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SCREENING NEONATALE OGGI

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SOMMARIO

SommarioSCREENING E SOCIETÀ ..............................................................................6

Che cos’è lo screening neonatale ......................................................................6

Quali sono i motivi per l’avvio di un programma di screening neonatale?........6

Gli inizi dello screening neonatale ....................................................................7

LO SCREENING IN PRATICA ......................................................................9

Raccolta dei campioni di macchie di sangue essiccato .....................................9

Tempi del prelievo del campione e necessità di ripetizione del test ..................10

DIFETTI DELL'OSSIDAZIONE DEGLI ACIDI GRASSI (FAO) ........................11

Deficit primitivo di carnitina (CUD) ...................................................................11

Deficit di L-3-idrossiacil-CoA deidrogenasi a catena lunga (LCHAD) .................13

Deficit di acil-CoA deidrogenasi a catena media (MCAD) .................................15

Deficit di proteina trifunzionale mitocondriale (TFP) .........................................18

Deficit di acil-CoA deidrogenasi a catena molto lunga (VLCAD) .......................20

ALTERAZIONI DEGLI ACIDI ORGANICI .....................................................22

Aciduria 3-idrossi-3-metilglutarica (HMG) ........................................................22

Acidemia glutarica tipo I (GA I) .........................................................................23

Acidemia isovalerica (IVA) .................................................................................25

Deficit di 3-metil-crotonil-CoA carbossilasi (3-MCC) .........................................27

Acidemie metilmaloniche (MUT) .......................................................................29

Deficit di β-chetotiolasi (BKT) ...........................................................................31

Acidemia propionica (PA) ..................................................................................33

Deficit multiplo di carbossilasi (MCD) ...............................................................35

ALTERAZIONI DEGLI AMINOACIDI ............................................................37

Aciduria argininosuccinica/citrullinemia ............................................................37

Omocistinuria (HCY) ..........................................................................................39

Malattia delle urine a sciroppo d’acero (MSUD) ...............................................41

Fenilchetonuria (PKU) .......................................................................................43

Tirosinemia tipo I (TYR I) ...................................................................................45

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ALTRE ALTERAZIONI ..................................................................................48

Deficit di biotinidasi ..........................................................................................48

Fibrosi cistica (CF) .............................................................................................49

Deficit di glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) ............................................51

Iperplasia surrenale congenita (CAH) ................................................................53

Ipotiroidismo congenito (CH) ............................................................................55

Cellule falciformi e altre emoglobinopatie ........................................................57

Galattosemia.....................................................................................................59

Immunodeficienza combinata grave (SCID) ......................................................61

TECNOLOGIE ..............................................................................................63

Immunodosaggio ..............................................................................................64

Fluorimetria a tempo-risolto .............................................................................66

Dosaggio enzimatico .........................................................................................67

Spettrometria di massa tandem (MS/MS) .........................................................69

Isoelettrofocalizzazione.....................................................................................70

PCR end-point basata su TR-FRET .....................................................................71

RIFERIMENTI UTILI ....................................................................................73

Organizzazioni che forniscono informazioni sullo screening .............................73

Abbreviazioni ....................................................................................................77

BIBLIOGRAFIA............................................................................................79

Bibliografia generale sullo screening neonatale e la sua storia ........................79

Acidemia glutarica tipo I ...................................................................................79

Acidemia isovalerica .........................................................................................80

Acidemia propionica .........................................................................................80

Acidemie metilmaloniche ..................................................................................80

Aciduria argininosuccinica/citrullinemia ............................................................81

Cellule falciformi e altre emoglobinopatie ........................................................81

Deficit di acil-CoA deidrogenasi a catena media ...............................................82

Deficit di acil-CoA deidrogenasi a catena molto lunga .....................................82

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Deficit di β-chetotiolasi .....................................................................................83

Deficit di biotinidasi ..........................................................................................83

Deficit di glucosio-6-fosfato deidrogenasi .........................................................83

Deficit di L-3-idrossiacil-CoA deidrogenasi a catena lunga ...............................84

Deficit di 3-metil-crotonil-CoA carbossilasi .......................................................84

Deficit di proteina trifunzionale.........................................................................85

Deficit multiplo di carbossilasi ..........................................................................85

Deficit primitivo di carnitina ..............................................................................86

Fenilchetonuria .................................................................................................86

Fibrosi cistica.....................................................................................................86

Galattosemia.....................................................................................................87

3-idrossi-3-metilglutaril aciduria .......................................................................87

Immunodeficienza combinata grave .................................................................87

Iperplasia surrenale congenita ..........................................................................88

Ipotiroidismo congenito ....................................................................................89

Malattia delle urine a sciroppo d’acero .............................................................89

Omocistinuria ....................................................................................................89

Tirosinemia tipo I ..............................................................................................90

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Che cos’è lo screening neonataleLo screening neonatale è una forma di assistenza sanitaria preventiva che ha lo scopo di esaminare i bambini nei loro primi giorni di vita, per scoprire la presenza di patologie i cui sintomi principali potrebbero non essere evidenti.

Affinché uno screening possa funzionare in modo ottimale, sono necessarie anali si semplici e affidabili. Inoltre, deve esistere un trattamento che si riveli efficace in caso di individuazione precoce di una patologia. Le malattie per cui si effettuano screening sono diverse; possono essere di natura genetica, endocrina, metabolica o ematologica. Ciò che tutte queste malattie hanno in comune è che, in assenza di un trattamento tempestivo, causeranno danni gravi al bambino.

A differenza dei processi sanitari basati sul trattamento, lo screening neonatale si basa sulla popolazione. Ciò significa che le analisi non vengono effettuate solo sui bambini malati, ma a tutti i bambini, compresa la vasta maggioranza che apparirà del tutto sana. Un’analisi di screening ha lo scopo di capire se un bambino sia più a rischio di un altro di essere affetto da un’alterazione. Non fornisce l’informazione certa che un bambino abbia un’alterazione. Qualora un’analisi di screening mostri un risultato anomalo, è necessario eseguire analisi diagnostiche per confermare la presenza di una malattia.

È importante riconoscere che il processo di screening neonatale comporta molto più che una semplice analisi di screening. L’istituzione di un programma richiede che siano posti in essere sistemi per la raccolta efficiente dei campioni da tutti i neonati, per redigere i risultati e per l’eventuale richiamo di un bambino per le analisi diagnostiche. Inoltre, ed è l’aspetto più importante, è necessario attivare un sistema che assicuri che i bambini con alterazioni confermate ricevano il trat­tamento tempestivo di cui necessitano.

Quali sono i motivi per l’avvio di un programma di screening neonatale?Secondo quanto dichiara Harry Hannon, medico e già direttore della sezione per lo screening neonatale di CDC (Centers for Disease Control and Prevention, centri per il controllo e la prevenzione delle malattie), lo screening neonatale

SCREENING E SOCIETÀ

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è essenziale per assicurare che non vi siano sofferenze non necessarie a carico dei genitori e dei neonati, e per prevenire quanti più esiti avversi delle alterazioni sia possibile e offrire… (al bambino affetto)… una vita quanto più possibile simile a quella normale che ci si aspetterebbe in assenza di malattia.

Benché la riduzione della sofferenza si un obiettivo naturale per tutti i profes­sionisti del settore sanitario, l’investimento nelle cure preventive assicura vantaggi significativi se si confronta il costo complessivo di un programma screening a quello del caso in cui sia necessario fornire cure e sostegno per tutta la vita a persone con malattie che avrebbero potuto essere trattate con efficacia se fossero state identificate con sufficiente anticipo.

Figura 1. Nel materiale impiegato per descrivere i vantaggi dello screening neonatale, lo UP-NIH (University of the Philippines-National Institutes of Health) in associazione con Philhealth (Philippine Health Insurance Corporation) ha presentato i casi di due bambini entrambi positivi per ipotiroidismo congenito. La bambina di 7 anni a sinistra nell’immagine è stata curata con successo dopo lo screening neonatale con cui si è indivi-duata la malattia. Il ragazzo di 14 non è stato sottoposto a screening, è la mancanza di un trattamento tempestivo ha provocato un ritardo nello sviluppo.

Gli inizi dello screening neonataleLa storia dello screening neonatale cominciò all’inizio del ventesimo secolo, quando Sir Archibald Garrod, medico britannico pioniere della genetica medica, utilizzò il termine “inborn error of metabolism” (errore congenito del meta­bolismo) per il titolo della sua Croonian Lecture del 1908 tenuta al Royal College of Physicians di Londra. I quattro errori congeniti considerati da Garrod furono albinismo, alcaptonuria, pentosuria e cistinuria. Lavorando solo dopo pochi anni dopo la riscoperta del lavoro di Mendel, Garrod stabilì che un problema in una specifica via biochimica era connesso alla mutazione di un gene.

Un vero impulso verso lo screening neonatale ebbe inizio con il lavoro del medico Robert Guthrie e, in particolare, il suo lavoro con i bambini affetti da fenilcheto­nuria (PKU). In seguito alla nascita nella sua famiglia di un bambino con una malattia dello sviluppo (benché non si trattasse di PKU), cominciò a interessarsi di questi soggetti, specialmente del potenziale insito in una tempestiva identi­ficazione di PKU. Si scoprì che i bambini in cui si identificava la malattia

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potevano essere trattati con una dieta a basso contenuto di fenilalanina e che, grazie alla scoperta e al trattamento tempestivi, i neonati godevano di uno sviluppo cognitivo normale, rispetto agli infanti non trattati che sviluppavano grave ritardo mentale.

Guthrie era un ricercatore nell’ambito delle patologie tumorali e conosceva bene lo sviluppo dei test di inibizione batterica (BIA). In questo test, si utilizzano un ceppo batterico e un mezzo di crescita in modo tale che la crescita batterica non possa avere luogo se non si aggiunge una terza sostanza, quella del test. Quando si aggiungono campioni non noti al mezzo di crescita e al ceppo batterico, la successiva crescita batterica è proporzionale alla quantità di sostanza nei campioni non noti.

Nel 1962, Guthrie mise a punto un test di inibizione batterica che ha rappre sen­tato il primo, sensibile e poco costoso test di screening per PKU. Il test è noto come test di Guthrie. Quando Guthrie introdusse anche un sistema per la raccolta e il trasporto dei campioni di sangue su carta da filtro, divenne possibile lo screening genetico su vasta scala, economicamente conveniente.

In seguito all’implementazione da parte dello stato del Massachussets, a metà degli anni Sessanta, del primo programma di screening neonatale universale, inizialmente per l’identificazione di una sola alterazione, l’iperfenilalaninemia (HPA), altri stati presto seguirono l’iniziativa. Questa patologia rappresenta tuttora la maggior parte dei programmi di screening a livello globale.

Poco dopo l’introduzione del test di Guthrie, furono sviluppati test batterici anche per consentire lo screening di altre malattie, come la malattia delle urine a sciroppo d’acero (MSUD) e l’omocistinuria. L’introduzione della tecnologia radioimmunologica negli anni Settanta ha consentito lo sviluppo di un test adeguatamente poco costoso e semplice per la tiroxina (T4). Livelli bassi di questo ormone sono associati all’ipotiroidismo congenito (CH), che ha un’incidenza più elevata rispetto a PKU. Un’altra importante patologia per la quale fu implementato lo screening è la galattosemia.

Nel corso del decennio successivo, i test radioimmunologici o immunoradio­metrici (o le controparti non radioattive di queste due tecniche) sono stati introdotti per sostanze quali l’ormone di stimolazione della tiroide (TSH, con un’ulteriore attrezzatura per lo screening di CH), il 17­OH­progesterone (17­OHP, per lo screening dell’iperplasia congenita), e la tripsina immuno­reattiva (IRT, per l’individuazione precoce della fibrosi cistica).

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LO SCREENING IN PRATICA

Raccolta dei campioni di macchie di sangue essiccatoSi può affermare che il processo per lo screening neonatale abbia inizio con la raccolta dei campioni di sangue, che avviene tipicamente fra il secondo e il quinto giorno di vita (dove il giorno della nascita è numerato come 0). L’uso delle macchie di sangue essiccato nello screening neonatale è il metodo general­mente preferito, poiché è facile ottenere i campioni e occorre solo una piccola quantità di sangue.

A seconda dei tempi e di altri fattori locali, la raccolta dei campioni può avvenire presso il luogo del parto, presso una clinica postnatale o a domicilio. Il sangue verrà prelevato di solito da un’ostetrica o da un’infermiera e sarà compilata una scheda per il campione, con tutte le informazioni necessarie in accompagnamento al campione stesso.

Il sangue viene prelevato dal tallone del bambino, che va delicatamente riscaldato. L’area in cui eseguire la puntura, all’interno della zona ombreggiata nell’illustrazione, va pulita con una soluzione adeguata, ad esempio una soluzione alcolica al 70%, quindi si attende che la soluzione si asciughi all’aria. Si utilizza poi una lancetta sterile per la puntura, a una profondità non superiore a 2 mm. La prima goccia di sangue che si forma può essere pulita con una garza sterile asciutta. Non si deve stringere il piede.

Figura 2. Prelievo di sangue da un lato del fondo del tallone del bambino.

Si deve attendere che si formi una goccia di sangue sufficientemente grande da riempire il cerchio stampato sulla carta per la raccolta; il sangue va poi applicato

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solo sul lato posteriore della carta. Il sangue deve riempire completamente il cerchio e saturare lo spessore della carta.

Va applicata una sola goccia di sangue su ogni cerchio, e ogni cerchio deve essere riempito. La ferita può essere successivamente trattata secondo la pratica locale, e si deve lasciare asciugare all’aria la carta a temperatura ambiente (15–22 °C). Durante l’asciugatura, le carte non vanno impilate.

I campioni asciutti vanno inviati direttamente al laboratorio per la misurazione.

Tempi del prelievo del campione e necessità di ripetizione del testBenché vi siano ovvi vantaggi di ordine pratico nella possibilità di effettuare lo screening primario mentre il bambino si trova ancora nel reparto maternità dell’ospedale, in molti casi la raccolta dei campioni può ragionevolmente avvenire dopo i 5 giorni suggeriti in precedenza. Tuttavia, è importante ricordare che, per molte delle alterazioni descritte, per i bambini trovati positivi si deve iniziare il trattamento almeno entro poche settimane dalla nascita. Poiché la ripetizione del test si rende necessaria per tutti i bambini inizialmente risultati positivi allo screening, è importante esercitare un controllo rigoroso sui tempi dello screening primario. Per questo motivo, alcuni marker tradizionalmente utilizzati per i dosaggi dopo 5 giorni sono recentemente stati oggetto di attenzione. Ad esempio, il dosaggio della tirosina, un marker per la tirosinemia di tipo I, nel momento in cui un bambino si trova nel reparto di maternità dell’ospedale può condurre a un risultato erroneo dello screening. Un marker preferibile per la tirosinemia di tipo I può essere il succinilacetone, che è chiaramente individuabile molto prima, dopo la nascita.

Per i bambini nati prematuramente può essere necessaria una ripetizione dell’analisi per CH al momento equivalente a 36 settimane di gestazione. La ripetizione dei test per molte alterazioni può anche rendersi necessaria nei bambini che hanno ricevuto una trasfusione di sangue poco dopo la nascita.

I bambini positivi allo screening vengono indirizzati a un team specialistico direttamente dal laboratorio; i medici locali vengono informati. Questi passaggi hanno lo scopo di assicurare l’inizio tempestivo del trattamento per la patologia in questione.

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DIFETTI DELL'OSSIDAZIONE DEGLI ACIDI GRASSI (FAO)

Deficit primitivo di carnitina (CUD)CenniIl deficit primitivo di carnitina (CUD) è una condizione che impedisce all’orga­nismo di utilizzare i grassi per la produzione di energia, in particolare nei periodi di assenza di alimentazione (digiuno). La carnitina, una sostanza naturale acquisita prevalentemente mediante l’alimentazione, è utilizzata dalle cellule per elaborare i grassi e produrre energia. Nei soggetti con CUD, le proteine note come trasportatori della carnitina non funzionano correttamente. Queste proteine normalmente trasportano la carnitina nelle cellule e impediscono nell’organismo la perdita di carnitina nelle urine. Si stima che CUD colpisca meno di 1 soggetto per 100.000 nati vivi. Tuttavia, si è rilevato che in Giappone tale patologia ha un tasso di incidenza di 1:40.000 nati vivi.

Aspetti cliniciTipicamente, i sintomi iniziali della patologia compaiono durante l’infanzia o la prima infanzia e includono spesso alterazioni del tessuto cerebrale (encefalopatia) che causano anomalie funzionali; un ingrossamento del cuore con disturbi del flusso sanguigno (cardiomiopatia); confusione; vomito; debolezza muscolare; basso livello di zuccheri nel sangue (ipoglicemia). Esiste anche il rischio di complicanze gravi, come arresto cardiaco, problemi al fegato, coma, morte improvvisa inaspettata. Patologie gravi dovuta a CUD possono essere scatenate da periodi di digiuno o da malattie come infezioni virali, soprat­tutto in presenza di una riduzione dell’alimentazione.

Questa condizione viene talvolta confusa con la sindrome di Reye, una grave patologia che si sviluppa nei bambini nel momento in cui stanno apparentemente guarendo da infezioni virali come la varicella o l’influenza.

Esami diagnosticiLo screening neonatale mediante spettrometria di massa tandem su macchie di sangue essiccato identifica livelli bassi di carnitina libera (C0). Anche il valore di (C0+C2+C3+C16+C18:1+C18)/Cit si ritiene sia un rapporto indicativo. L’analisi della carnitina nel plasma e nell’urina rivelerà un calo dei livelli di carnitina (C0) libera e totale nel plasma e l’eccesso di escrezione urinaria

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di carnitina. Si deve controllare anche la madre del neonato, perché in seguito ai risultati, mediante screening, di anomalie a carico dei neonati sono stati identificati molti casi di CUD a carico delle madri. La diagnosi viene effettuata mediante l’analisi dei trasportatori e sequenziamento del gene OCTN2.

TrattamentoIl trattamento dei pazienti con CUD mediante integrazione per via orale con L­carnitina porta a un lento aumento dei livelli plasmatici di carnitina. Se i livelli del bambino riflettono un deficit primario materno di carnitina, l’aumento dei livelli plasmatici è rapido; questo dovrebbe indicare una diagnosi di deficit primario materno di carnitina. I pazienti con CUD devono anche evitare il digiuno e, talvolta, oltre alla somministrazione di L­carnitina si applica una dieta con basso contenuto di grassi ed elevato contenuto di carboidrati. Sono state definite le linee guida per la gestione del deficit di carnitina e di altri disturbi mitocondriali degli acidi grassi.

Poiché la diagnosi e la terapia per CUD sono complesse, è consigliabile che il pediatra gestisca il paziente in stretta collaborazione con uno specialista delle malattie metaboliche pediatriche. È opportuno che i genitori portino sempre con sé una lettera con le linee guida del trattamento preparata dal medico che ha in cura il paziente.

EreditarietàQuesta patologia segue un pattern ereditario autosomico recessivo. Nel caso di patologie recessive, i pazienti affetti devono avere due copie del gene patologico (o della mutazione) per mostrare i sintomi della malattia. I soggetti con una sola copia del gene patologico (detti portatori) solitamente non mostrano segni o sintomi della condizione, ma possono trasmettere il gene patologico ai figli. Quando entrambi i genitori sono portatori del gene patologico di uno specifico disturbo, vi è il 25% di probabilità per ogni gravidanza che i figli siano affetti da tale disturbo.

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Deficit di L-3-idrossiacil-CoA deidrogenasi a catena lunga (LCHAD)CenniIl deficit di L­3­idrossiacil­CoA deidrogenasi a catena lunga (LCHAD) è un disturbo a carico della β­ossidazione mitocondriale degli acidi grassi. LCHAD è uno dei due enzimi che intervengono nella terza reazione (su quattro) della β­ossidazione degli acidi grassi; l’altro enzima è SCHAD (idrossiacil­CoA deidrogenasi a catena corta), che agisce su substrati a catena più corta. L’attività di LCHAD avviene a livello della proteina trifunzionale mitocondriale, che agisce nella catalisi di 3 reazioni sequenziali della β­ossidazione. Il deficit di LCHAD avviene come difetto isolato (qui descritto) oppure in associazione con il deficit degli altri 2 enzimi nel deficit della proteina trifunzionale mitocondriale. Il deficit di LCHAD compromette l’ossidazione degli acidi grassi a catena lunga (16 atomi di carbonio e più), di origine alimentare o endogena. Si stima che l’incidenza del deficit di LCHAD sia di almeno 1 caso per 75.000 nati vivi.

