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Secuenciación de Nueva Generación (NGS) para la Caracterización y Análisis de
Organismos Genéticamente Modificados (OGM)
Marco legal De acuerdo con el Protocolo de Cartagena sobre seguridad de la biotecnología del convenio sobre la diversidad biológica.
Anexo III, sobre la Evaluación del Riesgo:
a. Una identificación de cualquier característica genotípica y fenotípica nueva relacionada con el organismo vivo modificado que pueda tener efectos adversos en la diversidad biológica y en el probable medio receptor, teniendo también en cuenta los riesgos para la salud humana;
Diferentes regulaciones en el mundo:
• Información del evento o construcción (Argentina)
• Caracterización genético molecular (Uruguay)
• Caracterización del OGM (México)
• Caracterización del evento (Colombia)
a) Métodos convencionales de ingeniería genética:
1. Agrobacterium tumefaciens
2. Bombardeo de partículas “biobalística”
b)Nuevas técnicas de mejoramiento
1. Mutagénesis dirigida por Oligonucleótidos
2. Cisgénesis
3. Metilación de ADN, ARN-dependiente
4. Injertos en Biotecnología
5. Ingeniería reversa
6. Agro-infiltración
7. Edición de Genomas con Nucleasas Sintéticas
8. Genómica sintética
Información de la caracterización molecular
• Genotípica
•Fenotípica
Evaluación del Riesgo • Análisis
• Dictamen
Identificación del OGM • NGS
• PCR
Objetivo:
Mostrar el uso de la tecnología de la secuenciación de nueva generación para coadyuvar en la evaluación del riego a través de dotar de mayores elementos técnico científicos a los reguladores en materia de bioseguridad de organismos genéticamente modificados.
¿QUÉ ES LA SECUENCIACIÓN?
Determinación del
orden exacto de los
pares de bases de una
región específica
de DNA
La
SECUENCIACIÓN
amplía la
información genética
del organismo a
analizar y permite
confirmar su
identidad
HISTORIA DE LA SECUENCIACIÓN
1953 1977 1983 1986 1990 1995 1996
Descubrimiento
de la doble
hélice del DNA
por Watson y
Crick
Secuenciación de
Maxam-Gilbert
Secuenciación de
Frederick Sanger
Reacción en Cadena
de la Polimerasa
(PCR), desarrollada
por Kary B. Mullis
Applied Biosystems
pone en el mercado
el primer
secuenciador
automatizado (ABI
370)
Inicio del
proyecto del
genoma
humano
Primer genoma
completo de un
organismo libre
vivo, la bacteria
Haemoplhilus
Influenzae
Publicación del
método de
Pirosecuenciación
por Pál Nyren y
Mostafa Ronaghi
HISTORIA DE LA SECUENCIACIÓN
2000 2003 2004 2006 2010 2011
Publicación del método
“MPSS” por Lynx
Technologies, lanzando
la Secuenciación de
Nueva Generación
(NGS)
Término del Proyecto
del Genoma humano
Sale al mercado el
secuenciador de
nueva generación de
Illumina
Life Technologies
pone en el
mercado nuevas
tecnologías
454 Life Sciences saca
al mercado la versión de
secuenciación por
Pirpsecuenciación
Pacific Biosciences
comercializa la
secuenciación
SMRT(del
inglés single
molecule real time
sequencing)
CLASIFICACIÓN DE LA SECUENCIACIÓN
Platform Instrument Year Reads per run Read length Bases per run (gigabases)
ABI Sanger 3730xl - 96 800 0.0000768
454 GS20 2005 200000 100 0.02
Illumina GA (launch?) 2006 28000000 25 0.7
454 GS FLX 2007 400000 250 0.1
SOLiD 1 2007 40000000 25 1
Illumina GA 2008 28000000 35 1
SOLiD 2 2008 115000000 35 4
454 GS FLX Titanium 2009 1000000 500 0.45
Illumina GAIIx 2009 440000000 75 33
Illumina HiSeq 2010 2000000000 100 200
454 GS FLX+ 2011 1000000 700 0.5
IonTorrent PGM 314 chip 2011 100000 100 0.01
IonTorrent PGM 316 chip 2011 1000000 100 0.1
IonTorrent PGM 318 chip 2011 5000000 100 0.5
Illumina GAIIx 2011 640000000 75 48
Illumina HiSeq 2011 3000000000 100 600
Illumina MiSeq 2011 30000000 150 4.5
SOLiD 5500xl 2011 3000000000 60 180
PacBio RS C1 2011 36000 1300 0.045
IonTorrent PGM 318 2012 5000000 200 1
IonTorrent Proton 2012 50000000 200 10
Illumina MiSeq 2012 30000000 250 8.5
PacBio RS C2 2012 36000 2500 0.09
PacBio RS C2 XL 2012 36000 4300 0.155
www.454.com
EVOLUCIÓN EN LA ESCALA DE LOS PROYECTOS CIENTÍFICOS
EVOLUCIÓN DE LA CAPACIDAD DE
SECUENCIACIÓN
Ejemplo:
Genoma humano
20 instituciones de todo el
mundo
10-13 años de trabajo
3,000 millones de dólares
Miles de científicos y
técnicos
1 laboratorio de
secuenciación masiva
14 - 45 días
Aprox 5,000-10,000
dólares (Dependiendo del
nivel de análisis deseado)
Un par de científicos y
técnicos
Antes Ahora
Usa dideoxinucleotidos.
