salmonella pasantia modulo i 2
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Cronograma de actividades - Modulo I
Lunes 8/8: presentacin de patgenos
siembra en medios de enriquecimiento
Martes 9/8: E. coliO157:H7 IMS y siembra en medios
Salmonellarepique en caldos selectivos
Mircoles 10/8: E. coliO157:H7 lectura de placas
y aislamiento en TSA
Extraccin para PCR real time
Salmonellarepique en medios slidos
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Cronograma de actividades - Modulo I -
Jueves 11/8: Bioqumicas /ltex /aglutinacin
Curso de calidad : 5 S
Viernes 12/8: PCR: - preparacin de master mix
- carga de capilares
- corridalectura de las bioqumicas
Interpretacin
Informe de resultados
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INVESTIGACION DE SALMONELLA spp.
MODULO 1
Med. Vet. Mara Noel OliveraServicio de Microbiologa
INAL-ANMAT
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GENERALIDADES
Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae
Son bacilos G-, no esporulados, oxidasa
muchos son mviles por flagelos pertricos Anaerobios facultativos
T crecimiento amplio 7-48 C y pH 4-8
Caractersticas
Son bacterias ubicuas
Principal reservorio intestino de animales
Alta capacidad de supervivencia en el ambiente
Viabilidad y capacidad infectiva en agua (sem) y suelos (aos)
Capacidad de infectar al hombre y los animales (portadores)
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Alimentos implicados
Alimentos de origen animal (huevos, carne, leche, pescado, marisco)
Subproductos de origen animal (ovo productos y lcteos no
pasteurizados) Alimentos sanos que se contaminan por otro alimento contaminado opor manipulador
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Cules son los sntomas de la salmonelosis?1. diarrea grave o leve,2. fiebre3. vmitos.4. Sntomas adicionales pueden incluir escalofros, dolor de cabeza,
nausea.
Desaparecen a los 4 a 7 das
Periodo de incubacin: entre 8 a 72 horas
AutolimitanteRiesgosa para poblacin suceptible: nios, embarazadas, ancianos e
inmunocomprometidos
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Prevencin
Muere por calentamiento a 70C cocinar los alimentos
Contaminacin cruzada
higiene de losutensilios/manipuladores/orden
entre los alimentos crudos y cocidos
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EEUU brote en julio 2011------ por papayas de origenmexicano carne molida de pavo
MADRID brote en marzo 2011---- en formula en polvo paralactantes
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ISO 6579 : 2002
Mtodo horizontal para la deteccin deSalmonella spp.
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Salmonella: microorganismos con colonias tpicas en medios decultivos selectivos que poseen caractersticas bioqumicas yserolgicas especificas.
OBJETIVO: determinar presencia o ausencia de Salmonellaen unvolumen de alimento utilizando las pruebas en concordancia con elStandard Internacional.
ISO 6579:2002
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1- Enriquecimiento no selectivo:
X g de la muestra + 9 X ml de BPW (diluc. 1/10) Incubar a 37C +/- 1C,18 hs. +/- 2 hs.
Chocolates y productos con chocolates: agregar al BPW 50 g/l de casena o 100 g/l
de leche en polvo descremada estril. Alimentos cidos: BPW doble concentracin
Procedimiento
ISO 6579:2002
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2. Enriquecimiento selectivo:
- transferir 0.1 ml de BPW en 10 ml de caldo RVS.Incubar a 41,5C+/- 1C, 24 +/- 3 hs.
- transferir 1 ml de BPW en 10 ml de caldo MKTTn.Incubar a 37C+/- 1C, 24 +/- 3 hs.
ISO 6579:2002
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3. Estriado y aislamiento en placa:
A partir de RSV y MKTTn sembrar un ansada por agotamiento en superficieen agar XLD y en el segundo agar elegido . Incubar a 37C +/- 1C, 24 +/- 3 hs.