Aspetti cliniciIl deficit di LCHAD può presentarsi clinicamente dal primo giorno di vita ai 3 anni di età. Sono stati descritti due scenari clinici. Un gruppo di pazienti con deficit di LCHAD presenta sintomi di cardiomiopatia, con esito potenzialmente fatale. Sono stati descritti diversi problemi cardiaci, fra cui cardiomegalia, ipertrofia ventricolare sinistra e ridotta capacità contrattile. L’insorgenza può essere di natura acuta o cronica. Un secondo gruppo di pazienti presenta, generalmente dopo il digiuno, ipoglicemia non chetotica, vomito, ipotonia, epatomegalia. Può verificarsi rabdomiolisi. Entrambe le presentazioni sono altamente variabili, con caratteristiche che possono sovrapporsi. I sintomi possono avere inizio con una patologia apparentemente innocua (un raffred­dore o un’otite media), che causa un digiuno prolungato. Spesso i sintomi precedono la comparsa dell’ipoglicemia. L’ipoglicemia è causata dall’incapacità di soddisfare le esigenze gluconeogeniche durante il digiuno, nonostante l’attivazione di una via alternativa per la produzione di substrato: la proteolisi. L’esame fisico del bambini con patologia acuta può rivelare epatomegalia da lieve a moderata e debolezza muscolare. Mediante l’esame di laboratorio del sangue è possibile riscontrare ipoglicemia, valori elevati di CK e anomali di transaminasi. Caso unico fra i pazienti con disturbi dell’ossidazione degli acidi grassi, i soggetti LCHAD possono sviluppare nel corso del tempo neuropatia periferica sensomotoria e retinopatia pigmentosa. All’autopsia si rileva steatosi epatica e ciò spesso porta a un’errata diagnosi di sindrome di Reye o di sindrome di morte improvvisa del neonato (SIDS).

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Nelle donne con feto affetto da deficit di LCHAD è stata descritta una complicanza della gravidanza, la sindrome HELLP (emolisi, valori elevati degli enzimi del fegato, valori bassi delle piastrine).

Esami diagnosticiLo screening neonatale mediante spettrometria di massa tandem di una macchia di sangue essiccato identifica livelli elevati di diverse acilcarnitine a catena lunga (C16­OH, C16:1­OH, C18­OH, C18:1­OH e C16­OH/C16 si ritiene sia un rapporto indicativo). Test biochimici su sangue e urina per carnitina, acilcarnitine, acilglicine e acidi organici hanno valore diagnostico per questo disturbo. Con l’analisi degli acidi organici nell’urina generalmente si rileva la presenza di acidi dicarbossilici e idrossidicarbossilici, ma questa condizione può essere “normale” quando la patologia non è in fase acuta. L’analisi dell’attività di LCHAD nei fibroblasti può consentire di rivelare i soggetti affetti rispetto ai portatori eterozigoti e alle linee normali di fibroblasti. L’attività di LCHAD andrebbe valutata dopo la precipitazione degli anticorpi a seguito dell’attività di SCHAD, per via della sovrapposizione nel riconoscimento dei substrati.

I pazienti LCHAD hanno comunemente una mutazione (1528G>C) a livello di una subunità della proteina trifunzionale mitocondriale. L’individuazione delle mutazioni del DNA nei soggetti affetti consente di confermare i risultati dei test biochimici e di rilevare con precisione i portatori asintomatici fra gli altri membri della famiglia. La diagnosi prenatale è possibile mediante lo studio degli enzimi da coltura degli amniociti o mediante lo studio in vitro della via di β­ossidazione. È anche possibile utilizzare l’analisi del DNA per la diagnosi prenatale dei feti affetti nelle gravidanze a rischio, in cui entrambi i genitori sono portatori di una mutazione nota.

TrattamentoPer la gestione medica di LCHAD è fondamentale evitare il digiuno, soprattutto durante i periodi di elevato stress metabolico, come nel corso di malattie. Il digiuno notturno non dovrebbe protrarsi oltre le dodici ore e i bambini devono essere alimentati in tarda serata per ridurre tale periodo. L’aggiunta di amido di mais alimentare crudo mescolato a liquidi da assumere al momento di andare a letto, in alcuni casi ha portato nei bambini a una diminuzione della frequenza dell’ipoglicemia mattutina. Si dovrà evitare un regime alimentare ricco di grassi naturali. L’integrazione con trigliceridi a catena media supera il blocco metabolico e fornisce calorie sicure. Non sono stati rilevati benefici mediante

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integrazione orale con L­carnitina per quanto concerne l’eliminazione o il miglioramento dei sintomi clinici.

Durante i periodi di malattia va incoraggiata un’elevata assunzione di carboidrati, con l’avvio di integrazione endovenosa di glucosio nel caso in cui il bambino non riesca a contenere i liquidi o non sia in grado di nutrirsi adeguatamente per via orale. Per i soggetti con deficit di LCHAD, è imperativo che il paziente letargico riceva destrosio per via parenterale per evitare l’ipoglicemia durante la valutazione.

Poiché la diagnosi e la terapia per il deficit di LCHAD sono complesse, è con­sigliabile che il pediatra gestisca il paziente in stretta collaborazione con uno specialista delle malattie metaboliche pediatriche. È opportuno che i genitori portino sempre con sé una lettera con le linee guida del trattamento preparata dal medico che ha in cura il paziente.

EreditarietàQuesta patologia segue un pattern ereditario autosomico recessivo. Nel caso di patologie recessive, i pazienti affetti devono avere due copie del gene patologico (o della mutazione) per mostrare i sintomi della malattia. I soggetti con una sola copia del gene patologico (detti portatori) solitamente non mostrano segni o sintomi della condizione, ma possono trasmettere il gene patologico ai figli. Quando entrambi i genitori sono portatori del gene patologico di uno specifico disturbo, vi è il 25% di probabilità per ogni gravidanza che i figli siano affetti da tale disturbo.

Deficit di acil-CoA deidrogenasi a catena media (MCAD)CenniIl deficit di acil­CoA deidrogenasi a catena media (MCAD) è un’alterazione della β­ossidazione degli acidi grassi che si verifica almeno in 1 caso per 25.000 nati vivi. Il deficit enzimatico è a livello di acil­CoA deidrogenasi a catena media, una delle quattro acil­CoA deidrogenasi mitocondriali coinvolte nel processo iniziale di deidrogenasi nella β­ossidazione degli acidi grassi. Il deficit di MCAD compromette la capacità di ossidazione degli acidi grassi a catena media (6–12 atomi di carbonio) di origine alimentare o endogena.

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Aspetti cliniciIl deficit di MCAD solitamente di presenta fra il secondo mese e il secondo anno di vita, benché sia stata rilevata la sua comparsa anche a partire dal secondo giorno di vita e fino all’età adulta. La presentazione clinica spesso è scatenata da patologie apparentemente innocue come un’otite media o una sindrome virale. L’evento scatenante è solitamente un digiuno prolungato, che aumenta la lipolisi e la necessità di ossidazione degli acidi grassi. I sintomi comprendono vomito, letargia, apnea, coma, arresto cardiopolmonare o morte improvvisa inspiegabile. I sintomi iniziali spesso precedono la comparsa di ipoglicemia profonda, e sono probabilmente correlati a livelli elevati di acidi grassi liberi. L’ipoglicemia è causata dall’incapacità di soddisfare le esigenze gluconeogeniche durante il digiuno, nonostante l’attivazione di una via alternativa per la produzione di substrato (catabolismo proteico). L’esame fisico del bambino con patologia acuta è importante per rivelare epatomegalia da lieve a moderata, inoltre in alcuni pazienti si può riscontrare un’evidente debolezza muscolare. In assenza di indicazioni precedenti di malattia metabolica, il 20–25% di pazienti colpiti da questa patologia muore a causa del primo episodio o della prima malattia. All’autopsia si rileva edema cerebrale e steatosi a carico di fegato, cuore e reni, e ciò spesso porta a un’errata diagnosi di sindrome di Reye o di sindrome di morte improvvisa del neonato (SIDS). Questo disturbo causa circa l’1% dei decessi SIDS.

Esami diagnosticiLo screening neonatale mediante spettrometria di massa tandem su macchie di sangue essiccato prelevato dal tallone identifica livelli elevati di acilcarni­tina C8 (ottanoil­), solitamente accompagnati dagli esteri della carnitina C10 (decanoil­), C6 (esanoil­) e C10:1 (decenoil­). Si è rilevato che anche i rapporti C8/C2 e C8/C10 sono indicativi. Nel caso di patologia sintomatica, le analisi del sangue di laboratorio possono rilevare ipoglicemia, acidosi meta­bolica, acidosi lattica media, iperammoniemia, BUN elevato e livelli elevati di acido urico. Solitamente sono alte anche le transaminasi sieriche. L’urina spesso mostra livelli impropriamente bassi di chetoni o la loro assenza, a causa della compromissione dell’ossidazione degli acidi grassi. Nei pazienti non trattati si riscontrano tipicamente livelli bassi di carnitina in siero e urine. Test biochimici su sangue e urina per carnitina, acilcarnitine, acilglicine e acidi organici hanno valore diagnostico per questo disturbo. Si nota aciduria dicarbossilica, caratteriz­zata da elevazioni di suberilglicina ed esasnoilglicina. Nei fibroblasti, l’attività dell’acetil­CoA deidrogenasi a catena media è gravemente deficitaria nei soggetti affetti, mentre i portatori eterozigoti della patologia solitamente hanno livelli

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medi di attività, ma per il resto risultano immuni, sia per l’aspetto clinico sia per quello metabolico.

L’individuazione delle mutazioni del gene MCAD sul cromosoma 1 nei soggetti affetti conferma i risultati biochimici e identifica con precisione i portatori asintomatici fra gli altri membri della famiglia. La comune mutazione 985A>G è responsabile di circa l’85% dei casi. È possibile effettuare l’analisi sul DNA del tessuto post­mortem nel caso in cui non siano disponibili campioni di plasma e urine. La diagnosi prenatale è possibile mediante lo studio degli enzimi da coltura degli amniociti. Per la diagnosi nei feti affetti nelle gravidanze a rischio può inoltre essere utile l’analisi del DNA degli amniociti o dei villi corionici.

TrattamentoLa necessità di evitare il digiuno è fondamentale nella gestione medica di MCAD; soprattutto durante i periodi di elevato stress metabolico, come in caso di malattia. Il digiuno durante la notte va gestito con alimentazione notturna o in tarda serata, ove appropriato. L’aggiunta di amido di mais alimentare mescolato a liquidi da assumere al momento di andare a letto, in alcuni pazienti ha portato a una diminuzione della frequenza dell’ipoglicemia mattutina. Durante i periodi di malattia va incoraggiata un’elevata assunzione di carboidrati, con l’avvio di integrazione endovenosa di glucosio nel caso in cui il bambino non riesca a contenere i liquidi o non sia in grado di nutrirsi adeguatamente per via orale.

L’efficacia preventiva di una dieta a basso contenuto di grassi non è chiara, ma si deve evitare un eccesso di acidi grassi a catena lunga e media. L’integrazione per via orale con L­carnitina è stata associata a una riduzione della frequenza e della gravità degli episodi. La continua necessità di integrazione con carnitina nel periodo post­puberale è incerta e non è stata adeguatamente studiata.

Poiché la diagnosi e la terapia per il deficit di MCAD sono complesse, è consi­gliabile che il pediatra gestisca il paziente in stretta collaborazione con uno specialista delle malattie metaboliche pediatriche. È opportuno che i genitori portino sempre con sé una lettera con le linee guida del trattamento preparata dal medico che ha in cura il paziente.

EreditarietàQuesta patologia segue molto spesso un pattern ereditario autosomico recessivo. Nel caso di patologie recessive, i pazienti affetti devono avere due copie del gene patologico (o della mutazione) per mostrare i sintomi della malattia. I soggetti con una sola copia del gene patologico (detti portatori) solitamente

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non mostrano segni o sintomi della condizione, ma possono trasmettere il gene patologico ai figli. Quando entrambi i genitori sono portatori del gene patologico di uno specifico disturbo, vi è il 25% di probabilità per ogni gravidanza che i figli siano affetti da tale disturbo.

Deficit di proteina trifunzionale mitocondriale (TFP)

CenniIl deficit di proteina trifunzionale mitocondriale (TFP) è un’alterazione della β­ossidazione mitocondriale degli acidi grassi. Sul complesso dell’enzima TFP situato nella membrana mitocondriale interna sono situate tre attività enzi­matiche che operano in modo sequenziale nell’ossidazione degli acidi grassi. Si tratta degli enzimi a catena lunga enoil­CoA idratasi e idrossiacil­CoA deidroge­nasi (LCHAD) e di β­chetoacil­CoA tiolasi. Il complesso TFP consiste di due diverse subunità proteiche (α e β) codificate da due geni nucleari. Il complesso TFP è specifico per gli acidi grassi con lunghezza pari o superiore a 10 atomi di carbonio. Si stima che TFP colpisca meno di 1 soggetto per 100.000 nati vivi.

Aspetti cliniciNei pazienti colpiti da deficit di TFP sono state riferite diverse presentazioni cliniche. La presentazione comune compare nell’infanzia e segue un periodo di digiuno associato a una malattia non grave. Il paziente sviluppa ipoglicemia, ipotonia e acidemia lattica. All’esame fisico spesso si rilevano areflessia e cardio­miopatia e può verificarsi morte improvvisa. I pazienti possono avere livelli elevati di CK e anche rabdomiolisi e in qualche caso si è riscontrata iperam­moniemia. Sono stati misurati bassi livelli di carnitina nel siero e nei muscoli. La biopsia ha evidenziato steatosi epatica. Molti di questi pazienti muoiono a causa di ipotonia grave con difficoltà respiratoria.

Esami diagnosticiLo screening neonatale mediante spettrometria di massa tandem su macchie di sangue essiccato individua elevazione di diverse acilcarnitine a catena lunga e idrossiacil­carnitine (ad es., C16­OH, C16:1­OH, C18­OH, C18:1­OH e C16­OH/C16 si ritiene sia un rapporto indicativo). Tali risultanze sono carat­teristiche ma non definitive del deficit di TFP, poiché il deficit di LCHAD isolato mostra esiti simili. L’analisi quantitativa degli acidi organici nelle urine non è generalmente utile, perché l’elevazione degli acidi dicarbossilici da C6 a C14 e 3­idrossidicarbossilico può anche non essere presente. Il profilo di acilcarnitina

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ematica può dimostrare elevazione delle suddette acilcarnitine mediante analisi di macchie di sangue essiccato. L’analisi conclusiva viene effettuata mediante test enzimatico diretto su leucociti o fibroblasti, o mediante l’analisi di colture di fibroblasti per l’attività TFP con substrato di acidi grassi marcati.

Il deficit di TFP può essere causato da mutazioni nelle subunità alfa o beta dei geni per il TFP. Non è stata riferita alcuna mutazione comune nel deficit di TFP, tuttavia la diagnosi prenatale è teoricamente possibile qualora siano note entrambe le mutazioni.

TrattamentoLa terapia di sostegno per il paziente acuto comprende il trattamento di ipoglice­mia, acidosi lattica e iperammoniemia per via endovenosa con liquidi contenenti glucosio e bicarbonato. Si deve considerare la somministrazione di L­carnitina. È importante evitare il digiuno per prevenire episodi sintomatici.

Poiché la diagnosi e la terapia per il deficit di TFP sono complesse, è consigliabile che il pediatra gestisca il paziente in stretta collaborazione con uno specialista delle malattie metaboliche pediatriche. È opportuno che i genitori portino sempre con sé una lettera con le linee guida del trattamento preparata dal medico che ha in cura il paziente.

EreditarietàQuesta patologia segue molto spesso un pattern ereditario autosomico reces­sivo. Nel caso di patologie recessive, i pazienti affetti devono avere due copie del gene patologico (o della mutazione) per mostrare i sintomi della malattia. I soggetti con una sola copia del gene patologico (detti portatori) solitamente non mostrano segni o sintomi della condizione, ma possono trasmettere il gene patologico ai figli. Quando entrambi i genitori sono portatori del gene patologico di uno specifico disturbo, vi è il 25% di probabilità per ogni gravidanza che i figli siano affetti da tale disturbo.

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Deficit di acil-CoA deidrogenasi a catena molto lunga (VLCAD)CenniIl deficit di acil­CoA deidrogenasi a catena molto lunga (VLCAD) è un’altera­zione della β­ossidazione degli acidi grassi. Tale deficit enzimatico riguarda una delle quattro acil­CoA deidrogenasi mitocondriali che svolgono il passaggio iniziale di deidrogenazione nella β­ossidazione degli acidi grassi. Il deficit di VLCAD compromette l’ossidazione degli acidi grassi a catena lunga (16 atomi di carbonio e più). L’accumulo dei prodotti intermedi di acidi grassi a catena lunga e acil­CoA produce effetti tossici sul normale funzionamento del metabolismo. Il gene si trova sul cromosoma 17 e codifica una proteina che agisce a livello della membrana mitocondriale interna. Si stima che VLCAD colpisca almeno 1 soggetto per 75.000 nati vivi.

Aspetti cliniciSono state riferite due presentazioni generali relative al deficit di VLCAD, benché entrambe possano variare notevolmente. I neonati possono presentare sintomi gravi di sepsi simili a sindrome di Reye, spesso fatale. Il paziente può risultare ipoglicemico a digiuno e presentare acidosi metabolica, livelli elevati di enzimi epatici con epatomegalia (causata da steatosi), colestasi, cardiomiopatia ipertrofica, proteinuria ed ematuria. Una seconda presentazione compare successivamente e mostra letargia e coma a digiuno. Questi pazienti soffrono di ipoglicemia ipochetotica, epatomegalia, “infezioni” ricorrenti e affaticamento frequente con conseguenti dolori muscolari. Alcuni pazienti presentano rabdomiolisi causata dall’esercizio.

Esami diagnosticiLo screening neonatale mediante spettrometria di massa tandem rileva livelli aumentati di acilcarnitine C14:1, C14:2 e C14, a indicare un caso probabile di deficit di VLCAD (in questo senso si ritiene che sia indicativo anche il rapporto C14:1/C16). I test clinici possono rilevare ipoglicemia con elevazione di lattato, piruvato, ammonio e CK. Spesso si riscontrano livelli elevati di acidi dicarbossilici, saturi e insaturi, mediante lo studio degli acidi organici mentre il paziente è malato. Si possono anche utilizzare test enzimatici eseguiti su coltura di fibroblasti per individuare in modo indiretto l’attività VLCAD mediante test marcato per la β­ossidazione.

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TrattamentoI pazienti con deficit di VLCAD sono trattati con integrazione di carnitina ed evitando rigorosamente il digiuno. Il mantenimento dell’omeostasi del glucosio viene ottenuto con alimentazione frequente, limitando l’assunzione di grassi e aumentando quella di carboidrati, utilizzando un’integrazione mediante olio con trigliceridi a catena media (MCT) e possibilmente amido di mais qualora sia necessario per prevenire l’ipoglicemia. Il work­up di un paziente con sospetto deficit di VLCAD deve escludere deficit di MCAD (acil­CoA deidrogenasi a catena media) o aciduria glutarica tipo II (GA­II), perché l’integrazione con olio MCT è controindicata per tali patologie. Nei soggetti con VLCAD, è imperativo che il paziente letargico riceva glucosio per via parenterale per evitare l’ipo glicemia.

Poiché la diagnosi e la terapia per il deficit di VLCAD sono complesse, è consi­gliabile che il pediatra gestisca il paziente in stretta collaborazione con uno specialista delle malattie metaboliche pediatriche. È opportuno che i genitori portino sempre con sé una lettera con le linee guida del trattamento preparata dal medico che ha in cura il paziente.

EreditarietàQuesta patologia segue molto spesso un pattern ereditario autosomico recessivo. Nel caso di patologie recessive, i pazienti affetti devono avere due copie del gene patologico (o della mutazione) per mostrare i sintomi della malattia. I soggetti con una sola copia del gene patologico (detti portatori) solitamente non mostrano segni o sintomi della condizione, ma possono trasmettere il gene patologico ai figli. Quando entrambi i genitori sono portatori del gene patologico di uno specifico disturbo, vi è il 25% di probabilità per ogni gravidanza che i figli siano affetti da tale disturbo.

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ALTERAZIONI DEGLI ACIDI ORGANICI

Aciduria 3-idrossi-3-metilglutarica (HMG)

CenniLa 3­idrossi­3­metilglutaril­CoA (HMG­CoA) liasi svolge una duplice funzione per il metabolismo della leucina e per la regolazione della produzione dei corpi chetonici. Si trova prevalentemente nei mitocondri ma è presente anche nei perossisomi. Nell’ultima fase del metabolismo della leucina, scinde 3­idrossi­3­metilglutaril­CoA producendo acetil­CoA e aceto acetato, uno dei corpi chetonici. L’aciduria 3­idrossi­3­metilglutarica (HMG) è stata descritta per la prima volta nel 1971 e da allora sono stati diagnosticati più di 60 pazienti. Si stima che HGM colpisca meno di 1 soggetto per 100.000 nati vivi.

Aspetti cliniciHMG compare tipicamente entro la prima settimana di vita, benché in alcuni pazienti sia stata rilevata la sua comparsa più tardi, entro il secondo anno di età. La comparsa dei sintomi è causata da digiuno, infezione, carico proteico da alimentazione o semplicemente dallo stress della nascita. I sintomi procedono da vomito, letargia, tachipnea e disidratazione al coma, talvolta con esito fatale. All’esame fisico si riscontrano epatomegalia e anomalie neurologiche. Le analisi di laboratorio rilevano ipoglicemia non chetotica, acidosi metabolica, iperammoniemia e livelli elevati di transaminasi epatiche. Si riscontra presenza anomala di acidi organici e una quantità elevata di acilcarnitine plasmatiche.

