sƠ lƢỢc phÂn loẠi thỤ thỂ theo cẤu trÚc vÀ vỊ trÍ … · 2014. 8. 19. · sƠ...
TRANSCRIPT
-
SƠ LƢỢC PHÂN LOẠI THỤ THỂ THEO CẤU TRÚC VÀ VỊ TRÍ HOẠT
ĐỘNG
6.1 Nhóm thụ thể của Neurotransmitters: (neurotransmitters receptors-NR)
Về mặt tổng quát, nhóm thụ thể này là những heterotetramer hoặc heteropentamer và mỗi tiểu
đơn vị được mã hóa trên một hoặc nhiều gene khác nhau trên cùng hay khác nhiễm sắc thể. Tất
cả các NR đều là protein bậc IV và chịu rất nhiều nguy cơ đột biến gene cũng như sai lệch trong
quá trình biểu hiện gene.
Synapses là nơi mà neuron giải phóng neurotransmitter, tác động đến hậu synapse của tế bào
đích (có thể là một neuron, cơ hay các tế bào tuyến). Trong phần này chúng ta sẽ tập trung vào
một số vấn đề quan trọng liên quan đến sự truyền tín hiệu (impulse transmission):
- Neurotransmitter được tạo ra ở đầu tận sợi trục như thế nào.
- Cái gì tạo ra điện thế hoạt động tại đầu tận sợi trục (axon termini) tại presynapse để kích
thích tiết neurotransmitter.
- Bằng cách nào việc gắn neurotransmitter vào thụ thể tương ứng tại postsynapse dẫn đến
thay đổi điện thế màng.
- Neurotransmitter được loại bỏ như thế nào sau khi nó kích thích tế bào postsynapse.
Thụ thể neurotransmitter được chia làm hai loại chính: Ligand-gated ion channels – có khả năng
mở ra ngay lập tức khi neurotransmitter bám vào và thụ thể G protein-coupled. Neurotransmitter
bám vào thụ thể G protein-coupled làm mở hay đóng các kênh ion riêng lẽ bởi quá trình kéo dài
từ vài giây đến vài phút. Những thụ thể neurotransmitter loại “chậm” này đã được đề cập chi tiết
khi thảo luận về cấu trúc lẫn chức năng của thụ thể G protein-coupled. Ở phần này, chúng ta sẽ
cùng nhau làm rõ hơn cấu trúc và hoạt động của nhóm thụ thể nicotinic acetylcholine – nhóm
được tìm thấy rất nhiều ở các synapse thần kinh-cơ. Đây là kênh ion đầu tiên được phát hiện,
phân dòng, là cơ sở các hệ luận của các kênh ion neurotransmitter khác.
Cấu trúc của thụ thể acetylcholine hƣớng ion
Thụ thể acetylcholine ở tế bào cơ bám xương là một protein pentamer với các tiểu đơn vị cấu tạo
lần lượt là α2βγδ. Tiểu đơn vị α, β, γ có tính tương đồng trong trình tự cấu tạo, bình thường
khoảng 35-40%. Thụ thể hoàn chỉnh là một cấu trúc 5 vòng xoắn, lòng ion là một cấu trúc hiện
hữu trong lòng thụ thể tương thích với 5 tiểu đơn vị.
Kênh này mở ra khi acetylcholine nối kết tại vùng nằm trên mặt ngoài tế bào tại vị trí của αγ và
αδ. Khi sự nối kết xảy ra, kênh sẽ mở trong một vài micro giây. Các nghiên cứu định lượng tính
thấm với các cation cho thấy lòng kênh khá hẹp, đường kính khoảng 0.65 đến 0.80 nm, đủ để
cho ion Na+ và K+ đi ngang qua khi chúng ở trong phức thể với phân tử nước. Do vậy, thụ thể
acetylcholine có khả năng vận chuyển cation được hydrated hóa, không giống các kênh Na+ và
K+ thông thường khác (chỉ vận chuyển được ion đơn thuần).
-
Hình 6.1: Minh họa cấu trúc thụ thể acetylcholine
Mặc dù cấu trúc trung tâm kênh vẫn chưa được làm sáng tỏ ở mức độ phân tử, có nhiều bằng
chứng cho thấy rằng nó được cấu tạo bởi 5 xoắn α M2 xuyên màng tương đồng nối kết với từng
đơn vị dưới của kênh. Xoắn M2 được cấu tạo ởi phần lớn các amino acid không phân cực hay kị
nước, nhưng luôn có phần mang điện tích âm của aspartate hay glutamate ở mỗi đầu tận, gần bề
mặt màng; ngoài ra còn có một vài serine hay threonine ở gần trung tâm. Các đột biến xảy ra đối
với thụ thể acetylcholine thay đổi vùng điện tích âm bởi điện tích dương (của lysine) đã được xác
định.
Khi thụ thể nối kết với acetylcholine, nhất thiết phải thúc đẩy sự biến đổi lập thể của thụ thể và
dẫn đến việc nới rộng lòng kênh.
-
Hình 6.2: Minh họa sự đóng/mở lòng kênh.
Neurotransmitter đƣợc tải vào túi synapse (synaptic vesicles) bởi H+-linked antiport
proteins
Có rất nhiều các phân tử nhỏ hoạt động như là một neurotransmitter tại các synapse khác nhau,
ngoại lệ là acetylcholine, một loại neurotransmitter có bản chất là một dẫn xuất của amino acid.
Các nucleotide, như ATP chẳng hạn và những nucleoside tương ứng (không gắn gốc phosphate)
cũng đóng vai trò là neurotransmitter. Mỗi neuron có khả năng sản xuất chỉ một loại
neurotransmitter mà thôi.
Tất cả các neurotransmitter cổ điển (classic neurotransmitter) đều được tổng hợp trong tế bào
chất và được vận chuyển ra các túi synapse bám màng tại đầu tận của sợi trục và được dự trữ ở
đó. Những túi synapse này có đường kính khoảng 40-50 nm, và có tính acid, được tổng hợp bởi
sự hoạt động của nhóm V bơm H+ (V-class proton pump) tại màng tế bào của túi.
Ví dụ, acetylcholine được tổng hợp từ acetyl coenzyme A (chất trung gian trong quá trình thoái
hóa glucose và acid béo) và choline với sự xúc tác của choline acetyltransferase:
-
Hình 6.3: Phản ứng tạo thành acetylcholine
Túi synapse thu giữ acetylcholine từ bào tương thông qua quá trình vận chuyển ngược với
radient nồng độ bằng cách sử dụng H+/acetylcholine antiporter tại màng tế bào. Có điều lạ là
gene mã hóa cho cái antiporter này có vị trí tại vùng intron đầu tiên của gene mã hóa cho choline
acetyltransferase, cách sắp đặt này là nguyên nhân bảo tồn được cơ chế điều hòa tương tác rất
chặt chẽ biểu hiện của cả hai protein này. Ngoài ra còn có những protein H+/neurotransmitter
antiport khác được sử dụng để đưa các loại neurotransmitter khác vào trong túi synapse.
Dòng Ca2+
nhập bào thông qua kênh cổng điện thế Ca2+
(Voltage-gated Ca2+
channels) kích
thích tiết neurotransmitter
Neurotransmitter được giải phóng qua quá trình xuất bào. Quá trình này có sự hỗ trợ của các tải
nội bào chế tiết và các protein xuyên màng. Có 2 điều làm cho sự xuất bào ở synapse khác với
những tế bào chế tiết khác:
- Sự tiết liên quan chặt chẽ đến hoạt động điện thế màng tại đầu tận của sợi trục.
- Túi synapse được tái cấu trúc tại khu vực hoạt động của nó, ngoại trừ acetylcholine.
Sự khử cực của màng tế bào không thể tự gây ra sự hòa màng của các túi synapse. Để có sự hòa
màng xảy ra, một hoạt động điện nhất thiết phải được biến đổi thành một tín hiệu hóa học – sự
gia tăng nồng độ Ca2+
trong tế bào chất. Kênh cổng điện thế Ca2+
sẽ mở ra để dòng Ca2+
nhập
bào khi sự khử cực xảy ra. Dòng Ca2+
nhập bào này làm gia tăng nồng độ Ca2+
trong tế bào chất
của các túi synapse kế cận từ
-
Có một thí nghiệm đã chứng tỏ được tầm quan trọng của kênh cổng điện thế Ca2+
trong quá trình
giải phóng neurotransmitter. Bằng cách khóa kênh này bằng tetrodotoxin (thuốc ức chế kênh
cổng điện thế Na+) để ngăn chặn sự thay đổi điện thế hoạt động của tế bào, người ta thấy rằng
không có sự chế tiết neurotransmitter. Nếu màng tế bào của sợi trục sau đó được khử cực bằng
cách sử dụng 100mM KCl, neurotransmitter lại tiếp tục được giải phóng bởi vì dòng Ca2+
lại vào
được tế bào thông qua kênh cổng điện thế Ca2+
, tương tự như quá trình khử cực bằng kênh cổng
điện thế Na+.
