roman gardlík - imbm• replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, hsv,...

Ústav molekulárnej biomedicíny LF UK

Roman Gardlík

[email protected]

Francis Crick

(1916 – 2004)

Nobel prize

1962 – Physiology or medicine

James Watson

(1928 – )

Nobel prize

1962 – Physiology or medicine

BiomeD

Génová terapia

• Definícia

• Princípy

• Rozdelenia

• Vektory

• Klinika

• Problémy

BiomeD

Definícia

• Všetky prístupy na liečenie chorôb, ktoré

využívajú nukleové kyseliny a génové

inžinierstvo

BiomeD

Princípy génovej terapie

• Náhrada génu

• Zabitie cieľovej bunky

• Oprava mutácie

• Cielená inhibícia génovej expresie

• Cielená overexpresia génu

BiomeD


• Cieľom je zvyčajne dosiahnuť

– stabilnú expresiu transgénu…

– v cieľovom tkanive…

– po takú dlhú dobu ako je potrebné…

– vo vhodne regulovanej forme…

– bez vedľajších účinkov

BiomeD


• Náhrada génu

BiomeD



BiomeD



Vektor

Gén pretymidín kinázu

Bunka tumoru

ganciklovír fosfát inhibuje DNA polymerázu

ganciklovír

tk

BiomeD


• Zabitie cieľovej bunky indukciou

imunitného systému

BiomeD


• Oprava mutácie

BiomeD


• Cielená inhibícia génovej expresie

BiomeD


• Ribozýmy

BiomeD


• Oligodeoxynukleotidy

– Antisense stratégia

– Antigénová stratégia

BiomeD


• Antisense RNA

BiomeD


• Antigénová stratégia

BiomeD


• RNA interferencia

BiomeD


• RNA interferencia

shRNA

BiomeD

Gene editing

• Zinc finger nucleases

• TALENs

• CRISPR/Cas9

– Restrikčné enzýmy

– Spôsob využitia:

• 1. Knock out – vyradenie génu

• 2. Korekcia – oprava génu

• 3. Knock in – vloženie génu

– Targeting špecifických sekvencií v genóme

BiomeD

Gene editing

• Zinc finger nucleases

– DNA binding domain + DNA cleavage domain

– Making use of endogenous DNA repair machinery

– Require making custom protein for each specific

target

BiomeD

Gene editing

• TALENs – transcription activator-like

effector nucleases

– TAL effector DNA binding domain + DNA

cleavage domain

– Custom protein for each specific sequence

• Problems

– Potential off-target cleavage - overwhelming of

repair machinery – chromosomal rearrangement

– cell death

BiomeD

Gene editing

BiomeD

Gene editing

• CRISPR/Cas9

– Clustered regularly interspaced short palindromic

repeats / CRISPR-associated nuclease

– Analogous to RNA interference in eukaryotes

– Cut genome at any desired location

– Deliver Cas9 protein and appropriate guide RNA

– No need to make new custom nucleases!

– Add spacers – target sequences

BiomeD

CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9

BiomeD

Rôzne delenia génovej terapie

• Podľa funkčnej nukleovej kyseliny

– DNA based

– RNA based

BiomeD


• Podľa typu ovplyvnených buniek

– Somatická

– Zárodočná

BiomeD


BiomeD


• Podľa prístupu

– In vivo

– Ex vivo

BiomeD


• Podľa prístupu

BiomeD

Vektory

• Stabilný a účinný prenos

• Ľahká produkcia

• Bezpečnosť

• Regulovateľnosť

BiomeD

Vektory

• Zabezpečiť:

– Prenos génov do buniek (ich jadra)

– Ochranu pred degradáciou génu

– Transkripciu génu v cieľovej bunke

BiomeD

Ideálny vektor

• Bezpečný

• Cielený

• Chránený pred degradáciou a imunitnou reakciou

• Vhodný pre klinickú aplikáciu

• Nenákladný

• Ľahká produkcia a purifikácia vo vysokých množstvách

BiomeD

Vektory

• Vírusové vektory– Retrovírusy

– Adenovírusy

– Adeno-associované vírusy

– Herpesvírusy

– Alphavírusy

– ...