ISO 6579:2002
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4. Aislamiento en agar nutritivo:
Seleccionar colonias tpicas y estriar en agar nutritivo.Incubar a 37C+/- 1C, 24 +/- 3 hs. de cada medio selectivo al menos unacolonia tpica o sospechosa de Salmonella y 4 colonias ms si laprimera es negativa
ISO 6579:2002
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5. Confirmacin:
Pruebas bioqumicas en tubos o kits comerciales- TSI- LDC- Urea--Galactosidasa- VP
- Indol
Serologa:- Antigenos O, Vi y H
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6. Confirmacin definitiva:Una vez identificada la cepa como Salmonella spp. enviar al centro de referenciapara su tipificacin.
7. Informe de resultados:Indicar presencia o ausencia de Salmonella spp. en la cantidad de muestra analizada(por gramos o mililitros para muestras lquidas)
ISO 6579:2002
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Bacteriological Analytical Manual (BAM)
Captulo 5
Versin: Diciembre 2007
Investigacin de Salmonella
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Preparacin de la suspensin inicial:
BAM-FDA
Alimento Medio de enriquecimiento
Yema de huevo en polvo, lechefluda , preparados a base depolvos ( tortas , galletitas, ej)
Caldo lactosado estril
Huevo con cscara Caldo TSB + sulfato ferroso
Leche en polvoAgua destilada estril+ verde
brillante
Especias Caldo TSB
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1. Enriquecimiento:
25 g de muestra + 225 ml de diluyente (dilucin 1/10)
Ajustar el pH 6.8 / 0.2
Homogeneizar: 2 minutos
2. Incubacin
Incubar a 35C+/- 1C durante 24h +/- 2 h
BAM-FDA
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1ml en 10ml de Caldo Selenito (CS) y1ml en 10ml de Caldo Tetrationato (TTB)
Otros Alimentos
0.1ml en 10ml de caldo Rappaport-Vassilliadis (RV) y
1ml en TTB
3.Enriquecimiento selectivo
Alimentos sospechosos de contener S. Typhi
BAM-FDA
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Caldo selenito y caldo TT ---------24 -/+2 hs a 35C
Alimentos con baja carga microbiana
Caldo RV --------24-/+ 2hs a 42 -/+ 0.2C Caldo TT ---------24-/+2hs a 35 -/+ 2.0C
Alimentos con alta carga microbiana
Caldo RV --------24-/+ 2hs a 42 -/+ 0.2C Caldo TT ---------24-/+2hs a 43 -/+0.2C
Incubacin del enriquecimiento selectivo
Alimentos sospechosos de contener S. Typhi
BAM-FDA
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4.Aislamiento en medios slidos
Pasar un ansada de TT / RV / SC
agar Sulfito Bismuto (BS)
agar Xilosa Lisina Desoxycolato (XLD)
agar Hektoen (HE)
Incubacin de los medios slidos
24 hs-/+ 2hs a 35C
BAM-FDA
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5. a) Identificacin de colonias tpicas
Medio HE: colonias azul-verdosas con o sin centro negro , algunas cepas puedenoriginar colonias completamente negras
Medio XLD: colonias rosas con o sin centro negro.
Medio BS: colonias marrones o grises con o sin centro negro ( puede requerir
incubacin de 48 -/+ 2hs)
BAM-FDA
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5.b) Identificacin de colonias atpicas
Medio HE y XLD: colonias atpicas amarillas con o sin centro negro.