Luồng tín hiệu tại synapse thƣờng kết thúc bởi sự thoái giáng hoặc tái hấp thu
neurotransmitter
Hình 6.4: Minh họa quá trình tiết neurotransmitter, sự tái tạo synapse vesicle và sự tái hấp thu
neurotransmitter.
Sự co cơ và sự mở kênh acetylcholine-Gated cation
-
Hình 6.5: Trình tự hoạt hóa sự co cơ.Điện thế nơi tận tại presynapse của neuron vận động làm
mở kênh cổng điện thế Ca2+
(b1) và kích thích giải phóng acetylcholine, hoạt hóa sự mở thụ thể
acetylcholine tại màng tế bào cơ (b2). Kết quả của quá trình trên là sự nhập bào của Na+, rồi khử
điện thế màng gây hiện tượng mở kênh cổng điện thế Na+, Na
+ tiếp tục nhập bào gây ra một điện
thế hoạt động (b3). Khi Sự khử cực truyền tế ống T, nó tạo ra kích thích mở kênh cổng điện thế
Ca2+
trên màng tế bào. Ca2+
của sarcoplasmic reticulum sẽ đi vào tế bào chất (b4). Chính Ca2+
này sẽ kích thích quá trình co cơ (có thể tìm hiểu cơ chế cụ thể ở các tài liệu khác). (Theo
Guyton’s medical physiology)
-
Hình 6.6: Các tiểu đơn vị và polymere của thụ thể neurotransmitter
-
Hoạt động của chất trung gian ở neuron hậu synapse - Chức năng của thụ thể
Hình 6.7: Minh họa hoạt động của chất trung gian ở neuron hậu synapse (Theo Guyton’s
Medical physiology)
Màng neuron hậu synapse chứa rất nhiều protein thụ thể. Các thụ thể này được cấu tạo bởi 2
thành phần chính: (1) protein bám màng, hướng ra màng đến khe synapse – đây là nơi tiếp nhận
chất dẫn truyền thần kinh từ đầu tận của thần kinh tiền synapse, (2) các ion được truyền từ màng
vào bên trong của thần kinh hậu synapse bởi các thể mang ion. Các thể mang ion này tồn tại ở 2
dạng (1) kênh ion- cho phép 1 số ion chuyên biệt qua màng, (2) chất kích hoạt chất thông tin thứ
hai – phân tử này hướng về phía bào tương và kích hoạt một hoặc nhiều chất bên trong neuron
hậu synapse chứ không đơn thuần là một kênh ion.
Các kênh ion ở màng thần kinh hậu synapse có 2 loại (1) kênh cation (chủ yếu là Na+ đôi khi
cũng cho K+ và Ca
2+ đi qua), (2) kênh anion (kênh này chủ yếu cho Cl
- và 1 số ít các anion khác
đi qua). Kênh Na+ mang điện tích âm. Chính điện tích âm này giúp kênh vận chuyển được ion
Na+ khi đường kính của kênh lớn hơn đường kính của ion Na
+. Anion Cl
- và các anion khác
không qua được kênh này mà đi qua các kênh dành riêng cho chúng (có đường kính đủ lớn).
Nguyên nhân chủ yếu làm cho Na+, K
+, Ca
2+ không qua được các kênh dành cho anion là vì thể
hydrate hóa của các ion này có kích thước quá lớn.
-
Các chất dẫn truyền trung gian có nhiệm vụ mở kênh cation được gọi là chất dẫn truyền kích
hoạt, ngược lại các chất làm nhiệm vụ mở kênh anion được gọi là chất dẫn truyền ức chế. Các
kênh ion được mở ngay lập tức khi các chất dẫn truyền trung gian kích hoạt chúng (chưa đến 1
ms) và khi các chất dẫn truyền trung gian không còn nữa các kênh này sẽ được đóng lại với tốc
độ tương tự. Vậy, sự điều khiên của các neuron hậu synapse được nhanh chóng là nhờ sự đóng-
mở các kênh ion.
Hệ thống chất thông tin thứ 2 ở neuron hậu synapse
Một vài chức năng của hệ thần kinh như sự ghi nhớ cần có những thay đổi trong neuron từ vài
giây đến hằng tháng kể từ khi chất dẫn truyền thần kinh không còn nữa.. Kênh ion đóng trong
vòng vài ms sau khi chất dẫn truyền biến mất nên nó không có khả năng gây ra những thay đổi
neuron hậu synapse kéo dài. Thay vào đó, các kích thích hoặc hạn chế các thay đổi neuron hậu
synapse bằng cách kích thích hệ thống chất thông tin thứ 2 ở trong chính những neuron hậu
synapse đó. Và chất thông tin thứ 2 sẽ giúp kéo dài sự thay đổi.
Hệ thống chất thông tin thứ 2 có nhiều loại. Loại phổ biến nhất là G-Proteins. G-protein bám vào
phần thụ thể hướng vào bên trong tế bào. G-protein gồm 3 phần phần α - phần kích hoạt và phần
β, phần γ bám vào phần α và bên trong màng tế bào kế cận của protein thụ thể. Khi có kích thích
thần kinh, phần α tách khỏi phần β và γ để găn vào bào tương.
Trong bào tương, tùy vào từng loại neuron mà phần α thực hiện 1 hay nhiều nhiệm vụ khác nhau.
Hình thể hiện 4 thay đổi có thể xảy ra. Đó là các dạng:
1. Mở 1 vài kênh ion thông qua màng tế bào hậu synapse. Ở bên góc trái của hình: kênh K+ được
mở nhờ G-protein, nhờ G- protein kênh này được mở ra rất lâu so với cơ chế không dùng hệ
thống chất thông tin thứ 2.
2. Kích hoạt cAMP hay cGMP ở trong tế bào thần kinh. cAMP, cGMP có khả năng kích hoạt
những hệ thống chuyển hóa chuyên biệt trong neuron nên chúng có thể gây ra sự thay đồi lâu dài
trong cấu trúc tế bào, và chúng cũng nhạy cảm với các kích thích của neuron.
3. Sự kích hoạt các enzyme nội bào. G-protein có thể kích hoạt một hoặc nhiều enzyme nội bào.
Các enzyme này sẽ thực hiện một vài chức năng hóa học nhất định trong tế bào.
4. Kích hoạt sự phiên mã. Đây là một trong những tác dụng quan trọng nhất của hệ thống thông
tin thứ 2 vì sự phiên mã có thể tạo ra những protein mới trong neuron, các protein này sẽ thay đổi
bộ máy chuyển hóa hay cấu trúc của tế bào. Thật vậy , sự thay đổi cấu trúc được gây ra bởi
neuron xảy ra ở qui trình ghi nhớ dài hạn
Rõ ràng là sự kích hoạt hệ thống thông tin thứ 2 trong neuron bởi G-protein hay các loại khác, rất
quan trọng trong việc đáp ứng lâu dài ở những con đường dẫn truyền thần kinh khác nhau.
Sự kích hoạt hoặc kìm hãm thụ thể trong màng neuron hậu synapse
-
Vài thụ thể hậu synapse khi được kích hoạt có thể kích thích hay ức chế các neuron hậu synapse.
Sự kích thích hay ức chế này rất quan trọng trong chức năng của hệ thần kinh. Các thụ thể khác
nhau sẽ sử dụng những cơ chế màng và phân tử khác nhâu để kích hoạt và ức chế.
Sự kích hoạt
1. Sự mở của kênh Na+
cho phép 1 lượng lớn điện tích dương chảy vào bên trong tế bào hậu
synapse. Sự tăng về nồng độ các điện tích dương làm cho điện thế dương nội màng tăng đến
mức ngưỡng kích thích để tạo ra kích thích.
2. Giảm lượng ion vận chuyển qua kênh chloride và postassium. Nó làm giảm sự khuếch tán Cl-
vào bên trong neuron hậu synapse hay giảm sự khuếch tán của K+ ra ngoài. Nó làm cho màng
nội bào dương hơn mức bình thường, đó là sự kích thích.