• Nevírusové vektory– Nahá DNA (RNA)

– Lipofekcia, kationické peptidy, polyetylénimín…

• Bakteriálne vektory (baktofekcia)

BiomeD

Vektory

• Prečo vírusy?

BiomeD

Vírusové vektory

• Príprava

– Delécia génov esenciálnych pre replikáciu, poskladanie do častíc, infekciu – replikačná deficiencia

– Nahradenie terapeutickým génom

– Replikácia vektorov iba v špeciálnych bunkových líniách – komplementácia deletovaných génov

– Možná reaktivácia

BiomeD

Vírusové vektory

• Integrujúce sa – retrovírusy, lentivírusy

• Neintegrujúce sa – adenovírusy, HSV...

BiomeD

Vektory

• Vírusové vektory

BiomeD

• RNA vírusy

• Prvé vektory v GT

• Delécia génov gag, pol, env

• Cielený gene transfer – fúziou časti env génu s génom pre ligand tkanivovo-špecifického receptora

Retrovírusy

BiomeD

• MoMLV

• Úspešná transdukcia vyžaduje deliace sa bunky

• Integrácia do genómu:

-stabilná expresia transgénu – výhoda napr. pri dedičných ochoreniach

Retrovírusy

BiomeD

• Riziko inzerčnej mutagenézy

• Over-expresia terapeutického génu

• Nízka účinnosť transdukcie

• Nízky titer, nestabilita častíc

• Neschopnosť infikovať nedeliace sa bunky– Preto vhodné pre ex vivo GT

Retrovírusy

BiomeD

• Neobalené dsDNA vírusy, 36 kb, 50

vírusových polypeptidov

• Na prekonanie limitácií retrovírusov

• 50 sérotypov, v GT najviac používané 2 a 5

• Ochorenia respiračného systému

• Jednoduchá manipulácia, produkcia vo

vysokých množstvách

Adenovírusy

BiomeD

• Interakcia povrchových kapsidových štruktúr s bunkovými receptormi – modifikáciou možno špecificky namieriť infekciu (prenos génu) do buniek určitého typu

• Vysoká účinnosť transfekcie deliacich sa aj nedeliacich sa buniek

• Transfekcia do širokého spektra buniek

• Aktívny transport do jadra

• Epizomálmy stav, neintegrujú sa do genómu

Adenovírusy

BiomeD

• Ale

– Iba prechodná expresia

– Indukcia imunitnej a zápalovej odpovede

– Väčšina ľudí má protilátky – rýchla degradácia

• Použitie kapsidových proteínov z iných sérotypov

– 90% vektorov degradovaných počas rvých 24 hodín po aplikácii

– Neschopnosť infikovať bunky, ktoré neexprimujú receptor

Adenovírusy

BiomeD

Vektory

• Adenovírusy

BiomeD

• Nevyžadujú deliace sa bunky – aktívny mechanizmus transportu do jadra

-schopnosť infikovať deliace sa aj nedeliace sa bunky

• HIV-1 vektor má 6 z 9 génov off

• Dlhodobá expresia, efektívny transfer

• Bez imunitnej reakcie

Lentivírusy

BiomeD

Adeno-asociované vírusy

• ssDNA, neobalené parvovírusy, 4,5 kb

• Nahradenie všetkých kódujúcich oblastí okrem ITR

terapeutickým génom – obsahujú len 145 bp pôvodného

• Replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu – adenovírus,

HSV, vaccinia

• Gény rep a cap potrebné pre replikáciu, enkapsidáciu a

špecifickú integráciu

BiomeD

Adeno-asociované vírusy

• Spôsobujú latentné infekcie

• Transfekcia širokého spektra buniek aj

druhov

• Väčšina odvodená od sérotypu 2 (AAV 2)