Esami diagnosticiLo screening neonatale per HMG può essere effettuato mediante spettrometria di massa tandem su macchie di sangue essiccato. La presenza di livelli elevati di acilcarnitina dicarbossilica a sei atomi di carbonio (C6­DC) e di idrossiacil­carnitina C5 (C5­OH) suggerisce l’alterazione metabolica. Si ritiene inoltre indicativo per HGM il rapporto C5­OH/C8. La diagnosi richiede l’esecuzione di ulteriori analisi. L’analisi degli acidi organici urinari di un paziente con HMG rivelerà elevazione degli acidi 3­idrossi­3­metilglutarico, 3­metilglutaconico e 3­idrossi­isovalerico. La diagnosi va confermata mediante la misurazione dell’attività dell’enzima HMG­CoA liasi in fibroblasti o leucociti. La diagnosi prenatale è possibile mediante il dosaggio dell’acido 3­idrossi­3­metilglutarico nel liquido amniotico e l’analisi dell’attività dell’enzima HMG­CoA liasi in colture di amniociti e villi corionici. In diversi pazienti sono state identificate

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mutazioni del gene HMG­CoA liasi sul cromosoma 1 e la diagnosi prenatale può essere eseguita mediante analisi del DNA.

TrattamentoI sintomi acuti del deficit di HGM­CoA liasi vanno trattati con glucosio per via endovenosa, bicarbonato per l’acidosi metabolica e limitazione proteica (leucina). Nel corso di un episodio acuto, i pazienti possono necessitare di ventilazione assistita. Per il trattamento a lungo termine, i pazienti affetti devono evitare il digiuno e devono ridurre l’apporto proteico.

Poiché la diagnosi e la terapia per il deficit di HMG­CoA liasi sono complesse, è consigliabile che il pediatra gestisca il paziente in stretta collaborazione con uno specialista delle malattie metaboliche pediatriche. È opportuno che i genitori portino sempre con sé una lettera con le linee guida del trattamento preparata dal medico che ha in cura il paziente.

EreditarietàQuesta patologia segue molto spesso un pattern ereditario autosomico recessivo. Nel caso di patologie recessive, i pazienti affetti devono avere due copie del gene patologico (o della mutazione) per mostrare i sintomi della malattia. I soggetti con una sola copia del gene patologico (detti portatori) solitamente non mostrano segni o sintomi della condizione, ma possono trasmettere il gene patologico ai figli. Quando entrambi i genitori sono portatori del gene patolo­gico di uno specifico disturbo, vi è il 25% di probabilità per ogni gravidanza che i figli siano affetti da tale disturbo.

Acidemia glutarica tipo I (GA I)

CenniL’acidemia glutarica tipo I (GA I) è stata descritta per la prima volta nel 1975. La patologia è provocata da un deficit genetico dell’enzima glutaril­CoA deidrogenasi (GCD), che causa l’accumulo di acido glutarico nei tessuti e la sua escrezione nelle urine dei pazienti affetti. GCD è coinvolto nel catabolismo degli aminoacidi lisina, idrossilisina e triptofano.

La letteratura medica ha riportato oltre 200 casi di GA I. GA I è una delle acidemie organiche più comuni e ha un’incidenza stimata di 1 caso per 50.000 nati vivi. Per via dell’iniziale lentezza nel progresso dei sintomi clinici, GA I spesso viene diagnosticata solo alla prima crisi metabolica acuta.

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Aspetti cliniciI neonati con GA I possono apparire normali alla nascita o presentare macro­cefalia. Nel corso del primo anno di vita lo sviluppo è solitamente normale, ma in seguito il bambino viene colpito da crisi da encefalopatia acuta scatenata da altre malattie. I sintomi sono caratterizzati da acidosi metabolica, distonia, atetosi e convulsioni. Il paziente spesso è colpito da distonia permanente e perdita a lungo termine delle funzioni motorie. Il recupero neurologico è raro e incompleto. In alternativa, il neonato affetto può conseguire con ritardo le capacità motorie iniziali e apparire irritabile, nervoso, ipotonico e presentare una compromissione nei movimenti volontari. Ciò può evolversi come un disturbo neurologico graduale senza colpire le capacità mentali. Entrambe le presentazioni contemplano la distruzione di caudato e putamen, con conse­guenti disturbi motori tipici di GA I. I pazienti affetti presentano un rischio molto alto di problemi neurologici prima del quinto anno di età.

Esami diagnosticiLo screening neonatale mediante spettrometria di massa tandem su macchie di sangue essiccato prelevato dal tallone individua i pazienti con GA I mediante la presenza di acido glutarico con legame covalente con la carnitina (acilcarnitina dicarbossilica, C5­DC). Si ritengono inoltre indicativi per GA I i rapporti C5DC/C5­OH, C5D/C8 e C5DC/C16. Ciò consente di giungere a diagnosi precoci e di avviare prima il trattamento dei pazienti presintomatici. Nei pazienti con patologia acuta, l’analisi degli acidi organici consente di riscontrare quantità elevate di acido glutarico nel sangue e nelle urine. L’analisi delle urine per individuare anomalie nei livelli di acidi organici in un paziente sospetto può rilevare la presenza di acido glutarico, acido 3­idrossi­glutarico (patognomico per GA I) ed eventualmente acido glutaconico. Questi acidi organici possono tuttavia non essere presenti nei pazienti che non sono in fase acuta, e in tal caso sono preferibili l’analisi dell’acilcarnitina o il dosaggio enzimatico. L’attività dell’enzima GCD può essere analizzata in colture di fibroblasti, colture di amniociti e nei villi corionici (direttamente o mediante coltura). La diagnosi prenatale è stata anche conseguita mediante l’individuazione di livelli elevati di acido glutarico nel liquido amniotico. L’analisi della mutazione del DNA per la diagnosi prenatale richiede la conoscenza della mutazione (o delle mutazioni) nei genitori prima dell’esecuzione del test. In fase di diagnosi, i livelli di carnitina libera spesso sono bassi mentre quelli della carnitina acilata sono alti. Gli aminoacidi plasmatici solitamente sono nella norma e non sono utili ai fini diagnostici.

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Si è scoperto che le mutazioni genetiche che causano GA I sono molte e diverse. Non si è riscontrata alcuna correlazione fra mutazione del DNA e gravità clinica dell’alterazione per uno specifico paziente.

TrattamentoIl trattamento precoce e aggressivo prima della comparsa dei sintomi può prevenire lo sviluppo di danno neurologico. Alla comparsa di qualsiasi patologia o scompenso metabolico, si consiglia un trattamento sollecito e vigoroso con liquidi per via endovenosa, compresi glucosio e carnitina, con somministrazione monitorata di insulina. Le limitazioni proteiche, ad esempio di lisina e triptofano, non hanno portato a vantaggi clinici evidenti.

Poiché la diagnosi e la terapia per GA I sono complesse, è consigliabile che il pediatra gestisca il paziente in stretta collaborazione con uno specialista delle malattie metaboliche pediatriche. È opportuno che i genitori viaggino portando con sé una lettera con le linee guida del trattamento preparata dal medico che ha in cura il paziente.

EreditarietàQuesta patologia segue molto spesso un pattern ereditario autosomico recessivo. Nel caso di patologie recessive, i pazienti affetti devono avere due copie del gene patologico (o della mutazione) per mostrare i sintomi della malattia. I soggetti con una sola copia del gene patologico (detti portatori) solitamente non mostrano segni o sintomi della condizione, ma possono trasmettere il gene patologico ai figli. Quando entrambi i genitori sono portatori del gene patologico di uno specifico disturbo, vi è il 25% di probabilità per ogni gravidanza che i figli siano affetti da tale disturbo.

Acidemia isovalerica (IVA)

CenniL’acidemia isovalerica è causata da un’alterazione nel metabolismo dell’amino­acido leucina. Il primo caso di paziente con acidemia isovalerica è stato descritto nel 1966 e, alcuni anni dopo, è stato individuato il deficit dell’attività di isovaleril­CoA deidrogenasi. L’isovaleril­CoA deidrogenasi opera nella matrice mito condriale interna. Il gene si trova sul cromosoma 15. Si stima che IVA colpisca meno di 1 soggetto per 100.000 nati vivi.

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Aspetti cliniciIl deficit di isovaleril­CoA deidrogenasi ha due presentazioni generali. La prima ha luogo entro i primi giorni o le prime settimane di vita sotto forma di una malattia acuta, molto intensa, con vomito e chetoacidosi che conduce a letargia, coma e morte in più del 50% dei pazienti. Altri risultati di laboratorio includono livelli variabili di iperammoniemia, ipocalcemia, neutropenia, trombocitopenia e pancitopenia. La seconda presentazione avviene più tardi, nel corso del primo anno di vita o in seguito. Questi pazienti sviluppano patologie croniche, intermittenti, causate da infezioni o da un elevato apporto proteico. Le analisi di laboratorio sono analoghe a quelle descritte in precedenza, ma non sempre così gravi. Entrambi i gruppi sono suscettibili di infezione. Solitamente il paziente presenta un caratteristico odore di “piede sudato” durante una malattia, a causa dell’accumulo di acido isovalerico volatile.

Esami diagnosticiLo screening neonatale per IVA può essere effettuato mediante spettrometria di massa tandem su macchie di sangue essiccato prelevato dal tallone. La presenza di livelli elevati di acilcarnitina C5 può indicare un deficit di isovaleril­CoA deidrogenasi o un deficit di 2­metilbutiril­CoA deidrogenasi. Per differenziare le due patologie sono necessarie ulteriori analisi. Si è rilevato che anche i rapporti C5/C0, C5/C2 e C5/C3 sono indicativi. L’analisi degli acidi organici urinari di un paziente con IVA rivelerà elevazione di isovaleril­glicina e, in misura minore, dell’acido 3­idrossi­isovalerico. L’isovalerato odoroso è presente nei campioni di urina solo durante la fase acuta della patologia, quando i suoi livelli sono significativi. Per via della sua volatilità (che è causa dell’odore), viene perso sia prima sia durante la preparazione del campione per il dosaggio degli acidi organici urinari. Per contro, nelle urine dei pazienti con deficit di 2­metilbutiril­CoA deidrogenasi sono presenti 2­metilbutirato e 2­metilbutirilglicina. La diagnosi prenatale è possibile mediante il dosaggio dell’isovaleril­glicina nel liquido amniotico e l’analisi dell’attività dell’enzima isovaleril­CoA deidrogenasi in colture di villi corionici e amniociti. L’attività può anche essere analizzata in fibroblasti e leucociti.

TrattamentoIl trattamento dei pazienti con acidemia isovalerica include la riduzione dell’apporto proteico, in particolare dell’aminoacido ramificato leucina. Nel corso di un episodio acuto, è necessario il ricorso aggressivo a glucosio ed elettroliti. L’integrazione con glicina si è rivelata utile perché questo aminoacido è coniugato con l’isovalerato, dando origine all’isovaleril­glicina, meno dannosa. Analogamente, il trattamento con carnitina è efficace. In alcuni

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pazienti, un rigoroso controllo dell’alimentazione e un trattamento aggressivo hanno consentito uno sviluppo normale. Tuttavia, molti pazienti con acidemia isovalerica mostrano anomalie neurologiche causate dalla patologia acuta.

Poiché la diagnosi e la terapia per l’acidemia isovalerica sono complesse, è consi­gliabile che il pediatra gestisca il paziente in stretta collaborazione con uno specialista delle malattie metaboliche pediatriche e un dietologo. È opportuno che i genitori portino sempre con sé una lettera con le linee guida del trattamento preparata dal medico che ha in cura il paziente.

EreditarietàQuesta patologia segue molto spesso un pattern ereditario autosomico recessivo. Nel caso di patologie recessive, i pazienti affetti devono avere due copie del gene patologico (o della mutazione) per mostrare i sintomi della malattia. I soggetti con una sola copia del gene patologico (detti portatori) solitamente non mostrano segni o sintomi della condizione, ma possono trasmettere il gene patologico ai figli. Quando entrambi i genitori sono portatori del gene patologico di uno specifico disturbo, vi è il 25% di probabilità per ogni gravidanza che i figli siano affetti da tale disturbo.

Deficit di 3-metil-crotonil-CoA carbossilasi (3-MCC)CenniIl deficit di 3­metil­crotonil­CoA carbossilasi (3­MCC) è noto dal 1984. È un’alterazione della degradazione dell’aminoacido leucina. L’attività di 3­MCC, un enzima della carbossilasi, richiede biotina. Nell’uomo vi sono quattro carbossilasi che utilizzano la biotina; il deficit può essere a carico di una o di tutte le carbossilasi. Qualora il metabolismo della biotina presenti alterazioni, il livello di carbossilasi sarà basso causando un deficit multiplo di carbossilasi. Alcune delle evidenze biochimiche riscontrate per il deficit di 3­MCC sono sovrapponibili a quelle relative al deficit multiplo di carbossilasi, di conseguenza è necessario procedere con attenzione nell’analisi per distinguere fra le due condizioni. Si stima che 3­MCC colpisca almeno 1 soggetto per 75.000 nati vivi.

Aspetti cliniciLe presentazioni cliniche di deficit di 3­MCC vanno da gravi a benigne. I sintomi solitamente compaiono durante i primi anni di vita, ma sono state riportati casi in cui i sintomi sono comparsi più tardi e casi di adulti asintomatici. Spesso

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i sintomi si presentano inizialmente per via di infezioni, malattie o digiuno prolungato. I pazienti con deficit di 3­MCC possono soffrire di stress catabolico che porta a vomito, letargia, apnea, ipotonia o iperreflessia e convulsioni. I pazienti possono presentare ipoglicemia profonda, acidosi metabolica media, iperammoniemia, livelli elevati di transaminasi epatiche e chetonuria. I livelli plasmatici di carnitina libera possono risultare molto bassi. Altri pazienti possono presentare deficit di crescita a partire dal periodo neonatale o ritardi nello sviluppo. Alcuni individui con deficit di 3­MCC non hanno sintomi apparenti. Le donne asintomatiche con deficit di 3­MCC possono trasmettere il metabolita 3­MCC ai figli attraverso la placenta che, di conseguenza, conterrà livelli elevati di 3­MCC nel momento dell’esecuzione dello screening neonatale con spettrometria di massa tandem, ma i bambini non avranno tale malattia.

Esami diagnosticiLo screening neonatale con spettrometria di massa tandem rivela elevazione di C5­idrossiacil­carnitina (C5­OH) dalle macchie di sangue essiccato prelevato dal tallone del paziente affetto. Si è rilevato che anche i rapporti C5­OH/C8 e C5­OH/C0 sono indicativi per 3­MCC. La diagnosi del deficit di 3­MCC richiede poi ulteriori analisi. L’analisi degli acidi organici urinari rileva elevazione di acido 3­idrossi­isovalerico e solitamente di 3­metil­crotonil­glicina. In seguito a integrazione con carnitina, mediante spettrometria di massa tandem generalmente si rileva elevazione di 3­idrossi­isovaleril­carnitina nel profilo dell’acilcarnitina. Nel caso di elevazione di acilcarnitina C3, si è in presenza di deficit multiplo di carbossilasi. Per confermare ulteriormente la diagnosi del solo deficit di 3­MCC, si dovrà analizzare l’attività enzimatica in fibroplasti e leucociti, oltre a dovere riscontrare attività enzimatica normale di almeno un’altra carbossilasi. L’attività di 3­MCC può anche essere analizzata in campioni di villi corionici. Le madri dei neonati nei quali sia stato riscontrato un livello elevato di 3­MCC mediante lo screening neonatale, devono essere sottoposte a dosaggio dell’acilcarnitina nel sangue per verificare se il deficit di 3­MCC sia a loro carico piuttosto che dei neonati. Tali analisi dovrebbero essere estese anche agli altri membri della famiglia.

TrattamentoIl trattamento del deficit di 3­MCC include la riduzione dell’apporto alimentare di leucina, mediante un regime che riduca l’apporto di leucina o, più in generale, l’apporto proteico. Con la compara della patologia, è necessario somministrare glucosio per via endovenosa per correggere l’acidosi. Sia l’integrazione con carnitina sia quella con glicina si sono rivelate utili. I pazienti devono sottoporsi quanto prima a un test con integrazione di biotina per verificare la possibilità

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che il deficit sia a carico del metabolismo della biotina piuttosto che soltanto di 3­MCC; in caso di assenza di risultati si potrà sospendere la somministrazione di biotina.

Poiché la diagnosi e la terapia per il deficit di 3­MCC sono complesse, è consi­gliabile che il pediatra gestisca il paziente in stretta collaborazione con uno specialista delle malattie metaboliche pediatriche. È opportuno che i genitori portino sempre con sé una lettera con le linee guida del trattamento preparata dal medico che ha in cura il paziente.

EreditarietàQuesta patologia segue molto spesso un pattern ereditario autosomico recessivo. Nel caso di patologie recessive, i pazienti affetti devono avere due copie del gene patologico (o della mutazione) per mostrare i sintomi della malattia. I sog­getti con una sola copia del gene patologico (detti portatori) solitamente non mostrano segni o sintomi della condizione, ma possono trasmettere il gene pato­logico ai figli. Quando entrambi i genitori sono portatori del gene patologico di uno specifico disturbo, vi è il 25% di probabilità per ogni gravidanza che i figli siano affetti da tale disturbo.

Acidemie metilmaloniche (MUT)

CenniL’acidemia metilmalonica (MUT) può essere causata da diversi disordini genetici, compresi il deficit di metilmalonil­CoA mutasi e i difetti degli enzimi nel metabolismo della cobalamina (vitamina B12). L’acidemia metilmalonica è uno dei difetti metabolici più studiati, dal momento che è stato individuato per la prima volta nel 1967. Si stima che la sua incidenza sia di 1 caso su 48.000 nascite, ma probabilmente è più alta, per via della carenza di riconoscimento e diagnosi. Sono state identificate mutazioni multiple del DNA per la MUT.

Aspetti cliniciA causa della dipendenza dell’attività di metilmalonil­CoA mutasi dal meta­bolismo e dalle funzioni della cobalamina, i diversi difetti che danno origine a MUT hanno presentazioni cliniche simili. Durante la prima settimana di vita, l’acidemia metilmalonica provoca vomito ricorrente, disidratazione, sofferenza respiratoria, ipotonia muscolare e letargia, che possono condurre al coma e alla morte. L’acidosi metabolica è pronunciata. Spesso si riscontrano anche cheto acidosi, iperglicemia, ipoglicemia e iperammoniemia, assieme

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a leucopenia, trombocitopenia e anemia. Lo stesso scenario può presentarsi più avanti, durante il primo mese di vita, manifestandosi con deficit della crescita e disabilità intellettiva. In tutti i pazienti si è riscontrata sensibilità alle infezioni. L’insufficienza renale è una complicanza a lungo termine di MUT.

Esami diagnosticiLo screening neonatale per MUT può essere effettuato mediante spettrometria di massa tandem su macchie di sangue essiccato prelevato dal tallone. La presenza di livelli elevati di acilcarnitina C3 indica un possibile deficit meta­bolico, ossia MUT o acidemia propionica. Si è rilevato che anche i rapporti C3/C2 e C3/C16 sono indicativi per MUT. La diagnosi richiede l’esecuzione di ulteriori analisi. L’analisi degli acidi organici urinari di un paziente con MUT rivelerà una notevole elevazione di acido metilmalonico, assieme ai precursori metaboliti β­idrossipropionato e metilcitrato. Questi e altri metaboliti inibiscono la funzionalità mitocondriale. È possibile analizzare l’attività di metilmalonil­CoA mutasi e del metabolismo della cobalamina in molti tessuti. Uno studio condotto sulla terapia con vitamina B12 ha importanza diagnostica nell’identificazione dei pazienti che hanno difetti a carico del metabolismo della cobalamina. La diagnosi prenatale è possibile mediante il dosaggio dell’acido metilmalonico nel liquido amniotico o nell’urina materna, e l’analisi dell’attività dell’enzima in colture di amniociti.

TrattamentoIl trattamento dei pazienti con MUT include la riduzione dell’apporto proteico, in particolare degli aminoacidi ramificati valina e isoleucina, e di metionina e treonina. Sono disponibili in commercio preparati specifici a questo scopo. Tutti i pazienti dovrebbero essere sottoposti a un controllo dell’integrazione con cobalamina per valutarne l’esito, poiché la gestione dei pazienti che rispondono a B12 è decisamente più semplice e la prognosi è migliore. Si è rivelata utile l’integrazione con carnitina. Gli antibiotici orali aiutano a controllare le infezioni e, ipoteticamente, riducono i batteri intestinali, che producono acido propionico che può essere assorbito a livello intestinale e che contribuisce alla produzione di acido metilmalonico. Nel corso dell’infanzia è indispensabile esercitare un controllo rigoroso. In molti pazienti di età più avanzata con disturbi metabolici medi non trattati non si sono riscontrati disturbi.

Poiché la diagnosi e la terapia per MUT sono complesse, è consigliabile che il pediatra gestisca il paziente in stretta collaborazione con uno specialista delle malattie metaboliche pediatriche e un dietologo. È opportuno che i genitori

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portino sempre con sé una lettera con le linee guida del trattamento preparata dal medico che ha in cura il paziente.