Reacción de Terminación de Cadena.
SECUENCIACIÓN TIPO SANGER
SECUENCIACIÓN DE NUEVA
GENERACIÓN (NGS) Secuenciación masiva en paralelo, durante la cual
millones de fragmentos de ADN a partir de una
sola muestra se secuencian al unísono.
¿Qué es la Bioinformática?
¿Qué es la Bioinformática?
CHIPseq
RNAseq Exoma
Genoma completo
Metagenomica
Deteccion de SNPs
NGS
Biología
Química
Estadística
C. Computacionales
TI
Bioinformática
Datos B+T+C+E+Q Integración
conceptual y computacional
Modelos Bioinformática
Biología Ciencias computacionales y
tecnologías de la información Bioinformática
Ejemplo: Búsqueda de una secuencia de ADN o de proteína en una base de datos.
Es la integración y análisis de datos (principalmente moleculares) mediante una intersección de modelos bioquímicos, matemáticos y
biológicos a través de métodos computacionales y de tecnologías de la información para extraer y estructurar información de tipo biológica,
química, epidemiológica, etc a partir de dichos datos.
Bioinformática para OGM • La bioinformática se aplica en el análisis de OGM a distintos niveles:
1. Estructuración de la información molecular regulatoria asociada a OGMs en bases de datos.Ejemplo: GmoDetectionDatabase (http://gmdd.shgmo.org/) .
2. Desarrollo de software para la toma de decisiones. Ejemplo: GMOseek (http://www.gmoseek.com/) .
3. Desarrollo de algoritmos para el análisis de datos de secuenciación masiva de OGM. Ejemplo: Transeq. (http://www.nature.com/srep/2013/131003/srep02839/full/srep02839.html)
4. Creación in-silico de sistemas análisis de OGM: Ejemplo: Métodos de detección por primers y PCR.
5. Integración de datos moleculares, bases de datos, información regulatoria y datos de secuenciación en sistemas de análisis que permitan caracterizar muestras transgénicas: Ejemplo: Trabajo del CNRDOGM.
Bioinformática básica para análisis de datos de NGS: Los dos tipos básicos de análisis:
Mapeo a referencia y ensamble de novo
Tomado de : http://www.diss.fu-berlin.de/diss/servlets/MCRFileNodeServlet/FUDISS_derivate_000000014352/thesis_nocv_neu.pdf
Consideración de la información de secuencia en la ley
• La palabra secuencia aparece 14 veces en el reglamento de la Ley de Bioseguridad de OGM al 28 de Abril del 2015.
• El término secuencia se encuentra contemplado en los
títulos segundo (Permisos para las actividades con OGM) y tercero (De las autorizaciones) de dicho reglamento.
• Aún donde el término secuencia no es usado hay
apartados donde esta información en conjunto el análisis bioinformático podría proveer el dato requerido por la ley.
A continuación los ejemplos para el caso del titulo segundo…
Food Anal. Methods, DOI 10.1007/s12161-013-9673-x
Información solicitada en el RLBOGM que puede ser presentada a partir de NGS
Tomado de: http://www.foodstandards.gov.au/code/applications/Documents/A1097-GM-CFS-SD1.pdf
INJERTOS VEGETALES
El injerto es la unión física de dos
plantas, la que proporciona la raíz se
llama patrón, portainjerto o pie y la
segunda es el vástago o injerto.
Ambas crecen como un solo individuo.
El portainjerto y/o el injerto pueden
transformarse a través de:
• Agrobacterium thumefasciens
• Biobalística
• Transgénesis
• Cisgenesis
• Etc.
Beatriz Xoconostle Cázares, Depto. de Biotecnología, CINVESTAV IPN
INJERTOS VEGETALES
Posibilidades:
Beatriz Xoconostle Cázares, Depto. de Biotecnología, CINVESTAV IPN
A B
Caracterización Detección Referencia
Secuenciación del
fruto y/o porta-injerto
Secuenciación de
genoma completo
PCR (diseño de
oligos)
Science 1 May 2009:
Vol. 324 no. 5927 pp. 649-
651,DOI: 10.1126/science.1170,397
Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Feb 14; 109(7):
2439–2443.
