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RNA編集機構を利用した 部位特異的RNA変異導入法

福岡大学理学部化学科

　　　　助教　福田 将虎

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本発明の概要

RNA編集酵素（ADAR）を目的RNAに誘導し、標的アデノシンをイノシンに変異する

※編集ガイドRNA

編集ガイドRNAを用いた新しいRNA変異導入技術

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発表内容

1.  研究背景 2.  RNA変異導入とRNA編集機構 3.  編集ガイドRNA 4.  実施例 5.  問題点と今後の展望

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研究背景（タンパク質の合成経路 -セントラルドグマ-）

DNA

RNA タンパク質

設計図 生命現象の担い手

DNA情報を運ぶ

遺伝情報はDNA→RNA→タンパク質の順に流れる。 タンパク質の様々な機能により生命現象が支えられている

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DNA

RNA タンパク質

多くの病気はタンパク質の機能異常により生じる

作られる量や機能が変わる

研究背景　（タンパク質機能の異常は病気の原因）

設計図 生命現象の担い手

DNA情報を運ぶ

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DNA

RNA タンパク質

設計図 生命現象の担い手

DNA情報を運ぶ

タンパク質機能を自在に操ることができるようになれば、 生命現象を制御できる。

＝病気の予防、治療ができる

機能制御

研究背景（タンパク質機能制御の位置づけ）

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DNA RNA タンパク質

生体内標的タンパク質機能制御方法

情報 機能

情報のレベルで標的タンパク質の機能を制御

標的タンパク質の機能を直接制御する

（一般的な薬剤） （siRNAやゲノム編集技術）

RNA変異導入技術は確立されていない

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DNA変異導入とRNA変異導入の違い

DNA変異 RNA変異

恒常的 一過的 （細胞が死ぬまで続く）

一度変異を導入すると元に戻らない

標的を容易に変更可能

RNA変異導入技術はDNA変異とは異なる効果が得られる

効果

標的

リスク

用途 DNA遺伝子治療 未開発

DNA RNA

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本技術開発の目的

● siRNA, miRNAによる標的タンパク質発現抑制

細胞内在性の機構を利用するため、RNAを細胞に導入するだけ （外来のタンパク質を必要としない）

○ 標的RNAと相補的な配列を設計

（従来のRNAを標的としたタンパク質機能制御技術）

○

従来技術に匹敵する「RNA変異導入技術」を開発する

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RNA編集機構

DNA

RNA タンパク質

N

NN

N

NH2

O

OH

OPO-

O

OPO O-

NH

NN

N

O

O

OH

OPO-

O

OPO O-

adenosine inosine

A-to-I RNA 編集

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Prior to editing After A-to-I editing

AGU/C IGU/C

UAU/C UIU/C

ACA/C/G/U IGA/C/G/U

AUU/A/C IUU/C/A

AUG IUG

UAA UIA, UAI

CAU/C

CIU/C

AAA/G IGA/G

AAU/C IAU/C

CAA/G CIA/G

GAU/C GIU/C

GAA/G GIA/G

IAA/G

AIU/C

Ser

Tyr

Thr

Ile

Start/Met

Stop

His

Lys

Asn

Gln

Asp

Glu

Gly

Cys

Ala

Val

Val

Trp

Arg

Gly Glu

Asp Ser

Arg

Gly

Gly

UAG, UGA

UIG Stop Trp

A-to-I RNA編集によるコドン変換

N

NN

N

NH2

O

OH

OPO-

O

OPO O-

NH

NN

N

O

O

OH

OPO-

O

OPO O-

IはGとして翻訳される

A I

-AGU- -IGU- -GGU- Ser Gly

RNA編集によるコドン変換

タンパク質機能、リン酸化の制御

=

（例）

細胞内シグナル伝達を始め、多くの生体内プロセスの制御が可能

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Adenosine deaminase acting on RNA (ADAR)

● ADARノックアウトマウスは、

ADAR1: 胚性致死

ADAR2: 生後2〜3週間で致死

RNA編集酵素

● 二本鎖構造中のアデノシンを編集する

Higuchi, M. et al., Nature, 406, 78. (2000)

Wang, Q. et al., Science, 290, 1765. (2000) dsRBD2 dsRBD1

Deaminase domain

Macbeth, M.R. et al. Science 309, 1534 (2005) Stefl, R et al. Cell, 143, 225. (2010)

hADAR2の構造 ● miRNAのプロセシング及びRNAサイレンシングを制御 Nishikura, K. et al. Cell, 153, 575. (2013)

N

NN

N

NH2

O

OH

OPO-

O

OPO O-

NH

NN

N

O

O

OH

OPO-

O

OPO O-

A I

● ほとんどの細胞種で発現（特に神経細胞で高発現）

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A-to-I RNA編集機構を利用したRNA変異導入

dsRBD2

標的RNA

A I

hADAR2 標的RNAにADARを誘導し、 部位特異的にA-to-I変異を導入する

RNA変異導入法

標的アデノシン

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標的部位の設定（相補配列）

標的RNA

標的アデノシン

相補配列

U�

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従来のRNA変異導入法の特徴

U�

Stafforst, T., Schneider, M. F. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51, 11166. (2012)

（従来の方法は修飾したADARを用いる）

・煩雑な操作が必要

・内在のRNA編集に干渉する可能性

標的RNA

相補配列

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編集ガイドRNA（AD-gRNA）コンセプト

標的RNA

A I

hADAR2

ADARを目的部位に誘導するガイドRNA

ADAR-guide RNA (AD-gRNA)

AD-gRNAによるRNA変異導入 ・内在のRNA編集機構を利用 ・相補配列で標的を設定

標的アデノシン

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CAUUA GGUGGGUGG AUA UAUAACAAUAU

