Saccharomyces cerevisiae : “budding yeast”

groeiende uitstulping (“bud”) : afsplitsing van nieuwe cel16 chromosomenweinig intronsgroei en ontwikkeling mogelijk als haploïden en als diploïden

Schizosaccharomyces pombe : “fission yeast”

celdeling : splitsing3 chromosomen meer intronsmeer gelijkend op hogere eukaryoten dan S. cerevisiae

Methylotrofe gist : Pichia pastoris :

hoge expressierendementen

Klonering in S. cerevisiae en andere gisten en fungi

Primrose & Twyman : hoofdstuk 11

Klonering in S. cerevisiae Achtergrond

Organisme bij uitstek – Saccharomyces cerevisiae (bakkersgist/biergist)Grootte: 12 Mb (excl. enkele repeats, o.a. rRNA); haploide set chromosomen : 16 Eencellige eukaryoot : doel studie : inzicht in eukaryotische processen

recombinante eiwitexpressie /secretie- enfermentatiemogelijkheden

geen pyrogene toxines, wel glycosylaties, relatief grote opbrengst, relatief zuiver gemakkelijker te kweken dan dierlijke cellen mogelijkheid klonering grote DNA’s (YAC’s) veel auxotrofe en andere genetische merkers

Open-leesraam (ORF) analyse van chromosoom XIV (linkerarm)

Yeast : ribosomale RNAsAlle nucleair-gecodeerde ribosomale RNAs van de Saccharomyces cerevisiae zijn gegroepeerd in één gebied op chromosoom XII. Enkele daarvan zijn in sequentie gebracht. Aan de rechterzijde bevinden zich verschillende kopijen van een 3,6 kb herhaling (precieze aantal in het genoom tot minstens 1997 onbekend), waarin het ASP3 gen en een 5S rRNA gen.

*N

Noot : diploïde en haploïde gistcellen

centromeersequenties - chromosomen*

Transformatie

• niet “natuurlijk” transformeerbaar

• (vroeger) aanmaak van sferoplasten/protoplasten (d.i. cellen zonder celwand –enzymatische behandeling) + permeabilisatie met polyethyleenglycol, behandeling met CaCl2 + toevoeging DNA;

regeneratie celwand in medium met 3% agar

• nieuwere methoden: gebruik van lithiumacetaat, PEG, ssDNA (voorbehandeling) ; enzymatische verwijdering niet nodig

• alternatieven : elektroporatie, conjugatie naar protoplasten

• geen bruikbare gistvirussen – geen transductie (infectie)/virale vectoren

Klonering in S. cerevisiae

• selectiemerkers?

1) gist is weinig of niet gevoelig voor antibiotica (uitzondering: geneticine G418)

geneticine G418

derivaat van neomycine – toxisch

substraat voor aminoglycoside fosfotransferasen –

prokaryotische enzymen – te voorzien van gistexpressiesignalen

bleek actief in gist als resistentiemerker

Vectoren

• gistreplicon of integratie in een chromosoom of ander replicerend element ;

vanuit historisch oogpunt van vectorontwikkeling, was er ook meestal een E. coli

plasmide-ori voorzien ;

waarom een E. coli plasmide-ori ? : - isolatie van intact plasmide DNA uit S. cerevisiae is moeilijk

- bereiding van zuivere en grote hoeveelheden plasmide DNA werd mogelijk na een

E. coli transformatie met een (klein, ruw) DNA extract uit gist (dus, E. coli als tussenstap)

Klonering in S. cerevisiae

2) maar meestal werden biosynthetische genen gebruikt – auxotrofe merkers Werkwijze ?