• Sekvenčne špecifická integrácia do CH 19

• Stabilná a dlhotrvajúca expresia transgénu

• Bezpečnosť – odvodené od ľudských vírusov

• Minimálne riziko inzerčnej mutagenézy

BiomeD

Herpes simplex vírus

• Obalený dsDNA vírus, 150 kb

• Prirodzený patogén, replikuje sa v epitelových

bunkách, ale v latentnom stave zotrváva v

nedeliacich sa bunkách – neurónoch

• HSV-1

• Veľká kapacita 30 – 40 kb

• Ale: v latentnom stave sú vypnuté všetky gény

okrem LAT oblasti

– klonovanie terapeutických génov pod LATP1 a

LATP2 promótory

BiomeD

Ďalšie

• Poxvírusy – vaccinia vírus

• Alfavírusy – Togaviridae

– Semliki forest virus (SFV)

– Sindbis virus (SIN)

– Venezuelan equine encephalitis virus

(VEE)

BiomeD

Nevírusové vektory

• Prečo nevírusové?

– Cena

– Bezpečnosť

– Dostupnosť

– ...

BiomeD

Vektory

• Nahá DNA– Plazmidy

– Lineárne XNA

• PCR produkty

BiomeD

Vektory

• Elektroporácia150 – 1500V

BiomeD

Vektory

• Elektroporácia– Ex vivo

BiomeD

Vektory

• „Gene gun“

– DNA sa naväzuje

na častice zlata

• DNA vakcinácia

http://www.brown.edu/Courses/Bio_160/Projects2000/RCC/genegun.jpg

BiomeD

Vektory

• Hydrodynamický tlak

– Intravaskulárna injekcia veľkého objemu

– Lokálne zvýšenie tlaku

• Mikroinjekcia XNA do bunky

– Ex vivo

BiomeD

Vektory

• Lipofekcia

– Kationické lipidy

– Pinocytóza/fagocytóza

http://www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/BIOBK/bilayer.gif

BiomeD

Vektory

• Plazmidy napodobňujúce stratégiu vírusov

– Protilátka na vektore viažúca receptor na povrchu

bunky

– Disrupcia endozómu

BiomeD

Integrácia• Bezpečná integrácia do genómu

Sekvenčne

špecifické

rekombinázy

BiomeD

Extrachromozomálny stav

– Epizómy - SMAR

– Ľudské arteficiálne chromozómy (HAC)

BiomeD

Bakteriálne vektory

• Vstup do bunky

– Cez invazívny proteín – receptor

• Salmonella, Shigella

– Cez bakteriálny proteín – ligand

• Yersinia, Listeria vstup pomocou zipsového

mechanizmu (zipper-like mechanism)

• Baktéria sa ocitne v obale

BiomeD


• Ako z endozómu von?

– Listeriolysin O – LLO pod kontrolou ActA

promótora (aktivovaný v cytoplazme)

• Listérie a E.coli hly, inv

BiomeD


• Baktofekcia

– Listeria

– Escherichia

– Salmonella

BiomeD

Vektory - Baktofekcia

BiomeD

Vektory

• Alternatívna génová terapia

– In situ produkcia terapeutického proteínu

baktériami

– DNA nemusí sa dostať do jadra

– Pozitívna kontrola

• Aplikácia baktérií, inducibilné promótory

– Negatívna kontrola

• Odstránenie baktérií (antibiotiká)

Alternatívna génová terapia

BiomeD

Vektory

• Alternatívna génová terapiaBaktochondria

Rekombinantné

probiotiká

BiomeD

John Craig Venter

(1946 - )

Genome sequencing

Francis Sellers Collins(1950 - )

BiomeD

Klinika

• 1990 – prvá klinická štúdia

• Severe combined immunodeficiency

(SCID)

• Retrovírusový vektor

• Integrácia do chromozómu

• Ex vivo

BiomeD

Klinika

BiomeD

Problémy GT

• Etické

• Prenos génu

– Účinnosť

– Špecificita

– Bezpečnosť

– Regulácia expresie

BiomeD

Shinya Yamanaka(1962 - )

BiomeD

iPSC

103

Shinya Yamanaka

Kyoto University

iPS

• Reprogramming of differentiated

cells

• Pluripotency

• No immune response

• Without retroviral vectors

• Without oncogenes

BiomeD

BiomeD

[email protected]

roman gardlík - imbm• replikácia závislá od prítomnosti helper vírusu –adenovírus, hsv,...

Documents