sérologiemikrobiologie.unas.cz/soubory/serologie.pdf · • reakce fia (flouorscent immuno assay)...

SSéérologierologiePrezentace proPrezentace pro obor: obor:

VVššeobecneobecnéé lléékakařřstvstvííJan SmJan Smíšíšek ek ©© ÚÚLM 3. LF UKLM 3. LF UK 20072007

•• Antigen Antigen –– specifickspecifickáá povrchovpovrchováástruktura schopnstruktura schopnáá vyvolat imunitnvyvolat imunitnííreakcireakci––ČČasto proteinovasto proteinováá, ale i polysacharidov, ale i polysacharidováá, ,

glykoproteinovglykoproteinováá, lipoproteinov, lipoproteinováá atd.atd.•• Epitop Epitop –– prostorovprostorováá ččáást molekuly st molekuly

antigenu, kterantigenu, kteráá vyvolvyvoláávváá imunitnimunitnííreakci (jeden antigen mreakci (jeden antigen můžůže me míít vt vííc c epitopepitopůů))

ZZáákladnkladníí pojmypojmy

•• HaptenHapten a a semihaptensemihapten –– antigennantigenníí struktura struktura schopnschopnáá vyvolat imunitnvyvolat imunitníí reakci jen po reakci jen po vazbvazběě na vna věěttšíší molekulu (protein)molekulu (protein)

•• SpecifickSpecifickáá protilprotiláátka tka –– protilprotiláátka (obvykle tka (obvykle vyrobenvyrobenáá hybridomovou technikou) urhybridomovou technikou) urččenenááproti konkrproti konkréétntníímu antigenu (antigenmu antigenu (antigenůům)m)–– MonovalentnMonovalentníí –– vváážže epitop 1 antigenue epitop 1 antigenu–– PolyvalentnPolyvalentníí –– vváážže epitopy ve epitopy vííce antigence antigenůů


•• HybridomovHybridomováá technikatechnika––Metodika tvorby specifických Metodika tvorby specifických

protilprotiláátektek––Hlodavci se podHlodavci se podáá antigen proti antigen proti

nněěmumužž chceme vytvochceme vytvořřit specifickou it specifickou protilprotiláátkutku


•• HybridomovHybridomováá technikatechnika–– Po ubPo uběěhnuthnutíí doby nezbytndoby nezbytnéé pro aktivaci pro aktivaci

hlodavcovy imunity se hlodavec usmrthlodavcovy imunity se hlodavec usmrtíí a z a z jeho sleziny nebo kostnjeho sleziny nebo kostníí ddřřeneněě se izolujse izolujííaktivovanaktivovanéé plasmatickplasmatickéé bubuňňky ky

–– Jejich jJejich jáádra injikujdra injikujíí do nesmrtelndo nesmrtelnéé bubuňňky ky lidsklidskéého myelomu (nho myelomu (náádor tvodor tvořřííccííimunoglobuliny)imunoglobuliny)

–– FFůůznzníí bubuňňka (hybridom) produkuje protilka (hybridom) produkuje protiláátkytky


HybridomovHybridomováá bubuňňkaka

PlasmatickPlasmatickáábubuňňkaka

MyelomovMyelomováábubuňňkaka

AntigenAntigen

HybridomovHybridomováá technikatechnika

SpecifickSpecifickéé protilprotiláátkytky

•• Aglutinace Aglutinace –– shlukovshlukováánníí antigenu specifickou antigenu specifickou protilprotiláátkoutkou

•• Precipitace Precipitace –– tottotééžž v gelovv gelovéém prostm prostřřededíí•• Titr Titr –– ppřřevrevráácencenáá hodnota hodnota řřededěěnníí•• KonjugKonjugáát t –– protilprotiláátka znatka značčenenáá markeremmarkerem•• Marker Marker –– obvykle enzym, který dokobvykle enzym, který dokáážže po e po

ppřřididáánníí specifickspecifickéé smsměěsi obsahujsi obsahujííccíí substrsubstráát t vyvvyvííjet konkrjet konkréétntníí zbarvenzbarveníí jehojehožž intenzita je intenzita je ppřříímo mo úúmměěrnrnáá koncentraci markerukoncentraci markeru


