UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN VETERINAR CLUJ-NAPOCAFACULTATEA DE ZOOTEHNIE I BIOTEHNOLOGII COALA DOCTORAL: RESURSE VEGETALE I ANIMALE DOMENIU: BIOTEHNOLOGII

Ing. PAG ANDREEA IOANA

REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT

CARACTERIZAREA I VALORIFICAREA LIGNANILOR DIN SEMINELE DE IN

CONDUCTOR STIINIFICProf. univ. dr. CARMEN SOCACIU

CLUJ-NAPOCA 2014

CUPRINSINTRODUCERE: SCOP I OBIECTIVEIVREZULTATE EXPERIMENTALEVICAPITOLUL I.OPTIMIZAREA METODEI DE EXTRACIE A LIGNANILORVIII.1 Probe analizate, proceduri i optimizriVII

I.1.1 Caracterizarea materialului vegetal: aspect morfologic, provenien

VII

Obinerea coci din semine de inVIIPregtirea materialului vegetal pentru extracieVIII.1.3.1Proceduri de extracieVIIII.2Caracterizarea extractelor hidroalcoolice din semine de inIXdegresateI.2.1Materiale i metodeIXRezultate i discuiiXCaracterizarea extractelor prin analiz spectrometric UV-VISX

Determinarea compuilor fenolici totali prin metoda Folin Cioclteu

XIV

Determinarea activitii antioxidante a extractelorXVII.3 ConcluziiXVIIII.5.1 Analiza cromatografic a extractelorXVIIII.5.2 Rezultate i discuiiXVIIII.6.1 Activitatea antimicrobiana a extractelorXXII.6.2 Rezultate i discuiiXXIII.7ConcluziiXXII

CAPITOLUL II.CARACTERIZAREA COMPARATIV A COMPOZIIEI N LIGNANI A EXTRACTELOR OBINUTE DIN DIFERITETIPURI DE SEMINE DE IN PRIN ANALIZA SPECTROMETRIC

XXIV

II.1Probe analizate, proceduri de obinereXXVII.1.1Selectarea materialului vegetalXXVII.2 Obinerea extractelor din diferite tipuri de semine de inXXV

II.3 Caracterizarea extractelor hidroalcoolice din semine de in degresate

XXVI

II.3.1Materiale si metodeXXVI

II.3.2Rezultate si discuiiXXVII

Amprenta spectrometric UV-VIS a extractelorXXVII

Determinarea compuilor fenolici totali prin metoda FolinXXVII

Cioclteu

Determinarea activitii antioxidante a extractelorXXVIII

Caracterizarea extractelor prin analiza spectrometric FT-MIRXXIX

Analiza tip Principal Component Analysis (PCA)XXXI

II.3.3ConcluziiXXXI

3CAPITOLUL III.ANALIZA VARIABILITII DE COMPOZIIE N LIGNANI A EXTRACTELOR OBINUTE DIN DIFERITE TIPURI DE SEMINE DE IN INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE

XXXIII

III.1 Materiale i metodeXXXIVIII.2 Rezultate si discuiiXXXIVIII.3 ConcluziiXXXVICAPITOLUL IV.

OBINEREA I CARACTERIZAREA UNOR PRODUSE CE VALORIFIC POTENIALUL BIOMEDICAL AL LIGNANILOR

XXXVIII

IV.1Obinerea alimentelor funcionaleXXXVIII

IV.2Caracterizarea alimentelor funcionaleXL

IV.2.1Materiale i metodeXL

IV.2.2Rezultate i discuiiXL

IV.2.3ConcluziiXLI

Concluzii generaleXLII

BIBLIOGRAFIEXLIII

INTRODUCERE: SCOP I OBIECTIVE

Descoperirile arheologice sugereaz ca inul (Linum usitatissimum L.) a fost folosit de oameni nc de acum aproximativ 10.000 de ani. Acesta a fost, probabil, una dintre primele plante care au fost domesticite, acum aproximativ 6.000 de ani .Hr. n Mesopotamia.

Conform datelor arheologice, seminele de in au fost ncorporate n pine n Iordania i n Grecia n urm cu 3000 ani. Uleiul din semine de in a fost utilizat ca aliment, n scopuri medicale nc din antichitate (Vaisey-Genser and Morris, 2003), dar i pentru fabricarea de vopsele. Seminele de in prezint i acum un interes sporit datorit coninutului ridicat de coninut ridicat de compui bioactivi fenolici (acizi fenolici i lignani), fibre alimentare i acizi grai eseniali omega 3, omega 6 i omega 9 (Dean, 2003).

