sİbutramİn’İn gc- metodu - sakarya Üniversitesi...saÜ fen edebiyat dergisi(2012-ii)...

SAÜ Fen Edebiyat Dergisi(2012-II) A.KÜÇÜK TUNCA, E.İMAMOĞLU

1

SİBUTRAMİN’İN GC-FID KROMATOGRAFİSİ

METODU İLE FARMASÖTİK PREPARATLARDA

MİKTAR TAYİNİ

Aysel KÜÇÜK TUNCA, Esin İMAMOĞLU

Sakarya Üniversitesi Fen Fakültesi Kimya Bölümü, Sakarya, 54187, Türkiye

[email protected]

ÖZET

Ticari bir antiobezite ilacının etken maddesi olan Sibutramin için literatürde yer

almayan yeni bir Gaz Kromatografisi-Alev İyonlaşma Dedektörü (GC-FID)

miktar tayini yöntemi geliştirilmiş ve ticari preparatlarda mevcut bulunan

miktarlar bu yöntemle belirlenmiştir. Sibutramin için geliştirilen bu yöntemin

biyonalitik yöntem validasyonu da yapılarak bütün parametreler belirlenmiştir.

Sibutramin için 5-30 μg mL-1’lik konsantrasyon aralığında seçilen çalışma

standart çözeltilerinin oldukça iyi bir lineerlik gösterdiği tespit edilmiştir. Bu

aralıktaki LOQ değerinin 9,08 μg mL-1 ve LOD’nin ise 2,72 μg mL-1 olduğu da

hesaplanmıştır.

Anahtar Kelimeler: Sibutramin, GC-FID kromatografisi

A.KÜÇÜKK TUNCA, E.İMAMOĞLU SAÜ Fen Edebiyat Dergisi(2012-II)

2

QUANTITATION OF SIBUTRAMINE IN

PHARMACEUTICAL PREPARATIONS BY GC-FID

CHROMATOGRAPHY METHOD

ABSTRACT

A new GC-FID quantification method with flame-ionization detector not

available in the literature for Sibutramine which is the active ingredient of a

commercial antiobesity trade drug was developed and the amounts present in

commercial preparations was determined via this method. Bioanalytical method

validation of this method developed for Sibutramine was realised and all the

validation parameters were determined. Working standard solutios chosen at the

concentration range of 5-30 mg mL-1 for Sibutramine were found that showed

quite good linearity. It was also calculated that LOQ value in this range was

9,08 mg mL-1 and LOD was 2,72 mg mL-1.

Key words: Sibutramine, GC-FID chromatography

1. GİRİŞ

Sibutramin, kilo vermede, verilen kilonun korunmasında ve

obezite tedavisinde kullanılan bir maddedir (Şekil 1.) [1]. İlaçlarda,

Sibutramin Hidroklorür Monohidrat olarak kullanılmaktadır.

Şekil 1. Sibutramin Hidroklorür’ün molekül formülü (C17H29C12NO.HCl)


3

Yapılan literatür araştırmaları sonucunda, iştah azaltıcı bir madde

olan Sibutraminin miktar analizine yönelik, yeni yöntemler

geliştirilmesi ile ilgili çeşitli çalışmalara ulaşılmıştır; UV-

spektroskopisi ile ticari kapsüllerde *2-5+, UV dedektörlü HPLC ile

tabletlerde ve fare serumunda [6-8], kiral kromatografi ile

Sibutramin enantiyomerleri için *9], Tandem Mass Spektroskopisi

ile insan plazmasında *10], LC-ESI-MS ile insan plazmasında *11,

12], LC-ESI-TMS ile insan plazmasındaki Sibutramin metabolitleri

için *13, 14] ve idrarda GC-MS ile Sibutraminin ana metabolitleri

için *15] gibi. Ancak, ticari kapsüllerde bulunan Sibutramin’in GC-

FID yöntemiyle miktar analizine yönelik literatürde yer alan bir

çalışmaya henüz rastlanılmamıştır. Bu maksatla, Sibutramin için

bir GC-FID miktar tayini yöntemi geliştirilmiş ve bu yöntemle

ticari preparatlarda bulunan miktarları belirlenmiştir.