EreditarietàQuesta patologia segue molto spesso un pattern ereditario autosomico recessivo. Nel caso di patologie recessive, i pazienti affetti devono avere due copie del gene patologico (o della mutazione) per mostrare i sintomi della malattia. I sog­getti con una sola copia del gene patologico (detti portatori) solitamente non mostrano segni o sintomi della condizione, ma possono trasmettere il gene pato­logico ai figli. Quando entrambi i genitori sono portatori del gene patologico di uno specifico disturbo, vi è il 25% di probabilità per ogni gravidanza che i figli siano affetti da tale disturbo.

Deficit di β-chetotiolasi (BKT)

CenniLa β­chetotiolasi (acetoacetil­CoA tiolasi mitocondriale) è un enzima con una duplica funzione metabolica. Tale enzima agisce nella scomposizione dell’aceto­acetil­CoA generato dall’ossidazione degli acidi grassi e regola la produzione dei corpi chetonici. Inoltre catalizza un passaggio successivo della scomposizione dell’aminoacido isoleucina. Il deficit di β­chetotiolasi è stato descritto per la prima volta nel 1971 e, da allora, sono stati individuati più di 40 casi. Si stima che BKT colpisca meno di 1 soggetto per 100.000 nati vivi.

Aspetti cliniciIl deficit di β­chetotiolasi ha presentazione variabile. Molti pazienti affetti hanno fra i 5 e i 24 mesi di vita e presentano sintomi di chetoacidosi grave. I sintomi possono essere scatenati da un carico proteico alimentare, da un’infezione o dalla febbre. I sintomi procedono dal vomito alla disidratazione e chetoacidosi. Possono essere presenti neutropenia e trombocitopenia, e iperammoniemia moderata. I valori di glucosio nel sangue sono solitamente normali, ma negli episodi acuti possono risultare bassi o alti. Può verificarsi un ritardo nello sviluppo, anche in un momento precedente al primo episodio acuto, e la RMI cerebrale ha talvolta rilevato necrosi bilaterale dello striato a livello dei gangli della base. Alcuni pazienti possono sviluppare cardiomiopatia. Un’eccessiva risposta chetogenica al digiuno o alla malattia può fare ipotizzare la presenza di questa patologia.

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Esami diagnosticiLo screening neonatale per BKT può essere effettuato mediante spettrometria di massa tandem su macchie di sangue essiccato. La presenza di livelli elevati di C5:1 e C5­OH suggerisce il deficit metabolico. Si ritiene inoltre indicativo per BKT il rapporto C5­OH/C8. La diagnosi richiede l’esecuzione di ulteriori analisi. L’analisi degli acidi organici urinari di un paziente con BKT rivelerà elevazione di acido 2­metil­3­idrossibutirrico, acido tiglico e tiglilglicina. La diagnosi va confermata mediante la misurazione dell’attività dell’enzima in fibroblasti o leucociti. La diagnosi prenatale è possibile mediante l’analisi dell’attività dell’enzima in colture di amniociti e villi corionici.

Nei pazienti con BKT sono state identificate diverse mutazioni. Tuttavia, non vi sono mutazioni comuni che permettano uno screening rapido. La possibilità di diagnosi prenatale è presente nel caso in cui vi siano mutazioni note in ambito famigliare.

TrattamentoL’acidosi acuta da BKT va trattata in modo aggressivo con bicarbonato di sodio, tenendo presente la possibilità di ipernatriemia iatrogena. Si devono normaliz­zare i livelli plasmatici di glucosio, elettroliti e ammonia. L’integrazione con carnitina può essere utile.

Per il trattamento a lungo termine, i pazienti affetti devono evitare il digiuno, alimentarsi frequentemente e devono ridurre l’apporto proteico. In caso di febbre o vomito, si può utilizzare glucosio per via endovenosa. L’integrazione con carnitina è accettabile. Con un monitoraggio e una terapia appropriati, vi sono buone prospettive di uno sviluppo normale.

Poiché la diagnosi e la terapia per BKT sono complesse, è consigliabile che il pediatra gestisca il paziente in stretta collaborazione con uno specialista delle malattie metaboliche pediatriche. È opportuno che i genitori portino sempre con sé una lettera con le linee guida del trattamento preparata dal medico che ha in cura il paziente.

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EreditarietàQuesta patologia segue molto spesso un pattern ereditario autosomico recessivo. Nel caso di patologie recessive, i pazienti affetti devono avere due copie del gene patologico (o della mutazione) per mostrare i sintomi della malattia. I sog­getti con una sola copia del gene patologico (detti portatori) solitamente non mostrano segni o sintomi della condizione, ma possono trasmettere il gene pato­logico ai figli. Quando entrambi i genitori sono portatori del gene patologico di uno specifico disturbo, vi è il 25% di probabilità per ogni gravidanza che i figli siano affetti da tale disturbo.

Acidemia propionica (PA)

CenniL’acidemia propionica (PA) è caratterizzata dall’accumulo dell’acido propionico causato dal deficit di propionil­CoA carbossilasi, un enzima dipendente dalla biotina coinvolto nel catabolismo degli aminoacidi. Si può avere accumulo di acido propionico anche nel deficit multiplo di carbossilasi e nell’acidemia metilmalonica. Sono state identificate mutazioni multiple del DNA per nei casi di PA. Si stima che la PA colpisca almeno 1 soggetto per 75.000 nati vivi.

Aspetti cliniciI pazienti con PA presentano, solitamente nei primi giorni di vita, disidratazione, letargia, ipotonia, vomito, chetoacidosi e iperammoniemia. Possono essere presenti anche convulsioni, neutropenia, trombocitopenia ed epatomegalia. I pazienti non trattati possono entrare in coma e morire. Molti pazienti che sopravvivono al periodo neonatale hanno episodi di acidosi metabolica scatenata da infezioni, digiuno o da una dieta con elevato apporto proteico. In alcuni casi, l’iperammoniemia episodica sembra predominante rispetto all’acidosi metabolica. Il ritardo psicomotorio è una complicanza a lungo termine. In alcuni pazienti i sintomi compaiono più avanti nel corso dell’infanzia, con encefalopatia e associata chetoacidosi, o ritardo nello sviluppo.

Esami diagnosticiLo screening neonatale per PA può essere effettuato mediante spettrometria di massa tandem su macchie di sangue essiccato prelevato dal tallone. La presenza di livelli elevati di acilcarnitina C3 indica una possibile alterazione metabolica, ossia PA, acidemia metilemalonica o, più raramente, difetti nel metabolismo della biotina. Si è rilevato che anche i rapporti C3/C2 e C3/C16 sono indicativi per PA. La diagnosi richiede l’esecuzione di ulteriori analisi.

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L’analisi degli acidi organici urinari di un paziente con PA rivelerà notevole elevazione di acido propionico e dei composti correlati, come metilcitrato, glicina propionil, β­idrossipropionato e acido tiglico. Spesso nei casi di PA si riscontra una deficienza di carnitina causata dall’aumento di escrezione renale della propionil­carnitina.

TrattamentoIl trattamento di PA include la riduzione dell’apporto proteico, in particolare degli aminoacidi valina, isoleucina, metionina e treonina che entrano nella via disfunzionale. Ciò richiede che il neonato sia sottoposto a un regime con preparati metabolici specifici per la limitazione di questi aminoacidi. Tutti i pazienti dovrebbero essere sottoposti a un controllo dell’integrazione con cobalamina e biotina per valutarne l’esito, fino al raggiungimento della diagnosi di PA. Si è rivelata utile l’integrazione con carnitina. Gli antibiotici orali aiutano a controllare le infezioni e, ipoteticamente, riducono i batteri intestinali, che producono acido propionico che può essere assorbito a livello intestinale e che contribuisce allo stress metabolico. È importante prevenire la stipsi. Nel corso dell’infanzia è indispensabile esercitare un controllo rigoroso. Raramente, in pazienti di età più avanzata con forme medie di PA non trattate non si sono riscontrati disturbi.

Poiché la diagnosi e la terapia per un disturbo metabolico come la PA sono complesse, è consigliabile che il pediatra gestisca il paziente in stretta collabora­zione con uno specialista delle malattie metaboliche pediatriche. È opportuno che i genitori portino sempre con sé una lettera con le linee guida del trattamento preparata dal medico che ha in cura il paziente.

EreditarietàQuesta patologia segue molto spesso un pattern ereditario autosomico recessivo. Nel caso di patologie recessive, i pazienti affetti devono avere due copie del gene patologico (o della mutazione) per mostrare i sintomi della malattia. I sog­getti con una sola copia del gene patologico (detti portatori) solitamente non mostrano segni o sintomi della condizione, ma possono trasmettere il gene pato­logico ai figli. Quando entrambi i genitori sono portatori del gene patologico di uno specifico disturbo, vi è il 25% di probabilità per ogni gravidanza che i figli siano affetti da tale disturbo.

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Deficit multiplo di carbossilasi (MCD)

CenniVi sono quattro enzimi carbossilasi che richiedono la biotina per la loro attività. Questi enzimi sono propionil­CoA carbossilasi, 3­metilcrotonil­CoA carbos­silasi, piruvato carbossilasi e acetil­CoA carbossilasi. Qualora il metabolismo della biotina presenti difetti, i quattro enzimi carbossilasi risulteranno deficitari. La biotina si lega con legame covalente a un residuo di lisina in ogni carbossilasi per l’azione dell’olocarbossilasi sintetasi. Quando le proteine con carbossilasi vengono degradate, il legame biotina­lisina è rotto dalla biotidinasi, rilasciando biotina libera che può essere riutilizzata. I due difetti nel metabolismo della biotina associati al deficit multiplo di carbossilasi (MCD) sono causati da un’insufficiente attività di olocarbossilasi sintetasi e biotinidasi. La comparsa dei disturbi clinici tende ad avvenire a età diverse; il deficit di olocarbossilasi sintetasi è considerato come deficit multiplo di carbossilasi precoce (neonatale), mentre il deficit di biotinidasi è considerato come deficit multiplo di carbossilasi a comparsa più tardiva. Entrambi i deficit rispondono all’integrazione con biotina. Si stima che MCD colpisca meno di 1 soggetto per 100.000 nati vivi.

Aspetti cliniciI pazienti affetti da deficit di olocarbossilasi sintetasi generalmente presentano, nei primi giorni o nelle prime settimane di vita, carenze nell’alimentazione, letargia, ipotonia e convulsioni, che talvolta conducono al coma. Possono anche essere presenti eruzioni cutanee e alopecia. Nei pazienti affetti si rilevano acidosi metabolica e moderata iperammoniemia. Per contro, il deficit di biotinidasi, che colpisce la gran parte dei pazienti con deficit multiplo di carbossilasi, solitamente compare dopo diversi mesi dalla nascita, con sintomi neurocutanei come ritardo nello sviluppo, ipotonia, convulsioni, atassia, perdita d’udito, alopecia ed eruzioni cutanee. In alcuni pazienti, può essere una patologia a rischio di vita.

Esami diagnosticiIl deficit di biotinidasi può essere prontamente rilevato mediante la misura zione dell’attività degli enzimi su macchie di sangue essiccato prelevato dal tallone. Lo screening neonatale con spettrometria di massa tandem può rivelare eleva zione di C5­idrossiacil­carnitina (C5­OH) da macchie di sangue essiccato prelevato dal tallone del paziente affetto da deficit multiplo di carbossilasi. Si ritiene inoltre indicativo per MCD il rapporto C5­OH/C8. La diagnosi di deficit di olocarbos­silasi sintetasi richiede ulteriori analisi. L’analisi degli acidi organici urinari rivela elevazioni di acido β­idrossi­isovalerico, β­metilcrotonilglicine e tiglilglicine.

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L’urina può anche contenere i metaboliti visti nel caso di deficit di propionil­CoA carbossilasi e di deficit di β­metilcrotonil­CoA carbossilasi. Ai fini di avviare il trattamento adeguato, è importante distinguere fra questi disturbi.

TrattamentoIl trattamento dei pazienti con MCD comporta la somministrazione di elevate dosi di biotina. Una risposta rapida e ottimale alla biotina è tipica di entrambi i deficit associati a MCD. Ciò evidenzia l’importanza di una valutazione diagnostica precisa e puntuale dei bambini malati.

Poiché la diagnosi e la terapia per MCD sono complesse, è consigliabile che il pediatra gestisca il paziente in stretta collaborazione con uno specialista delle malattie metaboliche pediatriche. È opportuno che i genitori portino sempre con sé una lettera con le linee guida del trattamento preparata dal medico che ha in cura il paziente.

EreditarietàQuesta patologia segue molto spesso un pattern ereditario autosomico recessivo. Nel caso di patologie recessive, i pazienti affetti devono avere due copie del gene patologico (o della mutazione) per mostrare i sintomi della malattia. I sog­getti con una sola copia del gene patologico (detti portatori) solitamente non mostrano segni o sintomi della condizione, ma possono trasmettere il gene pato­logico ai figli. Quando entrambi i genitori sono portatori del gene patologico di uno specifico disturbo, vi è il 25% di probabilità per ogni gravidanza che i figli siano affetti da tale disturbo.

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ALTERAZIONI DEGLI AMINOACIDI

Aciduria argininosuccinica/citrullinemiaCenniLa presenza di livelli elevati di citrullina nelle macchie di sangue essiccato dei neonati sottoposti a screening suggerisce la presenza di due deficit metabolici: deficit di acido argininosuccinico sintetasi o deficit di argininosuccinato liasi. Sono entrambe alterazioni del ciclo dell’urea e sono associate a iperam­moniemia grave episodica. Il deficit di acido argininosuccinico sintetasi (comunemente noto come citrullinemia) si verifica in 1 caso per 57.000 nascite e provoca una nettissima elevazione della citrullina plasmatica. Il deficit di argininosuccinato liasi provoca un aumento meno evidente della citrullina plasmatica, ma nondimeno risulta devastante sotto l’aspetto clinico. Si verifica in 1 caso per 70.000 nascite.

Aspetti cliniciEntrambe le forme di citrullinemia si presentano in modo simile. Nel caso di comparsa precoce, il neonato appare normale per le prime 24 ore. I sintomi si sviluppano in associazione con un peggioramento dell’iperammoniemia. Entro 72 ore generalmente compaiono letargia, difficoltà ad alimentarsi e vomito. Il paziente sviluppa ipotermia, alcalosi respiratoria e spesso necessita di ventila­zione. I pazienti non trattati vanno tipicamente incontro a coma e morte. L’esame fisico rivela encefalopatia, causata da edema cerebrale e alterazione degli astrociti da accumulo di glutammina e dalla conseguente ritenzione idrica. I pazienti con deficit di argininosuccinato liasi possono presentare epatomegalia. In questi pazienti spesso si diagnostica erroneamente la sepsi. Un’anomalia negli esami di laboratorio importante nel suggerire un’alterazione del ciclo dell’urea è un livello basso di azoto ureico nel sangue, che dovrebbe consigliare il dosaggio dell’ammonio. I pazienti che sopravvivono al periodo neonatale possono subire un ritardo neurologico. Questi pazienti con manifestazione precoce hanno episodi ricorrenti di iperammoniemia associati a infezioni virali o aumento dell’apporto proteico alimentare. In alcuni pazienti, colpiti da una o dall’altra delle due forme, la patologia si manifesta più tardivamente con un quadro meno grave, rendendo più difficoltosa la diagnosi.

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Esami diagnosticiLo screening neonatale con spettrometria di massa tandem su macchie di sangue essiccato può individuare livelli elevati di citrullina in entrambe le alterazioni. Si ritiene inoltre indicativo per ASA il rapporto citosina/arginina. I pazienti con deficit di argininsuccinato liasi presentano livelli misurabili di acido argininosuccinico nel sangue, mentre solitamente non viene individuato. L’attività di entrambi gli enzimi può essere analizzata mediante biopsia del fegato. Entrambi i geni sono stati isolati e le mutazioni identificate. Per la diagnosi prenatale si può effettuare l’analisi del DNA, nel caso in cui siano note le mutazioni per entrambi i genitori. Sono utili anche l’analisi biochimica delle colture di amniociti e dei villi corionici. La presenza di acido argininosuccinico nel liquido amniotico nel caso dei pazienti con deficit di argininosuccinato liasi è stata utilizzata per la diagnosi prenatale.

TrattamentoI sintomi della citrullinemia sembrano avere origine più dall’iperammoniemia che dall’accumulo di citrullina. L’iperammoniemmia acuta può richiedere emodialisi, che risulta più efficace per la riduzione dell’ammonio rispetto alla dialisi peritoneale o all’emofiltrazione arterovenosa. Si somministra sodio benzoato per coniugare la glicina, un aminoacido importante che contribuisce alla formazione di ammonio nel ciclo dell’urea, formando ippurato, che viene successivamente escreto con l’urina. La somministrazione endovenosa di arginina conduce alla diminuzione dell’ammonio aumentando la formazione di citrullina nei deficit di acido argininosuccinico sintetasi o argininosuccinato liasi. Entrambi i metaboliti vengono escreti nell’urina, inoltre si estrae l’azoto in eccesso dall’ammonio. I pazienti che sopravvivono alla manifestazione iniziale vengono sottoposti a limitazione dell’apporto proteico. I pazienti con uno dei due deficit con manifestazione della patologia nel periodo neonatale vanno incontro a esiti poco favorevoli e a rischi significativi di danno neurologico o morte.

Poiché la diagnosi e la terapia di queste alterazioni metaboliche sono complesse, è altamente consigliabile che il pediatra gestisca il paziente in stretta collabora­zione con uno specialista delle malattie metaboliche pediatriche. È opportuno che i genitori portino sempre con sé una lettera con le linee guida del trattamento preparata dal medico che ha in cura il paziente.

EreditarietàQueste patologie seguono molto spesso un pattern ereditario autosomico reces­sivo. Nel caso di patologie recessive, i pazienti affetti devono avere due copie del gene patologico (o della mutazione) per mostrare i sintomi della malattia.

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I soggetti con una sola copia del gene patologico (detti portatori) solitamente non mostrano segni o sintomi della condizione, ma possono trasmettere il gene patologico ai figli. Quando entrambi i genitori sono portatori del gene patologico di uno specifico disturbo, vi è il 25% di probabilità per ogni gravidanza che i figli siano affetti da tale disturbo.

Omocistinuria (HCY)

CenniLa presenza di livelli elevati di metionina nelle macchie di sangue essiccato di neonato sottoposto a screening suggerisce la presenza di due deficit metabolici: 1) omocistinuria dovuta a deficit di cistationina β­sintasi (CBS) o 2) deficit di metionina adenosiltransferasi epatica. L’alterazione più probabile è un deficit di CBS, che provoca una patologia del tessuto connettivo con diverse manifestazioni. Dal primo evento riferito nel 1962, sono stati descritti molti casi di pazienti con omocistinuria. La metionina si accumula all’inizio di una via metabolica che converte sequenzialmente questo aminoacido in omocisteina, cistationina e cisteina. La fase del ciclo che converte omocisteina in cistationina è catalizzata da CBS. Anche nel caso in cui il suo livello sia molto elevato, l’omocisteina non viene rilevata in sede di screening neonatale a causa della sua natura reattiva con molti componenti del sangue, compresa essa stessa, con la formazione del dimero cistina. L’elevazione della metionina è perciò utilizzata per individuare questa alterazione nello screening neonatale. L’incidenza del deficit di CBS è di circa 1 caso per 60.000, benché molti ricercatori ritengano che sia più diffuso.

Aspetti cliniciNonostante il deficit metabolico sia presente alla nascita, i sintomi iniziali di omocistinuria compaiono solitamente più tardi nel periodo neonatale e nell’in­fanzia. Il ritardo nello sviluppo può essere il primo segno ed è l’indica zione di disabilità intellettuale, ma non sempre. Un’evidenza precoce e distintiva è lo spostamento del cristallino dell’occhio (ectopia lentis). Il rischio per i pazienti di sviluppare tromboembolismo in età successiva è molto alto. Ciò può condurre a ictus, convulsioni, sequela neurologica permanente e morte. L’aumento della capacità di coagulazione mette a rischio le soluzioni chirurgiche. L’osteoporosi è una complicanza a lungo termine dell’omocistinuria.

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Esami diagnosticiLo screening neonatale con spettrometria di massa tandem su macchie di sangue essiccato rivela elevazione dei livelli di metionina, che deve indurre prontamente ad analisi del sangue per gli aminoacidi, compresa l’omocisteina. Livelli elevati di metionina e omocisteina nel sangue indicano deficit di CBS, mentre un aumento isolato della metionina suggerisce deficit di metionina adenosiltransferasi epatica. Si ritiene inoltre indicativo per HCY il rapporto metionina/fenilalanina. Nei pazienti affetti, la presenza di omocisteina nell’urina viene costantemente rilevata, soprattutto dopo la prima infanzia. L’attività dell’enzima CBS può essere misurata in molti tessuti, compresi fibroblasti, linfociti, fegato, amniociti e villi corionici (biopsia o colture cellulari). L’attività enzimatica deficitaria può essere seguita mediante analisi delle mutazioni del DNA per diverse mutazioni note del gene CBS.