Transformeren naar een stam met mutatie in een biosynthetisch gen

de stam is afhankelijk van het voedingssupplement

Plasmide draagt het wild-type gen

na transformatie complementatie van de groeideficiëntie

URA3 gen - vereist voor biosynthese van uracil (in feite ribo-uridylaat : rUMP)

LEU2 - vereist voor biosynthese van leucine

HIS3 - vereist voor biosynthese van histidine

gist E. coli

LEU2 leuB -isopropylmalaat dehydrogenase URA3 pyrF orotidine-5’-fosfaat decarboxylaseHIS3 hisB imidazol glycerolfosfaat dehydratase TRP5 trpAB tryptofaan synthase ARG4 argH argininosuccinaat lyase

Voorbeelden van auxotrofe selectiemerkers en bijhorende biochemische component

Terminologie : auxotroof = mutant, niet in staateen bepaalde verbinding nodig voor zijn groei zelf aan te maken, maar groeit wel als die toegevoegd wordt aan het cultuurmedium.

prototroof = in staat te groeien op een gedefinieerd minimaal medium, dat idealiter slechts één C-bron en anorganische verbindingen bevat. niet verwarren met : autotroof = haalt zijn C uit CO2 (energie en reducerende kracht uit fotosynthese of chemosynthese)

heterotroof = haalt C uit organische verbindingen (en kan ze mineraliseren tot CO2 en H2O)

URA3 : is ook een tegenselecteerbare merker :aanwezigheid van URA3-gen is letaal op een medium met 5-FOA

URA3 – ura3p : systematische naam YEL021W Beschrijving : orotidine-5‘-fosfaat (OMP) decarboxylase : katalyseert de zesde enzymatische stap in de de novo biosynthese van pyrimidines, door omzetting van OMP tot uridine monofosfaat (UMP)

5-FOA = 5-fluoro-orotic acid

(na inbouw)

5-fluoro-uracil Toxic

Kan een gist DNA fragment een auxotrofe E. coli mutant complementeren?

=> test : transformatie van een E. coli leuB stam met restrictiefragmenten van gist DNA

=> leidde tot identificatie van het gist LEU2 gen

Vervolgens omgekeerd :

Kan dit gekloneerde LEU2 plasmide DNA een LEU2- mutant complementeren?

=> test : import in gistcellen

42 transformanten werden bekomen (analyse door Southern hybridisatie)

35 bevatten "pBR322-DNA" (m.a.w. vectorsequenties)

(wees op integratie door enkelvoudige recombinatie)

30 op de homologe plaats (type I integratie)

5 op een andere plaats (type II integratie)

7 via allelomwisseling (type III integratie : dubbele homologe recombinatie)

7

30

5

Southern analyse van de 42 gist-transformanten :

2 strategieën voor gerichte integratie :

lineaire (homologe) uiteinden zijn zeer recombinogeen

1. linearisatie in het doelwitgen en inbouw van de ganse vector

2. voorafgaande inbouw van de merker in het doelwitgen, en excisie van het merkerfragment met doelwitsequenties aan de uiteinden

Telkens een intact merkergen, met uiteinden, homoloog aan het doelgebied in het waardcel DNA. Wil men hierbij

nog een extra, niet-selecteerbaar gen meebrengen, kan dit

uiteraard naast het merkergen (op de vector bij 1. of op het

fragment bij 2.) liggen.

A.

B.

• yeast integrating plasmid (YIp)

• yeast replicating plasmids (YRp)

• yeast episomal plasmids (YEp)

• yeast centromere plasmids (YCp)

• yeast artificial chromosomes (YAC)

Vectortypes

Primrose: Tabel 11.1

yeast integrating plasmid (YIp)

• Vb. YIP5

• Antibioticumselectiemerkers

voor E. coli: ApR, TcR – pendelen!

• E. coli ori ColE1 (van pBR322) – pendelen!