3. Sự thay đổi đa dạng trong chuyển hóa nội bào của neuron hậu synapse kích hoạt hoạt động tế
bào. (sự tăng lên các thụ thể màng kích hoạt hay giảm xuống các thụ thể màng ức chế)
Sự ức chế
1. Sự mở các kênh Cl- trên màng neuron hậu synapse giúp cho Cl
- khuếch tán nhanh chóng từ
ngoài vào bên trong neuron hậu synapse, làm tăng điện tích âm bên trong màng, đó là sự ức chế.
2. Sự thoát K+
khỏi neuron giúp các ion dương được khuếch tán ra ngoài làm tăng điện thế âm
bên trong neuron.
3. Sự kích hoạt các enzym thụ thể làm kiềm chế các chức năng chuyển hóa tế bào, tăng thụ thể
synapse ức chế hoặc giảm thụ thể synapse kích hoạt.
6.2 Nhóm thụ thể kết hợp với Protein G: (G protein-coupled receptor)
Sự phát hiện ra G protein
G- protein được phát hiện nhờ vào thí nghiệm của Martin Rodbell năm 1971 về sự kích hoạt
cAMP bởi glucagon. Nhờ thí nghiệm này Martin Rodbell đã phát hiện ra sự hiện diện của GTP
là rất quan trọng trong phản ứng này. Ông gọi đây là protein điều hòa guanine nucleotide, sau
này đổi tên là N-protein, hoạt động như bộ chuyển đổi trung gian giữa discriminator (receptor)
and amplifier (effector; i.e., adenylate cyclase). Sau đó, ông thấy rằng adenylatecyclase đã
được kích hoạt mạnh mẽ và không thể đảo ngược bởi một analog GTP,5'-
guanylylimidophosphate, hoặc[GPP (NH)-p]’. Vì GPP (NH)-p có khả năng chống thủy phân
nên Rodbell cho rằng GTP là"chất thủy phân tại vùng tác hoạt", có nghĩa là, bộ chuyển đổi
giống như GTPase. Điều này sau đó đã được thể hiện rõ hơn bởi Cassell và Selinger vào năm
1976. Sự có mặt của protein bám GTP riêng lẽ, khác biệt với các enzyme adenylate cyclase,
được xác định bởi Alfred Gilman và đồng nghiệp người đã tái thiết lại GPP (NH)-p-, 1 chất kích
thích hoạt động adenylate cyclase trong màng từ dòng đột biến tế bào ung thư hạch (cyc-) - có
-
adenylate cyclase nhưng thiếu G-protein bằng cách bổ sung thêm yếu tố 40kDa GTP bám riêng
biệt. Năm 1980, Howlett và Gilman cho rằng sự kích hoạt lâu dài của G-protein kích hoạt
cyclase làm giảm lượng phân tử protein, nhấn mạnh rằng G-protein được tạo thành bởi những
tiểu đơn vị có thể li giải được. Cấu trúc tam thể (3 thành phần) của G-protein được phát hiện bởi
Stryer và cộng sự. Họ đã chứng tỏ được rằng sự kích hoạt Gt bởi Gpp(NH)-p và ánh sáng dẫn
đến sự phân ly của phức hợp trimeric αβγ, tạo nên Gpp(NH)-p bám αt và βγ (αt có vai trò kích
hoạt sự khử phosphoryl hóa). Năm 1985, α-transducin được tạo thành bởi 4 nhóm với các trưởng
nhóm là Numa, Boume, Khorana, và Simon; Năm 1986, cấu trúc của tiểu đơn vị α được xác định
đầy đủ bởi nhóm của Gilman. Rodbell và Gilman được trao giải Nobel vào năm 1994.
Cấu trúc của G-protein
G-protein được gồm 3 thành phần: tiểu đơn vị α có KLPT ~39–45 kDa, tiểu đơn vị β có KLPT
~37 kDa và tiểu đơn vị γ có KLPT ~8 kDa . Có khoảng 20 gen mã hóa nhiều loại tiểu đơn vị α,
6 gen đối với tiểu đơn vị β và 12 gen cho tiểu đơn vị γ. Ở trạng thái trimer hóa, G-protein bám
vào mặt trong của màng tế bào thông qua đuôi kị nước của tiểu đơn vị α và γ (myristoyl và
palmitoyl trên α, farnesyl hoặc geranylgeranyl trên γ). Tiểu đơn vị β và γ được nối lại với nhau
bởi liên kết giữ lõi với lõi để tạo nên βγ-dimer; tiểu đơn vị β của βγ-dimer này sẽ bám vào tiểu
đơn vị α bằng theo kiểu bổ sung ở vùng liên kết peptide trên 2 protein và sự tương tác với đuôi kị
nước. Khi G-protein được kích hoạt, liên kết giữa tiểu đơn vị α và β bị đứt, trimer bị phân ly
thành tiều đơn vị monomeric α và tiểu đơn vị dimeri βγ. Tiểu đơn vị α và βγ đều bám vào màng
tế bào nhưng cũng dễ dàng tách khỏi màng khi cần.
Hình 6.8: Mô tả cấu trúc G-protein (Theo Textbook of Receptor Pharmacology 2nd ed - J.
Foreman_ T. Johansen)
Tiểu đơn vị α có 2 vùng chức năng quan trọng khác ngoài vùng để nối kết với tiểu đơn vị β.
-
Một là, tiểu đơn vị α tác động với thụ thể ở vị trí 5 amino acid cuối của đầu C tận. Hai là nó
mang vùng gắn kết với guanine nucleotide binding pocketđể thực hiện chức năng GTPase của G-
protein. Mặc khác, cả 2 tiểu đơn vị α và βγ đều có thể tác động đến bề mặt tác động của G-
protein.
Sự xáo trộn của chu trình G-Protein
Chu trình của G-protein có thể bị xáo trộn bởi những con đường sau:
1. Sự đảo của chu trình dựa vào sự thủy phân của γ-phosphate của GTP. Điều này xảy ra khi một
dẫn xuất của GTP nối kết vào thụ thể nhưng không có khả năng thủy phân hay thủy phân chậm
nối kết với tiểu đơn vị. Ví dụ,
5′-guanylylimidophosphate (Gpp(NH)-p) hay guanosine 5′-O-(3-thiotriphosphate)
(GTPγS),hay thêm vào AlF4, tạo các triphosphate giả (pseudo phosphate) trên GDP trong Gα-
GDP. Trong những điều kiện này, sự hoạt hóa các chất tác hiệu trở thành không thuận nghịch.
Thụ thể được kích hoạt sẽ xúc tác chu trình G-protein, về bản chất cũng giống như khi có ligand
kết nối nhưng chậm hơn từ 100 đến 1000 lần. Khi thiếu sự kích hoạt thụ thể bởi ligand, chu trinh
cơ bản chậm sẽ xảy ra. Nguyên nhân có thể là vì phần nhỏ của thụ thể hiện diện trong thể hoạt
động ngay cả khi thiếu ligand. Kết quả là, sự thay đổi Gpp(NH)-p hay GTPγS bởi GTP hay sự có
mặt của AlF4 đóng vai trò tạo ra các đáp ứng tác hiệu (effector response) trong khi thiếu ligand
thụ thể. Tuy vậy, sự kích hoạt vẫn chậm hơn khi có sự hiện diện của ligand.
-
Hình 6.9: Minh họa một số cấu trúc (Theo Textbook of Receptor Pharmacology 2nd ed - J.
Foreman_ T. Johansen)
2. Chu trình có thể chậm lại khi thêm vào những GDP dư thừa hay, guanosine
5′-O-(2-thiodiphosphate) (GDPβS) – một dẫn xuất ổn định hơn. Không giống GTPγS, GDPβS
có liên kết thuận nghịch nên nó chỉ cạnh tranh với GTP. Do vậy nó sẽ chỉ hoạt động ở nồng độ
cao hơn tiêu chuẩn từ 10 lần trở lên.
3.Khi có sự hiện diện của NAD+, tiểu đơn vị α của G-protein có thể bị ADP-ribosylated bởi 2
loại
Protein vi khuẩn. Độc tố của vi khuẩn Ho gà (whooping-cough) (PTx) ADP-ribosylates cysteine
ở đầu C tận của G-protein của nhóm Gi và Go ngăn cản sự bắt gặp của G-protein thụ thể và
năng chặn sự hoạt hóa GPCR. . N-ethyl-maleimide (NEM) cũng alkyl hóa cysteins theo cùng cơ
chế.