MUTAGÉNESIS DIRIGIDA POR
OLIGONUCLEÓTIDOS (ODM)
Mutare (cambiar)
alteración o cambio en la información
genética (genotipo) de un ser vivo y que
por lo tanto, va a modificar las
características de éste; además se
puede heredar a la descendencia.
Dvorak Montiel Condado, Ph. D Profesor Tiempo Completo Facultad de Ciencias Biológicas, UANL.
Técnica empleada para corregir o
introducir cambios específicos en sitios
definidos del genoma.
El oligonucleótido NO se integra al
genoma de las células de la planta
hasta que se INDUCE el Mecanismo de
Reparación que
cambia la secuencia endógena por la
secuencia deseada.
MUTAGÉNESIS DIRIGIDA POR
OLIGONUCLEÓTIDOS (ODM)
NO requiere de la introducción
de secuencias de ADN de
otras especies al genoma
natural.
Dvorak Montiel Condado, Ph. D Profesor Tiempo Completo Facultad de Ciencias Biológicas, UANL.
Caracterización Detección Publicación
Secuenciación por amplicones/Resecuenciación
NA GA21
METILACIÓN DE DNA DIRIGIDA POR RNA (RdDM)
La expresión de genes se modifica a
través de epigenética
RdDM induce al gen transcripcional de
silenciamiento (TGS ) de determinados
genes a través de la metilación de
secuencias promotoras. A fin de que
obtener la RdDM, los genes que
codifican para RNAs, los cuales son
homólogas a las regiones promotoras,
son liberados a las células de las
plantas por métodos adecuados de
transformación. Esto implica , en algún
momento, la producción de una planta
transgénica.
Dr. Edgar Rodríguez Negrete, CINVESTAV-IRAPUATO
METILACIÓN DE DNA DIRIGIDA POR RNA (RdDM)
Caracterización Detección Publicación
Secuenciación de bisulfito NA Methods Mol Biol. 2011;744:187-97. doi: 10.1007/978-1-61779-123-9_13.
MEJORAMIENTO GENÉTICO REVERSO
DR. YURI JORGE PEÑA RAMÍREZ, ECOSUR CAMPECHE
Método en el cual el orden de los
acontecimientos que conducen a la
producción de una variedad de
planta híbrida se invierte.
Hace uso de transgénesis para
suprimir la recombinación meiótica.
en pasos subsiguientes, sólo las
plantas no transgénicas son
seleccionadas.
Se lleva a cabo a través del
silenciamiento de genes.
MEJORAMIENTO GENÉTICO REVERSO
Hace uso de transgénesis para suprimir
la recombinación meiótica. en pasos
subsiguientes, sólo las plantas no
transgénicas son seleccionadas.
Caracterización Detección Referencia
Secuenciación de genoma
completo NA Sin referencia
Tecnología Técnica de NGS aplicable
Técnica de detección aplicable
Referencia
Dedos de Zinc Secuenciación de genoma completo
PCR de región modificada por los dedos de zinc
Moreover, sequence analysis of the entire ben-1(y462) mutant genome revealed only two indels: the ZFN-induced ben-1 mutation and a deletion unlikely to have been caused by ZFN activity. The latter arose at a site unrelated to the ZFN site (fig. S4) and at a frequency consistent with spontaneous C. elegans indels (3). PMCID: PMC3489282
DEDOS DE ZINC
Tecnología Aplicación de NGS Técnica de detección aplicable
Referencia
Cisgénesis /Intragénesis
Secuenciación de regiones flanqueantes
PCR de regiones flanqueantes.
Schubert and Williams state it would be difficult to characterize cisgenic plants at the genomic level and monitor them after release. However, this is not the case. As long as the insertion site differs from the native genomic site, an event-specific PCR reaction can be developed with one primer that anneals to the inserted sequence and another primer that anneals to flanking DNA. The flanking DNA can be sequenced by using commonly available genome walking kits. Nature Biotechnology 24, 1331 - 1333 (2006) doi:10.1038/nbt1106-1331
CISGÉNESIS E INTRAGÉNESIS
Tecnología Aplicación de NGS Técnica de detección aplicable
Referencia
Agroinfiltración
RNAseq, Metagenómica,
RNAseq, no aplica PCR
Prior to further propagation of plant tissue infected withAgrobacterium, the plant material should be screened for the absence of any foreign DNA sequences (e.g., chromosomal Agrobacterium DNA or T-DNA). Use of Novel Techniques in Plant Breeding and Practical Consequences Concerning Detection, Traceability, Labeling, and Risk Assessment
Agroinfiltración
Tecnología Técnica de NGS aplicable
Técnica de detección aplicable
Referencia
Genómica sintética
Secuenciación de genoma completo
PCR de marcas de agua de “mensajes encriptados en el genoma”
Creation of a Bacterial Cell Controlled by a Chemically Synthesized Genome
GENÓMICA SINTÉTICA
GRACIAS POR SU ATENCIÓN
Muchas Gracias!!!