รั�ชนี�กรั ก�ลลปรัะวิ ทธ์2557

Gene : ส่�วนของ DNA ที่� transcribe ไปเป�น RNA หรื�อ protein

Central DogmaDNA RNA protein

RNA synthesis (transcription) เป�นีขั้��นีตอนีแรักในีการัแสดงออกขั้องยี�นีโดยีการัแปลรัหั�สจากเบสบนีสายี DNA มาเป�นีล"าด�บเบสขั้อง RNA

2

Transcription : ถู�กควบค�มในที่�กเซลล�

ใน prokaryotes 3% ของยีนจะม transcription ในขณะที่�ยีนของ differentiated eukaryotic cells 0.01% เที่�าน#$นที่�จะถู�ก transcribed ณ เวลาใดเวลาหน&�ง

3

RNA synthesis (transcription)

Size RNA < DNA

Largest RNA mol = 50,000

nucleotides

Smallest DNA mol = 45,000,000

bp.

RNA single strand

(mRNA, tRNA, rRNA)snRNA

scRNA

snoRNA

miRNA

4

RNA synthesis ต้(องการื1. DNA template

2. ribonucleoside triphosphate

(ATP, GTP, CTP, UTP)

3. DNA dependent RNA polymerase

4. Mg2+, Mn2+ ไม�ต้(องการื primer

5

Transcription is initiated at promoter sites

on the DNA template

กรืะบวนการื transcription เรื)�มโดยี RNA

polymerase มาจ#บบนส่ายีของ DNA ที่�บรื)เวณ promoter ซ&�งเป�นต้+าแหน�งที่�มล+าด#บ nucleotide

ค�อนข(างจ+าเพาะแน�นอน เรืยีกว�า consensus หรื�อ conserved sequence

6

ท�# promoter อาจเป�นี palindrome sequence คื%อ nt สายีหันี&#ง จะเหัม%อนีก�บ nt อ�กสายีหันี&#ง แต'อยี('ในีท ศทางตรังก�นีขั้*าม

G G A T C CC C T A G G

7

DNA TTGACA TATAAT

Prokaryotic promoter site

template PRIBNOW BOXSTART OF RNA

5' -35 -10 +1

Eukaryotic promoter site

DNA GGNCAATCT GC

TATA5' -75 -25 +1

templateCAAT BOX

TATABOX(HOGNESS BOX)

8

9

RNA polymerase ใน eukaryote ไม�ส่ามารืถูจ#บบรื)เวณ promoter และเรื)�มการืส่#งเครืาะห� RNA ได(ด(วยีต้#วเอง ต้(องอาศั#ยีโปรืต้นที่�เรืยีกว�า transcription factor

มาจ#บที่� promoter ก�อน

10

Transcription factors ขั้อง RNA polymerase II ท�#ส�งเคืรัาะหั mRNA ในีคืนีแบ'งเป�นี 2 ปรัะเภท1. TF ขั้อง gene ท�#ท"าหันี*าท�#เหัม%อนีก�นีในีแต'ละ cell และท"า

หันี*าท�#ปรัะจ"าในีแต'ละ cell (housekeeping gene) gene เหัล'านี��จะถู(ก transcribed ตลอดเวิลา เรั�ยีกวิ'าconstitutive genes e.g. enzyme ในี glycolysis, Krebs cycle, ETS etc.

2. TF ขั้อง gene ท�#ท"าหันี*าท�#จ"าเพาะต'อ cells, tissues gene เหัล'านี��จะถู(ก transcribed ในี cells และ tissues บางชนี ดเฉพาะเวิลาท�#จ"าเป�นี และในีบางเวิลาขั้องการัพ�ฒนีาการัเท'านี��นี

11

- Transcription factors interact with

eukaryotic promoters : TF I , II

Sp 1- 95 Kd or 105 Kd protein from mammalian cells- required for transcription of genes whose

promoters contain GC boxes

ต�วิอยี'าง

12

CTF

- CCAAT binding transcription factor

- 60 Kd- bind to the CAAT Box

B-protein - bind to TATA boxHeat-shock transcription factor

gal 4 protein : - bind ก�บ upstream sequence ขั้อง promoter ขั้อง gene ท�# encode enzyme ในีการั

metabolize galactose13

14

นีอกจาก promoter แล*วิ DNA ขั้อง eukaryotes ช��นีส(ง ม�ส'วินีท�#ท"าหันี*าท�#คืวิบคื0ม transcription ท�#เรั�ยีกวิ'า transcription elements e.g. enhancer,silencer และ response element

enhancer : - DNA sequence ท�#เพ #ม rate ขั้อง initiation ขั้อง transcription โดยี RNA pol II