Độc tố dịch tả (CTx) ADP-ribosylates arginine trong G-proteins của lớp Gs (adenylate cyclase-
stimulating) ở gần vị trí GTPase. Nó làm ngăn cản chức năng của GTPase xúc tác và gây ra sự
hoạt hóa Gs/adenylate cyclase lâu dài. Tranducin và gustducin (tín hiệu nhìn và nếm) đều được
ADP-ribosylated bởi cả 2 loại độc tố trên. Phản ứng này có thể được dùng để phân lập các G-
protein có thể bị ADP-ribosylated.
Sự điều hòa tín hiệu G-protein
RGS Protein
RGS protein thuộc họ các protein liên kết lỏng lẻo giống nhau ở vị trí RGS 130 amino acid cho
phép chúng bám vào tiều đơn vị α của G-protein. Khi RGS protein bám vào, nó điều hòa tín hiệu
G-protein theo 2 cách. Cách thứ nhất (quan trọng nhất), nó có vai trò như GAPs (protein kích
hoạt GTPase), tăng cường sự thủy phân GTP bằng cách hoạt hóa G-protein, sau đó chúng kích
hoạt GαGTP hay Gβγ tăng cường sự khôi phục của các phần tử tác hiệu (effector). RGS protein
không ảnh hưởng đến tỉ lệ GDP-GTP và tỉ lệ G-protein được kích hoạt bởi thụ thể. Cách thứ 2.
RGS protein làm giảm khả năng bám của GαGTP vào các phần tử tác hiệu, ngăn chặn phản ứng.
Ta có thể thấy tiểu đơn vị α được kích hoạt bở GTPγS không thủy phân được. Ví dụ, RGS
protein, RGS4, ngăn cản sự đáp ứng của PLC-β1đối với GTPγS kích hoạt Gq.
Có rất nhiều loại RGS protein vì vậy cũng có rất nhiều độ chọn lọc cho từng tiểu đơn vị α và
cũng có nhiều tác động lên từng hệ thống tác động khác. Những thuộc tính này thường được
đánh giá trong hệ thống biểu hiện khôi phục. Hiện nay vai trò của RGS protein riêng biệt trong tế
bào vẫn chưa được rõ.
Một trong những điều thú vị của vấn đề này đó là sự liên kết giữa RGS protein và tiểu đơn vị α
có thể bị phá vỡ bởi điểm đột biến trên tiểu đơn vị α mà không ảnh hưởng đến chức năng của
-
Gα. Sự kết hợp đột biến này với đột biến khác giúp loại bỏ tính nhạy cảm của PTx (hình 7.10).
RGS protein nội sinh có vai trò trong việc ức chế dòng Ca2+
trong thần kinh giao cảm bởi Go
được kích hoạt bởi noradrenaline. Ví dụ: sự thay thế Goα bằng Goα đột biến giúp giảm sự nhạy
cảm của noradreanaline đi 10 lần và làm chậm quá trình khởi động và khôi phục sự ức chế. Tuy
nhiên, vấn đề này liên quan đến khả năng hoàn nguyên của hệ gene.
Hình 6.10: Minh họa một số vai trò của RGS protein
Protein hoạt hóa GTPase hoạt động nhƣ một phân tử tác hiệu
Enzyme có vai trò như GAP - tăng cường sự thủy phân GTP, điều khiển sự bất hoạt nhanh của
các ezyme được hoạt hóa bởi G-protein. Ví dụ, Gαq-GTP thuần có hoạt tính GTPase rất yếu (tiêu
tốn 10-60s) nhưng hoạt tính này sẽ tăng lên 50 lần khi có mục tiêu tác hiệu của nó, như PLC-β1
chẳng hạn, điều nay làm cho chu kì bán hủy hoạt tính sinh học của nó chỉ kéo dài trong 1s. Như
-
thế, sự thêm vào phosphodiesterase rút ngắn chu kì bán hủy của GTP-bound α-transducin từ 20s
xuống còn 5s. Tác dụng tăng cường của phosphodiesterase kết hợp với tác động visual RGS
được đề cập ở trên. Các tác hiệu của kênh ion có vai trò như GAP khi thiếu RGS protein vẫn
chưa rõ cơ chế.
6.3 Nhóm thụ thể Tyrosine Kinase: (Tyrosine kinase receptors)
Distinct mechanisms of small-molecule inhibitors and monoclonal antibodies for targeting receptor
tyrosine kinases in cancer cells. a | Epidermal growth factor receptor (EGFR) and receptor tyrosine kinase
(RTK)-dependent growth signalling in cancer cells. The extracellular region of EGFR consists of four
domains, the ligand-binding domains (L1 and L2) and the cysteine-rich domains (CR1 and CR2), and the
C-terminal domain of EGFR contains six tyrosine residues (Y; only two are depicted here for simplicity).
Following the activation of EGFR by ligand binding or ligand-independent dimerization, the Ras–Raf–
MEK–MAPK pathway is activated through the growth factor receptor-bound protein 2 (GRB2)–SOS
complex. EGFR-mediated signalling also activates the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)–AKT
-
pathway, which contributes to anti-apoptotic effects of EGFR activation. Additionally, signal transducer
and activator of transcription (Stat) proteins (STAT1, STAT3 and STAT5) are also activated. The
coordinated effects of these EGFR downstream signalling pathways lead to the induction of cellular
responses including proliferation, differentiation, cell motility, adhesion and angiogenesis. The
deregulation of EGFR-mediated signalling in some cancer cells leads to aberrant proliferation, invasion,
metastasis and neovascularization.[9] b | Small-molecule tyrosine kinase inhibitors (TKIs) such as
gefitinib function as ATP analogues and inhibit EGFR signalling by competing with ATP binding within
the catalytic kinase domain of RTKs. As a result, the activation of various downstream signalling
pathways is blocked. Each TKI has a different selectivity for RTKs, and some are dual- or multi-selective,
which might provide a therapeutic advantage. c | By contrast, therapeutic monoclonal antibodies (mAbs)
bind to the ectodomain of the RTK with high specificity (for example, cetuximab binds to the L2 domain
of EGFR, and thereby inhibits its downstream signalling by triggering receptor internalization and
hindering ligand–receptor interaction. Unlike small-molecule inhibitors, mAbs also activate Fcγ-receptor-
dependent phagocytosis or cytolysis by immune-effector cells such as neutrophils, macrophages and
natural killer cells by inducing complement-dependent cytotoxicity (CDC) or antibody-dependent cellular
cytotoxicity (ADCC).[107] MAPK, mitogen-activated protein kinase; MEK, mitogen-activated protein
kinase kinase.
Khám phá thụ thể Tyrosine kinase
Khoảng hơn 30 năm trước, các thụ thể của hormone polypeptide như là insulin và GH đã được
phát hiện như là vùng nối kết kích hoạt hoạt động của màng tế bào, tế bào hoặc các protein
xuyên màng bằng cách sử dụng protein đánh dấu phóng xạ. Tuy nhiên, sự truyền tín hiệu của
những thụ thể này vẫn còn là điều bí mật trong suốt 10 năm sau đó cho đến khi hoạt tính của
PTK được khám phá. RTK đầu tiên được khám phá cả về cấu tạo và chức năng là thụ thể EGF
(epidermal growth factor). Stanley Cohen và đồng sự đã tách ly được thụ thể EGF và chứng
minh nó là một glycoprotein trong màng tế bào và có trọng lượng là 170kDa, ngoài ra người ta
còn thấy nó có một vùng nối kết đặc biệt. Cấu trúc hoàn chỉnh của thụ thể EFG được phát hiện
nhờ vào phương pháp phân dòng cDNA (cDNA cloning) và trình tự mRNA, PTK được cố định
ở trong bào tương tại thụ thể chuỗi polypeptide (receptor polypeptide chain). Ligand nối kết làm
nhị hợp hóa thụ thể EGF và nhanh chóng kích hoạt PTK tự phosphoryl hóa một vài phân tử
tyrosine tại đầu C của thụ thể. Các phosphotyrosine là vùng nối kết cho vùng Src homology 2
(SH2) hoặc vùng gắn kết phosphotyrosine (phosphotyrosine-binding domain, PTB) của một vài
phân tử protein tín hiệu.