2. DENEYSEL KISIM

2.1. Cihaz

Shimadzu marka FID dedektörlü GC cihazı, yeni bir CBM-102

iletişim modülüyle güncellenmiştir. Bu sistem GC-17A Gas

Chromatograph, AOC-20s Autosampler, AOC Power Supply

Module, CBM-102 Communications Bus Module, FCM Kesintisiz

Güç Kaynağı ve bunlara bağlı bir HP masaüstü bilgisayardan

oluşmaktadır. Kolon olarak Fused-silika 0,25 μm capillar optima-1

kolon (25 m-0,25 mm), % 99 saflıkta kuru hava, azot ve hidrojen

gazları ve software olarak da bilgisayara yeni yüklenmiş olan GC

solution yazılım programı kullanılmıştır. Sibutramin’in uygun

kromatogram piklerini elde edebilmek için çeşitli sıcaklık


4

programları denenmiştir. Bu denemeler sonucunda, sıcaklık

programı olarak; başlangıçta kolon sıcaklığı direkt 185 °C’ye

çıkarılıp, daha sonra 25 °C/dk hız ile 260 °C’ye çıkarılmıştır, orada

1 dk tutularak, en son da 50 °C/dk hız ile 290 °C’ye çıkarılarak yine

orada da 1 dk tutulmuştur. Kromatografik şartlar ise; 1 ml/dk

kolon akış hızı, 1 μL enjeksiyon hacmi, split modda (oranı 10), 185

°C kolon sıcaklığı, 200 °C dedektör sıcaklığı ve 107 kPa basınç

olarak ayarlanmıştır.

2.2. Kromatografik Parametreler ve Optimizasyon

Sibutramin’in kromatografik analizi için sistem uygunluk

parametreleri de hesaplanmıştır: Kapasite faktörü, kS′: 1,48 (1 mL

dk-1 akış hızında), toplam teorik plaka sayısı, NS: 4733, plaka

yüksekliği, HS: 5,28.10-1 cm. Ayrıca bu parametreler CDER’inkilerle

de (Center for Drug Evaluation and Research) kontrol edilmiştir

[16].

Kromatogramların iyileştirilmesi için başlangıçta kromatografik

koşullar optimize edilerek, ön denemeler yapılmış ve en uygun

şartlar bulunmuştur. Bu maksatla, GC-FID için, kapiler kolonda,

uygun sıcaklık programı bulunarak, uygun gaz akış hızları,

enjeksiyon hacmi ve enjektör, dedektör ve fırın sıcaklıkları

seçilerek en iyi yöntem geliştirilmeye çalışılmıştır. Geliştirilen

yöntem, spesifiklik, hassaslık, kesinlik, doğruluk ve lineerlik gibi

bütün validasyon parametreleri kullanılarak valide edilmiştir.


5

2.3. Stok ve Standart çözeltilerin hazırlanması

Gaz Kromatografisi-FID cihazı ile Sibutramin Hidroklorür

monohidrat içeren ticari bir kapsül için yeni bir miktar tayini

yöntemi geliştirilmesi maksadıyla, elde edilen Sibutramin içeren

stok çözeltiden bir seri standart çözeltiler hazırlanarak, öncelikle

kalibrasyon eğrileri oluşturulmuştur. Bunun için Sibutramin stok

çözeltisinden 5-30 μg mL-1’lik konsantrasyon aralığında seçilen

çalışma standart çözeltileri, sabit bir hacime metanol ile

seyreltilerek hazırlanmıştır. Kalibrasyon eğrileri de bu stok

çözeltiden 6 farklı konsantrasyondaki çalışma standart çözeltileri

ile hazırlanmıştır. Ana stoktan hazırlanan 5, 15 ve 25 μg mL-1’lık

standartlar ile gün-içi ve günler-arası kesinlikler için ölçümler

alınmış ve aynı standartlar ile tekrarlanabilirlik çalışmaları

gerçekleştirilmiştir. Kalibrasyon eğrisi, konsantrasyonlara karşı

pikler altında kalan alanlar işaretlenerek hazırlanmıştır (n=6).