TrattamentoIl trattamento del deficit CBS solitamente inizia con uno studio dell’integrazione orale con vitamina B6 (pirossidina), con dosaggi quotidiani degli aminoacidi plasmatici. CBS richiede pirossidina come coenzima per l’attività enzimatica. Nel complesso, circa il 25% dei pazienti risponde a forti dosi di piridossina, benché la percentuale possa risultare inferiore per i pazienti identificati tramite screening neonatale. La risposta alla pirossidina solitamente coincide con la presenza di una residua attività enzimatica. Una dieta con limitazione della metionina in combinazione con integrazione di cistina rimedia in una certa misura alle alterazioni biochimiche e pare ridurre i sintomi clinici. Sono dispo­nibili in commercio preparati specifici a questo scopo, ma è difficile mantenere la dieta a lungo termine. Nel tentativo di diminuire i livelli di omocisteina, si può seguire un’integrazione con acido folico e betaina per indurre il riciclo di questo aminoacido in metionina per vie metaboliche alternative. Può anche essere utile la vitamina B12 (cobalamina).

Poiché la diagnosi e la terapia per omocistinuria sono complesse, è consigliabile che il pediatra gestisca il paziente in stretta collaborazione con uno specialista delle malattie metaboliche pediatriche. È opportuno che i genitori portino sempre con sé una lettera con le linee guida del trattamento preparata dal medico che ha in cura il paziente.

EreditarietàQuesta patologia segue molto spesso un pattern ereditario autosomico recessivo. Nel caso di patologie recessive, i pazienti affetti devono avere due copie del gene patologico (o della mutazione) per mostrare i sintomi della malattia.

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I soggetti con una sola copia del gene patologico (detti portatori) solitamente non mostrano segni o sintomi della condizione, ma possono trasmettere il gene patologico ai figli. Quando entrambi i genitori sono portatori del gene patologico di uno specifico disturbo, vi è il 25% di probabilità per ogni gravidanza che i figli siano affetti da tale disturbo.

Malattia delle urine a sciroppo d’acero (MSUD)

CenniLa malattia delle urine a sciroppo d’acero (MSUD) è stata descritta per la prima volta nel 1954, in una famiglia con quattro nascite successive affette da questa patologia. Tutti i figli sono morti con patologie neurologiche progressive nelle prime settimane di vita. MSUD è causata da un deficit nella capacità di decarbossilazione degli aminoacidi a catena ramificata. Tale attività enzimatica risiede nel complesso alfa­chetoacido deidrogenasi a catena ramificata, nella membrana mitocondriale. Si stima che MSUD colpisca meno di 1 soggetto per 100.000 nati vivi, ma nel gruppo dei mennoniti del vecchio ordine (Old Order Mennonites) l’incidenza sale a 1 per 176.

Aspetti cliniciLa forma più comune di MSUD si presenta con sintomi gravissimi nei primi giorni di vita. I pazienti appaiono normali alla nascita, ma iniziano ad avere difficoltà a nutrirsi, con vomito, per poi progredire verso coma e morte. Il neonato può piangere in modo acuto, mentre dai pannolini può emanare un odore simile a quello dello sciroppo d’acero. Generalmente è presente acidosi metabolica con gap anionico e si rilevano aminoacidi plasmatici a catena ramificata (leucina, isoleucina e valina). Può verificarsi ipoglicemia. Il deterioramento neurologico è progressivo e rapido. L’edema cerebrale conduce all’encefalopatia che provoca stati alterni di ipertonia e ipotonia, atteggiamento a forbice delle gambe, opistotono, anomalie respiratorie, coma e morte. Nei pazienti che sopravvivono a questo periodo, qualsiasi infezione o stress metabolico possono avere esito fatale. Sono state riferite altre presentazioni meno acute, compresa una forma intermittente con atassia e acidosi episodiche, e una forma media, intermedia, più cronica con acidosi meno grave. In tutte le forme di MSUD, i sintomi neurologici sono tipicamente evidenti entro i due anni di età. Le diverse mutazioni del complesso alfa­chetoacido deidrogenasi a catena ramificata e la residua capacità metabolica di un dato soggetto danno origine a fenotipi variabili.

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Esami diagnosticiMediante lo screening neonatale con spettrometria di massa tandem su macchie di sangue essiccato si perviene al dosaggio di valina e della somma di leucina, isoleucina e alloisoleucina, gli aminoacidi ramificati. Si è rilevato che anche i rapporti valina/fenilalanina, (leucina+isoleucina)/fenilalanina e (leucina+isoleucina)/alanina sono indicativi per MSUD. Leucina, isoleucina e valina sono aminoacidi essenziali che vanno introdotti mediante l’alimenta zione. Nei soggetti colpiti da MSUD, tali aminoacidi non vengono metabolizzati (decarbossilati) e si accumulano raggiungendo livelli molto elevati; i livelli più alti sono raggiunti dalla leucina. La decarbossilazione ossidativa è il secondo passaggio del processo metabolico degradativo, che in presenza di MSUD viene bloccato con il conseguente accumulo di tre acidi organici (2­oxo­isocaproico dalla leucina, 2­oxo­3­metilvalerico dalla isoleucina e 2­oxo­isovalerico dalla valina) che risultano presenti a livelli elevati nelle urine dei pazienti affetti. Durante una crisi, il paziente risulta acidotico per via dei livelli elevati di acidi organici e lattato, e generalmente chetotico. La diagnosi di MSUD si basa sul dosaggio degli aminoacidi ramificati plasmatici e dell’alloisoleucina, e sull’individuazione di anomalie negli acidi organici urinari. Il deficit dell’attività enzimatica del complesso alfa­chetoacido deidrogenasi a catena ramificata può essere analizzato in colture di fibroblasti. La diagnosi prenatale può essere eseguita mediante il dosaggio dell’attività enzimatica nelle cellule di villi corionici o in colture di amniociti.

TrattamentoIl trattamento spesso inizia con interventi aggressivi nel corso di una crisi meta­bolica acuta. L’emodialisi, se disponibile, può ridurre i livelli plasmatici di aminoacidi a catena ramificata e acidi organici. Un’abbondante somministra­zione endovenosa di liquidi aiuta a eliminare gli acidi organici per via renale. Il glucosio per endovena fornisce una fonte di energia alternativa che riduce il catabolismo proteico, una fonte importante di aminoacidi ramificati nei neonati in fase acuta. La limitazione dell’apporto proteico alimentare si rende solitamente necessaria per tutta la vita; sono disponibili in commercio preparati a basso contenuto di aminoacidi ramificati. L’integrazione con carnitina è utile per la rimozione degli acidi organici e per la ricostituzione delle scorte di carnitina. Alcuni pazienti rispondono a integrazione ad alto dosaggio di tiamina, un cofattore del complesso enzimatico: tutti i neonati a cui venga diagnosticata questa alterazione andrebbero trattati con questa vitamina. Per ridurre morbosità e mortalità, è necessario un rigoroso monitoraggio dei pazienti che sopravvivono al periodo prenatale o in cui la patologia si manifesta successivamente.

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Poiché la diagnosi e la terapia per MSUD sono complesse, è consigliabile che il pediatra gestisca il paziente in stretta collaborazione con uno specialista delle malattie metaboliche pediatriche. È opportuno che i genitori portino sempre con sé una lettera con le linee guida del trattamento preparata dal medico che ha in cura il paziente.

EreditarietàQuesta patologia segue molto spesso un pattern ereditario autosomico recessivo. Nel caso di patologie recessive, i pazienti affetti devono avere due copie del gene patologico (o della mutazione) per mostrare i sintomi della malattia. I soggetti con una sola copia del gene patologico (detti portatori) solitamente non mostrano segni o sintomi della condizione, ma possono trasmettere il gene patologico ai figli. Quando entrambi i genitori sono portatori del gene patologico di uno specifico disturbo, vi è il 25% di probabilità per ogni gravidanza che i figli siano affetti da tale disturbo.

Fenilchetonuria (PKU)

CenniLa fenilchetonuria (PKU) è un’alterazione del metabolismo degli aminoacidi riconosciuta come deficit genetico fin dal 1930. La fenilalanina è un aminoacido essenziale che viene convertito in tirosina dall’azione dell’enzima fenilalanina idrossilasi. Un blocco in questa reazione causato da un’attività inadeguata di fenilalanina idrossilasi provoca PKU e induce sintomi gravi a carico del sistema nervoso centrale. La fenilalanina idrossilasi richiede tetraidrobiopterina come cofattore e anche un suo deficit, causato da un’alterazione enzimatica nella sintesi o nel riciclo di tetraidrobiopterina, può provocare PKU. L’incidenza di PKU nella popolazione caucasica è di circa 1 per 12.000. Storicamente, lo screening neonatale ha avuto inizio con Robert Guthrie, il medico che sviluppò un test per rilevare l’aumento di fenilalanina (PKU) in macchie di sangue essiccato.

Aspetti cliniciI bambini con PKU generalmente appaiono normali alla nascita nel periodo neonatale. In un secondo momento, i neonati possono manifestare irritabilità, anomalie posturali, aumento dei riflessi profondi dei tendini, un caratteristico odore “di topo” e vomito. Generalmente si ha pigmentazione pallida di capelli e pelle e a volte sono presenti convulsioni. La fenilalanina si accumula nei primi giorni di vita e i livelli di tirosina tendono a essere bassi. Benché siano presenti diversi metaboliti della fenilalanina, la stessa fenilalanina risulta essere

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la molecola tossica in caso di PKU. I livelli elevati di fenilalanina impediscono il trasporto di altri aminoacidi attraverso la barriera emato­encefalica, inibendo la sintesi di neurotrasmettitori fondamentali e compromettendo la sintesi proteica cerebrale. Ciò provoca grave disabilità intellettiva e patologie a carico della materia bianca.

Le donne non trattate affette da PKU in stato di gravidanza presentano un rischio alto di avere figli con danno neurologico. Ciò è causato dai livelli elevati di fenilalanina nella madre non trattata che attraversano la placenta durante la gravidanza e che sono tossici per il feto che si sta sviluppando. Le madri affette da PKU devono sottoporsi a controllo dietologico prima del concepimento, per evitare gli effetti tossici della fenilalanina sui loro figli.

Esami diagnosticiLo screening neonatale per la PKU è iniziato con analisi biologiche della carica batterica. In seguito si è conseguita una maggiore sensibilità mediante l’imple­mentazione di metodi fluorimetrici e della spettrometria di massa tandem. Quest’ultima tecnologia consente di determinare i livelli sia di fenilalanina sia di tirosina, evidenziando livelli elevati di fenilalanina in combinazione con un aumento del rapporto fenilalanina/tirosina, che è indicativo di PKU. Questa metodologia assicura efficacia, affidabilità ed efficienza dello screening per PKU. Diverse centinaia di mutazioni a carico del gene fenilalanina idrossilasi possono causare PKU (98% dei casi), così come le mutazioni di altri geni necessari per la produzione di tetraidrobioproteina (2% dei casi). In tutti i neonati con PKU vanno verificate le alterazioni per tetraidrobioproteina. L’iperalimentazione con integrazione di aminoacidi per via parenterale genera livelli elevati di fenilalanina nei neonati non colpiti da PKU, tuttavia il rapporto fenilalanina/tiosina non è elevato. In alcuni neonati sono presenti mutazioni in fenilalanina idrossilasi che causano media iperammoniemia e nessuna patologia neurologica grave.

TrattamentoNei pazienti con PKU è necessario mantenere livelli normali, fisiologici di feni­lalanina e tirosina per tutta la vita. Studi hanno dimostrato che periodi con fenilalanina elevata colpiscono lo sviluppo e le funzioni cerebrali. Nei pazienti con diagnosi di PKU è opportuno iniziare il regime dietetico il prima possibile. Sono disponibili in commercio vari preparati per PKU e alimenti con ridotto apporto di fenilalanina. La fenilalanina (e la tirosina) va controllata con regolarità per assicurare il corretto regime alimentare.

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Poiché la diagnosi e la terapia per PKU sono complesse, è consigliabile che il pediatra gestisca il paziente in stretta collaborazione con uno specialista delle malattie metaboliche pediatriche e un dietologo. È opportuno che i genitori portino sempre con sé una lettera con le linee guida del trattamento preparata dal medico che ha in cura il paziente.

EreditarietàQuesta patologia segue molto spesso un pattern ereditario autosomico recessivo. Nel caso di patologie recessive, i pazienti affetti devono avere due copie del gene patologico (o della mutazione) per mostrare i sintomi della malattia. I sog­getti con una sola copia del gene patologico (detti portatori) solitamente non mostrano segni o sintomi della condizione, ma possono trasmettere il gene pato­logico ai figli. Quando entrambi i genitori sono portatori del gene patologico di uno specifico disturbo, vi è il 25% di probabilità per ogni gravidanza che i figli siano affetti da tale disturbo.

Tirosinemia tipo I (TYR I)

CenniNelle tre alterazioni ereditarie del metabolismo della tirosina sono presenti livelli elevati di tirosina nel sangue. La tirosinemia di tipo I è stata descritta nel 1957 ed è causata da un deficit di fumarilaceto­acetato idrolasi (FAH). Benché fra i pazienti prevalgano quelli di origine franco­canadese o scandinava, questa alterazione è stata diagnosticata anche in individui di altri gruppi etnici. Complessivamente, si stima che TYR I colpisca meno di 1 soggetto per 100.000 nati vivi, ma tra i franco­canadesi l’incidenza sale a 1 per 12.500.

Aspetti cliniciTYR I generalmente si manifesta nei primi mesi di vita, con sintomi epatorenali progressivi. I neonati presentano deficit della crescita, epatomegalia, disfunzioni epatiche, oltre ad acidosi metabolica e disturbi elettrolitici dovuti a disfunzione tubulare renale (sindrome di Fanconi). La diminuita capacità di biosintesi del fegato, che risulta in una diminuzione dei fattori di coagulazione e in diatesi emorragica, spesso precede netti aumenti delle transaminasi sieriche. La patologia epatica progredisce fino a cirrosi, collasso epatico e morte nei pazienti non diagnosticati. In qualsiasi momento, i pazienti possono sviluppare crisi epatiche acute con asciti, ittero ed emorragie gastrointestinali. Possono verificarsi episodi neurologici di parestesie dolorose, debolezza, paralisi e insufficienza

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respiratoria. Esiste un alto rischio di sviluppo di noduli epatici e carcinoma epatocellulare. Molti pazienti non trattati muoiono durante la prima infanzia o l’infanzia. I pazienti con patologia di tipo I non soffrono di disabilità intellettiva.

Esami diagnosticiI livelli di tirosina e succinilacetone sono rapidamente misurati mediante lo screening neonatale con spettrometria di massa tandem su macchie di sangue essiccato. Si è rilevato che anche il rapporto tirosina/citosina è indicativo per TYR I. Aumenti dei livelli da medi a moderati per la tirosina che diminuiscono e rientrano nella norma nel corso dei controlli di follow­up sono tipici della tirosinemia transitoria del neonato. Questo aumento transitorio è una caratt eris­tica associata a immaturità o disfunzione del fegato.

Livelli elevati di tirosina o presenza di succinilacetone possono indicare un deficit metabolico ereditario. La gestione di questi pazienti comprende il dosaggio degli aminoacidi plasmatici e il controllo del succinilacetone mediante analisi degli acidi organici urinari. Nei casi di TYR I è stato riscontrato aumento dei livelli di tirosina plasmatica, spesso con metionina e talvolta con amino­acidemia generalizzata. La presenza di succinilacetone nell’urina è patognomico per la patologia di tipo I. Nei pazienti con TYR I l’attività di FAH è deficitaria in linfociti, eritrociti e tessuto epatico. La diagnosi prenatale per TYR I può essere eseguita mediante l’individuazione del succinilacetone nel liquido amniotico e del deficit di attività di FAH nelle cellule di villi corionici o in colture di amniociti.

TrattamentoLa normalizzazione dei livelli di tirosina è accelerata mediante integrazione dietetica con vitamina C. È necessario trattare aggressivamente i pazienti con l’alterazione di tipo I mediante limitazione dell’apporto alimentare di tirosina e fenilalanina e somministrazione di 2(2­nitro­4­trifluorometilbenzoil)­1,3­cicloesandione (NTBC). Questo farmaco inibisce 4HPPD e abbassa il livello dei metaboliti della tirosina che sono responsabili per la gran parte della morbosità associata alla patologia di tipo I. Il trapianto del fegato è un’opzione per la terapia dei pazienti con la patologia di tipo I, portando a una normale attività di FAH.

Poiché la diagnosi e la terapia per la tirosinemia sono complesse, è consigliabile che il pediatra gestisca il paziente in stretta collaborazione con uno specialista delle malattie metaboliche pediatriche. È opportuno che i genitori portino sempre con sé una lettera con le linee guida del trattamento preparata dal medico che ha in cura il paziente.

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EreditarietàQuesta patologia segue molto spesso un pattern ereditario autosomico recessivo. Nel caso di patologie recessive, i pazienti affetti devono avere due copie del gene patologico (o della mutazione) per mostrare i sintomi della malattia. I sog­getti con una sola copia del gene patologico (detti portatori) solitamente non mostrano segni o sintomi della condizione, ma possono trasmettere il gene pato­logico ai figli. Quando entrambi i genitori sono portatori del gene patologico di uno specifico disturbo, vi è il 25% di probabilità per ogni gravidanza che i figli siano affetti da tale disturbo.

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Deficit di biotinidasi

CenniLa biotina fa parte del complesso della vitamina B che funziona nell’organismo come cofattore per quattro enzimi carbossilasi. Quando la biotina si lega con legame covalente a un residuo di lisina nelle carbossilasi, gli enzimi vengono attivati. Quando gli enzimi carbossilasi sono degradati, viene prodotta biotinil­lisina. Successivamente la biotinidasi idrolizza la biotinil­lisina con rilascio di biotina libera, che può essere riciclata e resa disponibile per attivare nuovi enzimi carbossilasi sintetizzati. In assenza della normale attività della biotinidasi, il paziente sviluppa deficit funzionale di biotina e i suoi sintomi clinici. Il deficit di biotinidasi è anche noto come deficit multiplo di carbossilasi a insorgenza tardiva, distinguendolo da un’altra forma a insorgenza precoce causata da deficit di olocarbossilasi sintetasi.

Aspetti cliniciI neonati con deficit di biotinidasi possono apparire normali alla nascita. Il deficit di biotina si sviluppa nel corso del tempo con sintomi clinici che si manifestano in un periodo compreso fra le prime settimane e alcuni anni di età. I pazienti non trattati sviluppano chetoacidosi metabolica e aciduria organica. I sintomi comprendono atassia, ipotonia, ritardo nello sviluppo, congiuntivite, eritemi cutanei e alopecia, convulsioni, perdita d’udito, problemi respiratori e atrofia ottica. La manifestazione di questi sintomi è variabile, probabilmente per via dell’apporto di biotina con l’alimentazione e del grado di attività enzimatica residua di biotinidasi. Il deficit parziale di biotinidasi si manifesta come una patologia meno grave in molti pazienti, che presentano principalmente i sintomi cutanei, soprattutto quando sono sotto stress metabolico.

Esami diagnosticiMediante lo screening neonatale su macchie di sangue essiccato per l’attività di biotinidasi è possibile identificare i pazienti affetti entro breve tempo dalla nascita. Possono essere individuati sia i deficit completi sia quelli parziali. La diagnosi viene confermata mediante l’analisi dell’attività sierica di biotinidasi o del DNA per individuare i genotipi più comuni. Nei casi di sintomatologia clinica, l’analisi delle urine mediante cromatografia gassosa/spettrometria di massa consentirà di identificare l’aumento di β­idrossiisovalerato, lattato,

ALTRE ALTERAZIONI

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β­metilcrotonilglicina, β­idrossipropionato e metilcitrato. Questi componenti si accumulano a causa dell’inattività dei quattro enzimi che richiedono biotina.

TrattamentoIl deficit di biotinidasi è trattato con integrazione orale di biotina, che previene lo sviluppo dei sintomi clinici.

Poiché la diagnosi e la terapia dei disturbi metabolici sono complesse, è consi­gliabile che il pediatra gestisca il paziente in stretta collaborazione con uno specialista delle malattie metaboliche pediatriche. È opportuno che i genitori portino sempre con sé una lettera con le linee guida del trattamento preparata dal medico che ha in cura il paziente.

EreditarietàQuesta patologia segue molto spesso un pattern ereditario autosomico recessivo. Nel caso di patologie recessive, i pazienti affetti devono avere due copie del gene patologico (o della mutazione) per mostrare i sintomi della malattia. I sog­getti con una sola copia del gene patologico (detti portatori) solitamente non mostrano segni o sintomi della condizione, ma possono trasmettere il gene pato­logico ai figli. Quando entrambi i genitori sono portatori del gene patologico di uno specifico disturbo, vi è il 25% di probabilità per ogni gravidanza che i figli siano affetti da tale disturbo.