•• Princip:Princip:–– ProtilProtiláátky, ktertky, kteréé se vytvose vytvořříí v sv sééru pacienta v ru pacienta v

prprůůbběěhu onemocnhu onemocněěnníí se dajse dajíí prokprokáázat pomoczat pomocííppřříímméé aglutinaceaglutinace

–– DochDocháázzíí k vazbk vazběě komplexu antigenkomplexu antigen--protilprotiláátka tka a jeho na jeho nááslednslednéé aglutinaci, kterou lze aglutinaci, kterou lze pozorovat pouhým okem nebo hodnotit pozorovat pouhým okem nebo hodnotit specispeciáálnlníími pmi přříístrojistroji

PPřříímmáá aglutinaceaglutinace

•• ProtilProtiláátky IgM se tvotky IgM se tvořříí ppřřibliibližžnněě po 1 týdnu po 1 týdnu ppřříítomnosti mikroba organismu vrcholu jejich tomnosti mikroba organismu vrcholu jejich mnomnožžstvstvíí dosahuje v polovindosahuje v poloviněě druhdruhéého týdne ho týdne potpotéé jejich koncentrace v sjejich koncentrace v sééru klesru klesáá. IgG naproti . IgG naproti tomu dosahujtomu dosahujíí vrcholu avrcholu ažž v polovinv poloviněě ttřřetetíího ho týdne (viz. graf).týdne (viz. graf).


•• SSéérum narum nařřededííme ame ažž na titr 2560 podle tabulky. Pna titr 2560 podle tabulky. Přřididááme me antigen mikroba (konkrantigen mikroba (konkréétntníí antigen proti danantigen proti danéému mu sséérotypu) a po 2 rotypu) a po 2 –– 24 hodin24 hodináách hodnotch hodnotííme poslednme posledníízkumavku, kde dozkumavku, kde doššlo k aglutinaci. Plo k aglutinaci. Přřevrevráácencenáá hodnota hodnota řřededěěnníí ssééra v nra v níí ppřředstavuje titr protiledstavuje titr protiláátek (kvantifikaci tek (kvantifikaci jejich mnojejich množžstvstvíí v sv sééru).ru).

01:25601:12801:6401:3201:1601:801:401:20Ředění0,50,50,50,50,50,50,50,50,5Antigen (ml)

0,5 ml se přenáší z předchozí zkumavky do následující00,50,50,50,50,50,50,50,1Sérum (ml)

0,50,50,50,50,50,50,50,50,9Fyz. roztok (ml)

K87654321

Zkumavka


•• VýsledekVýsledek–– Aglutinace H antigenu (biAglutinace H antigenu (biččíík) je jemnk) je jemněějjšíší–– Aglutinace O antigenu (Aglutinace O antigenu (baktbakt.st.stěěna) je hrubna) je hrubšíší


•• PouPoužžititíí–– Widalova reakceWidalova reakce

•• PrPrůůkaz protilkaz protiláátek proti Salmoneltek proti Salmoneláámm–– WrightovaWrightova reakcereakce

•• PrPrůůkaz protilkaz protiláátek proti tek proti FranciselFranciseláámm a a BrucelBruceláámm

–– WeilovaWeilova--Felixova reakceFelixova reakce•• PrPrůůkaz protilkaz protiláátek proti tek proti ListeriListeriíímm


•• PrincipPrincip–– Pokud k suspenzi mikroba obsahujPokud k suspenzi mikroba obsahujííccíí znznáámý mý

antigen pantigen přřididááme protilme protiláátky proti zntky proti znáámméému mu antigenu dojde k aglutinaciantigenu dojde k aglutinaci