Sau đó, RTKs được phát hiện có 20 dòng nhỏ khác nhau và tất cả đã được phân lập. Những cấu
trúc này hằng định trong vùng xúc tác của PTK nhưng chúng biến động rất lớn trong khu vực
ngoại bào cũng như là tại juxtamembrane và vị trí tại đầu C trong bào tương. Sự phân loại các
dòng nhỏ (subfamilies) dựa vào các trình tự tương đồng chính yếu (primary-sequence homology)
và sự tương khớp trong cấu trúc bậc 2. Vùng giàu cysteine, vùng immunoglobulin-like (Ig-like),
vùng giàu leucine, vùng giàu cadherin-like, vùng fibronectin type III, vùng EGF-like, và vùng
kringle-like chỉ rõ đặc điểm của khu vực ngoại bào của RTKs.
-
Hình 6.11: Minh họa 20 họ của siêu họ RTK. (Theo Textbook of Receptor Pharmacology 2nd ed
- J. Foreman_ T. Johansen)
Nhìn chung, tyrosine kinase là họ thụ thể được cấu tạo bởi 2 thành phần chính: Ngoại bào và nội
bào, chúng nối kết với nhau bằng một chuỗi polypeptide xuyên màng. Thành phần ngoại bào là
nơi gắn kết với ligand (khu vực gắn ligand, ligand biding domain-LBD). Thành phần nội bào có
những amino acid tyrosine, là vị trí phosphoryl hóa dưới sự xúc tác của tyrosine kinase. Chuỗi
polypeptide xuyên màng là một vòng α có cấu trúc bậc II, cấu trúc mỏng manh của vòng xoắn α
làm thành phần ngoại bào dễ bị lệch trục khi màng bào tương trở nên giảm linh động do sự tích
hợp của protein, cholesterol tự do hay acid béo no lên màng bào tương nên LBD không thể gắn
được với ligand. Tình trạng này được xem là một trong những nguyên nhân gây ra hiện tượng
kháng insulin trong hội chứng chuyển hóa cũng như tình trạng miễn dịch kém trong hội chứng
này, vì thụ thể insulin và cytokines thuộc họ RTK.
-
Hình 6.12: Cấu trúc SH2
Các học thuyết về sự kích hoạt thụ thể Tyrosine Kinase
Các nghiên cứu trên chức năng của thụ thể EGF đã xác lập được 2 hệ luận trong sự hoạt hóa
RTK và sự truyền tín hiệu.
Trước hết, RTKs được kích hoạt bởi sự nhị hợp hóa phát sinh bởi sự liên kết với ligand. Ngoại
trừ họ thụ thể insulin, tất cả các thụ thể RTK khác (EGF, thụ thể platelet-derived growth factor
(PDGF)) đều có cấu trúc monomer trên màng tế bào. Khi ligand nối kết với thụ thể đã khiến nó
trải qua quá trình dimer hóa và quá trình tự phosphoryl hóa xảy ra trên vùng C (nội tế bào chất)
của nó. Thụ thể insulin là một thụ thể dimer disulfide, 2 chuỗi polypeptide được gọi là α2β2
heterotetramer. Insulin nối kết với tiểu đơn vị α ngoài màng tế bào dẫn đến quá trình sắp xếp lại
(rearrangement) trong cấu trúc của thụ thể (quaternary heterotetrameric) và kích hoạt PTK, tăng
cường quá trình tự phosphoryl hóa của vùng nội bào. Thể hoạt hóa của thụ thể insulin và các thụ
thể monomer PTK khác đều ở trạng thái dimer, và cơ chế hoạt hóa các thụ thể này rất tương
đồng với nhau.
-
Hình 6.13: Minh họa sự dimer hóa của RTK (Theo Textbook of Receptor Pharmacology 2nd ed
- J. Foreman_ T. Johansen)
Thứ hai, thụ thể tự phosphoryl hóa tạo ra vùng phosphotyrosine (phosphotyrosine sites) tại vị trí
trong màng bào tương của thụ thể, tạo ra một vùng neo (docking site) để nối kết với vùng SH2
và PTB. Hơn nữa, để cho thấy vai trò trung tâm trong quá trình điều hòa hoạt động của PTK, sự
tự phosphoryl hóa tyrosine của RTK là một quá trình thiết yếu để tái cấu trúc và kích hoạt các
phân tử protein tín hiệu. Hầu hết các vùng tự phosphoryl hóa tyrosine đều nằm ở vùng không xúc
tác (noncatalytic regions) của vùng nội bào phân tử thụ thể. Những vùng này gồm đuôi C (C-
terminal tail) (như với thụ thể EGF) hoặc vùng nối phosphate (kinase insert region) (như đối với
thụ thể PDGF). Sự tương tác giữa vùng SH2 và các motif phosphotyrosine tạo ra cơ chế hiệp
đồng và tái cấu trúc của phức hợp tín hiệu (signaling complex) bằng cách kích hoạt RTK. Do
vậy, tất cả RTK cần phải được biết đến không chỉ dưới vai trò thụ thể (PTK activity) mà còn phải
xem như là nền tảng của sự nhận diện và tái cấu trúc (bổ sung) các thành phần đặc biệt của phân
tử protein tín hiệu.
Hình 6.14: Thụ thể của Growth hormone (GH). Các cấu trúc monomer GH kết hợp với phần
khác để tạo thành cấu trúc dimer khi có GH nối kết. Quá trình này được xúc tác bởi JAK2 kinase
trans-phosphorylate JAK2 và thụ thể GH, yếu tố phiên mã STAT được phosphoryl bởi
JAK2.(Theo Textbook of Receptor Pharmacology 2nd ed - J. Foreman_ T. Johansen)
-
Hình 6.15: Các dạng RTK tiêu biểu và cấu trúc bất hoạt/hoạt động
Chi tiết sự hoạt hóa dimer hóa tysosine
Trong gần 20 năm trở lại đây, những quá trình tín hiệu đã được hiểu rõ dựa vào sự hiểu biết về
nền tảng phân tử của quá trình dimer hóa RTKs. Nền tảng này được các nghiên cứu hóa sinh học
về việc nối kết ligand và hoạt hóa RTK chứng minh là đúng. Tuy nhiên, các phân tử nền tảng
chính xác cho sự hình thành này vẫn chưa được biết đầy đủ. Các hiểu biết về ligand trong phức
hợp của nó với vùng kết nối thụ thể đã cho thấy cơ chế tự nhiên của sự dimer hóa này. Một vài
cấu trúc lập thể của thụ thể trong phức hợp của nó với ligand tương ứng đã được chứng minh,
bao gồm cả cytokin cũng như các thụ thể của yếu tố tăng trưởng (growth factor). Những ligand
-
khác nhau dẫn đến các cơ chế tác động khác nhau nhưng đều có điểm chung là kích thích vùng
dimer hóa của RTK.
Cấu trúc lập thể của những monomer ligand như GH và EPO trong phức hợp với các thụ thể đặc
hiệu cho thấy những hormone này tạo nối kết với thụ thể theo tỉ lệ 1:2. Sự dimer hóa thụ thể
được làm ổn định hóa hơn nữa bởi sự tương tác giữa các thụ thể kế cận.
Một vài yếu tố tăng trưởng là cấu trúc dimer thuần (homodimers), như vascular endothelial
growth factor (VEGF) và PDGF chứng minh cho việc dimer hóa của thụ thể. Thụ thể VEGF
chứa 7 vùng Ig-like trong cấu trúc xuyên màng của nó, trong đó chỉ có vùng 2 và 3 là có nối kết
với ligand. Cấu trúc lập thể của VEGF trong phức hợp với Ig-like 2 của thụ thể Flt-1 VEGF là
bằng chứng trực tiếp xác nhận sự dimer hóa của thụ thể. Cấu trúc này cho thấy một phân tử thụ
thể bám vào phần còn lại bởi 2 vùng nối liền giữa các VEGF protomer tạo thành phức hợp có 2
thành phần đối xứng (twofold symmetric), ngoài ra chứa thêm 2 VEGF protomer của vùng Ig-
like 2.
Fibroblast growth factor (FGF) là một monomer ligand, nó hoạt hóa thụ thể FGF với sự bổ trợ
của phân tử phụ - heparin sulfate proteoglycan. Cấu trúc lập thể của FGF trong phức hợp với
ligand tại vùng nối kết (bao gồm cả vùng 2 và 3 của Ig-like) cho tỉ lệ 2:2 (FGF:FGF) phức hợp
thụ thể, nghĩa là FGF tương tác bền với vùng 2 và 3 của Ig-like mà các nối kết này nằm trong
cùng 1 thụ thể. Cấu trúc dimer được giữ ổn định bởi một vùng liên kết thứ cấp có sự tương tác
giữa FGF và D2 của thụ thể thứ cấp trong phức hợp cũng như là sự tương tác giữa 2 thụ thể.