Veriler, en küçük kareler yöntemi kullanılarak, lineer regresyon

modeli ile analiz edilmiş (regresyon denklemi: y=90,278x-68,56) ve

elde edilen regresyon katsayısının (r=0,9951) oldukça iyi bir

lineerlik gösterdiği tespit edilmiştir. Regresyon analizinden

kesişimin standart hatası, Sa: 61,52 ve eğimin standart hatası Sb

ise: 3,16 olarak bulunmuştur.

Şekil 2.’de yaklaşık 3,4 dk civarında gelen 30 μg mL-1’lik

Sibutramin standardına ait piki gösteren bir GC kromatogramı

görülmektedir. Şekil 3.’de ise 5-30 μg mL-1’lik konsantrasyon

aralığındaki tüm Sibutramin standartları için elde edilmiş bir

kromatogram görülmektedir.


6

Şekil 2. 30 μg mL-1’lik Sibutramin standardına ait bir GC kromatogramı

Şekil 3. 5-30 μg mL-1’lik konsantrasyon aralığındaki tüm Sibutramin standartları için elde

edilmiş kromatogram

3. TARTIŞMA

Yapılan gün-içi ve günler-arası kesinlik çalışmaları sonucunda,

bulunan RSD değerlerinin oldukça iyi kesinlikler verdiği ortaya

çıkmıştır (Bkz. Tablo 1.). Kesinlik tayini için gün-içi ve günler-arası

ölçümlerdeki RSD’lerin < % 10 ve LOQ’nin de < % 20 olması

gerektiği ve doğruluk için ise günler-arası ortalama değer X,


7

gerçek değerinin ± % 15 içinde olduğu ve LOQ’nin de ± % 20’den

fazla sapmaması koşulunu sağladığı da tespit edilmiş, buna uygun

olarak LOQ değerinin 9,08 μg mL-1 ve LOD’nin ise 2,72 μg mL-1

olduğu hesaplanmıştır.

Tablo 1. Sibutramin için gün içi ve günler arası kesinlik değerleri (n=6)

Sibutramin içeren (Reductil kapsül) (15 mg) ticari ilaç için de uygulaması

yapılmış ve elde edilen geri kazanımlar kontrol edilmiştir. Bunun için 15

mg Sibutramin Hidroklorür içeren ticari Reductil kapsülden 150 μg mL-

1‘lik bir ana stok çözelti hazırlanmıştır. Daha sonra, bu stoktan alınarak

seyreltilen 5, 15 ve 25 μg mL-1’lık numuneler üzerinde gün içi ve günler

arası ölçümler gerçekleştirilmiş ve oldukça iyi RSD değerleri elde

edilmiştir (Tablo 2.).

Tablo 2. Metanol ortamında Sibutramin içeren ticari kapsüllerden elde edilen gün içi ve

günler arası kesinlik değerleri (n=6)

Kesinlik Gün-içi Günler-arası

Konsantrasyo

n (µg mL-1)

Ortalama

Değer (X)

Standart

Sapma

(SD)

RS

D

(%)

Ortalama

Değer (X)

Standart

Sapma (SD)

RS

D

(%)

5 449,50 6,28 1,40 446,17 7,63 1,71

15 966,80 22,46 2,32 1022,50 26,55 2,60

25 1618,17 25,75 1,59 1668,33 20,39 1,22


8

Ticari kapsülden hazırlanan 15 μg mL-1‘lik bir standardın

kromatogramı ise Şekil 4.’de görülmektedir.