GUAGU CCAUCCACC UAU AUAUUGUUGUA

A G G C U A

A G C C

A

dsRBDsとGluR2 RNAの複合体

(Stefl, R et al. Cell, 143, 225. (2010))

hADAR2

dsRBD1 dsRBD2

Deaminase domain

GluR2 RNA （生体内の編集基質RNA）

編集ガイドRNA(AD-gRNA)設計コンセプト

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GGGUGG AUA UAUAACAAUAU

XXXXX XXXUCCACC UAU AUAUUGUUGUA

A G G C U A

A G C C

A NNNNN NNN

編集ガイドRNA(AD-gRNA)設計コンセプト

標的RNA

AD-gRNA

相補領域 ADAR結合領域

● 天然型ADARを誘導 　（内在のRNA編集機構を利用） ● 相補領域の配列で標的部位を設定

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実施例 1　（AD-gRNAの設計と機能評価）

200

複合体形成確認（Gel shift assay）

(Annealing reaction condition) 300 nM GFPs RNA (160 nt) 900 nM AD-guide GFP_A200 10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl 80 ºC 3 min, slope 25 ºC for 15 min

8% Native PAGE (EtBr staining)

Lane 1: GFPs RNA (160 nt) Lane 2: AD-guide GFP_A200 Lane 3: Annealed sample

1 2 3

hADAR2 A

+

in vitro editing reaction

RT-PCR

Direct sequencing

In vitro 編集解析

5’

ACUGGUGGGACUCGA

A GFP mRNA

UGACCACCCUGAGCU CGGCGUGCAGUGCUU

GCC

3’

AD-guide GFP_A200

3’ C

配列設計

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(reaction condition) 12.5 nM recombinat ADAR2, 5 nM guide RNA -target RNA complex, 20 mM HEPES-KOH (pH 7.5),2 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 0.01% TritonX-100, 5% glycerol reaction duration: 2 h

A GG GC T A C GG G C

hADAR2

A

Antisense RNA

A GG GC T G C GA G C

hADAR2

A

AD-guide RNA

A GG GC T A C G G C

A

hADAR2

No guide-RNA

GFP RNA

200

0

20

40

60

80

100

guide (-) antisense AD-guide GFP_A200

% e

ditin

g�

編集率（反応時間1時間） ※ ピーク高の比（G/(A+G)）から算出

実施例 1　（AD-gRNAの設計と機能評価）

標的部位特異的な 変異導入に成功 （変異導入効率：約80％）

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改変型ADg-RNA（ADg-rRNA）の設計

3’-antisense

GCCGCACGUCAUGAA C 5’ CGA

5’-antisense

200

5’

ACUGGUGGGACUCGA

A GFP mRNA

UGACCACCCUGAGCU CGGCGUGCAGUGCUU

GCC

3’

ADg-GFP_A200

3’ C

200

5’ A GFP mRNA

UGACCACCCUGAGCU CGGCGUGCAGUGCUU

3’

ADg-rGFP_A200

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(reaction condition) 12.5 nM recombinat ADAR2, 5 nM guide RNA -target RNA complex, 20 mM HEPES-KOH (pH 7.5),2 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 0.01% TritonX-100, 5% glycerol

編集率（経時変化）

guide RNA (-)

ADg-rGFP _A200

実施例 2 (ADg-rGFP_A200の設計と機能評価)

A200

変異導入効率の向上に成功 （変異導入効率：約100％）

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新技術の特徴・従来技術との比較

•  タンパク質因子を必要とする従来技術と比べ、本技術は編集ガイドRNAのみで目的変異導入を達成できる（使いやすい、低コスト）

•  標的部位の設定は単純な相補配列で設定できる　（汎用性が高い、カセットベクター等の構築も可能）

•  本RNA変異導入法は、タンパク質機能制御に応用できるため、多くの生体内プロセスの制御に適用できる（創薬基盤技術への展開）

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想定される用途

•  本技術（ＲＮＡ変異導入）の特徴は、ゲノム情報を改変することなく、遺伝情報（タンパク質機能情報）を変換できることにある。

○ 新たな創薬基盤技術

核酸創薬（タンパク質リン酸化阻害剤、など）

○ 遺伝子変異導入ツール（基礎研究用）

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実用化に向けた課題 •  現在、in vitro （培養細胞内）における変異導入が可

能。しかし、実細胞及び生物個体での実施が課題。

•  今後、初代神経細胞内及びマウス個体での編集ガイドRNAの機能性について実験データを取得し、条件設定を行っていく。

•  アプタマー、siRNA等を用いた核酸創薬と同様の問題（コスト、薬効、ドラッグデリバリーなど）に直面する。逆に、これら技術に適用されている化学修飾や導入方法を応用し、実用化に向けて、編集ガイドRNAの最小化及び高機能化する必要がある。

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企業への期待

•  RNA変異導入技術の確立及びその応用研究に興味を持って頂ける企業。特に、核酸創薬及び生物個体における機能評価技術を持つ、企業との共同研究を希望。

•  また、核酸医薬品を開発中の企業、遺伝子治療への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。

「RNA変異導入技術」を用いた創薬は未だ例が無い

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本技術に関する知的財産権

出願番号 ：特願2015-140894 出願人 ：福岡大学 発明者 ：福田 将虎

（発明の名称）

部位特異的ＲＮＡ変異導入方法およびそれに使用する標的編集ガイドＲＮＡならびに標的ＲＮＡ－標的編集ガイドＲＮＡ複合体

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問い合わせ先

福岡大学

研究推進部  産学官連携センター

担当コーディネーター　芳賀  慶一郎

ＴＥＬ ０９２-８７１-６６３１（内線２８０９）

ＦＡＸ ０９２-８６６-２３０８

e-mail khaga@adm.fukuoka-u.ac.jp