• URA3 - gistselectiemerker (ev. seq voor homologe recombinatie

of alternatief : een repetitieve sequentie)

• “kloneervehikel” voor stabiele introductie van constructen in het gistchromosoom

• behoud door integratie in genoom (onder selectiedruk)

• replicatie met het genoom, en zelfde kopijenaantal

yeast integrating plasmid (YIp)

Alleluitwisseling met YIp-vectoren

• uitvissen van mutante genen (allelen) uit het genoom

• integratie duplicatie van het gen

• excisie op flankerende knipplaatsen en transformatienaar E. coli leidt tot 50% wt en 50% mutant allel

(door linearizatie, efficiëntere integratie –lineaire uiteinden dirigeren de insertieplaats)

Integratieve vector : voor stabiele expressie in Pichia pastoris

Zeocine selectie is mogelijk zowel in bacteriën (E. coli), gist als dierlijke cellen.

ARG4 mogelijk als (extra) auxotrofe merker ; hier mogelijks in te bouwen in het AOX1 doelwitgen. (AOX1 = aldehyde oxidase 1)

TT : transcriptieterminator

Zeocine behoort tot de bleomycine/phleomycine familie van antibiotica die binden aan DNA ( intercaleren) en het afbreken. Resistentie steunt op het Sh ble genproduct (van Streptoalloteichus hindustanus), dat bindt aan het antibioticum en aldus de binding aan DNA verhindert.

Recombinogene klonering in gist.

Homologe recombinatie is zeer efficient in S. cerevisiae (en ook behoorlijk in andere fungi) en ds-uiteinden zijn het beste substraat.

Dit kan uitgebuit worden door fragmenten met corresponderende uiteinden in vivo te laten recombineren (in dit voorbeeld in een gistvector in de cel) en aldus DNA segmenten uit te wisselen (bvb. een merker, een genconstruct, enz.).

REMI : restriction enzyme mediated integration

Lineaire DNA fragmenten, bvb. BamHI fragmenten,

die samen met het BamHI restrictieënzym aan een

transformatiemengsel toegevoegd worden, zullen

(bij voorkeur) integreren in een genomische BamHI

plaats. De transformatie-efficiëntie is tevens sterk

verhoogd.

Deze techniek is ook toegepast in andere fungi.

yeast replicating plasmid (YRp)

• Vb. YRP17

• E. coli elementen (fig/tabel)

• intermediair kopijaantal - meer transformanten

• ARS = ‘Autonomous ReplicatingSequences’ - replicatie in gist

gemeenschappelijk motief 5’WTTTATRTTTW3’

• URA3, TRP1 selectiemerkers

• nadeel : mindere stabiliteit en neiging tot segregatie met de oudercel oudercel - ondanks de selectiedruk

(A) Structuur van ARS1, een typisch autonoom replicerend element(ARS) dat werkt als een ori in Saccharomyces cerevisiae. De relatieve posities van de functionele sequenties A, B1, B2 en B3 zijn aangeduid.

(B) Opensmelten van de DNA helix gebeurt in subdomein B2,geïnduceerd door aanhechting van het ARS bindingsproteïne 1 (ABFI1) aan subdomein B3. De eiwitten van het “origin replication complex” zijn permanent gebonden aan subdomeinen A en B1.

*

yeast replicating plasmid (YRp)

YRP177002 bp

ORI : Col E1 ori voor E. coliAp : bla ; ampicilline resistentiegenTc : tet ; tetracycline resistentiegen

• Toepassing: alleluitwisseling

Alleluitwisseling zonder integratie !

‘Genconversie’-mechanisme !(allel dient als “matrijs” voor aanmaak van nieuwe seq.)

Vb. Isolatie van een genomisch allel van de MAT locus : ‘uitvissen’ van de allelsequentie uit het genoom

- linearisatie / behoud van de flankerende sequenties- dubbele cross-over

Gelineariseerd DNA kan enkel blijven bestaan ingist na circularisatie of integratie => hercircularisatie na recombinatie en genduplicatie

- “pendeling” naar E. coli en analyse van de mutanten

yeast episomal plasmid (YEp)

• Vb. YEp24

• Hoog kopijenaantal (50-100 per cel)

• E. coli plasmide-elementen

• URA3 selectiemerker in gist

• Replicatie in gist door replicatie-elementen van het circulaire 2µ plasmide

• 2µ plasmide – vrij algemeen voorkomend in S. cerevisiae

• ~ 6300 bp (naamgeving : 2, 2-, 2mu, 2-mu, 2m, ...)