Ngược lại với liên kết disulfide của VEGF dimer, 2 phân tử FGF trong liên hệ 2:2 (FGF:FGF)
không có sự liên hệ với nhau. 2 thụ thể FGF không hoàn toàn cố định thành thụ thể FGF dimer
hóa trên bề mặt tế bào. Heparin hay heparan sulfate proteoglycan là thành phần ổn định hóa cấu
trúc dimer này. Heparin bám vào vùng eo có điện tích dương được tạo bởi Lys và Arg kéo dài
xuyên qua vùng D2 (D2 domain) của cả 2 thụ thể trong cấu trúc dimer và nối tiếp biên phân tử
FGF.
-
Hình 6.16: Cấu trúc FGF receptor.(Theo Textbook of Receptor Pharmacology 2nd ed - J.
Foreman_ T. Johansen)
Chi tiết quá trình tự phosphoryl hóa tyrosine
Quá trình hoạt hóa RTKs được hoàn thành nhờ quá trình tự phosphoryl hóa tyrosine – kết quả
của quá trình dimer hóa ligand. Hai quá trình này dẫn đến kết quả là tăng cường hoạt động xúc
tác của PTK và tạo nên vị trí gắn trong miền nội bào, thúc đẩy sự dẫn truyền tín hiệu đến các
protein. Một cách tổng quát mà nói, quá trình tự phosphoryl hóa tyrosine trong quai kích hoạt
(activation loop) tại vùng PTK đưa đến việc kích thích hoạt động của kinase, và tự phosphoryl
hóa tyrosine trên juxtamembrane, cài kinase (kinase insert) và vùng carboxyl tạo ra vị trí neo giữ
nhận ra phosphotyrosine trong các trường hợp đặc biệt. 2 module nối kết phosphotyrosine hoàn
chỉnh (2 well-established phosphotyrosine-binding modules) hiện diện trong protein tín hiệu là
vùng SH2 và PTB.
Mọi RTKs chứa khoảng 1 đến 3 phân tử tyrosine trong quai hoạt hóa kinase (kinase activation
loop), trong subdomain VII và VIII của lõi xúc tác protein kiase (protein kinase catalytic core).
Sự phosphoryl hóa các phân tử tyrosine này được chứng minh là cần thiết cho việc kích hoạt khả
năng xúc tác và các chức năng sinh học của một lượng lớn RTKs, kể cả thụ thể insulin, FGF và
VEGF, PDGF, Met (hepatocyte growth factor) và TrkA (NGF). Ngoại lệ quan trọng là thụ thể
EGF, quá trình tự phosphoryl hóa của tyrosine trong quai kích hoạt không liên quan đến quá
trình truyền tin. Sự thay đổi tyrosine thành phenylalanine không làm thay đổi hoạt động của
RTK hoặc dòng thác tín hiệu.
-
Về nguyên tắc, sự tự phosphoryl hóa RTK có thể xảy ra ở mặt cis (trong lòng thụ thể monomer)
hoặc trans (giữa hai thụ thể ở trạng thái dimer). Trong trường hợp thứ nhất, ligand bám vào có
thể gây ra sự biến đổi cấu trúc thụ thể và làm quá trình cis-autophosphoryl hóa của tyrosine cố
định trong hoặc ngoài vùng PTK. Trong trường hợp thứ hai, không nhất thiết phải xảy ra sự thay
đổi cấu trúc dimer. Một hiệu ứng đơn giản gần (simple proximity effect) có thể tạo điều kiện
thuật lợi cho quá trình trans-autophosphoryl hóa tyrosine ở vùng nội bào tương bởi một RTK thứ
hai.
Cấu trúc lập thể của trạng thái không phosphoryl hóa thụ thể insulin cung cấp chi tiết cơ chế
phân tử trạng thái bất hoạt của RTKs (tình trạng hoạt động kém) trước khi sự tự phosphoryl hóa
xảy ra. Trong cấu trúc thụ thể insulin, 1 trong 3 tyrosine ở trong quai hoạt hóa, Tyr1162, liên kết
với vùng hoạt động và có vẻ như trong vị trí tự phosphoryl hóa dạng cis. Tuy nhiên, Asp1150
của PTK-conserved, trình tự Asp-Phe-Gly ở vị trí khởi đầu quai hoạt hóa không phải ở vị trí
chính xác để phối hợp với MgATP và gây trở ngại cho việc gắn ATP. Điều này phụ hợp với dữ
liệu hóa sinh về việc phosphoryl của Tyr1162 (và Tyr1158, Tyr1163) cho rằng nó xảy ra theo
dạng trans (bởi một phân tử thụ thể insulin thứ 2). Hơn nữa, sự thay thế Tyr1162 bằng
phenylalanine dẫn đến việc tăng hoạt động kinase hóa cơ bản một cách chắc chắn, phù hợp với
vai trò ức chế của Tyr1162.
-
Hình 6.17: Cấu trúc giải phẫu vùng hoạt hóa của protein kinase. Biểu đồ trình bày thông tin
chính của vùng prototypicalkinase catalytic dựa trên cấu trúc của IRK. Vùng N được biểu diễn
màu xanh, vùng C được biểu diễn màu tím và quai hoạt hóa màu vàng. Cơ chất peptide neo vào
quai hoạt hóa và một phân tử ATP màu đen. Xoắn C chứa các thành phần xúc tác, xoắn G – nơi
neo giữ protein cơ chất có dạng phiến mỏng.
Cấu trúc lập thể vùng tris-phosphorylated PTK của thụ thể insulin tiết lộ vai trò của quai hoạt
hóa phosphoryl hóa trong sự kích thích hoạt động xúc tác. Sự tự phosphoryl hóa thụ thể insulin
mang lại sự xác định rõ vai trò của quai hoạt hóa (activation loop). Cụ thể, sự thay đổi cấu trúc
của quai hoạt hóa tris-phosphorylated insulin RTK được ổn định bởi sự tương tác với
phosphotyrosine (cụ thể là phosphorylated Tyr1162, có liên kết hydrogen với phân tử arginine
đầu tiên của quai hoạt hóa (Arg1155) và gốc amide với một nữa sau của quai). Do đó, thụ thể
insulin có bản chất ức chế dạng cis, khi có sự gắn kết của Tyr1162 tại vùng hoạt hóa sẽ cạnh
-
tranh với protein cơ chất nhưng không tự phosphoryl hóa dạng cis được bởi vì sự ràng buộc
không gian ngăn chặn sự nối kết của MgATP. Thụ thể insulin có bản chất hoạt hóa dạng trans
nhờ phân tử thụ thể thứ 2 có khả năng phosphoryl hóa Tyr1162. Các yếu tố nhiệt độ (B-factors)
cho thấy vị trí phosphoryl hóa của quai hoạt hóa insulin RTK rất di động, có lẽ là vì có sự cân
bằng giữa những sự biến đổi đa chiều với các phân tử hiện diện trong dung dịch. Tập hợp các
nhóm loại này (trạng thái bất hoạt của thụ thể insulin) gây trở ngại sự liên kết với cơ chất
(protein và ATP). Ngược lại, những sự biến đổi cấu hình khác (thụ thể insulin RTK hoạt hóa) sẽ
làm cho việc nối kết với cơ chất và quá trình phosphoryl hóa dễ dàng hơn.
Hình 6.18: Protein kinase trong điều hòa thông qua tương tác vùng N. Trong rất nhiều protein
kinase, quá trình điều hòa hoạt động của protein kinase xảy ra ở một vùng nối kết xoắn C với
vùng điều hòa như GRK2 và họ Scr, …
Chất ức chế RTK (Receptor Tyrosine Kinase)
-
RTK là thành phần giới hạn của con đường tín hiệu, nó điều khiển sự tăng trưởng và phát triển
của tế bào. Khi có bất kì sự kích thích nào bất thường vào RTK do đột biến hay do sự quá biểu
hiện (overexpression) thì điều đó chứng tỏ có ung thư. Do vậy, sự ức chế có lựa chọn RTKs là
một điều cần thiết.