- อาจอยี('ท�# upstream, downstream หัรั%อ กลาง gene ท�#ถู(กtranscribed

15

silencer : DNA sequence ท�#ลด หัรั%อยี�บยี��ง transcription

response elements : DNA sequence ส"าหัรั�บ

จ�บก�บ transcription factor ท�#ถู(กคื0มโดยี signaling molecule เช'นี cyclic AMP response elements

16

Hormonal action of glucocorticoids

enhancerpromoter

Inactive gene

hormone-receptorcomplex

mRNA synthesis

promoter

activatedenhancer

+active gene

17

RNA polymerase

upstream sense strand (+) downstream

DNA5-ATG-TCC-GCA-CGG-CCT-33-TAC-AGG-CGT-GCC-GGA-5

antisense (template) strand (-)

transcription

RNA5 -AUG-UCC-GCA-CGG-CCU-3translation

Protein NH3-Met-Ser-Ala-Arg-Pro-CO2

+ -

aminoterminus

carboxylterminus

18

RNA polymerase

Prokaryotic cell ม� 1 ชนี ดEukaryotic cell ม� 3 ชนี ด

RNA polymerase Location Product

I, A nucleolus rRNA II, B nucleoplasm mRNA III, C nucleoplasm tRNA

(5S rRNA)sn RNA, sc RNA

mitochondria RNAs in mito.

REMOTE19

DNA dependent RNA polymerase

- form phosphodiester bond

ท ศทาง 5 3

- ม� 6 subunits α2 ββ σω

α2 ββ = core enzyme

σ sigma factor

20

เป�นีต�วิก"าหันีดจ0ดเรั #มต*นีส�งเคืรัาะหับนี DNA template และจะเขั้*ามารัวิมก�บ core enzyme เม%#อเรั #มต*นีการัส�งเคืรัาะหั RNA

เม%#อ ส�งเคืรัาะหั ได* RNA strand ยีาวิ 10 nucleotides ก3จะแยีกจาก core enzyme

α - binds regulatory sequencesβ - forms phosphodiester bondβ' - binds DNA templates - recognizes promoter and initiates

synthesisω - unknown

σ

21

DNA

2

first nucleotides ATP, GTP5' 2 (core enzyme)

RNA synthesis1. initiation2. elongation3. termination rho factor[]4. release 22

23

Stem-loop structure

Termination of transcription24

Rho protein

ATP +

H2O

ADP +

H2O

ppp5

RNA polymerase

Termination of transcription

25

Sequences in DNA

1. unique - nonrepetitive code ส"าหัรั�บ protein 2% ขั้อง genome

2. moderately repetitive <106 copies/haploid กรัะจายีอยี('ในี unique sequence

3. highly repetitive 5-500 bp, 1-107 copies/haploid

26

Coding region

Intervening sequence

translation

5

3

RNA transcript

DNA strand

mRNA

Spliced mRNA

Polypeptide chain

CapPoly A

H2N COOH 27

mRNA ท�#ส�งเคืรัาะหัจาก DNA เป�นี primary

transcriptเรั�ยีกวิ'า heterogeneous nuclear

RNA (hnRNA) ต'อมาจ&งม� posttranscriptional

processing ก'อนีผ่'านีออกจาก nucleus

28

PPPA

(G)

5 3poly A 200

guanosineM7 M6 M

1. nucleotide ต�วิแรักม� base เป�นี A หัรั%อ G

2 . ม� poly A (200 AMP) มาต'อทาง 3 –OH

3. ทาง 5 –P จะม� guanosine มา capped

4. ม� methylation ท�# M7G และ M6A และ methylate

ribose-2 ขั้อง A (or G) (& อาจท�# nucleotide ต�วิถู�ดไปด*วิยี)

5. ต�ดส'วินีท�#เป�นี intron ออก และเช%#อม exon เขั้*าด*วิยีก�นี (splicing)

29

Posttranscriptional processing of mRNA

30Posttranscriptional processing

Splicing ต*องอาศ�ยีโมเลก0ลขั้อง RNA ขั้นีาดเล3กท�#อยี('ในี nucleus และ cytosol

- small nuclear RNA (snRNA) และ - small cytoplasmic RNA (scRNA)

ซ&�ง RNA เหล�าน$ม#กจะอยี��รืวมก#บโปรืต้นเป�น - small nuclear ribonucleoprotein particles

(snRNPs, snurps) และ - small cytoplasmic ribonucleoprotein

particles (scRNPs, scurps)

31

snRNP (size) Role

U1 (165nt) binds the 5 splice site and then the 3 splicesite

U2 (185nt) binds the branch site and forms part of the catalytic center

U5 (116nt) binds the 3 splice siteU4 (145nt) masks the catalytic activity of U6U6 (106nt) catalyzes splicing

complex U1, U2 + mRNA precursor + U4-U5-U6 complex

spliceosome (60S complexes)

32

ApG***

*** ApG

*** ApG

pGpUp pGpUpRpApYp ApG

pGpUpRpApYp ApG

pG

pU

p

pGpUpRpApYp

pG

pU

p

OH 2′

OH 3′

OH

3′ApG

5

5

5 3

3

3

5′splice site

3′splice site

exon1 intron exon2

Pre-mRNA

1

2

Intron

exon1 exon2

exon2exon1

(2,5)

(2,5)

spliced junction

+

+

+excised intron in lariat form

spliced exons

U1 U5U2

U4/6

AG GU AG

Complex U1 ,U2 + mRNA precursor + U4 –U6-U5 complex

Spliceosome (60s complex)33

Splice sites in mRNA precursor are specified by sequences atthe end of introns.