Datorit componentelor bioactive i a nutrienilor din seminele de in, acestea au devenit ingrediente folosite n dieta uman. Seminele de in sunt utilizate pe scar larg pentru realizarea de produse alimentare funcionale. Cererea crescnd a pieei pentru produse alimentare dietetice, cu coninut sporit de fibre i alte substane biologic active poate fi echilibrat prin diversificarea sortimentelor de produse, trend n care se nscriu i produsele cu formulri inovative propuse. Componentele din seminele de in, care confer o serie de beneficii pentru sntate sunt fibrele, lignanii i acizii grai (Omega-3 i omega 6). (Oomah, 2001).

Scopul cercetrilor a fost caracterizarea variabilitii de compoziie n lignani a apte soiuri diferite de semine de in, optimizarea sistemelor de extracie, de identificare i dozare cromatografic i formularea unor produse cu valoare nutriional superioar care valorific potenialul biomedical al lignanilor.

4Obiectivele punctuale ale cercetrilor proprii au urmrit:1. Optimizarea sistemelor de extracie, de identificare i dozare cromatografic a lignanilor2. Caracterizarea comparativ a variabilitii de compoziie a extractelor de tip hidroalcoolic, din cele apte soiuri de in investigate, utiliznd metode analitice avansate (spectrometrie de tip UV-VIS, spectrometrie in Infrarou Mediu (FT- MIR), LC-DAD-MS, HPLC i GC-MS3. Obinerea i caracterizarea unor preparate care valorific potenialul biomedical al lignanilor

Teza este mprit n dou pri .Prima parte este de studiu bibliografic i include dou capitole (1-2): Capitolul I. Seminele de in potenial surs de lignaniCapitolul II. Metode de extracie i analiz a lignanilor

Partea a doua este partea de cercetri proprii i cuprinde patru capitole (3-6): Capitolul III. Metode de extracie a lignanilor. Optimizarea extracieiCapitolul IV. Caracterizarea comparativ a compoziiei extractelor obinute din diferite tipuri de semine de in prin analiza spectrometricCapitolul V. Analiza variabilitii de compoziie n lignani a extractelor obinute din diferite tipuri de semine de in investigate prin cromatografieCapitolul VI. Obinerea i caracterizarea unor produse ce valorific potenialul biomedical al lignanilor

6REZULTATE EXPERIMENTALE

Utilizrile seminelor de in pot fi clasificate n trei grupe principale: (1) producia de uleiuri n scopuri comestibile (ca produs natural consumat ca atare, pentru gtit, ca ingredient de panificaie, ingredient n produse de tip margarin) i aplicaii industriale (ca ntrire agent, pictur, cerneal de imprimant i a vopselurilor), (2) producia de fibre pentru industria textil, i (3) utilizarea seminelor ca materie prim pentru obinerea de produse cu valoare adugat (coca de in, suplimente alimentare cu coninut ridicat n lignani), ca ingredient n industria alimentar (intr n componena produselor de panificaie, paste i cereale pentru micul dejun), ca aliment funcional (pentru a oferi protecie mpotriva anumitor tipuri de cancer, boli de inim, hiperglicemie, accident vascular cerebral i tromboz), ca hran pentru animale, n form de coc rezultat din presarea seminelor (pentru bivoli, vite, cai, psri de curte, pisici i cini) (Jhala and Hall, 2010; Oomah, 2001; Singh et al., 2011).Mai recent, a crescut interesul pentru ncorporarea seminelor de in ntr-o serie de produse alimentare i ingrediente bioactive pentru sntatea uman, inclusiv lignani, secoisolariciresinol diglucozid (SDG), acid -linolenic (ALA) i polizaharide non- amidon (gum sau fibre) (Hall et al., 2006). De exemplu, fina din semine de in a fost introdus ca hran pentru multe animale din ferme (pentru lapte i ou) i pete, pentru a mbogi produsele lor cu acizi grai omega-3 (Jiang et al., 1991; Kennelly, 1996; Thompson and Cunnane, 2003).n ceea ce privete coninutul n lignani, seminele de in reprezint cea mai nsemnat surs de lignani (coninutul n lignani este de 800 de ori mai mare dect n orice alt surs alimentar) (Meagher and Beecher, 2000; Milder et al., 2005; Smeds et al., 2007; Cornwell et al., 2004).

CAPITOLUL I.METODE DE EXTRACIE A LIGNANILOR. OPTIMIZAREA EXTRACIEII.1 PROBE ANALIZATE, PROCEDURI I OPTIMIZRII.1.1 Caracterizarea materialului vegetal: aspect morfologic, provenienMateria prim a constat n seminele de in din soiul Cosmin, cunoscut ca soi i pentru obinerea de fibre de bun calitate, provenite de la Staiunea de Cercetare- Dezvoltare Agricol Livada din judeul Satu-Mare.