Medio BS: colonias atpicas verdes con poco o nada de ennegrecimiento del medio asu alrededor . No olvidar la incubacin adicional de 24 hs
En cualquiera de los casos elegir 2 colonias atpicas
BAM-FDA
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6.Pruebas presuntivas
Tomar colonias caractersticas y sembrar en:
TSI
LIA (anaerobiosis-4 cm fondo de tubo)
35C 24 -/+2hs
BAM-FDA
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7.Lectura de Pruebas presuntivas
Se consideran colonias sospechosas aquellas que:
TSI: reaccin cida abajo (amarillo)/alcalina arriba (rojo)
con o sin produccin de H2S
LIA: reaccin alcalina abajo (prpura)la mayora con H2S
BAM-FDA
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8.Confirmacin de colonias sospechosas:
ureasa (convencional/ test rpido)
Serologa flagelar (H) polivalente
Si urea es (-): -caldo lisina decarboxilasa
-caldo base prpura con 0.5% dulcitol
-caldo triptona ( triptofano)
Serologa somtica (O) polivalente
Pruebas bioqumicas adicionales
BAM-FDA
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9.Pruebas adicionales:
BAM-FDA
Pruebas Reaccin + Reaccin - SalmonellaGlucosa (TSI) amarillo rojo +
Lisina descarboxilasa (LIA) prpura amarillo +H2S (TSI y LIA) ennegrecimiento No ennegrecimiento +
Ureasa de color rojo-prpura ningn cambio de color -Caldo Lisina Descarboxilasa color prpura color amarillo +Caldo Dulcitol rojo de fenol color amarillo y / o gas no gas, sin cambiar de color +Prueba Voges-Proskauer color rosa a rojo ningn cambio de color -
Prueba citrato de Simmons azul verde variablePrueba del Indol color rojo en la superficie sin cambio de color en la
superficie-
Prueba polivalente flagelar aglutinacin sin aglutinacin +Prueba Polivalente somticas aglutinacin sin aglutinacin +Caldo Lactosa rojo de fenol color amarillo y / o gas sin gas, sin cambiar de color -
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10.Identificacin presuntiva:
Utilizar kits comerciales (API 20E, Enterotube II, Enterobacteriaceae II, MICRO-ID)
Interpretacin de los resultados para su correcto informe:
kit comercial + serologa H y O positivas: presuntivo Salmonella descartar aquellos cepas que no corresponden segn criterio AOAC
En caso de no poder llegar a la confirmacin, enviar la cepa a un centro dereferencia
BAM-FDA
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ICMSF
International Commission on Microbiological Specifications for Foods
Deteccin de Salmonella spp. en alimentos
http://images.google.com.ar/imgres?imgurl=http://www.icmsf.iit.edu/graphics/design/logo_94.gif&imgrefurl=http://www.icmsf.iit.edu/main/articles_papers.html&usg=__cJ6MvnyxsoML0sVdgbDsR4rsI1A=&h=83&w=94&sz=3&hl=es&start=2&tbnid=1YVzGH7ELM71lM:&tbnh=71&tbnw=80&prev=/images?q=ICMSF&gbv=2&hl=es&sa=G -
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Los mtodos para el aislamiento e identificacin pueden dividirse en 6 etapas:
1. Enriquecimiento no selectivo
2. Enriquecimiento selectivo
3. Siembra en medios selectivos y diferenciales
4. Caractersticas bioqumicas
5. Anlisis antignico en 2 fases: sueros polivalentes y monovalentes
6. Tipificacin por medio de bacterifagos
ICMSF
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1. Enriquecimiento no selectivo:
Objetivo recuperacin de aquellas Salmonellasquepudieron sufrir dao
Eleccin del medio adecuado: -Caldo Lactosado,
-Agua Peptonada tamponada,
-Agua destilada + verde brillante,
-AD con leche descremada + VB
-adicin de Tergitol 7
ICMSF
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X g de la muestra en 9 volmenes del medio de enriquecimiento (dil. 1/10)
Homogeneizar e incubar a 35-37 C por 18-24 hs
1. Enriquecimiento no selectivo:
ICMSF
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1. 1ml del pre-enriquecimiento en 10ml de Caldo Selenito Cistena (SC)Incubar en Bao Mara 43 C -/+ 0.05C 24 hs
2. 1ml del pre-enriquecimiento en 10ml de Caldo Tetrationato Verde Brillante(TVB)
Incubar 43C -/+ 0.05
C 24 hs
2.Enriquecimiento selectivo:
ICMSF
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3.Siembra en medios selectivos y diferenciales:
ICMSF
Sembrar cada uno de los tubos de SC y TVB en:
Agar Verde Brillante e incubar 24 hs a 35-37C
Agar Sulfito de Bismuto e incubar 48 hs a 35-37C
Queda a eleccin del laboratorio y se respetan las indicacionesdel fabricante
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Agar Verde Brillante: incoloras, rosa o fucsia o traslcidas a opacas, con el
medio que las rodea de color rosa a rojo.