• replicon en stabiliteitslocus vereist voor vectorconstructie (ORI + REP3)

• niet erg stabiel, maar toch beter dan de YRp vectoren.

De twee vormen van het 2 plasmide : het centrale gedeelte is de omgekeerde herhaling (inverted repeat)

ORI en REP3 zijn vereist in cis.

REP1 en REP2 kunnen in trans voorzien worden : => in CIR+ cellen volstaat 1 à 1,5 kb

2 DNA om een repliceerbaar

YEp plasmide te maken.

CIR+ cellen bevatten plasmide,

CIRo cellen bevatten geen 2.

yeast episomal plasmid (YEp)

YEp247769 bp

deel van het circulair 2 plasmide

yeast centromere plasmids (YCp)

• Stabilisatie van een YRp door een CEN (centromeer) sequentie :

ongeveer 120bp in budding yeast

vormt een “minichromosoom” :

- stabiel in mitose (>10 kb)(selectie op stabilisatie)

- segregeert mendeliaans in meïose

- 1 kopij per cel

YAC-vectoren : ‘yeast’ artificieel chromosoom (gist) (1987)

"Klassieke" YACs :

• lineair DNA : architectuur zoals gist chromosoom

in 1987 werd een kloneringsprocedure uitgewerkt : YAC vectoren

Latere ontwikkelingen :

• circulaire (of gecirculariseerde) YAC’s

• TAR : (transformation-associated recombination)

Zie hoofdstuk 14 : vectoren voor klonering van grotere DNA’s

yeast artificial chromosome (YAC)

• lineair DNA, met centromeersequentie, telomeersequenties, ARS, selectiemerkers (cfr. klonering van grote DNAs)

Na bepaling van de totale DNA-sequentie van het gistgenoom :

systematische gendisruptie en aanleggen van ORF-gedeleteerde

stammen (‘deletant strains’) (onderzoek naar het aantal 'echte' genen en hun functie)

Doel : - genfuncties bestuderen door aanleggen van disruptanten en fenotypische analyse

van de mutanten

- onderscheid tussen essentiële en niet-essentiële genen bepalen

- collecties van mutanten:haploïde van "mating " a en typehomozygote diploïden voor de niet-essentiële genenheterozygote diploïden voor de essentiële genen

• Strategie: PCR-gebaseerde deletiecassette : KanMX-module:aminoglycosidefosfotransferase o.i.v. "gist"-transcriptiesequenties selectie op geneticine G418

• Studie van essentiële genen (16-18%) via temperatuursensitieve mutanten (bvb. geninactivatie leidt tot afsterven - aanmaak van temperatuursgevoelige allelen :

puntmutaties (‘error-prone PCR’) die invloed hebben op de eiwitstructuur/stabiliteit (vb. cs/ts-mutanten = ‘cold sensitive’/’temperature sensitive’ mutanten) : mutante eiwitten destabiliseren bij 16°C.

Constructie

Gendisruptie – aanleggen van gen-gedeleteerde stammen (‘deletant strains’) van gist(PCR-gebaseerd)

Gendisruptie – aanleggen van gen-gedeleteerde stammen (‘deletant strains’) - GIST

Verificatie

Strategie voor aanbrengen van grotedeleties in het S. cerevisiae genoom.

Split-marker vectoren :

stuffer-1

stuffer-2

U R

R A

- uitsplitsen met NotI - transformatie van gistcellen

genoom

U R A 3

- 3-dubbele recombinatie in gist- selectie naar URA3

(doel : vermijden van (selectie van) type II integratie)

Humane genen (en bijhorende genproducten) die gist-mutantenkunnen complementeren. (update mei 1994)

Addendum

*N