Figura I.1 Semine de in (soi Cosmin)Coca de in obinut n urma presrii la rece a seminelor de in a constituit materia prim pentru obinerea extractelor, deoarece valorific un subprodus rezultat din industria uleiurilor i prezint o serie de avantaje la condiionarea materialului vegetal: mcinarea i degresarea este mai facil deoarece cea mai mare parte din ulei este ndeprtat i valorificat superior.

I.1.2 Obinerea coci din semine de inSeminele presate cu o pres de capacitate 8-10 kg/or, produs de SC GAMM SRL, Romnia. Coca obinut, a fost lsat la temperatura camerei s se rceasc, apoi a fost depozitat n condiii de refrigerare pn la utilizare.

I.1.3. Pregtirea materialului vegetal pentru extaciePregtirea materialului vegetal a constat supunerea acestuia unei serii de operaii: mcinare, uscare i degresare, deoarece n literatura de specialitate se menioneaz c prin degresare, cantitatea de polifenoli i implicit i lignani se poate dubla, sau n unele cazuri chiar se poate tripla (Hall et al., 2006).

VIII.1.3.1 Proceduri de extracie a lignanilor15 grame de coc de in, mcinat, uscat i degresat a fost supus operaiei de extracie prin adugarea proporiei de solvent aferent fiecrei probe conform planului de lucru, timp de 3-4 ore, la 600C.Parametrii variai n scopul optimizrii extraciei lignanilor au fost: raportul etanol:ap (v:v) i anume 100:0; 80:20; 60:40.

I.1.3.2 HidrolizaA) Hidroliza acid a extractelor brute10 ml extract brut, a fost hidrolizat acid prin adugarea a 1,644 ml acid clorhidric 37%, timp de 2 ore.Deoarece n literatura de specialitate, datele existente menioneaz mai multe tipuri de hidroliz, s-a ncercat optimizarea acesteia prin varierea temperaturii de hidroliz (60-800C).

B) Hidroliza enzimaticDeoarece lignanii din seminele de in se afl localizai n inveliul exterior al seminelor, s-a ncercat o prehidroliz enzimatic - o fermentare n stare solid (solide state fermentation, SSF) a coci de in, nainte de extracia cu solvent propriu-zis, cu lacaze provenite de la mucegaiuri: Phanerochaete chrysosporium i Trichoderma reesei.Parametrii variai n scopul optimizrii extraciei au fost: timpul de expunere al materialului vegetal la prehidroliza enzimatic (Trichoderma reesei) i o comparaie ntre prehidroliza enzimatic cu Phanerochaete chrysosporium i Trichoderma reesei.

C) NeutralizareaA fost necesar n scopul neutralizrii acidului clorhidric prezent n extracte, dar i pentru oprirea procesului hidrolitic.

D) FiltrareaFiltrarea are ca scop obinerea unei soluii limpezi din suspensia extractelor hidrolizate. Extractele au fost filtrate prin filtre cu membran polisulfon:poliflorur de vinilen (PSF:PVDF) cu dimensiunea porilor 0,45 m.

8I. 2 CARACTERIZAREA EXTRACTELOR HIDROALCOOLICE DIN SEMINE DE IN DEGRESATEI.2.1. Materiale si metodeA) Amprenta spectrometric UV-VIS a extractelorExtractele au fost diluate 1:110. Din extractele diluate s-a prelevat 3 ml prob, care a fost introdus ntr-o cuv de cuar (Helma Analytics, de grosime 100 mm). Citirea probelor s-a fcut n intervalul 210-400 nm, n raport cu un blank, care a fost apa distilat. nregistrarea datelor s-a fcut cu ajutorul programului WinASPECT Versiunea 2.2.1.0.

B) Determinarea compuilor fenolici totali prin metoda Folin Cioclteu1 ml extract a fost adugat ntr-un balon cotat de 25 ml care a fost adus la semn cu ap distilat. Balonul a fost agitat i din acesta a fost prelevat 1 ml prob, la care s-a adugat 0,5 ml reactiv Folin-Cioclteu, 2 ml carbonat de sodiu, Na2CO3, 20% i 5 ml ap distilat. Amestecul a fost inut la ntuneric 90 min, absorbana probelor a fost citit la 765 nm, n raport cu un martor preparat n aceleai condiii, cu ajutorul unui spectofotometru UV-VIS, model Specord 200 (Abdel-Hameed, 2009; Grubesic et al., 2005).

C) Determinarea activitii antioxidante a extractelorA fost determinat activitatea antioxidant att pentru extractele brute, ct i pentru cele hidrolizate, astfel: din extractele brute, respectiv cele hidrolizate s-a amestecat o cantitate de 100 l cu 3 ml DPPH (0,2 mM). Amestecul de reacie a fost agitat i meninut la temperatura camerei, la ntuneric pentru o or. Absorbana s-a citit la 517 nm fa de un blank. nregistrarea datelor s-a fcut cu ajutorul programului WinASPECT Versiunea 2.2.1.0. S-au identificat absorbiile specifice la lungimile de und cu maxim i s-au msurat intensitile de absorbie.

