1. Uraikan tentang alfatoksinAflatoksin adalahsenyawa racun/toksin yang dihasilkan oleh metabolit sekunder kapang/jamurAspergillus flavusdanA.parasiticus. Aflatoksin merupakan segolongan mikotoksin(racun/toksin yang berasal dari fungi/kapang/jamur) yang sangat mematikan dan karsinogenik (pemicu kanker) bagi manusia dan hewan. tingginya kandungan aflatoksin pada makanan/pakan akan berbuntut keracunan dan berakibat kematian, hal ini menjadi tantangan bagi kita semua. Kondisi iklim indonesia, tropis hal ini membuat tingkat kelembaban yang tinggi sehingga kendisi tersebut sangat cocok untuk pertumbuhan kapang/jamur. Kapang ini biasanya ditemukan pada bahan pangan/pakan yang mengalami proses pelapukan, antara biji kacang-kacangan (kedelai, kacang tanah, dan bunga matahari), rempah-rempah (seperti ketumbar, lada, jahe, serta kunyit) dan serealia (seperti padi, gandum, sorgum dan jagung) Aflatoksin juga dapat dijumpai padasusuyang dihasilkanhewan ternakyang memakan produk yang terinfestasikapang tersebut. Obat juga dapat mengandung aflatoksin bila terinfestasi kapang ini.Praktis semua produk pertanian dapat mengandung aflatoksin meskipun biasanya masih pada kadar toleransi. Kapang ini biasanya tumbuh pada penyimpanan yang tidak memperhatikan faktor kelembaban (min. 7%) dan bertemperatur tinggi. Daerah tropis merupakan tempat berkembang biak paling ideal.Aflatoksin B1, senyawa yang paling toksik, berpotensi merangsangkanker, terutamakanker hati. Serangan toksin yang paling ringan adalah lecet (iritasi) ringan akibat kematian jaringan (nekrosis). Pemaparan pada kadar tinggi dapat menyebabkansirosis,karsinomapada hati, serta gangguanpencernaan, penyerapan bahan makanan, danmetabolismenutrien. Toksin ini dihatiakan direaksi menjadiepoksidayang sangat reaktif terhadap senyawa-senyawa di dalamsel. Efek karsinogenik terjadi karena basa NguaninpadaDNAakan diikat dan mengganggu kerjagen. Berikut struktur alfatoksin:

(struktur alfaatoksin)Aflatoksin dapat mengakibatkan penyakit dalam jangka pendek (akut) maupun jangkapanjang (kronis). Namun, keracunan akut jarang terjadi sehingga tingkat kewaspadaanmasyarakat terhadap pencemaran aflatoksin pada pangan dan pakan relatif rendah. Aflatoksin juga dapat dijumpai pada susu yang dihasilkan hewan ternak yang memakan produk yang terinfestasi kapang tersebut.Masalah yang timbuljika mengonsumsi pangan yang mengandung aflatoksin Keracunan akut (aflatoksikosis), dengan gejala mual, muntah, kerusakan hati hingga kematian pada kasus serius Perkembangan anak dan pertumbuhan janin terganggu Metabolisme protein terganggu Kekebalan tubuh menurun Kanker hati (Hepatocellular carcinoma (HCC)

2. Pengujian Cemaran alfatoksinUntuk mengetahui kandungan aflatoksin dalam makanan/pakan bisa mengunakan seperangkat teknologi pendeteksi yang dikenal dengan Kit ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, sebagian besar perusahaan pakan di Indonesia sudah banyak mengunakan ini, namun untuk mendeteksi dengan metode masih tergolong mahal. ELISA(singkatanbahasa Inggris:Enzyme-linked immunosorbent assay) atau 'penetapan kadar imunosorben taut-enzim' merupakan ujiserologisyang umum digunakan di berbagai laboratoriumimunologi. Uji ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik pengerjaan yang relatif sederhana, ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi. ELISA diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk menganalisis adanya interaksiantigendenganantibodidi dalam suatu sampel dengan menggunakanenzimsebagai pelapor (reporter label).Aplikasi ELISAELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel, karenanya merupakan metode yang sangat berguna untuk menentukan konsentrasi antibodi dalam serum (seperti dalam tes HIV), dan juga untuk mendeteksi adanya antigen. Metode ini juga bisa diaplikasikan dalam indiustri makanan untuk mendeteksi allergen potensial dalam makanan seperti susu, kacang, walnut, almond, dan telur. ELISA juga dapat digunakan dalam bidang toksikologi untuk uji pendugaan cepat pada berbagai kelas obat.Umumnya ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitucompetitive assayyang menggunakan konjugat antigenenzim atau konjugat antobodienzim, dannon-competitive assayyang menggunakan dua antibodi. Pada ELISAnon-competitive assay, antibodi kedua akan dikonjugasikan dengan enzim sebagai indikator. Teknik kedua ini seringkali disebut sebagai "Sandwich" ELISA..Pengujian aflatoksin B1Uji aflatoksin B1 menggunakan metoda ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) berdasarkan prinsip dasar metode immunoasay adalah reaksi spesifik antara antigen dan antibodi,hasil reaksi dapat diamati dengan menggunakan penandaBeberapa Tipe ELISAA. IndirectELISATahap umum yang digunakan dalamindirectELISA untuk menentukankonsentrasi antibodidalam serum adalah:1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan lubangplatemikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standaryang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji. 2. Suatu larutan pekat dari proteinnon-interacting, sepertibovine serum albumin(BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubangplatemikrotiter. Tahap ini dikenal sebagaiblocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain keplate.3. Lubangplatemikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.4. Platedicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.6. Platedicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia.8. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia lainnya.Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari metodeindirectELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubangplatemikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang. MekanismeindirectELISA dapat dilihat pada gambar di bawah ini.

B. SandwichELISA Tahapan dalamSandwichELISA adalah sebagai berikut:1. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi penangkap2. Semua non spesifikbinding sitespada permukaan diblokir3. Sampel berisi antigen dimasukkan dalamplate4. Platedicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat5. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigen6. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan dengan antibodi primer7. Platedicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang8. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimia9. Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigenKeuntungan utama dari metodesandwichELISA adalah kemampuannya menguji Sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi. salah satu kerugian di antaranya adalah kemungkinan yang besar terjadinya hasilfalse positivekarena adanya reaksi silang antara antigen yang satu dengan antigen lain.Hasil berupafalse negativedapat terjadi apabila uji ini dilakukan padawindow period, yaitu waktu pembentukan antibodi terhadap suatuvirusbaru dimulai sehingga jumlah antibodi tersebut masih sedikit dan kemungkinan tidak dapat terdeteksiPrinsip kerjasandwichELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:

C. ELISA kompetitifTahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah dibahas sebelumnya, yaitu:1. Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya2. Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi antigen3. Platedicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel, semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada permukaan lubang, karena inilah disebut kompetisi4. Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik utnuk antibodi primer. Antibodi sekunder ini berpasangan dengan enzim5. Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik/ fluoresensi.Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah sinyal yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut ini:

Secara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai berikut:

Tugas Standarisasi Bahan Alam

Nama Kelompok:Rica (10060312012)Riri Indri Septiani (10060312033)Chyntia Karimah (10060312037)Alyah darajat (100660312041)Nur Annisa (100600312043)

Farmasi A