–– TTíímto zpmto způůsobem msobem můžůžeme ureme urččit konkrit konkréétntnííantigennantigenníí slosložženeníí ststěěny neznny neznáámméého mikroba a ho mikroba a ttíím ho podle znm ho podle znáámých schmých schéémat (pro mat (pro Salmonelly jde o Salmonelly jde o KaufmannKaufmann--WhiteovoWhiteovoschschééma) druhovma) druhověě čči dokonce kmenovi dokonce kmenověě ururččitit

ZpZpěětntnáá aglutinace aglutinace –– serotypizaceserotypizace

•• PostupPostup–– Na prvnNa prvníí podlopodložžnníí sklsklííččko kko káápneme kapku protilpneme kapku protiláátek tek

proti O antigenu 9 a 12 a na druhproti O antigenu 9 a 12 a na druhéé podlopodložžnníí sklsklííččko ko protilprotiláátky proti H antigenu g,m. tky proti H antigenu g,m.

–– V kapce rozmV kapce rozmííchchááme bakteriologickou klime bakteriologickou kliččkou kolonii kou kolonii mikroba sebranou z pevnmikroba sebranou z pevnéé kultivakultivaččnníí ppůůdy ady ažž vznikne vznikne homogennhomogenníí suspenze suspenze

–– PotPotéé se kývavým pohybem snase kývavým pohybem snažžííme vyvolat aglutinaci me vyvolat aglutinaci kterou odekterou odeččííttááme proti tmavme proti tmavéému pozadmu pozadíí. Pokud k n. Pokud k níídojde kompletuje se zndojde kompletuje se znáámý antigen mikroba se mý antigen mikroba se znznáámou protilmou protiláátkoutkou


•• Výsledek Výsledek –– viditelnviditelnáá aglutinaceaglutinace


•• PouPoužžititíí::–– Serotypizace kmenSerotypizace kmenůů Salmonella typhiSalmonella typhi++–– UrUrččeneníí povrchových antigenpovrchových antigenůů vvěěttššiny iny

lléékakařřsky významných bakterisky významných bakteriíí, kter, kteréédosahujdosahujíí diagnosticky významndiagnosticky významnéého ho polymorfismu (Streptokoky, Stafylokoky, polymorfismu (Streptokoky, Stafylokoky, Hemofily a mnoho dalHemofily a mnoho dalšíších)ch)


•• PrincipPrincip–– HeterofilnHeterofilníí protilprotiláátky (protiltky (protiláátky, ktertky, kteréé

dokdokáážžou aglutinovat i nou aglutinovat i něěkterkteréé antigeny antigeny na nehumna nehumáánnnníích erytrocytech) pch erytrocytech) přříímo mo aglutinujaglutinujíí beranberaníí erytrocyty v zerytrocyty v záávislosti vislosti na svna svéém titrum titru

HemaglutinaceHemaglutinace

•• PostupPostup–– V mikrotitraV mikrotitraččnníí destidestiččce nace nařřededííme sme séérum pacienta rum pacienta

podle tabulky tak aby dopodle tabulky tak aby doššlo k vytvolo k vytvořřeneníí znznáámméého titru ho titru a pa přřididááme roztok beranme roztok beraníích erytrocytch erytrocytůů

–– NechNechááme reagovat 18me reagovat 18--24 hodin v chladu a pozorujeme 24 hodin v chladu a pozorujeme poslednposledníí jamku, kde dojamku, kde doššlo k aglutinacilo k aglutinaci

–– JejJejíí titr ptitr přředstavuje titr hledaných protiledstavuje titr hledaných protiláátektek

1:10241:5121:2561:1281:641:321:161:81:4

1:2Ředění

505050505050505050505050Beraní ery

50 ul se přenáší z předchozí jamky

0050505050505050505050Sérum (ul)

05050505050505050505050Fyz. roztok (ul)

121110987654321

Jamka číslo


•• VýsledekVýsledek–– AglutinovanAglutinovanéé erytrocyty pokryjerytrocyty pokryjíí v hrudkv hrudkáách ch

dno zkumavky, neaglutinovandno zkumavky, neaglutinovanéé pokryjpokryjíí dno v dno v normnormáálnlníím jasnm jasněě ohraniohraniččenenéém sedimentum sedimentu