Agar Sulfito de Bismuto: marrones o grises a negro, a veces con brillo metlico . Elmedio que las rodea puede ir cambiando desde marrn hasta negro con el tiempo .Pueden aparecer colonias atpicas de color verde con halo poco o nada oscurecido.
Caractersticas de las colonias
ICMSF
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4. Identificacin de Salmonella:
Se puede llegar a la identificacin mediante pruebas bioqumicas y
serolgicas con los sueros comerciales.
Se enva la muestra a un centro de referencia para su confirmacindefinitiva
bioqumica
Sembrar en TSI y Agar Lisina Hierro 2 ms colonias sospechosas decada uno de los 3 los medios selectivos.
Incubar 24 hs a 35-37C
ICMSF
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TSI tpico: c / alc con o sin H2STSI atpico : c / c porque fermentan la sacarosa y lactosa tambin.
Agar lisina hierro tpico: alcalino en todo el medio con o sin H2S
ICMSF
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Pruebas serolgicas:
Reaccin con el antisuero polivalente O ( somtico ):Diluir y ensayar los antisueros con cultivos testigos.
1. Depositar una pequea cantidad del cultivo sospechoso sobre el extremo de unportaobjetos.
2. Depositar una gota de Sn fisiolgica y emulsionar con el cultivo mediante unaaguja limpia.
3. Aadir una gota del antisuero polivalente O y mezclar.
4. Repetir la operacin sin el agregado del antisuero.
5. Balancear durante 1 min y observar sobre fondo oscuro si hubo o noaglutinacin.
(+) aquel cultivo que aglutina en la mezcla cultivo - sn. fisiolgica - antisuero(-) aquel cultivo que NO aglutina ensayar antisuero polivalente H.
ICMSF
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Reaccin con el antisuero polivalente H (flagelar )
1.Diluir y ensayar los antisueros con cultivos testigos
2.Aadir 5ml de Sn. Salina formolada al 0.6% a 5ml de un cultivo en caldo Hde 24hs.
3.Depositar 0.02ml del antisuero diluido en un tubo de ensayo adecuado y
aadir 1ml del caldo formolado.
4.Preparar un control negativo sustituyendo el antisuero por Sn salinaformolada.5.Incubar ambos tubos a 50C 1h en un bao de agua.
6.Balancear durante 1 min y observar sobre fondo oscuro si hubo o noaglutinacin.
(+) aquel cultivo que aglutina en la mezcla cultivo - sn. salina formolizada -antisuero y no hay aglutinacin en el control negativo.
(-) aquel cultivo que NO aglutina.
ICMSF
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Conclusiones:
la norma ISO permite adaptar la tcnica a los diferentes alimentos.Utiliza un medio como enriquecimiento ( BPW ), RV y MKTTn comocaldos selectivos y 2 medios slidos para el aislamiento.
El BAM separa a los alimentos, en cuanto a su paso deenriquecimiento, utilizando varios caldos y suplementos . Sugiere 3caldos selectivos que luego se pasan a 3 medios slidos.
La ICMSF divide en 6 etapas la identificacin sin exigencia en el
pre-enriquecimiento . Utiliza 2 caldos y 3 medios slidos selectivos.De los resultados del TSI y agar Lisina Hierro se puede realizar laserologa.
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MUCHAS GRACIAS!
Med. Vet. Mara Noel Olivera