Mặc dù có rất nhiều tác nhân tham gia vào quá trị ức chế RTKs đã được khám phá, tuy nhiên cho
đến nay cơ chế ức chế vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ. Có 2 nghiên cứu đã báo cáo xác định
được cấu trúc lập thể của chất ức chế RTK trong phức hợp với Tyrosine kinase domain của thụ
thể FGF 1 - một nhóm của chất ức chế RTKs có nền tảng là nhân oxindole (indolinones). Tác
chất của nhóm này ngăn chặn khả năng liên kết với gốc PO43-
của thụ thể FGF 1 (FGFR1) và có
tính đặc hiệu cao đối với nhiều nhóm RTKs khác nhau. Cấu trúc của phức hợp này cho thấy rằng
đầu oxindole chiếm giữ vị trí bám của ATP, và đầu còn lại bám vào vị trí bản lề của RTKs. Sự
ức chế của thụ thể FGF 1 sẽ càng đặc hiệu hơn nếu có sự thay đổi cấu trúc lập thể trong nối kết
nucleotide (nucleotide-binding loop). Một nhóm ức chế RTKs khác liên quan đến sự tổng hợp
pyrio-2,3-D-pyrimidine, nhóm này ức chế chọn lọc hoạt động PTKs nhờ thụ thể FGF và VEGF.
Cấu trúc phức hợp protein kinase inhibitors và vùng gắn gốc PO43-
trong thụ thể FGF 1 cho thấy
khả năng nới rộng sự tương tác bề mặt với những nhóm giống pyrimidine và nhóm kị nước ATP-
binding của thụ thể FGF 1. Những tác nhân ức chế này rất hứa hẹn trong việc chữa bệnh ung thư
và các rối loạn tăng trưởng khác trong tương lai.
-
Hình 6.19: Structural details of part of the fibroblast-growth-factor signalling pathway.
-
a | The structural details for part of the fibroblast growth factor (FGF) pathway. b | The same pathway
shown schematically. In part a, the structures of three protein complexes are shown (FGF1–FGF-receptor-
1 (FGFR1) (blue–red), son-of-sevenless-1 (SOS1)–Ras (blue–red) and Ras–Raf1 (red–green)). The
structures that are involved in domain–peptide or phosphorylation interactions are coloured according to
the secondary structure of the domain ( -helices are in purple, -strands are in yellow, and turns are in
light blue), and the interacting peptides are coloured red or orange, or are shown schematically. Solid
black arrows denote activation events, whereas dashed arrows indicate an interaction between a domain
of one protein and a particular region of another (if known, the labels on these arrows indicate the
residues that the domain binds). The steps are as follows. Step 1, FGF1 binds FGFR1, which dimerizes
and autophosphorylates. Step 2, the SH2-domain-containing transforming protein-1 (SHC1)
phosphotyrosine-binding (PTB) domain binds phosphotyrosine (pTyr) on FGFR1, and FGFR1
phosphorylates SHC1. Step 3, the FGFR substrate-2 (FRS2) PTB domain binds pTyr on FGFR1 and
FGFR1 phosphorylates FRS2. Step 4, the SH2-domain-containing tyrosine phosphatase-2 (SHP2) SH2
domain binds pTyr on FRS2. Step 5, the growth-factor-receptor-bound protein-2 (GRB2) Src-homology-2
(SH2) domain binds pTyr on SHP2 (SHP2 is possibly phosphorylated by FGFR1) and its C-terminal Src-
homology-3 (SH3) domain binds SHP2. Step 6, the GRB2 SH2 domain binds pTyr on SHC1. Step 7, the
C-terminal SH3 domain of GRB2 binds the SOS1 Pro-rich region (GRB2 can also bind to FRS2). Step 8,
the SOS1 globular domains bind and activate Ras. Step 9, Ras binds Raf1, which results in mitogen-
activated-protein-kinase recruitment.
Thụ thể insulin
Thụ thể insulin có ở nhiều tế bào khác nhau trong cơ thể, kể cả ở những tế bào insulin không có
khả năng làm tăng sự hấp thụ glucose.
Thụ thể insulin (KLPT 340 000), được cấu tạo bởi hai tiểu đơn vị có bản chất glycoprotein. Mỗi
tiểu đơn vị được tạo ra từ một mARN và chúng gắn với nhau nhờ cầu nói disulfide. Gen mã hóa
thụ thể insulin gồm 22 exon và nằm trên NST số 19 ở người. Tiểu đơn vị nhỏ nối kết với insulin
nằm ở vùng ngoại bào, trong khi đó tiểu đơn vị đóng vai trò là cầu nối hướng vào trong bào
tương. Phần nội bào của tiểu đơn vị có hoạt tính tyrosine kinase.
-
Hình 6.20: Insulin, thụ thể IGF-I và IGF-II. Mỗi hormone nối kết với thụ thể tương ứng của
nó, tuy nhiên insulin cũng nối kết với thụ thể IGF-I, còn IGF-I và IGF-II nối kết với cả 3 loại thụ
thể. Lưu ý sự tương đồng về cấu trúc giữa thụ thể insulin và thụ thể IGF-I, và cũng nên nhớ rằng
có 15 trình tự lập lại ở phần ngoại bào của thụ thể IGF-II. ISF là dịch kẽ.(Theo Ganong’s review
of medical physiology 23rd, 2009)
Sự nối kết của insulin vào thụ thể làm phát sinh hoạt tính tyrosine kinase của tiểu đơn vị, tạo ra
sự phosphoryl hóa tự động của tiểu đơn vị trên những tyrosine còn sót lại. Sự phosphoryl hóa tự
động có vai trò rất quan trọng trong việc tăng cường các tác dụng của insulin, gây ra sự
phosphoryl hóa cho các protein nội bào và sự khử phosphoryl của các các chất khác (serine và
threonin còn sót lại). IRS-1 đóng vai trò trung gian trong đáp ứng tín hiệu và đồng thời cũng là
chất tác hiệu trong những hệ thống khác, do vậy nó có phần khác so với insulin. Ví dụ, chuột có
gen mã hóa thụ thể insulin bị bất hoạt, sẽ có những triệu chứng chậm phát triển rõ rệt tử cung, dị
dạng thần kinh trung ương và da, chết khi mới sinh do suy hô hấp. Ngược lại, khi IRS-1 bị bất
hoạt, chuột chỉ chậm phát triển tử cung nhẹ, sống và kháng insulin.
-
Hình 6.21: Minh họa cho hoạt động của Insulin receptor subtrate-1 (IRS-1)(Theo Ganong’s
review of medical physiology 23rd, 2009)
Protein điều hòa sự phát triển đồng hóa tác dụng của insulin thông qua phosphatidylinositol 3-
kinase (PI3K).Thực nghiệm cho thấy ở những loài không xương sống , con đường này bao gồm
sự phát triển của tế bào thần kinh và thần kinh thị giác.
Thụ thể insulin gần giống với thụ thể của IGF-I nhưng lại khác với thụ thể của IGF-II. Những
thụ thể khác của yếu tố sinh trưởng và những thụ thể của các gen gây ung thư đều là tyrosine
kinases. Mặc dù vậy, thành phần amino acid của các thụ thể này vẫn rất khác nhau.
Khi insulin bám vào thụ thể của nó, nó kết tập thành từng đám và được đưa vào tế bào bời những
thụ thể trung gian nhập bào. Cuối cùng, phức hợp thụ thể-insulin đi vào lysosomes, tại đây cái
thụ thể bị phá hủy hay được tái sử dụng. Chu kì bán hủy của thụ thể insulin khoảng 7 giờ.
-
Hình 6.22: Sự phosphoryl hóa PDK-1 và PDK-2 dẫn tới sự kích hoạt PKB/Akt. Khi PKB/Akt
được kích hoạt nó gây ra sự vận động của protein vận chuyển glucose từ máu vào mỡ và tế bào
cơ vân. Như vậy nhiều glucose được hấp thụ hơn dẫn đến hạ đường huyết.
-
Hình 6.23: Lộ trình tính hiệu của thụ thể insulin và chú giải
-
6.4 Nhóm thụ thể Hormone nội bào: (intracellular hormone receptors)
Hình 6.24: Ligand của thụ thể nhân và các thụ thể tương ứng
Cho đến nay, đã có 48 loại thụ thể nhân đã được xác định dựa vào phổ điều hòa chức năng của
chúng. Các quá trình điều hòa bao gồm sự tăng trưởng và phát triển của tế bào, quá trình viêm
và sự chuyển hóa. Những phân tử tín hiệu kị nước, tạo liên kết với các thụ thể nhân được chứng
minh là có khả năng khuếch tán qua màng tế bào, xuyên qua bào tương và đến nhân tương tác
với thụ thể (theo các cơ chế khác nhau) để sinh ra các đáp ứng sinh học.