•• PouPoužžititíí–– Paul Bunnelova reakcePaul Bunnelova reakce

•• StanovenStanoveníí heterofilnheterofilníích protilch protiláátek proti EBV tek proti EBV (Virus Epstein Barrov(Virus Epstein Barrovéé –– ppůůvodce infekvodce infekččnníímononuklemononukleóózy) pomoczy) pomocíí aglutinace 2 % aglutinace 2 % roztoku beranroztoku beraníích erytrocytch erytrocytůů


•• Princip:Princip:–– NNěěkterkteréé mikroby uvolmikroby uvolňňujujíí v tekutv tekutéém m

rrůůstovstovéém prostm prostřřededíí antigeny (tzv. antigeny (tzv. solubilnsolubilníí Ag) ze svAg) ze svéého povrchuho povrchu

–– Tyto antigeny lze prokazovat pomocTyto antigeny lze prokazovat pomocííspecifických protilspecifických protiláátek navtek naváázaných na zaných na latexových latexových ččáásticsticííchch

LatexovLatexováá aglutinaceaglutinace

•• Postup:Postup:–– Na podloNa podložžnníí sklsklííččko kko káápneme kapku pneme kapku

latexových latexových ččáástic obalených protilstic obalených protiláátkami tkami –– V kapce rozmV kapce rozmííchchááme bakteriologickou me bakteriologickou

klikliččkou kapku tekutiny obsahujkou kapku tekutiny obsahujííccíísolubilnsolubilníí antigeny antigeny

–– PotPotéé se kývavým pohybem snase kývavým pohybem snažžííme me vyvolat aglutinaci kterou odevyvolat aglutinaci kterou odeččííttááme proti me proti tmavtmavéému pozadmu pozadíí


•• PouPoužžititíí::–– ZejmZejmééna k prna k průůkazu kazu solubilnsolubilnííchch antigenantigenůů

Haemophillus influenzae, Neisseria Haemophillus influenzae, Neisseria gonorhoae, gonorhoae, StreptocoocusStreptocoocus pneumoniaepneumoniae

–– Vzhledem k tomu, Vzhledem k tomu, žže se jedne se jednáá o 3 o 3 nejnejččastastěějjšíší ppůůvodce bakterivodce bakteriáálnlníích ch meningitid, poumeningitid, použžíívváá se latexovse latexovááaglutinace jako aglutinace jako bedbed sideside test k rychltest k rychléému mu prprůůkazu meningitidy z likvorukazu meningitidy z likvoru


•• Výsledek Výsledek –– zzřřetelnetelnáá aglutinaceaglutinace


•• ProtilProtiláátka mtka můžůže být znae být značčenaena–– Radionuklidem Radionuklidem

•• Reakci oznaReakci označčujeme jako RIA (ujeme jako RIA (RadioRadio immuno immuno assay) assay) –– prokazujeme prokazujeme denzitometrickydenzitometricky

–– EnzymemEnzymem•• Reakce EIA (Enzyme immuno assay) Reakce EIA (Enzyme immuno assay) ––

prokazujeme barevnou reakcprokazujeme barevnou reakcíí se specifickým se specifickým barvivo obsahujbarvivo obsahujííccíím substrm substráátem enzymutem enzymu

–– FluorescenFluorescenččnníím barvivemm barvivem•• Reakce FIA (Reakce FIA (FlouorscentFlouorscent immuno assay) immuno assay) ––

prokazujeme pomocprokazujeme pomocíí fluorescenfluorescenččnníího zho záářřeneníí

PrPrůůkaz znakaz značčenými protilenými protiláátkamitkami

•• PouPoužžititíí–– PrPrůůkaz libovolných antigenkaz libovolných antigenůů–– PouPoužžíívváá se nejen v sse nejen v séérologii, ale naprologii, ale napřřííklad v klad v

biochemii k prbiochemii k průůkazu antigenkazu antigenůů napnapřř. . konkrkonkréétntníích proteinch proteinůů krevnkrevníího sho sééra atd.ra atd.

