.4 Liver 1686546 1Liver.6 Liver 1621487 1Kidney.7 Kidney 1727889 1


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Liver.8 Liver 1566378 1

$counts Kidney.1 Liver.2 Kidney.3 Liver.4 Liver.6 Kidney.7 Liver.8ENSG00000209350 4 35 7 32 31 3 29ENSG00000212679 110 177 131 135 141 149 148ENSG00000212678 12685 9246 13204 9312 8746 12403 8496ENSG00000187634 49 27 43 34 23 41 35ENSG00000188976 73 34 77 56 45 68 5513260 more rows ...

$all.zerosENSG00000209350 ENSG00000212679 ENSG00000212678 ENSG00000187634 ENSG00000188976 FALSE FALSE FALSE FALSE FALSE 13260 more elements ...

Hay varias cosas que podemos hacer para explorar estos datos antes de proseguir, pero una de las más útiles esgenerar una imagen que nos permita identificar las relaciones entre todas las muestras. Una de las maneras es usarla función plotMDS, que realiza un análisis parecido a un PCA.

plotMDS(dge)

Podemos ver que las muestras de cada tejido se separan bastante bien, en este caso en la primera dimensión.

Normalización

La mayoría de los mejores métodos para analizar expresión diferencial basada en datos de cuentas (númerosenteros) consideran que no se deben modificar estas cuentas directamente para normalizarlas. En lugar de esto, secalculan factores de normalización que luego son usadas internamente por el modelo. Esto es bastante sencillo dehacer dentro de edgeR, aunque si hay muchas opciones que pueden ser modificadas para casos especiales.


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dge = calcNormFactors(dge)

dge$samples

group lib.size norm.factorsKidney.1 Kidney 1789440 1.2824730Liver.2 Liver 1682034 0.8274582Kidney.3 Kidney 1839511 1.2899479Liver.4 Liver 1686546 0.8292361Liver.6 Liver 1621487 0.8252799Kidney.7 Kidney 1727889 1.2923124Liver.8 Liver 1566378 0.8260124

Podemos realizar un diagnóstico visual sobre los cambios de expresión entre cualquier par de muestras (tomemoslas primeras dos). Figuras de tipo MA han sido populares desde el tiempo de los microarreglos, y comparan el logde la Abundancia (en este caso cuentas de lecturas mapeadas) en el eje X contra el log Fold-change (diferencia deexpresión) en el eje Y.

maPlot(dge$counts[,1], dge$counts[,2])

Para facilitar la interpretación podemos agregar una gradilla y una linea de tendencia, mostrando la diferencia entrelos dos factores de normalización de las mismas bibliotecas.

grid(col = "blue")abline(h = log2(dge$samples$norm.factors[2]/dge$samples$norm.factors[1]), col="red", lwd=2)

El bulto de los genes parece tener log Fold-changes negativos, lo cual sugeriría que la mayoría de los genes seexpresan más altamente en riñón comparado con hígado. Esto es poco probable que sea la realidad biológica, otraexplicación siendo que hay un subconjunto de genes muy altamente expresados en hígado (encerrados en el óvalomorado) que están acaparando muchas de las lecturas, dejando el resto de los genes subrepresentados. Losfactores de normalización pueden corregir este efecto, como podemos ver mediante el valor negativo de la línea roja(que representa el centro de los datos después de normalizar).


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Analizar la expresión diferencial

Para hacer un análisis de expresión diferencial necesitamos estimar la dispersión de nuestros datos, y luego haceruna prueba para buscar diferencias entre nuestros dos tejidos.

dge = estimateCommonDisp(dge)

et = exactTest(dge, dispersion=dge$common.dispersion)

Después podemos interrogar los genes más diferencialmente expresados:

topTags(et)

Comparison of groups: Liver-Kidney logFC logCPM PValue FDRENSG00000105697 8.514453 8.098067 0 0ENSG00000141485 8.344629 9.251094 0 0ENSG00000134391 8.002654 7.573499 0 0ENSG00000139547 7.860641 9.643655 0 0ENSG00000151490 -7.849813 7.586220 0 0ENSG00000151224 7.812275 11.464031 0 0ENSG00000123843 7.771028 7.880559 0 0ENSG00000197901 -7.702878 7.046667 0 0ENSG00000005421 7.691921 7.382464 0 0ENSG00000140505 7.683381 8.561442 0 0

Estos pocos genes tienen una confianza estadística excelente. Probablemente querramos ver una lista má grande ycompelta de genes. Generalmente es más fácil obtener la evaluación estadística de todos los genes y despuéselegir los umbrales de corte a utilizar.

deTab = topTags(et, n=Inf)$table

head(deTab)

logFC logCPM PValue FDRENSG00000105697 8.514453 8.098067 0 0ENSG00000141485 8.344629 9.251094 0 0ENSG00000134391 8.002654 7.573499 0 0ENSG00000139547 7.860641 9.643655 0 0ENSG00000151490 -7.849813 7.586220 0 0ENSG00000151224 7.812275 11.464031 0 0

Podemos elegir ahora genes que tienen un P-valor ajustado de menos de 0.01 (esto representa la fracción de falsospositivos) y una magnitud de cambio (log Fold-change) mayor a 1 (fuera de escala log2, mayor a 2).

deGenes = rownames(deTab)[deTab$FDR < 0.01 & abs(deTab$logFC) > 1]

head(deGenes)

length(deGenes)

[1] "ENSG00000105697" "ENSG00000141485" "ENSG00000134391" "ENSG00000139547" "ENSG00000151490" "ENSG00000151224"

[1] 5132

Hay otra figura que puede ayudarnos a observar los genes que estamos encontrando como diferencialmenteexpresados:


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plotSmear(dge, de.tags=deGenes)

Finalmente, podemos guardar la tabla completa de nuestros resultados de expresión diferencial. Podemos hacerloasí:

write.table(deTab, file="DiffExp_edgeR.txt", sep="\t")

Ejercicios:

Cuáles y cuántos genes hay que se expresan más altamente en Hígado?y en Riñón?


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rna-seq_r

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