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RNAseq et NGS

Journée Transcriptomique| Evry 10 juin 2014

Adriana Alberti – Karine Labadie

LES TECHNOLOGIES

METHODE SANGER

ABI 3730 xl

NGS 2ème génération

Pyroséquençage

- Roche 454 GS-FLX+

/ Roche GS Junior

Séquençage Illumina

- HiSeq / MiSeq /

NextSeq500…

Séquençage SOLiD

Séquençage PGM / Ion

Proton


PacBio

Nanopore

LES ORGANISMES

EUCARYOTES

animaux

plantes

champignons

protistes

BACTERIES

ARCHEES

VIRUS

METAGENOMES

LES SOURCES

ADN GENOMIQUE

ARN / cDNA

AMPLICONS

BACs ET FOSMIDES


Séquençage et Diversité


LES APPLICATIONS

Genome : de novo sequencing; targeted re-sequencing;

whole genome re-sequencing

Epigenome: methylation analysis, Chromatine

Immunoprecipitation Sequencing (ChIP-Seq)…

Metagenome and Amplicon Sequencing

Transcriptome : whole transcriptome analysis; small

RNA analysis; gene expression profiling

Séquençage et Diversité

LES TECHNOLOGIES

METHODE SANGER

ABI 3730 xl


Pyroséquençage

- Roche 454 GS-FLX+

/ Roche GS Junior

Séquençage Illumina

- HiSeq / MiSeq /

NextSeq500…

Séquençage SOLiD

Séquençage PGM / Ion

Proton


PacBio

Nanopore

Journée Transcriptomique| Evry 10 juin 2014 Adriana Alberti – Karine Labadie


Solid Ion PGM Ion Proton

Quelles différences?

Le Principe

La Quantité et la Qualité des données

Les Longueurs de Lectures

Les Modes de Lecture

Impact sur les applications

2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014

NGS : de perpétuelles évolutions

GS 20

GA HiSeq MiSeq

2em

e g

én

éra

tio

n

3em

e

gén

éra

tio

n

GS Flx

NextSeq500



NGS : des spécifications très variées

Un compromis entre le nombre de lectures attendus et leurs longueurs

Output range Run time Expected Reads Maximum Read Length

454 / Roche GsFlx + 800 Mb 1 day 1 M 800 bp

MiSeq 0,3 - 15 Gb 5 - 60 h 15-25 M 2 x 300 bp

HiSeq 2000 100 - 600 Gb 2 - 11 days 3000 M 2 x 100 bp

HiSeq 2500 rapid run 10 - 180 Gb 7 - 40 h 300 M 2 x 150 bp (2 x 250 bp)

HiSeq 2500 high-output 50 - 1000 Gb 1-6 days 2000 M 2 x 125 bp

HiSeq Xten 1600 - 1800 Gb < 3 days 3000 M 2 x 150 bp

SOLiD 25 - 100 Gb 1 - 15 days 1400 M 75 bp

Ion PGM 30 Mb - 2 Gb 2 - 7 h 0,5 - 5 M 400 bp

Ion Proton 10 Gb 2 - 4 h 60 - 80 M 200 bp

Pacific Bioscience PacBio RS II 275 - 375 Mb 3 h 0,05 M 30 Kb

Oxford Nanopore MinIon 100 Mb 6 h ? 50 Kb

Illumina

Life Technologies


Evolution débit / coût du séquençage de 2001 à 2013

11 JUIN 2014

1 Mb / jour

20 => 700 Mb / jour

1 => 160 Gb / jour

5.000 $ / Mb

0,03 $ / Mb

2005

2007

2013


NGS : la course au diminution de coûts …


Evolution débit / longueur de lecture de 2001 à 2013

11 JUIN 2014


1 Mb / jour

20 => 700 Mb / jour

1 => 160 Gb / jour

900 bases

2 x 150 bases

700 bases

NGS : des longueurs de lectures…



NGS: avantages et inconvénients

454 Roche Illumina SOLiD Ion PGM

Ion Proton PacBio

AVANTAGES

Séquençage de

longs fragments

(=> 800 bases)

Débit élevé

Taux erreur

<2%

Coût

Large domaine

d’applications

Débit (150

Gb/sem)

Coût

Taux erreur <1%

Pas de système

optique mais un

détecteur

électronique

Utilisation de

nucléotides non

marqués

Capacités

dépendantes

des puces

Pas

d’amplification

Rapidité (3

bases/sec)

Longueur de

lecture (5 Kb en

moyenne)

INCONVENIENTS

Préparation des

banques

(emPCR)

Taux erreur

élevé (homo-

polymères)

Coût élevé

(systèmes

enzymatiques)

Débit limité

Lectures

courtes (haut

débit)

Fréquence des

évolutions

techniques et

logicielles

Taille des

fichiers

générés

Faible

complexité

(haut débit)

Préparation des

banques

(emPCR)

Lectures courtes

Complexité

d’analyse

Préparation des

banques

(emPCR)

Difficulté à

séquencer les

homopolymères

Coût

Taux d’erreur

élevé (~15%)

Photo-

inactivation de la

polymérase

Coût

Un avantage pour la technologie Illumina (60% du marché)



RNAseq: an approach for multiple applications

To catalogue all species of transcripts (mRNA, non coding RNA, small

RNA..)

To determine the transcriptional structure of genes (start site, 5’ and 3’

ends, splicing patterns)

To annotate de novo genomes

To perform gene expression profiling

To detect polymorphisms (CNV, SNP, micro indels)



Differents RNA, different questions, different

library preparations

Next generation sequencing protocol

cDNA, not RNA sequencing

Types of libraries available

Total RNA sequencing (stranded or not)

polyA+ RNA sequencing

Small RNA sequencing

Sequencing options

Single or paired end reads

Different lenghts (from 100 bp up to 300 bp)



rRNA removal strategies

Generally, rRNA have to be removed by:

rRNA removal treatments (ex RiboZero): you keep tRNA, small RNA,

cytoplasmic and chloroplastic mRNA at various maturation steps

BUT smallRNA are lost during library preparation

( specific small RNA library preparation methods are available)

Selection of polyA+ RNA by beads or oligodT priming (only cytoplasmic

mature mRNA are retained)



rRNA depletion

or polyA+ capture by beads

AAAAAAA TTTTTTTTT

RNA fragmentation

cDNA synthesis by

oligo-dT priming

cDNA fragmentation

cDNA synthesis by

random priming

Total RNA

Library preparation

Cytoplasmic mature mRNA AAAAAAA

NNNNNN NNNNNN NNNNNN Random

hexamers

TTTTTTTTT Oligo(d)T

cDNA preparation methods

polyA + capture

by oligo dT priming


RNAseq strategy has to be choosen based on characteristics of your study

- Eukaryotic or prokaryotic study?

- For eucaryotes: which RNA target? polyA+ mRNA or more?

- Is your sample challenging in terms of quantity and quality?

Laser capture microdissection

FFPE samples

Environmental samples

Single cells

11 JUIN 2014

Different RNAs, different questions, different strategies



METHODS

OligodT priming

Random priming

Random priming with

coding strand

information

SAMPLE TYPE

Eukaryotic total RNA

(RIN 7-10, >100 ng)

Prokaryotic total RNA

Small quantity of RNA,

single cell

(RIN 7-10)

LCM and FFPE samples,

degraded samples

(RIN 2-7)

In summary…


Merci pour votre attention


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