–– FIA se pouFIA se použžíívváá ččasto ve virologii k prasto ve virologii k průůkazu kazu antigenantigenůů virvirůů ppřříímo ve tkmo ve tkááňňovovéém vzorkum vzorku

PrPrůůkaz znakaz značčenými protilenými protiláátkamitkami

•• Enzym Linked Enzym Linked ImmunoImmuno SorbentSorbent AssayAssay•• Je v souJe v souččasnasnéé dobdoběě spolespoleččnněě s s

WesternblotemWesternblotem nejsofistikovannejsofistikovaněějjšíšísséérologickou reakcrologickou reakcíí

•• Je modifikacJe modifikacíí metodiky EIAmetodiky EIA•• PouPoužžíívváá se ve 3 variantse ve 3 variantááchch

–– SandwichovýSandwichový prprůůkaz Agkaz Ag–– SandwichovýSandwichový prprůůkaz Igkaz Ig–– KompetitivnKompetitivníí prprůůkaz Igkaz Ig

ELISA ELISA

•• Sandwichový typ reakce prSandwichový typ reakce průůkaz Agkaz Ag•• PrincipPrincip

–– Na stNa stěěnněě mikrotitramikrotitraččnníí destidestiččky navky naváázzáána na protilprotiláátkatka

–– PPřřididáá se sse séérum s antigenemrum s antigenem–– PPřřididáá se znase značčený konjugený konjugáátt–– VytvoVytvořříí se sandwichový komplexse sandwichový komplex

ELISA ELISA

ProtilProtiláátka na sttka na stěěnněě destidestiččkyky

PPřřididáá se sse séérum obsahujrum obsahujííccííantigenantigen

PPřřididáá se konjugse konjugáát znat značčený ený enzymemenzymem

Enzym pEnzym přřememěňěňuje substruje substráát t na barevný produktna barevný produkt

ELISA ELISA

•• Sandwichový typ reakce prSandwichový typ reakce průůkaz Igkaz Ig•• PrincipPrincip

–– Na stNa stěěnněě mikrotitramikrotitraččnníí destidestiččky navky naváázzáán n antigenantigen

–– PPřřididáá se sse séérum s protilrum s protiláátkamitkami–– PPřřididáá se znase značčený konjugený konjugáátt–– VytvoVytvořříí se sandwichový komplexse sandwichový komplex

ELISA ELISA

ProtilProtiláátka na sttka na stěěnněě destidestiččkyky

PPřřididáá se sse séérum obsahujrum obsahujííccííprotilprotiláátkytky

PPřřididáá se konjugse konjugáát znat značčený ený enzymemenzymem

Enzym pEnzym přřememěňěňuje substruje substráát t na barevný produktna barevný produkt

ELISA ELISA

•• KompetitivnKompetitivníí typ reakce prtyp reakce průůkaz Igkaz Ig•• PrincipPrincip


–– PPřřididáá se sse séérum s protilrum s protiláátkami a ztkami a záároveroveňň se se ppřřididáá znaznaččený konjugený konjugáátt

–– DochDocháázzíí ke ke kompeticikompetici o vazbu na antigeno vazbu na antigen

ELISA ELISA

KonjugKonjugáát t

HledanHledanááprotilprotiláátkatka

ELISA ELISA

•• KompetitivnKompetitivníí typ reakce prtyp reakce průůkaz Igkaz Ig•• PrincipPrincip


–– PPřřididáá se sse séérum s protilrum s protiláátkami a ztkami a záároveroveňň se se ppřřididáá znaznaččený konjugený konjugáátt