Một số nhóm ligand sinh học tan hoàn toàn trong lipid do vậy có khả năng đi xuyên qua màng tế
bào và tương tác với nhóm thụ thể nội bào. Các ligand này có thể có bản chất là steroids
(corticosteroids, mineralocorticoids, sex steroids, vitamin D), hormone tuyến giáp... Việc ligand
nối kết với thụ thể tương ứng sẽ kích thích các quá trình phiên mã và dịch mã, hay chính xác hơn
là thúc đẩy quá trình điều hòa các đoạn gene đích nhằm tạo ra các đáp ứng sinh học. Ngày nay,
nhiều đoạn DNA đích có vai trò là “yếu tố đáp ứng” (response elements) đã được xác định.
Những thụ thể kích hoạt gene (gene-active receptors) này thuộc về một họ protein có nguồn gốc
từ những phần tử báo trước chung (common precursor). Bằng kĩ thuật phân giải DNA, người ta
đã tìm được bản chất cơ chế hoạt động ở mức độ phân tử của những thụ thể này. Hình dưới đây
mô tả cơ chế hoạt động của glucocorticoid, giải thích như sau: Khi không có hormone, thụ thể
-
gắn kết với hsp90 [một protein xuất hiện để ngăn chặn sự gấp nếp bình thường một số vùng cấu
trúc (structural domains) của thụ thể]. Khi gắn kết với hormone tương ứng sẽ dẫn đến hiện tượng
giải phóng hsp90, khiến vùng liên kết DNA và kích hoạt phiên mã của thụ thể gấp cuộn lại đúng
cấu trúc lập thể chức năng của nó, cuối cùng là kích thích sự phiên mã gene đích.
Hình 6.25: Mô tả sơ lược hoạt động của thụ thể nhân
Cơ chế hoạt động điều hòa sự biểu hiện gene của các hormone nhóm này dẫn đến hai hệ quả
quan trọng sau:
1. Các hormone chỉ tác động sau quá trình biệt hóa kéo dài từ 30 phút đến hàng giờ,
đây là khoảng thời gian cần có để tổng hợp nên các protein mới. Điều này có
-
nghĩa là những hormone kích hoạt gene (gene-active hormone) không có cơ hội
sửa đổi (alter) vùng có bệnh lý trong vài phút. Ví dụ, glucocorticoids không thể
làm giảm nhẹ biểu hiện của hen phế quản cấp tính.
2. Tác động của các yếu tố này có thể kéo dài hàng giờ hay thậm chí nhiều ngày sau
khi nồng độ agonist (phân tử nối kết vào thụ thể, gây ra các đáp ứng kích thích
sau đó trong tế bào) giảm xuống bằng 0. Tính chất này có liên quan đến chu kì
hoạt động của phần lớp protein và enzymes, bởi vì chúng có thể duy trì hoạt tính
trong tế bào nhiều giờ và nhiều ngày kể từ khi chúng được tổng hợp. Do vậy,
những tác động có lợi hay gây hại (beneficial or toxic effects) của hormone kích
hoạt gene (gene-active hormone) thường xuyên chỉ giảm từ từ kể từ khi ngưng
đưa vào cơ thể.
Đại cƣơng về vị trí và cách nối kết ligand của thụ thể nhân
Ở phần này ta sẽ đề cập đến 2 vấn đề cơ bản của thụ thể đó là “vị trí” và “cơ chế tiếp cận ligand”.
Phần dimer hóa của thụ thể nhân và vai trò điều hòa dịch mã của nó sẽ không được trình bày vì
nó đi sâu vào cơ chế phân tử của nội tiết học, cần một thời lượng lớn để biểu đạt các nội dung do
vậy vượt quá giới hạn của đề tài.
Vị trí thụ thể nhân
-
Hình 6.26: Vùng cấu trúc của thụ thể nhân (Theo Goodman & Gilman’s Manual of
Pharmacology and Therapeutics)
Thụ thể nhân được tổng hợp tại ribosoms, ngoài nhân giống như các protein khác trong tế bào.
Việc đưa ngược lại thụ thể nhân vào nhân đòi hỏi một loại tín hiệu được gọi là nuclear
localization signal (NLS), nằm ở rìa vùng C và D (xem hình). Nhờ loạt tín hiệu này, phần lớn các
thụ thể nhân đều có mặt trong nhân dù có hay không có ligand hiện diện. Một ngoại lệ đáng quan
tâm đó là trường hợp của thụ thể glucocorticoid (GR), khi không có ligand nó sẽ bám vào phân
tử chaprone ở trong bào tương, bao gồm cả heat shock proteins (hsps). Khi hormone nối kết vào
thụ thể sẽ gây ra sự biến đổi cấu trúc dẫn đến phân ly phức hợp chaperone, hoạt hóa quá trình
đưa GR đi vào nhân bởi cuclear localization signal.
Quá trình nối kết với ligand
Các thụ thể nhân có thể tạo liên kết ái lực cao với các ligand ưa lipid (lipophilic ligand). Vùng
trực tiếp thực hiện chức năng này đó là C-terminal ligand-binding domains (LBDs), domains D
và E trong hình trên. Vùng này cũng có một vài chức năng khác, như là dimer hóa thụ thể hay
điều hòa dịch mã).
Cấu trúc của LBD có sự tương đồng trong phần lớn các thụ thể. Tất cả đều có cấu trúc bậc 3
điển hình chung bao gồm 12 đoạn xoắn α. Ligand nối kết tại vòng xoắn 3 (H3), H4 và H5. Sự
thay đổi cấu trúc lập thể sau khi ligand bám vào chủ yếu là sự cuốn gọn của đầu tận C (H12), tạo
thành một cái mũ (cap) tại vùng gắn của ligand. Mặc dù cơ chế nối kết của ligand nhìn chung là
tương đồng ở mọi thụ thể, mỗi ligand và thụ thể đều có nét đặc thù riêng dựa vào cấu trúc phân
tử của mình. Hình sau đây sẽ mô tả cơ chế chung của quá trình nối kết ligand:
-
Hình 6.27: Mô tả sự tiếp nhận ligand của thụ thể
Quá trình nhận diện gene đích của thụ thể
Một yếu tố đặc biệt khác của thụ thể nhân là khả năng nhận diện và bám vào vùng gene cần điều
hòa, phụ thuộc tín hiệu của ligand tương ứng. Gene đích chứa một trình tự DNA đặc biệt được
gọi là yếu tố đáp ứng hormone (HREs). Vùng C là nơi nối kết trực tiếp vào HRE. Vùng này có từ
66-68 amino acids, bao gồm 2 tiểu đơn vị dưới gọi là ngón tay kẽm (zinc finger, đã được đề cập
ở phần tổng quan).
-
Modules dạng kẽm (zinc-ordered modules) bao gồm các amino acid cơ bản tiếp xúc với DNA tại
LBD, cấu trúc của vùng gắn DNA (DNA-binding domain) rất giống nhau ở các siêu họ thụ thể
nhân. Sự nối kết vào DNA đặc hiệu được điều hòa bởi phức hợp nhiều yếu tố (trình bày trong
bảng ở dưới). Tất cả các thụ thể của hormone steroid ngoại trừ thụ thể của estrogen đều nối kết
với chuỗi kép DNA tại trình tự AGAACA.
-
Hình 6.28: Cấu trúc cơ bản của vùng gắn DNA đặc hiệu. A. Thụ thể hormone steroid và
AGGACA. B. RXR-NR và AGGTCA.
Theo qui ước, trình tự chuỗi kép được miêu tả bằng chuỗi bổ sung theo chiều 5’-3’. Những thụ
thể nhân khác nhận diện trình tự AGGTCA. Yếu tố quyết định tính đặc hiệu này nằm ở nhóm
amino acid gọi là P-box của DBD. Mỗi trình tự 6 DNA này được gọi là Half-sites. Chỉ có 2 trình
tự khác nhau của những half-site này (phần được gạch dưới). Ở một vài thụ thể nhân, sự duỗi
đầu C (C-terminal extension) của DBD góp phần tăng tính đặc hiệu của các half-sites mở rộng,
tăng tính đặc hiệu với trình tự DNA 5’ với hexomer (xem lại sơ đồ vùng cấu trúc của thụ thể
nhân bên trên). Một tính chất khác đặc hiệu cho gene đích đó là mật độ phân bố và độ rộng của
các half-site (spacing và orientation), phần lớn được gắn bởi thụ thể (dimers).