Fibrosi cistica (CF)

CenniLa fibrosi cistica (CF) è stata riconosciuta per la prima volta come entità clinica nel 1938. La sua natura genetica e il suo pattern ereditario autosomico recettivo sono stati descritti nel 1946. Nel 1948, nei pazienti con CF si osservò la perdita di sali in eccesso con la sudorazione, scoperta che portò allo sviluppo del test del sudore di cloruro (un test diagnostico tuttora in uso). La documentazione delle manifestazioni cliniche (insufficienza pancreatica e infezioni batteriche endobronchiali) nel corso degli ultimi tre decenni hanno condotto a diagnosi più tempestive. Negli anni Ottanta, si mettevano in relazione a CF i problemi del trasporto epiteliale del cloruro. Alla fine degli Ottanta, si associava al CF l’aumento dei livelli di IRT (tripsinogeno immunoreattivo pancreatico) nel sangue dei neonati. Infine, nel 1989, furono identificate muta zioni del DNA a carico del cromosoma 7 correlate con CF. Il gene prodotto vene definito CFTR (regolatore transmembranico di conduttanza della fibrosi cistica). Durante

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gli anni Novanta, si sono approfondite le conoscenze della funzione di CFTR e della patofisiologia di CF. Nel breve periodo sono seguiti miglioramenti decisivi nella tempestività della diagnosi e nel trattamento.

Aspetti cliniciSono state identificate più di 1600 mutazioni a carico del gene CFTR e, benché alcune mutazioni siano spesso associate a gravi conseguenze successive, anche fratelli con mutazioni di CF identiche possono avere decorsi clinici radical­mente differenti. La CF può colpire i polmoni e le vie respiratorie superiori, il tratto gastrointestinale, il pancreas, il fegato, le ghiandole sudoripare e il tratto genito­urinario. Anche anomalie dell’alimentazione secondarie a insufficienza pancreatica sono conseguenze prevedibili per la crescita e lo sviluppo. Le disfunzioni organiche possono presentarsi in età diverse e il progresso della patologia è altamente variabile. Benché la CF sia una patologia multisistemica, il coinvolgimento dei polmoni è decisamente la principale causa di morbosità e mortalità.

Esami diagnosticiMediante lo screening iniziale neonatale di campioni di sangue si misura l’IRT. Questo prodotto del pancreas esocrino e significativamente più alto in oltre il 90% dei neonati affetti. L’aumento di IRT deve indurre a una tempestiva valutazione genetica o a un test del sudore per confermare la diagnosi. Se il paziente in esame presenta ileo da meconio o altra ostruzione intestinale, lo screening per IRT non è affidabile e vanno presi in considerazione ulteriori controlli o test diagnostici, secondo quanto indicato.

TrattamentoLa diagnosi precoce mediante screening neonatale ha consentito di mettere a punto sia terapie tempestive combinate antinfiammatorie e antibiotiche per combattere le infezioni delle vie respiratorie superiori, sia un’integrazione alimentare per evitare deficit nutritivi. Sono stati conseguiti progressi notevoli nel miglioramento della qualità della vita di questi neonati.

Poiché la diagnosi e la terapia per la fibrosi cistica sono complesse, è consigliabile che il pediatra gestisca il paziente in stretta collaborazione con uno pediatra specialista delle malattie polmonari. È opportuno che i genitori portino sempre con sé una lettera con le linee guida del trattamento preparata dal medico che ha in cura il paziente.

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EreditarietàQuesta patologia segue molto spesso un pattern ereditario autosomico recessivo. Nel caso di patologie recessive, i pazienti affetti devono avere due copie del gene patologico (o della mutazione) per mostrare i sintomi della malattia. I sog­getti con una sola copia del gene patologico (detti portatori) solitamente non mostrano segni o sintomi della condizione, ma possono trasmettere il gene pato­logico ai figli. Quando entrambi i genitori sono portatori del gene patologico di uno specifico disturbo, vi è il 25% di probabilità per ogni gravidanza che i figli siano affetti da tale disturbo.

Deficit di glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD)

CenniL’attività di glucosio­6­fosfato deidrogenasi (G6PD) avviene in tutto l’organismo, ma il suo deficit manifesta gli effetti prevalentemente a carico dei globuli rossi. Il G6PD ancora la produzione di NADPH e glutatione per la protezione dell’organismo dai danni ossidativi. Gli eritrociti sono particolarmente sensibili al danno ossidativo. Il deficit di G6PD può causare ittero nei neonati e reazioni a rischio di vita a diversi farmaci, alimenti e infezioni. Il deficit di G6PD colpisce 400 milioni di persone in tutto il mondo ed è la più diffusa deficienza genetica enzimatica nell’uomo. Le informazioni su popolazione ed epidemiologia sembrano indicare che il deficit di G6PD favorisca una certa resistenza alla malaria.

Aspetti cliniciI neonati con deficit di G6PD possono apparire normali alla nascita. Possono manifestare ittero neonatale ed emolisi, talvolta così gravi da provocare danno neurologico o anche la morte. A parte queste gravi complicanze del periodo neonatale, i bambini con deficit di G6PD generalmente hanno una crescita e uno sviluppo nella norma. L’esposizione a determinati farmaci antimalarici e solfonammidi, lo stress da infezioni (come le infezioni delle vie respiratorie superiori o del tratto gastrointestinale), gli agenti ambientali (ad esempio palline antitarme) e il consumo di certi alimenti (ad esempio le fave), ciascuno dei quali influisce sulla capacità del paziente di gestire le reazioni ossidative, possono causare anemia emolitica acuta. Per contro, test uniformi condotti per molti anni dalle forze armate degli USA non hanno individuato alcun effetto avverso di deficit di G6PD nei maschi affetti dalla patologia per quanto concerne il loro stato di salute o le loro prestazioni militari, se sottoposti alle cure e alle limitazioni del caso.

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Esami diagnosticiLo screening neonatale per il deficit di G6PD può essere eseguito mediante analisi enzimatica o screening primario del DNA. Per la diagnosi del deficit di G6PD è opportuno eseguire test di conferma mediante studi quantitativi.

TrattamentoI bambini con deficit di G6PD possono avere un rischio maggiore patologico di ittero neonatale e possono richiedere uno stretto monitoraggio per le complicanze associate durante il periodo neonatale. Per il resto, il trattamento per il deficit di G6PD si basa sull’evitare i rischi connessi. Per i bambini, ciò significa evitare diversi farmaci prescritti di routine per infezioni e malattie. È inoltre necessario un attento controllo degli ingredienti degli alimenti preparati e dei pasti nei ristoranti, perché le fave sono un ingrediente spesso impiegato nella preparazione dei cibi. Si deve evitare l’esposizione dei pazienti alle palline antitarme contenenti naftalina. Gli effetti avversi delle infezioni sui pazienti con deficit di G6PD possono essere acuti e a rischio di vita. Uno sforzo eccessivo, causato da esercizio o da lavoro, che provochi disidratazione e ipoglicemia può scatenare sintomi clinici. Come detto in precedenza, i pazienti consapevoli di tali limitazioni possono condurre un’esistenza normale sia per l’attività fisica sia per le scelte di vita.

Poiché la diagnosi e la terapia di questo disturbo sono complesse, è consigliabile che il pediatra gestisca il paziente in stretta collaborazione con uno specialista in ematologia pediatrica. È opportuno che i genitori portino sempre con sé una lettera con le linee guida del trattamento preparata dal medico che ha in cura il paziente.

EreditarietàIl deficit di G6PD viene ereditato come difetto legato al cromosoma X. Sono colpiti i maschi con mutazione per deficit di G6PD del cromosoma X. Le femmine con una mutazione per deficit di G6PD sono portatrici con un rischio del 50% di trasmettere la deficienza di G6PD del cromosoma X a un figlio maschio. Trattandosi di un difetto legato al cromosoma X, si potrebbe generalmente ritenere che il deficit di G6PD si presenti solo nei maschi. Tuttavia, anche le femmine con mutazione per deficit di G6PD su entrambi i cromosomi X presentano sintomi clinici. Si sono riscontrati sintomi anche in alcune femmine portatrici. Perciò tutti i membri di una famiglia identificata dovrebbero sottoporsi a test G6PD e consulto genetico. Il rischio di gravidanza con figlio maschio affetto è di una su due per le portatrici femmine. Il deficit di G6PD viene riscontrato nelle popolazioni in aree del mondo in cui è diffusa la malaria.

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Iperplasia surrenale congenita (CAH)

CenniLa carenza di uno dei cinque enzimi necessari nella via steroidogenica per la biosintesi del cortisolo (idrocortisone) dà origine a un gruppo di malattie collettivamente note come iperplasia surrenale congenita (CAH). Le patologie sono ereditarie come disturbi autosomici recessivi. Come risultato della com promissione della sintesi di cortisolo da parte della corteccia surrenale, si verifica una secrezione eccessiva dall’ipofisi di ormone adrenocorticotropo (ACTH), o corticotropina, che stimola la corteccia surrenale a sintetizzare e secernere più cortisolo. Lo stimolo dell’ACTH causa iperplasia diffusa delle ghiandole surrenali e generalmente la patologia viene riconosciuta durante l’infanzia. Più del 90% dei casi di CAH è causato da attività ridotta o assente dell’enzima steroide 21­idrossilasi, noto come CYP21 o CAH classico. Questa forma di CAH si manifesta nella prima infanzia, nell’infanzia o nell’adolescenza, a seconda della gravità della compromissione dell’attività enzimatica. Nei casi gravi, un’attività molto bassa di CYP21 provoca una bassa secrezione di aldoste­rone, perdita di sali e ipovolemia. In associazione con ipotensione e ipoglicemia da deficit di cortisolo, ciò dà origine a morte neonatale durante il primo mese di vita se non viene riconosciuto e trattato adeguatamente. Poiché il processo di sintesi androgenica non richiede attività di CYP21, ne consegue un eccesso nella secrezione di androgeni e la virilizzazione dal feto femmina con vari gradi di ambiguità sessuale alla nascita.

Aspetti cliniciI bambini maschi con CAH sono normali alla nascita. Nei casi gravi, la perdita di sali diviene evidente entro i primi 7–10 giorni. Entro 2–3 settimane, si manifestano deficit della crescita, vomito inspiegabile, difficoltà ad alimentarsi, ipovolemia e shock. La stessa sequenza di sintomi si sviluppa nelle bambine non trattate con CAH, ma la virilizzazione con ambiguità sessuali alla nascita conduce in molti pazienti a una diagnosi precoce di CAH e a trattamenti adeguati. Tuttavia, i soggetti femmine con una completa virilizzazione alla nascita si presentano come maschi con criptorchidismo bilaterale. In tale presentazione, la diagnosi di CAH può non essere fatta e può essere assegnato il sesso sbagliato. Circa il 75% dei bambini con CYP21 soffre di CAH con perdita di sali. Le forme meno gravi di CAH, la cosiddetta CAH virilizzante semplice, presentano secrezione di aldosterone nella norma e virilizzazione nelle neonate, ma la diagnosi nei maschi può non essere evidente fino all’infanzia, quando l’eccesso di androgeni provoca precocità sessuale senza ingrandimento testicolare. La diagnosi tardiva è caratterizzata inizialmente da una netta

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maturazione scheletrica avanzata e una crescita lineare accelerata, ma da una pubertà naturale precoce e in ultima istanza da una bassa statura. Nelle forme meno gravi di CAH (deficit di 21­idrossilasi attenuato o a insorgenza tardiva), la secrezione sia di cortisolo sia di aldosterone sono nella norma, ma a spese di un eccesso cronico da medio a moderato di produzione di ormoni androgenici. Questi bambini presentano, durante l’infanzia o l’adolescenza, una crescita precoce di peluria pubica (pubarca prematuro), e/o irsutismo, oligomenorrea e acne nelle femmine, o infertilità in entrambi i sessi.

Esami diagnosticiLo steroide precursore immediato di CAH classico e il substrato per CYP21 è il 17­idrossiprogesterone (17­OHP). Il dosaggio di 17­OHP da campioni di sangue dei neonati può distinguere i neonati con CAH virilizzante semplice o con perdita di sali da quelli non affetti. Il test per lo screening neonatale solita­mente non individua i pazienti con forme attenuate o con CAH non classico a insorgenza tardiva. Quando i valori superano la soglia normale, si ripete l’analisi del 17­OHP utilizzando l’estrazione organica per rimuovere le sostanze di disturbo. I valori normali di 17­OHP variano a seconda del peso alla nascita e dell’età gestazionale, e i valori di cut­off vanno regolati di conseguenza.

I test di conferma sierologici includono la ripetizione per i valori di 17­OHP, altri steroidi precursori per verificare che un valore lievemente elevato di 17­OHP non sia causato da altra forma di CAH (ad esempio deficit di 11­idrossilasi) e test per la perdita dei sali, come sodio e potassio sierici, e per l’attività della renina. È anche disponibile un test del DNA di conferma.

TrattamentoL’idrocortisone per via orale con un dosaggio adeguato alla secrezione fisio logica è il trattamento di elezione per CAH. I glucocorticoidi, più potenti, sono contro­indicati in bambini e adolescenti in fase di crescita per la difficoltà di stabilire la differenza fra dosaggio fisiologico e farmacologico. Nei bambini con CAH con perdita di sale, il 9­fluoro­idrocortisone dovrebbe mantenere un normale equili­brio elettrolitico senza gli effetti eccessivi di natriuretici o gluco corticoidi. Il monitoraggio plasmatico di 17­OHP e dei livelli di andro stenedione, velocità di crescita e occasionalmente dell’età ossea offrono gli strumenti di base per una terapia adeguata ed efficace.

Poiché i test da selezionare e interpretare nel momento della diagnosi iniziale e durante la terapia sono spesso complessi, è consigliabile che il pediatra gestisca il paziente con CAH in stretta collaborazione con uno specialista in

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endocrinologia pediatrica. È opportuno che i genitori viaggino portando con sé una lettera con le linee guida del trattamento preparata dal medico che ha in cura il paziente, inoltre il bambino dovrebbe indossare un bracciale o una collana per consentire l’identificazione della deficienza di cortisolo in caso di emergenza.

EreditarietàLe forme di CAH sono tutte ereditarie come disturbi autosomici recessivi. Sono disponibili test del DNA per i portatori e per la diagnostica prenatale. L’identifi­cazione precoce dei feti affetti è importante per evitare la virilizzazione nei sog­getti di sesso femminile. Nelle famiglie con presenza di rischio per i figli, si inizia quanto prima la somministrazione di desametasone durante la gravidanza, dopo la diagnosi. Qualora la somministrazione abbia inizio prima delle 6 settimane di vita del feto, la virilizzazione è prevenuta o considerevolmente limitata. Dopo la determinazione del sesso del feto, la terapia materna può essere interrotta nel casi in cui il feto sia di sesso maschile; una volta che sono noti i test sul DNA delle neonate, la terapia materna può essere interrotta nel caso in cui il feto risulti non affetto.

Ipotiroidismo congenito (CH)

CenniIl deficit di ormoni tiroidei nei neonati è noto fin dall’antichità. Molti casi, prima del ventesimo secolo, erano causati da carenza di iodio. Benché sia tuttora una patologia causata a livello globale prevalentemente da problematiche legate alla nutrizione, la carenza di iodio raramente provoca l’ipotiroidismo congenito (CH) nei Paesi occidentali. Nei casi di mancato riconoscimento di CH e qualora non si avvii un trattamento adeguato entro 2 o 3 mesi dalla nascita, è nota la comparsa di deficit permanenti dello sviluppo neurologico. Dall’avvento dello screening neonatale per CH nel 1973, la disabilità intellettuale è stata virtual­mente debellata nei bambini affetti individuati mediante screening entro le prime 2–3 settimane di vita. L’incidenza è di circa 1 caso per 4.000 nelle popolazioni con apporto sufficiente di iodio. Nel 70%–80% dei casi non familiari l’eziologia è sconosciuta. L’ipotiroidismo materno può influire sul feto causando in rari casi evidenza di CH, o può essere associato a una lieve diminuzione del QI nel caso in cui compaia durante la prima metà della gravidanza, nonostante una funzionalità normale della tiroide nel feto e nel neonato.

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Aspetti cliniciIn più del 95% dei neonati con CH, non vi sono sintomi o segni di CH quando la diagnosi è sospetta in seguito a screening neonatale. Nel periodo dal secondo al sesto mese di vita, un bambino affetto non trattato con ipotiroidismo da moderato a grave può presentare iperbilirubinemia persistente, ernia ombeli­cale, ingrandimento della fontanella e tiroide assente, ipoplastica, normale o ingrossata; in seguito svilupperà gradualmente letargia, difficoltà ad alimentarsi, macroglossia, ipotermia, stipsi, pelle secca e di colore giallastro, pianto rauco, pallore circumorale e chiazze cutanee.

Esami diagnosticiPer l’individuazione dell’ipotiroidismo si possono utilizzare due test di screening neonatale: ormone di stimolazione della tiroide (TSH) e tiroxina (T4). Quando la tiroide è disfunzionale (ipotiroidismo primario), solitamente si rileva un aumento dei valori di TH e una diminuzione dei valori di T4, benché questi ultimi possono trovarsi entro la soglia di normalità nei casi di CH medio. L’ipotiroidismo primario rappresenta oltre il 95% dei casi. In presenza di alterazioni nella regolazione della tiroide da parte di ipotalamo o ipofisi (ipotiroidismo centrale), i valori di T4 risultano bassi; i valori di TH possono essere bassi, normali o moderatamente alti.

I test sierici di conferma sono normalmente limitati a due: TSH e tiroxina libera, o FT4 (la piccola frazione di T4 che non è legata alle proteine sieriche e che rappresenta il dato più rilevante da un punto di vista biologico). Un test sierico elevato per TSH è diagnostico per ipotiroidismo primario, la forma più comune di CH. Un valore sierico basso di FT4 con livelli nella norma di TSH è diagnos­tico per ipotiroidismo centrale. I bambini con ipotiroidismo centrale dovrebbero essere sottoposti ad altri test per valutare la funzione ipotalamo­pituitaria, poiché le carenze di ACTH/cortisolo, ormone della crescita e/o gonadotropine sono associate a ipoglicemia (tipicamente entro qualche ora dalla nascita) e, nei neonati di sesso maschile, a ipogonadismo (micropene, testicoli piccoli, criptorchidismo).

Spesso si ottiene un’immagine della tiroide mediante ultrasuoni e/o scansione della tiroide con radionuclidi. Questi test determinano se la tiroide sia ingrossata (gozzo), assente (atireosi), piccola (ipoplasia) o malformata e in posizione diversa da quella normale nel collo (ectopia). In queste situazioni, molto spesso il bambino ha una forma permanente di ipotiroidismo primario. La tiroide può risultare, agli ultrasuoni, normale nelle dimensioni e nella posizione nel collo (eutopica), specialmente in presenza di cause familiari di CH e CH transitorio.

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TrattamentoIl trattamento dell’ipotiroidismo è relativamente poco complesso. Non appena le analisi confermano la diagnosi di CH, va iniziata prontamente la terapia con levotiroxina (l­tiroxina). L’ipotiroidismo centrale può richiedere una gestione ulteriore basata su evidenze associate. La valutazione e il monitoraggio vanno effettuati in collaborazione con uno specialista in endocrinologia pediatrica.

EreditarietàUna percentuale compresa approssimativamente fra il 15% e il 20% dei bambini con CH presenta una delle molte forme ereditarie complessivamente note come disormonogenesi tiroidea familiare. Queste patologie sono causate da mutazioni negli enzimi necessari per la sintesi ormonale della tiroide, il metabolismo e la funzionalità dell’organo di destinazione, e sono ereditarie come tratti autosomici recessivi. Con questi pattern ereditari, le mutazioni nei geni per la sintesi degli ormoni di ipotalamo e ipofisi e dei loro recettori causano raramente CH. Esistono mutazioni molto rare nei geni che regolano l’embriogenesi di tiroide e ipofisi. Le modalità ereditarie non sono note. Benché non sia una causa di CH, il deficit di globulina legante la tiroxina (TBG) è provocato da mutazioni nel gene necessario per la sintesi di questa proteina principale per i legami delle proteine per T4. La modalità ereditaria solitamente è legata all’X, benché siano state riscontrate forme autosomiche recessive di deficit di TBG.

Cellule falciformi e altre emoglobinopatie

CenniLa malattia a cellule falciformi è stata la prima emoglobinopatia posta in relazione a un’alterazione strutturale ereditaria nel gene della beta­globina, e la prima in cui la mutazione di punto risultante nel difetto sia stata identificata e caratteriz­zata. L’ambito dello screening neonatale per la malattia a cellule falciformi, iniziato oltre trent’anni fa, si è evoluto con l’inclusione di altre emoglobinopatie.

Oggi, la valutazione dei neonati per le emoglobinopatie comprende l’individua­zione delle mutazioni di punto alla base dei difetti strutturali delle catene globiniche alfa e beta (emoglobinopatie) come la malattia a cellule falciformi, e l'individuazione dei difetti nel tasso di produzione delle catene globiniche alfa e beta (talassemie). Nel complesso, le alterazioni ereditarie dell’emoglobina sono fra le alterazioni genetiche più diffuse globalmente. Poiché le varie patologie dell’emoglobina coesistono con frequenza elevata in molte popolazioni e poiché

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i singoli individui possono ereditarne più di un tipo, tali patologie presentano una serie complessa di fenotipi clinici.