–– DochDocháázzíí ke ke kompeticikompetici o vazbu na antigeno vazbu na antigen

ELISA ELISA

•• Princip:Princip:–– CelCeláá řřada mikrobada mikrobůů obsahuje na svobsahuje na svéém povrchm povrchůů mnoho mnoho

diagnosticky významných antigendiagnosticky významných antigenůů–– KonkrKonkréétntníí kombinace antigennkombinace antigenníího sloho složženeníí je je

nejlepnejlepšíším znakem konkrm znakem konkréétntníího kmeneho kmene–– ČČlovlověěk pk přři infekci obvykle tvoi infekci obvykle tvořříí protilprotiláátky proti vtky proti věěttššininěě

antigenantigenůů mikrobamikroba–– PrPrůůkaz vkaz vššech konkrech konkréétntníích protilch protiláátek proti konkrtek proti konkréétntníí

kombinaci antigenkombinaci antigenůů ppůůvodce je diagnosticky velmi vodce je diagnosticky velmi výhodný, protovýhodný, protožže ure urččíí konkrkonkréétntníí kmen pkmen půůvodcevodce

Western blotWestern blot

•• Postup:Postup:–– SmSměěs antigens antigenůů ppůůvodce se elektroforeticky rozdvodce se elektroforeticky rozděěllíí a a

potpotéé se aplikuje na celulse aplikuje na celulóózový papzový papíírr–– Z tohoto papZ tohoto papííru se vytvoru se vytvořříí tenktenkéé prouproužžky (ky (stripystripy))–– Tyto prouTyto proužžky se inkubujky se inkubujíí se sse séérem pacientarem pacienta–– PPřři inkubaci dojde k navi inkubaci dojde k naváázzáánníí konkrkonkréétntníích protilch protiláátek tek

na konkrna konkréétntníí antigenyantigeny–– StripStrip se dse dáále inkubuje s le inkubuje s konjugkonjugáátemtem znaznaččeným eným

enzymem, který se navenzymem, který se naváážže na ve na vššechny oblasti echny oblasti obsahujobsahujííccíí navnaváázanou protilzanou protiláátkutku

–– Po inkubaci s barvivo obsahujPo inkubaci s barvivo obsahujííccíí substrsubstráátem enzymu tem enzymu dochdocháázzíí k mk míístnstníí barevnbarevnéé reakci v oblastech reakci v oblastech komplexkomplexůů

Western blotWestern blot

•• PrincipPrincip•• 3 kroky3 kroky

–– 1) p1) přřididáá se sse séérum s antigenem rum s antigenem komplementkomplementáárnrníím k hledaným protilm k hledaným protiláátktkáámm

–– 2) p2) přřididáá se komplementse komplement–– 3) p3) přřididáá se hemolytický komplex (beranse hemolytický komplex (beraníí

erytrocyty a krerytrocyty a krááliliččíí protilprotiláátky proti nim)tky proti nim)

Komplement fixaKomplement fixaččnníí reakcereakce

•• 2 mo2 možžnostinosti–– 1) Komplement se v1) Komplement se vššechen vechen váážže na prime na primáárnrníí

imunokomplex a nezbude imunokomplex a nezbude žžáádný aby rozlodný aby rozložžil il hemolytický komplexhemolytický komplex

–– 2) S2) Séérum neobsahuje protilrum neobsahuje protiláátky, primtky, primáárnrnííimunokomplex nevznikne a vimunokomplex nevznikne a vššechen echen komplement se vkomplement se váážže na hemolytický komplex, e na hemolytický komplex, který rozlokterý rozložžíí HEMOLÝZAHEMOLÝZA


Komplement Komplement

Hemolytický Hemolytický komplexkomplex

HledanHledanááprotilprotiláátkatka

AntigenAntigen


Komplement Komplement Hemolytický Hemolytický komplexkomplex

AntigenAntigen


VVííce informacce informacíí ooSerotypizaciSerotypizaci

LatexovLatexovéé aglutinaciaglutinaciELISAELISA

WesternblotuWesternblotuKFRKFR

najdete na CD:najdete na CD:

sérologiemikrobiologie.unas.cz/soubory/serologie.pdf · • reakce fia (flouorscent immuno assay)...

Documents