5 AGGUAAGU A CAGG 3Branch site

intron

Splicing : snRNPsATP

spliceosome

SLE : systemic lupus erythematosus

results from autoimmune response in which patientsproduces Ab against snRNPs

34

1 2 543 hn RNA

Constitutive Splicing

1 2 3 4 5 AAAAAAAAll splicesites used

1 2 543

1 2 4 5 AAAAAA

Segment 3 deleted by Alternative Splicing

35

1 2 543 hn RNAa b

Poly A addition signals

1 2 3 4 AAAAAA Site a used

1 2 3 4 5 AAAAAASite b used

Alternative tailing

36

Thalassemia บางชนี ดmutation G A (19nt away from normal 3 splice site of first intron)

new 3 acceptor site (splice site)

Aberrant protein

37

Aberrant splicing

Normal

5 CCTATTGGTCTATTTTCCACCGTTAGGCTGCTG 3

Normal 3 end of intron

-thal

5 CCTATTAGTCTATTTTCCACCGTTAGGCTGCTG 3

38

e.g. apolipoprotein B mRNA editing protein

human plasma : apo B 2 isoproteinsapo B 100, apo B 48

synthesized from a single gene by mRNA editingmechanism

39

Posttranscriptional RNA editing

apo B100 in liver is translated from a full-length 14.1 kb mRNA

apo B 48 in intestine is synthesized from

an apo B mRNA containing

premature inframe

translational stop codonCAA UAA

40

14536512kd

Lipoprotein assembly LDL receptor binding

Apo B 100Translation

CAA5 3Unedited mRNA

NH4RNA editing by deamination

UAA5 3Edited mRNA

Translation

1 2152240 kd

Apo B 48

41

Posttranscriptional RNA editing

5S ได(จาก 5S rRNA precursor

5.8S, 18S, 28S ได(จาก 45S rRNA precursor

5 3

121 nucleotides

5S rRNAprecursor

18S 5.8S 28S

45S rRNAprecursor

42

rRNA in eukaryotic cell

Eukaryotic ribosome

23 S RNA 5S RNA ~34 proteins

16 S RNA

~21 proteins

28S RNA 5.8S RNA5S RNA ~50 proteins

18S RNA

~30 proteins

70S

50S

30S

80S

60S

40S43

Prokaryotic ribosome

: The discovery of catalytic RNAThomas Cech

26S rRNA precursor from Tetrahymena

self splicing5'

3exon

intron

exon5

3

GOH

5

3

spliced exon

+

OH

G

5

3

5

3

L19RNA

catalytically active

L-19 IVS – nuclease and polymerase

OH

G

G

44

Self-splicing RNA

t RNARNA ท�#ม�อณู(เล3กท�#ส0ด 4S (73-93 nucleotides) ม� 50+ ชนี ด (for 20 aâ)

ม modified base เช่�น methylation, deamination

tRNA ที่�ที่+าหน(าที่�จ#บก#บ amino acid ช่น)ดเดยีวก#นเรืยีกว�า isoaccepting tRNA

5 3ribonuclease P exonuclease

5 G C-C-A 3

CTP, CTP, ATP

5 3G

ACC

anticodon จ�บก�บ codon บนี mRNA45

46

ส่ารืที่�ยี#บยี#$ง RNA synthesis1 . รัวิมก�บ DNA template2. ยี�บยี��ง RNA polymerase

1. รัวิมก�บ DNA template

1.1 Intercalation

Actinomycin D (between 2G-C base pairs)

inhibit transcription > replication : daunomycin,

doxorubicin, mithramycin, ethidium bromide

1.2 Cross-link

Alkylating agents – nitrogen mustard,

mechoethamine etc. form cross link รัะหัวิ'าง 2

guanines (N7) ท�#อยี('คืนีละสายี47

2. ยี�บยี��ง RNA polymerase

2.1 Rifamycin, rifampicin

inhibit RNA polymerase (initiation) ขั้อง prokaryote,

inhibit only mitochondrial RNA polymerase ขั้อง eukaryote

2.2 -Amanitin

Amanita phalloides

inhibit mammalian nuclear RNA polymerase II

2.3 Streptolydigin

inhibit RNA elongation

48