Aspetti cliniciNel periodo neonatale, si verifica una transizione fra produzione di emoglobina fetale (HbF) ed emoglobina adulta (HbA). Tale transizione maschera tempora­neamente i sintomi della malattia. Di conseguenza, le malattie associate alle anomalie dei globuli rossi (Hb S, C, S/C, S/O, e S/D) solitamente si manifes­tano durante il primo o il secondo anno di vita, benché possano comparire casi meno gravi anche in seguito. Solitamente le caratteristiche di presentazione sono deficit della crescita, infezioni ripetute nell’infanzia, dattilite dolorosa e pallore. A questo stadio sono tipicamente stabilite le evidenze ematologiche. Gli eterozigoti (ad esempio, nei tratti per le cellule falciformi) sono portatori senza sintomi clinici.

Le talassemie presentano un’ampia diversità clinica, in base al grado con cui vengono sintetizzate le catene alfa e beta. Nella beta talassemia maior, o assenza completa di produzione della catena beta, i neonati sono asintomatici. Con la diminuzione di HbF, i bambini affetti presentano anemia grave (di solito entro i primi due anni). La beta talassemia minor (sintesi parziale) ha decorso clinico variabile. Nell’alfa talassemia, l’assenza delle catene alfa è invariabilmente fatale per il neonato entro pochi giorni dalla nascita, mentre la produzione parziale, come la malattia da emoglobina H, può produrre sintomi clinici variabili.

Esami diagnosticiLo screening primario per le emoglobinopatie avviene tramite isoelettrofocaliz­zazione (IEF) del sangue da eluizione di un campione di sangue essiccato. La IEF separa le emoglobine e identifica le varianti più comuni sulla base della mobilità delle bande. Analisi del DNA per l’identificazione specifica di HbS, HbC, HbE, HbO Arab e HbD sono impiegate per confermare risultati anomali della IEF. La riduzione di HbA e un’analisi di secondo livello del DNA per le mutazioni comuni della beta talassemia aiutano a identificare le beta talassemie. La presenza di Hb di Bart e/o di Hb H nel pattern IEF individua alfa talassemia.

TrattamentoOltre al trapianto di midollo osseo, non esiste terapia curativa per le patologie dell’emoglobina. La gestione dei neonati con patologie falciformi comprende tipicamente la somministrazione quotidiana di penicillina per via orale per tutta l’infanzia, e vaccinazione contro Pneumococcus, Meningococcus e H. influenzae.

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Poiché la diagnosi e la terapia di questo disturbo sono complesse, è consigliabile che il pediatra gestisca il paziente in stretta collaborazione con uno specialista in ematologia pediatrica.

EreditarietàLe emoglobine con anomalie strutturali derivano da ereditarietà autosomica recessiva. Molte delle anomalie a carico dell’emoglobina, fra cui HbS, HbC, HbD, HbE e HbO Arab, causano poche manifestazioni cliniche, o nessuna, negli eterozigoti (una copia della mutazione). Poiché la produzione delle catene alfa è controllata da quattro loci per i geni (due su ogni coppia di cromosomi), ciascun gene controlla solo circa il 25% della produzione totale di catene alfa, e le emoglobinopatie causate da anomalie delle catene alfa sono poco diffuse, in confronto a quelle delle catene beta.

Galattosemia

CenniIndividui intolleranti all’ingestione di galattosio sono stati descritti fin dal 1908, ma solo a partire dal 1935 si è riscontrato che l’eliminazione del galattosio dalla dieta consentiva di evitare la sindrome da intossicazione acuta associata alla galattosemia. La via di Leloir, la principale via del metabolismo del galattosio, fu definita all’inizio degli anni Cinquanta. Nel 1955, fu dimostrato l’accumulo di galattosio 1­fosfato nei globuli rossi dei neonati con disturbi al metabolismo del galattosio. Successivamente sono stati sviluppati metodi per il dosaggio di galattosio 1­fosfato­uridil transferasi (GALT) e del galattosio 1­fosfato da campioni di sangue del neonato.

Il deficit di GALT è responsabile di circa il 95% delle galattosemie. Benché siano state documentate molte mutazioni del gene GALT, molti casi di deficit di GALT sono dovuti a poche mutazioni altamente frequenti. Nel 5% circa dei casi di galattosemia, il deficit metabolico è nella galattochinasi (GALK) e, molto raramente, in uridindifosfato­galattosio epimerasi (GALE).

Aspetti cliniciIl deficit di GALT molto spesso si presenta come una patologia a rischio di vita entro le prime due settimane dopo la nascita. I sintomi iniziali sono difficoltà nell’alimentazione, scarso aumento di peso, vomito e diarrea, letargia e ipotonia. All’esame fisico, i bambini risultano itterici con epatomegalia, possono avere una fontanella sporgente e mostrano sanguinamento prolungato dopo il

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prelievo di campioni venosi o arteriosi. Spesso sono presenti cataratte. Le analisi di laboratorio che rivelano patologie epatiche, disfunzione tubulare renale e anomalie ematologiche sono comuni. Possono presentarsi anemia e setticemia. Le complicanze a lungo termine includono compromissione dello sviluppo neurologico e complicanze neurologiche tardive. Ovaie non funzionanti a causa degli effetti tossici prenatali della galattosemia sono una condizione comune e non reversibile nelle femmine.

Nel deficit di GALK, l’unica evidenza clinica costante sono le cataratte. Nel deficit di GALE, i pazienti sono, con eccezioni molto rare, asintomatici, con crescita e sviluppo normali.

Esami diagnosticiLo screening per la galattosemia include le analisi per livelli elevati di galattosio totale (galattosio più galattosio­1­fosfato) e il dosaggio dell’attività enzimatica di GALT. Livelli elevati di galattosio totale e/o ridotta attività di GALT devono indurre a un’ulteriore valutazione del paziente. Il galattosio totale può essere scomposto nelle parti di galattosio libero e galattosio­1­fosfato, inoltre è possibile eseguire analisi del DNA per le mutazioni più comuni associate al deficit di GALT a partire dal campione di sangue iniziale. Questo approccio combinato rivela rapidamente, da un singolo campione di sangue, se la galattosemia sia un deficit di GALT o se sia dovuta a deficit di GALK o GALE. Le analisi di con­ferma solitamente includono studi sierici del galattosio e dell’associata attività enzimatica per caratterizzare il fenotipo del paziente.

TrattamentoL’immediata esclusione del galattosio dall’alimentazione (allattamento al seno, latte vaccino) va attuata al primo sospetto di galattosemia. Si consiglia l’utilizzo di preparati a base di soia per neonati, a meno che non vi sia una patologia epatica significativa. Per i neonati gravemente malati al momento della diagnosi, la terapia di supporto può comprendere trattamento con vitamina K e plasma fresco congelato per correggere le anomalie della coagulazione. Si deve supporre la presenza di sepsi da Gram­negativi e somministrare gli antibiotici appropriati per endovena.

Poiché la diagnosi e la terapia di questa patologia sono complesse, è consigliabile che il pediatra gestisca il paziente in stretta collaborazione con uno specialista delle malattie metaboliche pediatriche. È opportuno che i genitori portino sempre con sé una lettera con le linee guida del trattamento preparata dal medico che ha in cura il paziente.

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EreditarietàQuesta patologia segue molto spesso un pattern ereditario autosomico recessivo. Nel caso di patologie recessive, i pazienti affetti devono avere due copie del gene patologico (o della mutazione) per mostrare i sintomi della malattia. I sog­getti con una sola copia del gene patologico (detti portatori) solitamente non mostrano segni o sintomi della condizione, ma possono trasmettere il gene pato­logico ai figli. Quando entrambi i genitori sono portatori del gene patologico di uno specifico disturbo, vi è il 25% di probabilità per ogni gravidanza che i figli siano affetti da tale disturbo.

Immunodeficienza combinata grave (SCID)

CenniL’immunodeficienza combinata grave (SCID) è un gruppo di disturbi caratteriz­zati dall’assenza di immunità umorale e cellulare. I bambini con SCID muoiono di infezioni entro il secondo anno di età, se non si riesce a ripristinare l’immunità mediante il trattamento. La caratteristica che definisce la SCID è sempre un grave deficit nella produzione e nella funzione dei linfociti T, con deficit nei linfociti B come problema primario o secondario e, in alcuni tipi genetici, anche nella produzione di cellule NK. La SCID è anche nota comunemente come malattia “bubble boy”.

Aspetti cliniciPrima della comparsa dell’infezione i bambini generalmente risultano normali all’esame fisico. La patofisiologia e la biologia molecolare variano per le diverse forme di SCID, tuttavia, l’alterazione nella funzionalità dei linfociti T e dei linfociti B è il punto d’arrivo comune di tutte le forme di SCID. Generalmente si manifesta linfopenia per l’assenza di linfociti T, talvolta per l’assenza di cellule NK. Gli anticorpi funzionali sono ridotti o assenti. Le infezioni sono solitamente gravi e possono includere polmonite, meningite o infezioni del flusso sanguigno, con comparsa dei sintomi all’età media di 2 anni.

Esami diagnosticiI TREC (T­cell Receptor Excision Circle) sono frammenti di DNA circolare generati durante il riarrangiamento del recettore dei linfociti T. Nei neonati sani, i TREC vengono prodotti in quantità elevate, mentre nei neonati con SCID sono appena rilevabili. In seguito all’amplificazione con PCR, la quantità di copie di TREC nel sangue può essere utilizzata per distinguere i neonati con SCID linfofenico per i linfociti T dai neonati sani. Tuttavia, un basso numero di copie

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di TREC può anche essere causato da altra immunodeficienza, come la sindrome di DiGeorge, e talvolta può essere l’effetto dell’uso di farmaci immuno­soppressori. È necessario eseguire analisi di conferma per la diagnosi di SCID e per la determinazione della forma di SCID.

Figura 3. I TREC sono frammenti circolari di DNA. Vengono generati durante il riarrangia-mento di una sezione del cromosoma 14 (14q11-2), che contiene i geni responsabili per la codifica dei recettori dei linfociti T. I TREC sono amplificati mediante PCR.

TrattamentoLe infezioni sono trattate con specifici agenti antibiotici, antimicotici e antivirali e la somministrazione di immunoglobuline per via endovenosa. È essenziale ripristinare la funzionalità del sistema immunitario. Il trattamento preferenziale è il trapianto di midollo spinale e/o di cellule staminali. L’individuazione e il trattamento precoci possono consentire un netto miglioramento dei tassi di sopravvivenza. È disponibile la terapia di sostituzione enzimatica per il deficit di adenosin deaminasi (una forma di SCID). La terapia genica è ancora in fase sperimentale.

EreditarietàL’incidenza di SCID è di circa 1 caso per 50.000/100.000 nati vivi. Nell’uomo sono stati identificati oltre 10 difetti genetici associati allo SCID. Il tipo più comune è legato al cromosoma X, perciò colpisce solo i maschi. Questa forma legata al cromosoma X costituisce circa il 50% dei casi di SCID. Altre forme di SCID di solito seguono un pattern ereditario autosomico recessivo o sono il risultato di mutazioni spontanee. Circa il 25% dei pazienti con SCID autosomico recessivo presenta deficit di JAK3, mentre il 40% presenza deficit di adenosina deaminasi.

TCRα TCRδ TCRα

TCRα TCRα

Vα Vδ Jδ Cδ Jα Cα

Vα Jα CαδRec/ψJα

SjTREC

SjTREC

F-primer R-primer

CδVδ

1.FormazionediSjTRECmediantedelezionedellocusTCRδ

2.IlSjTRECvieneamplificatodaPCR

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Le tecnologie impiegate negli odierni laboratori di screening dipendono dall’ampiezza del programma di screening e dagli specifici materiali analitici da misurare. I dosaggi immunologici (pagina 64) e i dosaggi enzimatici (pagina 67) sono generalmente stati i metodi più usati, specialmente per i programmi in fase di avvio, per lo screening di una e più patologie. In una fase relativamente precoce nello sviluppo delle tecnologie per i dosaggi immunologici, si è indagato sulla possibilità di eseguire analisi multiple. Le analisi su più analiti sono associate a diversi vantaggi, fra cui:

• Risparmi in termini di tempo, lavoro e reagenti• Aumento della capacità di trattamento• Riduzione complessiva dei costi• Riduzione del volume dei campioni

Benché una tecnica come la fluorimetria a tempo­risolto consenta il dosaggio simultaneo di diverse etichette da un singolo pozzo di campionamento, la necessità di ampliare lo screening viene soddisfatta da una tecnologia alternativa, la spettrometria di massa tandem (pagina 69). Ciò consente l’analisi di grandi numeri di analiti partendo da un singolo campione di macchie di sangue essiccato.

Alla sua introduzione, all’inizio degli anni Novanta, la spettrometria di massa tandem condusse a una grande espansione delle patologie metaboliche congenite potenzialmente individuabili. Di conseguenza, sono stati aggiunti ulteriori test a molti programmi di screening.

Per alcune alterazioni sottoposte a screening, vi è la necessità di distinguere fra diverse sostanze simili o fra diverse forme della medesima sostanza. Ad esempio, per l’individuazione delle emoglobinopatie, la tecnica di isoelettrofocalizzazione (IEF, pagina 70) consente di ottenere una chiara distinzione fra le diverse forme di emoglobinopatia. Benché fra le opzioni disponibili per lo screening per le emoglobinopatie vi siano anche l’immunodosaggio e la cromatografia, IEF rimane la tecnologia di elezione per molti programmi.

Le analisi genetiche sono recentemente divenute una pratica standard nell’ambito dello screening neonatale e sono disponibili numerosi metodi applicabili all’analisi degli acidi nucleici. Tuttavia, molti di questi metodi non si conformano

TECNOLOGIE

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alle esigenze dello screening neonatale, che richiede elevato rendimento e processi scorrevoli ed efficienti. In questo documento (pagina 71) si cita un’applicazione di PCR end­point che dispone delle caratteristiche altrimenti carenti, ed è perciò adatta ai fini dello screening neonatale di routine.

ImmunodosaggioGli immunodosaggi sono dosaggi per proteine specifiche che si basano sull’elevata specificità e affinità della reazione di riconoscimento fra un anticorpo e il determinante antigenico, cioè la struttura chimica contro cui si forma l’anticorpo.

L’introduzione di gruppi di componenti per uno dei componenti della reazione immunologica facilita il monitoraggio del legame. Nel corso degli anni Sessanta e Settanta, l’evoluzione delle tecnologie per l’immunodosaggio si basò sull’impiego della marcatura con radioisotopi. A partire dalla fine degli anni Settanta e nel corso degli anni Ottanta, l’introduzione della marcatura non radioattiva ha consentito di conseguire nuovi miglioramenti nei dosaggi, nella direzione della loro automazione e di una maggiore sensibilità.

I primi immunodosaggi quantitativi sono stati i radioimmunodosaggi (RIA) competitivi, all’inizio degli anni Sessanta. Da allora i radioimmunodosaggi competitivi sono stati impiegati sia per apteni, antigeni a basso peso molecolare, sia per antigeni più grandi.

Figura 4. Esempio di immunodosaggio competitivo mediante la tecnologia DELFIA® di PerkinElmer con individuazione della fluorescenza a tempo-risolto.

IgGsufasesolida

Analitanelcampione

MolecoladianalitamarcataEu

IgCspecifico Incubazionee lavaggio

MisuradellafluorescenzaDELFIA

Inducer

Eu

Eu

EuEu

Eu

Eu

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Per via dei suoi limiti (dinamiche limitate dei dosaggi e sensibilità che dipende più dall’affinità degli anticorpi che dall’identificazione dell’etichetta) e in seguito allo sviluppo di sistemi di separazione su fase solida e del dosaggio con tecnica “sandwich”, il dosaggio competitivo ha perduto il suo primato come metodo di elezione per gli antigeni di grandi dimensioni. Ancora oggi, si deve ricorrere al dosaggio competitivo nella misurazione di analiti che, a causa delle dimensioni ridotte, possono legare un solo anticorpo per volta, ossia di antigeni incapaci di formare un “sandwich”.

L’invenzione della tecnologia degli immunodosaggi non competitivi è general­mente attribuita a Miles a Hales che, nel 1968, marcarono anticorpi anti­insulina con 125I impiegandoli in un dosaggio immunoradiometrico non competitivo in due passaggi (IRMA) di insulina. Miles e Hales hanno descritto il loro dosaggio come dosaggio immunoradiometrico perché hanno marcato anticorpi e non antigeni. In seguito, questo termine e i termini corrispondenti relativi ad altre tecnologie d’indagine, ad esempio il dosaggio immunofluorimetrico (IFMA), sono entrate in uso in modo più generico per descrivere metodologie di dosaggio non competitive in eccesso di reagenti, eseguite molto spesso come dosaggi “sandwich”. Di conseguenza, i dosaggi di tipo “sandwich” a due siti si sono rivelati i più adatti per molti antigeni (o anticorpi) con almeno due siti epitopici.

All’epoca, Miles e Hales ipotizzarono che le tecniche IRMA avrebbero dovuto offrire miglioramenti per quanto riguarda sensibilità e specificità analitica, e che si sarebbero potuti conseguire ulteriori vantaggi sostituendo lo iodio radio­attivo con un’alternativa non radioattiva ad attività elevata. Poiché la sensibilità dei dosaggi competitivi è definita mediante la costante di associazione degli anticorpi, mentre la sensibilità di un dosaggio non competitivo è definita mediante errore totale, leganti non specifici e affinità degli anticorpi, è stato possibile realizzare dosaggi non competitivi con una sensibilità superiore per diversi ordini di grandezza rispetto ai dosaggi competitivi.

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Figura 5. Esempio di dosaggio spettrofluorimetrico di tipo “sandwich” mediante la tecnologia DELFIA® di PerkinElmer con individuazione della fluorescenza a tempo-risolto.

Fluorimetria a tempo-risoltoGli esempi di metodiche di immunodosaggio illustrati nelle figure 4 e 5 com­portano l’uso di fluoroforo consistente in chelati di lantanidi e la sua rilevazione mediante fluorimetria a tempo­risolto. La rilevazione a tempo­risolto si basa su due proprietà importanti del fluoroforo, che contribuiscono alla sensibilità del dosaggio. Il fluoroforo ha un lungo tempo di decadimento (figura 6) e un ampio spostamento di Stokes (figura 7). Le misurazioni possono quindi essere effettuate secondo tempi e lunghezza d’onda per cui il background sia minimo.

La misurazione avviene mediante l’eccitazione ripetuta del fluoroforo misurando, dopo ciascuna eccitazione, la fluorescenza emessa per un periodo a partire da un intervallo stabilito. Per un ciclo di misurazione di 1 millisecondo, la misurazione può avvenire nel periodo compreso fra 400 e 800 microsecondi, come nell’esempio illustrato nella figura 6.

Fra i lantanidi, quello più comunemente utilizzato nelle tecniche FIA e IFMA è l’europio. Vi sono tuttavia vari altri lantanidi con proprietà simili, ma ciascuno con un profilo di fluorescenza unico. Sono disponibili dosaggi fluorimetrici a tempo­risolto per più analiti.

La fluorimetria a tempo­risolto trova ampia applicazione perché le etichette impiegate sono piccole, facili da applicare e non tossiche.

Eu

IgCspecificosufasesolida

Analitanelcampione

IgCspecificomarcatoEu

Incubazione

Misuradellafluorescenza

DELFIAInducer

Eu

Eu

Eu

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Figura 6. La fluorescenza dei chelati di europio dura tipicamente molto più a lungo rispetto a un fluoroforo convenzionale. Ciò significa che la misurazione del segnale può avere luogo molto dopo la scomparsa delle interferenze dovute a fluorescenza non specifica.

Figura 7. La lunghezza d’onda della luce fluorescente è significativamente diversa da quella della luce impiegata per eccitare il chelato d’europio. La differenza della lunghezza d’onda è nota come spostamento di Stokes. Un ampio spostamento di Stokes consente una misurazione più sensibile della fluorescenza.

Dosaggio enzimaticoGli enzimi sono proteine che catalizzano reazioni chimiche. Le molecole presenti all’inizio della reazione sono dette substrato; l’enzima le converte in molecole diverse, note come prodotto. Gli enzimi non sono consumati dalla reazione che catalizzano. I dosaggi enzimatici si basano sulla specificità molto elevata rispetto alle reazioni catalizzate e ai substrati coinvolti in tali reazioni.

L’attività enzimatica può essere influenzata da altre molecole. Gli inibitori sono molecole in grado di diminuire l’attività enzimatica; gli attivatori sono molecole in grado di aumentare tale attività. Molti farmaci e molti veleni sono inibitori enzimatici. L’attività inoltre è influenzata da temperatura, ambiente chimico (ad esempio pH) e concentrazione del substrato.

Poiché un controllo rigoroso dell’attività enzimatica è essenziale per l’omeostasi, una disfunzione (mutazione, eccesso o difetto di produzione, assenza di produ­zione) di un singolo enzima fondamentale può causare una malattia genetica.

Tempodiritardo

Tempo(µs)0 400 800 1000

Fluo

resc

enza

Finestradimisura

Eccitazione EmissioneFl

uore

scen

za

Lunghezzad’onda(nm)

300 400 500 600

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L’importanza degli enzimi è dimostrata dal fatto che una disfunzione di un solo tipo di enzima fra i migliaia di tipi presenti nel nostro organismo può causare una malattia letale. Un esempio è la galattosemia classica. Una mutazione in un singolo aminoacido dell’enzima galattosio­1­fosfato­uridil­transferasi porta all’accumulo di galattosio­1­fosfato. Se non viene diagnosticata e trattata può causare morte nel giro di alcune settimane.