Şekil 4. Ticari kapsülden elde edilen 15 μg mL-1‘lik standardın kromatogramı

Tablo 4.’e bakıldığında, ticari kapsülden hazırlanan standartlardan

elde edilen geri kazanım ve bağıl hata verileri hesaplanmıştır.

Buradan da elde edilen geri kazanımların ≥ % 75 oldukları

görülmektedir.

Tablo 4. Sibutramin içeren ticari kapsülden elde edilen doğruluk ve geri kazanım değerleri

(n=6)

Bilinen

Ortalama

Kons.

(µg mL-1)

Bulunan

Ortalama

Kons.

(µg mL-1)

Doğruluk

Bağıl Hata*

(%)

Geri

Kazanım**

(%)

5 5,03 0,60 100,60

15 12,19 -18,73 81,27

25 19,01 -23,96 76,04

*Bağıl Hata= Bulunan miktar - Bilinen miktar/ Bilinen miktar x 100

**Geri Kazanım= Bulunan miktar/Bilinen miktar x 100

Ticari kapsül numuneleri, etken maddesi Sibutramin Hidroklorür

Monohidrat olan 15 mg’lık Reductil ticari kapsülünden elde edilen

stok çözeltiden seyreltilerek ve tekrarlanabilirlik için 6 kez yeniden


9

standartlar hazırlanarak elde edilmiştir. Elde edilen kesinlik ve

tekrarlanabilirlik değerleri olan SD, RSD ve % Geri kazanım, Tablo

5.’de özetlenmiştir. Standart çözeltilerin 6 kez ölçümü sonucunda,

elde edilen RSD değerinin oldukça iyi bir kesinlik sağladıkları da

görülmektedir.

Tablo 5. Ticari kapsülden elde edilen değerler (n=6)

Sibutramin Alanı

(µg mL-1)

951

957

972

991

948

987

Ortalama Alan 968

Standart Sapma (SD) 18,52

Bağıl Standart Sapma

(%RSD) 1,91

Bulunan Konsantrasyon

(µg mL-1) 12,21

Geri Kazanım (%) 81,40

4. SONUÇ

Başarılı bir şekilde geliştirilen yöntemin geçerliliğinin test edilmesi

için spesifiklik, hassaslık, kesinlik, doğruluk ve lineerlik gibi bütün

validasyon parametreleri uygulanarak, biyoanalitik yöntem

validasyonu yapılmış ve yöntemin geçerliliği değerlendirilmiştir.

Aynı zamanda, yöntemin Sibutramin’in ticari kapsüllerdeki rutin

analizi için hem az masraf hem de kullanım kolaylığı açısından

pratik olarak uygulanabilir olduğu sonucuna da varılmıştır.

Ayrıca, Sibutramin için geliştirilen bu ilk GC-FID yöntemi, diğer

farklı yöntemlere nazaran kullanım kolaylığı açısından da bir

alternatif oluşturacaktır.


10

Bu çalışma, TÜBİTAK kurumu hızlı destek programı (1002)

tarafından 12 ay olarak desteklenen 109T555 numaralı projenin bir

bölümü kapsamındadır.

5. KAYNAKLAR

[1]. Hansen, D.L., Troubro, S., Stock, M.J., Macdonald, L.A., Astrup, A.,

The effect of sibutramine on energy expenditure and appetite during

chronic treatment without any dietary restriction, International

Journal of Obesity, 23, 1016-1024, 1999.

[2]. Maluf, D.F., Farago, P.V., Barreira, S.M.W., Pedreso, C.F., Pontarolo,

R., Validation of an analytical method for determination of

sibutramine hydrochloride monohydrate in capsules by UV-Vis

spectrophotometry, Latin American Journal of Pharmacy, 26(6), 909-

912, 2007.

[3]. Diefenbach, I.C.F., Friedrich, M., Bittencourt, C.F., Santos, M.R.,

Escarrone, A.L.V., Development and validation of an analytical

methodology for determination of sibutramine in capsules, Latin

American Journal of Pharmacy, 27(4), 612-617, 2008.

[4]. Quin, Z.H., Tan, R., Pu, L.J., Fading spectrophotometric method for

determination of sibutramine hydrochloride with Congo red and its

reaction mechanism, Chinese Journal of Analytical Chemistry, 34(3),

403-406, 2006.

[5]. Valarmathi, R., Karpagam, K.S.S., Revathi, R., Spectrophotometric

determination of sibutramine hydrochloride using folin-ciocalteu

reagent, The Indian Pharmacist, 25(3), 71-72, 2004.

[6]. Segall, A.I., Collada, E.A., Ricci, R.A., Pizzorno M.T., Reversed-Phase

HPLC determination of sibutramine hydrochloride in the presence

of its oxidatively-induced degradation products, Journal Of Liquid

Chromatography & Related Tecnologies, 26(6), 977-986, 2003.

[7]. Chandorkar, J.G., Kotwal, V.B., Dhande, N.S., Pachpor, M.P., Pande,

V.V., Development and validation of high performance liquid

chromatography method for analysis of sibutramine hydrochloride


11

and its impurity, Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences, 21(2),

121-124, 2008.

[8]. Um, S.Y., Kim, K.B., Kim, S.H., Ju, Y.C., Lee, H.S., Oh, H.Y., Choi,

K.H., Chung, M.W., Determination of the active metabolites of

sibutramine in rat serum using column-switching HPLC, Journal of

Separation Science, 31, 2820-2826, 2008.

[9]. Radhakrishna, T., Lakshmi Narayana, CH., Sreenivas Rao, D., Vyas,

K., Reddy, G.OM., LC method for the determination of assay and

purity of sibutramine hydrochloride and its anantiomers by chiral

chromatography, Journal of Pharmaceutical and Biomedical

Analysis, 22, 627-639,. 2000.

[10]. Bhatt, J., Shah, B., Kamli, S., Subbaiah, G., Singh, S., Ameta, S., Rapid

and sensitive method for the determination of sibutramine active

metabolites in human plasma by reversed-phase liquid

chromatography-tandem mass spectroscopy, Journal of

Chromatographic Science, 45(2), 91-96, 2007.

[11]. Ding, L., Hao, X., Huang, X., Zhang, S., Simultaneous determination

of sibutramine and its N-desmethyl metabolites in human plasma

by liquid chromatography electrospray ionization-mass

spectrometry method and clinical applications, Analytica Chimica

Acta, 492, 241-248,. 2003.

[12]. Huang, Z.Q., Xiao, S., Luo, D., Chen, B., Yao, S.Z., Simultaneous

determination of sibutramine and N-didesmethylsibutramine in

dietary supplements for weight control by HPLC-ESI-MS, Journal

of Chromatographic Science, 46(8), 707-711, 2008.

[13]. Chen, J., Lu, W., Zhang, Q., Jıang, X., Determination of the active

metabolite of sibutramine by liquid chromatography-electrospray

ionization tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography

B, 785, 197-203,. 2003.

[14]. Jain, D.S., Subbaiah, G., Sanyal, M., Shrivastav, P.S., Pal, U.,

Ghataliya, S., Kakad, A., Patel, H., Shah, S., Liquid

chromatography/electrospray ionization tandem mass


12

spectrometry validated method for the simultaneous quantification

of sibutramine and its primary and secondary amine metabolites in

human plasma and its application to a bioequivalence study,

Rapid Communications in Mass Spectrometry, 20, 3509-3521, 2006.

[15]. Rossi, S., Colamonici, C., Botre, F., Detection of sibutramine

administration: a gas chromatography/mass spectrometry study of

the main urinary metabolites, Rapid Communications in Mass

Spectrometry, 21, 79-88, 2007.

[16]. Reviewer Guidance: Validation of Chromatographic Methods,

Centre for Drug Evaluation and Research (CDER), Food and Drug

Administration, November 1994.

sİbutramİn’İn gc- metodu - sakarya Üniversitesi...saÜ fen edebiyat dergisi(2012-ii)...

Documents