Uno dei metodi più sensibili per il monitoraggio dei dosaggi enzimatici è l’utilizzo delle tecniche fluorimetriche. La fluorescenza si osserva quando una molecola emette luce di una certa lunghezza d’onda dopo avere assorbito luce di una lunghezza d’onda diversa. I dosaggi fluorimetrici sfruttano una differenza fra fluorescenza del substrato e quella del prodotto per misurare una reazione enzimatica. Un esempio di questi dosaggi è l’uso dei coenzimi nucleotidici NADH e NADPH. In questo caso, le forme ridotte sono fluorescenti mentre le forme ossidate non sono fluorescenti. Le reazioni di ossidazione possono perciò essere seguite tramite la diminuzione della fluorescenza, le reazioni di riduzione tramite l’aumento della fluorescenza. Sono anche disponibili substrati sintetici che rilasciano un colorante fluorescente in una reazione catalizzata da enzimi, come biotinil­6­aminochinolina per lo screening neonatale per deficit di biotinidasi.

Figura 8. Diagramma schematico di un dosaggio mediante fluorescenza dell’enzima GALT (galattosio-1-fosfato-uridil-transferasi). GALT, in un campione di sangue, catalizza una reazione fra galattosio-1-fosfato e uridina difosfoglucosio contenuti nel reagente substrato del dosaggio. Nel corso di ulteriori reazioni, NADP (nicotinammide adenina dinucleotide fosfato), anch’esso contenuto nel reagente substrato del dosaggio, viene ridotto a NADPH, un substrato fluorescente che può essere misurato con eccitazione a 355 nm e la cui eccitazione viene rilevata a 460 nm.

Uridindifosfo-glucosio

NADPH NADPHNADPNADPUridin

difosfo-glucosio

Galattosio-1-fosfato

Glucosio-1-fosfato

Glucosio-6-fosfato

Ribulosio-5-fosfato

6-fosfo-gluconato

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Spettrometria di massa tandem (MS/MS)

Nella spettrometria di massa tandem, per la produzione degli ioni si utilizza la ionizzazione elettrospray (ESI). Questi ioni, le molecole ionizzate, vengono estratti nell’analizzatore per la separazione sulla base dei loro rapporti massa/carica (m/z). L’analizzatore è costituito da tre camere (dette quadrupoli; rispettivamente Q1, Q2, e Q3). Q1 e Q3 sono spettrometri di massa separati da una cella di collisione (Q2), che frammenta gli ioni.

Nella misurazione degli aminoacidi e delle acilcarnitine da campioni di sangue essiccato, è innanzitutto necessario estrarre gli aminoacidi e le acilcarnitine. I dischi con i campioni di sangue essiccato vengono miscelato con metanolo e standard interno. Gli standard interni devono corrispondere alle proprietà chimiche della molecola di analita quanto più possibile e, in generale, si utilizza una versione dell’analita marcata con deuterio. Per i composti in cui non siano disponibili standard interni, si potrà utilizzare una sostanza chimica analoga.

Le miscele campione/standard possono essere analizzate direttamente, oppure è possibile effettuare prima una conversione verso esteri butilici mediante un processo noto come derivatizzazione. La derivatizzazione aiuta l’aumento della forza del segnale di alcuni composti. Tuttavia, si tratta di un processo lungo e laborioso che può anche generare misurazioni imprecise di alcune acilcarnitine. L’impiego di reagenti qualificati e ottimizzati può compensare la riduzione della forza del segnale, e i reagenti e kit di nuova generazione non derivatizzati sono generalmente considerati capaci di assicurare prestazioni analitiche costantemente elevate.

I campioni risultanti sono infine introdotti nello strumento MS/MS, ionizzati e analizzati. Si individuano i segnali corrispondenti alla gamma selezionata di rapporti massa/carica e si procede alla quantificazione in rapporto agli standard interni. Per ciascun singolo analita, la produzione di ioni presso il detector dipende in parte dalla concentrazione dell’analita nel campione originale utilizzato, ma anche dal grado di “soppressione ionica” da parte degli altri componenti della miscela (ad esempio, i sali) e da impostazioni strumentali, in particolare quelle relative alla fonte degli ioni e alle condizioni nella cella di collisione. Per la correzione di questi effetti si utilizzano gli standard interni e ciò consente di calcolare le concentrazioni degli analiti in questione. Quindi si confrontano concentrazioni e rapporti degli analiti con i valori di cut­off predeterminati.

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Isoelettrofocalizzazione

L’elettroforesi è un metodo consolidato per la separazione di miscele di proteine in proteine singole. Le proteine sono costituite da aminoacidi e gli aminoacidi sono sostanze anfotere, ossia possono avere carica positiva o negativa. La separa­zione elettroforetica avviene sulla base della carica netta delle singole proteine, cioè la somma delle cariche degli aminoacidi costituenti. Per semplificare, si può dire che una corrente diretta passa attraverso una membrana di supporto e il campione viene posto vicino al catodo. Le singole proteine si separano nel corso della loro migrazione verso l’anodo.

Il pH della soluzione in cui una proteina si trova ne determina la carica netta. Il pH in cui la proteina ha una carica netta pari a zero è il punto isoelettrico (pI) di quella proteina.

L’isoelettrofocalizzazione (IEF) può essere definita, in modo semplificato, come elettroforesi in un gradiente di pH. È un metodo di separazione su end­point in cui le proteine migrano verso posizioni specifiche sulla membrana di supporto che corrispondono ai loro punti isoelettrici. Nell’elettroforesi zonale, invece, si ha la presenza di un pH costante.

La storia della IEF iniziò nel 1964, con il brevetto svedese richiesto da Olaf Vesterberg per la sintesi di una nuova sostanza chimica, gli anfoliti. Nel processo relativo alla creazione di queste sostanze, Vesterberg impiegò diversi tipi di poliammine accoppiandoli a derivati specifici di acidi acrilici. Dopo un periodo di incubazione, la soluzione chimica produceva un gruppo del tutto nuovo di catene molecolari polimeriche con gruppi amminici protonati e gruppi carbos­silici deprotonati. Queste sostanze chimiche mostrarono proprietà chimiche uniche utilizzabili per generare gradienti di pH se soggette a corrente elettrica diretta; possono perciò essere impiegate in un sistema elettroforetico.

Nella IEF si prepara una miscela di anfoliti trasportatori in una matrice di supporto ad alto contenuto di agarosio purificato. Una soluzione di anoliti e una di catoliti vengono saturate su pezzetti di carta da filtro collocati direttamente sulla superficie del gel. Il campione viene introdotto in un punto qualsiasi sulla superficie del gel mediante un supporto di plastica, quindi viene applicata la corrente diretta collocando gli elettrodi in posizione. Gli anfoliti si spostano nella direzione della corrente e si differenziano creando zone distinte per pH quando raggiungono i loro punti isoelettrici. Una proteina, contenuta nel campione,

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migra quindi alla zona con pH che ne rappresenta il punto isoelettrico. A questo punto non si sposterà oltre, ma si accumulerà formando una banda visibile.

PCR end-point basata su TR-FRETI test genetici possono essere effettuati mediante l’analisi degli acidi nucleici, che utilizza spesso la reazione a catena della polimerasi (PCR), uno strumento di base nella biologia molecolare per l’amplificazione degli acidi nucleici. La PCR comprende generalmente quattro passaggi: campionamento, preparazione del campione, amplificazione e rilevamento. Vi sono diverse applicazioni che integrano gli ultimi due passaggi per consentire una semplice analisi di sequenzia­mento di acidi nucleici con una gestione minima post PCR. Diversamente dai metodi convenzionali di PCR, le tecniche PCR end­point basate su TR­FRET (Time­Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer, trasferimento di energia a risonanza di fluorescenza a tempo­risolto) combinano le fasi di preparazione del campione, amplificazione e rilevamento. Dopo la preparazione dei dischi campionati, tutti i passaggi della procedura, compresa l’aggiunta di reagenti per amplificazione e rilevamento, il ciclo termico e la misurazione della fluorescenza, avvengono nello stesso contenitore, rendendo il metodo semplice e di facile utilizzo.

Figura 9. Con la tecnologia TR-FRET, le etichette di donatore (D) e accettore (A) nelle sonde non ibridizzate (in alto a sinistra) sono vicine. In tal modo, si ha un’elevata efficienza nel trasferi-mento dell’energia e un segnale intensivo dell’accett ore con breve tempo di decadi-mento (la curva gialla nel grafico). Dopo l’ibridizzazione (in alto a destra), la catena rigida di DNA allontana le etichette. Ciò provoca una riduzione nell’efficienza del trasferimento di energia e un aumento del tempo di decadimento dell’accettore (curva rossa).

Tempo(µs)

A AD

D

Inte

nsità

Finestradimisura

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La tecnica PCR end­point basata su TR­FRET comporta l’impiego di sonde target specifiche per il sequenziamento, in cui i fluorofori donatori e accettori, lantanidi fluorescenti di lunga durata, siano accoppiati alle estremità opposte di una singola sonda molecolare. Quando la sonda viene ibridizzata, è possibile il rilevamento diretto della popolazione di sonde target ibridizzate, sulla base del tempo di decadimento prolungato del segnale dell’accettore indotto dal trasferimento di energia. Questo approccio basato sulle sonde consente anche di regolare sia la lunghezza d’onda sia il tempo di decadimento del segnale dell’accettore indotto nelle analisi su più analiti. Il metodo permette analisi del DNA rapide, omogenee, basate su un singolo passaggio, che richiedono solo un reagente per ogni oligonucleotide target. L’impiego di lantanidi fluorescenti di lunga durata nella misurazione a tempo­risolto elimina inoltre il background di un nanosecondo dell’analisi provocato da matrice del campione e dispersione di luce, aumentando perciò la sensibilità dell’analisi. Inoltre, la sensibilità dei suoi componenti permette l’impiego di campioni di piccole dimensioni, riducendo così l’interferenza dovuta ai componenti biologici e consentendo l’uso diretto di dischi di campioni in PCR omogenei.

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Organizzazioni che forniscono informazioni sullo screeningVi sono molte organizzazioni nazionali e internazionali attive nel sostenere la diffusione dello screening neonatale nel mondo mediante la condivisione delle conoscenze.

ACMGL’American College of Medical Genetics (ACMG) mira al miglioramento della salute mediante la genetica medica.

Nell’ambito della sua attività di definizione e nella promozione dell’eccellenza nella pratica della genetica medica, ACMG ha proposto un’informativa per l'uniformità consigliata dello screening (RUSP, recommended uniform screening panel).

Inoltre ACMG promuove e fornisce formazione in genetica medica, aumento dell’accesso a servizi di genetica medica e integra gli aspetti genetici nella cura del paziente.

http://www.acmg.net/

APHLAnche la APHL (Association of Public Health Laboratories), con sede negli USA, opera per assistere su scala globale e collabora con l’ISNS (International Society for Neonatal Screening) nell’assistenza ai Paesi che introducono nuovi programmi. Questa associazione ha una vasta esperienza, dal momento che i laboratori di salute pubblica effettuano test di screening neonatale a più del 95% dei quattro milioni di bambini nati ogni anno negli Stati Uniti.

http://www.aphl.org/

CDCIl CDC (Centers for Disease Control and Prevention, centri per il controllo e la prevenzione delle malattie) collabora nella creazione di competenze, infor­mazioni e strumenti di cui le persone e le comunità hanno bisogno per proteg­gere la propria salute, attraverso la promozione della salute, la prevenzione di malattie, infortuni e disabilità e la preparazione ad affrontare nuove minacce alla salute.

http://www.cdc.gov/

RIFERIMENTI UTILI

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Climb – Children Living with Inherited Metabolic DiseasesClimb è un’organizzazione nazionale del Regno Unito che fornisce informazioni, consigli e sostegno specifici per le malattie metaboliche a bambini, giovani, adulti, famiglie e professionisti. Inoltre fornisce informazioni e sostegno alle famiglie in tutto il modo, finanzia programmi di ricerca didattica e primaria e studia trattamenti e servizi medici.

http://www.climb.org.uk/

EGANEGAN (European Genetic Alliances Network) è un’organizzazione pan europea che opera a favore e per conto dei pazienti colpiti da disordini di natura genetica o congenita. L’attività riguarda sia patologie comuni sia rare.

http://www.egan.eu/

EPFIl Forum Europeo dei Pazienti (EPF, European Patients’ Forum) è un’organizza­zione pan europea di pazienti attiva nel campo della salute pubblica e della difesa della salute in Europa.

EPF è stato fondato nel 2003 ed è divenuto il rappresentante collettivo dei pazienti a livello dell’Unione Europea. Attualmente EPF rappresenta 46 organiz­zazioni. All’interno di questo gruppo sono comprese organizzazioni attive a livello UE di pazienti con patologie specifiche e organizzazioni collettive di pazienti a livello nazionale.

http://www.eu-patient.eu/

Genetic AllianceGenetic Alliance è un’organizzazione non profit statunitense le cui finalità sono la trasformazione della salute mediante la genetica e la promozione della trasparenza relativamente alle patologie genetiche. Svolge una funzione di collegamento fra diverse parti per creare collaborazioni a difesa della salute e per il miglioramento dei sistemi sanitari; inoltre opera in modo innovativo nell’ambito dell’informazione per consentire la traduzione delle ricerche a favore dell’attività decisionale dei servizi sanitari e dei singoli individui.

http://www.geneticalliance.org/

Genetic Alliance UKGenetic Alliance UK è un’alleanza nazionale di organizzazioni di cui fanno parte più di 130 istituzioni benefiche che sostengono bambini, famiglie e individui

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affetti da alterazioni genetiche. Le pagine web dell’organizzazione contengono un elenco esaustivo delle organizzazioni aderenti dedicate alle singole patologie.

http://www.gig.org.uk/

Genetics SocietyLa Genetics Society è stata fondata da William Bateson nel 1919 ed è una delle più antiche associazioni per la promozione scientifica dedicate alla genetica a livello mondiale. Conta più di 1700 membri, fra cui la maggior parte dei genetisti britannici, compresi accademici, ricercatori e studenti.

In qualità di istituzione benefica registrata, organizza incontri per promuovere la genetica, sostiene la partecipazione degli studenti agli incontri, sponsorizza la ricerca mediante finanziamenti per ricerche specifiche e borse di studio per gli studenti, e promuove la conoscenza pubblica della genetica.

http://www.genetics.org.uk/

ISNSISNS (International Society for Neonatal Screening) è un’organizzazione con circa 400 membri fra gli specialisti dei programmi di screening di tutto il mondo.

Il ruolo di ISNS è di raccogliere le opinioni di persone diverse da nazioni e continenti diversi, e di diffondere queste opinioni e la conoscenza condivisa.

http://www.isns-neoscreening.org/

March of DimesMarch of Dimes è un'organizzazione statunitense che ha la finalità di migliorare la salute dei bambini prevenendo i difetti alla nascita, la nascita prematura e la mortalità infantile. L'organizzazione realizza il suo scopo attraverso ricerche, servizi di comunità, attività di educazione e patrocinio mirati a salvare le vite dei bambini. I ricercatori, i volontari, gli educatori, gli operatori e i patrocinatori di March of Dimes collaborano allo scopo di dare a tutti i bambini la possibilità di combattere contro le minacce alla loro salute: precocità, difetti alla nascita, basso peso alla nascita.

http://www.marchofdimes.com/

NNSGRCNNSGRC (National Newborn Screening and Genetics Resource Center) è un accordo di collaborazione fra la sezione per i servizi di genetica di MCHB (Maternal and Child Health Bureau) e il dipartimento di pediatria di UTHSCSA (University of Texas Health Science Center at San Antonio). Il progetto è finanziato da HRSA (Health Resources and Services Administration). Lo scopo di NNSGRC è di fornire un forum per l’interazione fra consumatori,

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professionisti del settore sanitario, ricercatori, organizzazioni e politici per la messa a punto e lo sviluppo di programmi di salute pubblica per lo screening neonatale e la genetica; inoltre, di servire da centro risorse a livello nazionale per informazioni e formazione nel campo dello screening neonatale e della genetica.

http://genes-r-us.uthscsa.edu/

Rare Disease UKRare Disease UK è un’alleanza fra i principali enti per lo sviluppo della pianificazione strategica riguardo le malattie rare nel Regno Unito.

http://www.raredisease.org.uk/

Save Babies Through Screening FoundationLo scopo della Save Babies Through Screening Foundation è migliorare la vita dei bambini mediante la prevenzione di disabilità intellettuale, disabilità e morte dovute alle alterazioni individuabili mediante lo screening neonatale con campioni di sangue prelevato dal tallone.

http:// www.savebabies.org/http://www.savebabiescanada.org/http://www.savebabiesuk.org/

SSIEMLo scopo della SSIEM (Society for the Study of Inborn Errors of Metabolism) è di promuovere lo studio dei disordini metabolici ereditari e delle relative tematiche. La società, fondata nel 1963, opera per la promozione dello scambio di idee fra operatori professionisti di diverse discipline che sono interessati alle patologie metaboliche ereditarie.

http://www.ssiem.org/

UK Newborn Screening Programme CentreLo UK Newborn Screening Programme Centre ha la responsabilità di sviluppare, implementare e mantenere un programma di screening di alta qualità, uniforme, per tutti i neonati e i loro genitori.

http://newbornbloodspot.screening.nhs.uk/

UK NSCLo UK NSC (UK National Screening Committee) informa i ministeri e l’NHS operanti nelle quattro nazioni che costituiscono il Regno Unito circa tutti gli aspetti dello screening e sostiene l’implementazione dei programmi di screening. Mediante i dati della ricerca, programmi pilota e valutazioni di ordine

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economico, tale comitato valuta i dati relativi ai programmi mediante criteri riconosciuti a livello internazionale.

Inoltre lo UK NSC mette in atto meccanismi pratici per la supervisione dell’introduzione di nuovi programmi nell’NHS inglese e controlla l’efficacia e la qualità di questi programmi.

http://www.nsc.nhs.uk/

AbbreviazioniACMG American College of Medical GeneticsAPHL Association of Public Health LaboratoriesBIA Test di inibizione battericaBKT Deficit di β­chetotiolasiBUN Livello di azoto ureicoCAH Iperplasia surrenale congenitaCBS Cistationina β­sintasiCDC Centers for Disease Control and Prevention

(Centri per il controllo e la prevenzione delle malattie)CF Fibrosi cisticaCFTR Regolatore transmembranico di conduttanza della fibrosi cisticaCH Ipotiroidismo congenitoCK CreatinchinasiCUD Deficit primitivo di carnitinaCYP21 Enzima steroide 21­idrossilasiEGAN European Genetic Alliances NetworkEPF European Patients’ Forum (Forum Europeo dei Pazienti)FT4 Tirossina liberaG6PD Glucosio­6­fosfato deidrogenasiGA­I Aciduria glutarica tipo IGA­II Aciduria glutarica tipo IIGALE UDP galattosio epimerasiGALK GalattochinasiGALT Galattosio­1­fosfato­uridil­transferasi.GCD Glutaril­CoA deidrogenasiGI GastrointestinaleHbA Emoglobina adultaHbF Emoglobina fetaleHCY OmocistinuriaHELLP Emolisi, enzimi epatici elevati e bassa conta piastrinicaHMG 3­idrossi­3­metilglutaril aciduria

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HPA IperfenilalaninemiaHRSA Health Resources and Services AdministrationTSH Ormone di stimolazione della tiroideIEF IsoelettrofocalizzazioneIFMA Dosaggio immunofluorimetricoIRMA Dosaggio immunoradiometricoIRT Tripsina immunoreattivaISNS International Society for Neonatal ScreeningIVA Acidemia isovalericaIV Infusione endovenosaLCHAD 3­idrossiacil­CoA deidrogenasi a catena lungaMCAD Deficit di acil­CoA deidrogenasi a catena media3­MCC Deficit di 3­metil­crotonil­CoA carbossilasiMCD Deficit multiplo di carbossilasiMSMS Spettrometria di massa tandemMSUD Malattia delle urine a sciroppo d’aceroMUT Acidemie metilmalonicheNADP Nicotinammide adenina dinucleotide fosfatoNADPH Nicotinammide adenina dinucleotide fosfato (ridotto)NNSGRC National Newborn Screening and Genetics Resource Center17­OHP 17­OH­progesteronePCR Reazione a catena della polimerasipI Punto isoelettricoPKU FenilchetonuriaPA Acidemia propionicaRIA Dosaggio radioimmunologicoRUSP Recommended uniform screening panel

(informativa per l'uniformità consigliata dello screening)SCHAD 3­idrossiacil­CoA deidrogenasi a catena cortaSCID Immunodeficienza combinata graveSIDS Sindrome della morte neonatale improvvisaSSIEM Society for the Study of Inborn Errors of MetabolismT4 TirossinaTBG Globulina legante la tirossinaTFP Deficit di proteina trifunzionaleTREC Frammento circolare di escissione del recettore dei linfociti TTR­FRET Trasferimento di energia a risonanza di fluorescenzaTYR­I Tirosinemia tipo IUK NSC UK National Screening CommitteeVLCAD Deficit di acil­CoA deidrogenasi a catena molto lunga

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