9I.3. REZULTATE I DISCUIIA) Amprenta spectrometric UV-VIS a extractelorS-au identificat absorbiile specifice la lungimile de und cu maxim i s-au msurat intensitile de absorbie.n funcie de absorbiile specifice, s-au fcut identificri ale grupurilor de molecule, pe domenii: 212-214 nm pentru compui lipidici (fitosteroli, lipide polare), unor vitamine (vitamina C, E) i terpenoide (Wrolstad et al., 2005); 275-290 nm pentru compui fenolici (acizi fenolici liberi sau derivai ai acizilor fenolici) (Wrolstad et al., 2005); 270-290 nm pentru lignani (Amarowicz and Pegg, 2006); 320-330 nm pentru compuilor flavonoidici n forma liber sau glicozilai (Wrolstad et al., 2005); 390-420 nm pentru compui flavonoidici i chinone derivate prin oxidarea polifenolilor (Wrolstad et al., 2005).Figurile I.2-I. 12 reprezint spectrele suprapuse nregistrate comparativ pentru extracte brute i hidrolizate obinute n 4 i 3 ore:

Figura I.2 Spectrele suprapuse nregistrate comparativ pentru extracte brute obinute n4 (Proba 11) i 3 ore (Proba 14) cu etanol 100%Figura I.3 Spectrele suprapuse nregistrate comparativ pentru extracte brute obinute n 4 (Proba 21) i 3 ore (Proba 24) cu etanol80%

11

Figura I.4 Spectrele suprapuse nregistrate comparativ pentru extracte brute obinute n 4 (Proba 31) i 3 ore (Proba 34) cu etanol60%Figura I.5 Spectrele suprapuse nregistrate comparativ pentru extracte brute obinute n 4 ore, cu etanol 100% (Proba 11), cu etanol80% (Proba 21) i cu etanol 60% (Proba 31)

Figura I.6 Spectrele suprapuse nregistrate comparativ pentru extracte brute obinute n 3 ore, cu etanol 100% (Proba 14), cu etanol80% (Proba 24) i cu etanol 60% (Proba 34)Figura I.7 Spectrele suprapuse nregistrate comparativ pentru extract brut (Proba 11) i extracte hidrolizate la temperatura de 800C(Proba 111) i 600C (Proba 112), obinute n4 ore, cu 100% etanol

Figura I.8 Spectrele suprapuse nregistrate comparativ pentru extract brut (Proba 14) i extracte hidrolizate la temperatura de 800C(Proba 141) i 600C (Proba 142), obinute n3 ore, cu 100% etanolFigura I.9 Spectrele suprapuse nregistrate comparativ pentru extract brut (Proba 21) i extracte hidrolizate la temperatura de 800C(Proba 211) i 600C (Proba 212), obinute n4 ore, cu 80% etanol

Figura I.10 Spectrele suprapuse nregistrate comparativ pentru extract brut (Proba 24) i extracte hidrolizate la temperatura de 800C(Proba 241) i 600C (Proba 242), obinute n3 ore, cu 80% etanolFigura I.11 Spectrele suprapuse nregistrate comparativ pentru extract brut (Proba 31) i extracte hidrolizate la temperatura de 800C(Proba 311) i 600C (Proba 312), obinute n4 ore, cu 60% etanol

XII

Figura I.12 Spectrele suprapuse nregistrate comparativ pentru extract brut (Proba 34) i extracte hidrolizate la temperatura de 800C(Proba 341) i 600C (Proba 342), obinute n3 ore, cu 60% etanol

Din datele prezentate se pot sublinia urmtoarele constatri i concluzii: Extracte bruteSolventul este un factor care influeneaz puternic extracia acizilor fenolici.Din analiza amprentei UV-VIS a extractelor Figurile I.2-I4, a probelor brute reiese c o dat cu diluarea soluiei etanolice, folosit ca solvent, crete cantitatea de compui fenolici (275-290 nm) si compui flavonoidici, n form liber sau glucozilat (320-330 nm).Cea mai ridicat valoare n domeniu de absorbie specific acizilor fenolici, a fost nregistrat n cazul extractelor obinute cu 60% etanol (Proba 31) aa cum se poate observa i din Figura. I.5.Aceast constatare poate fi explicat prin atingerea unei polariti optime a solventului, deoarece adugarea apei n etanol duce la o cretere a polaritii solventului.n afar de polaritatea solventului, un alt motiv important pentru care s-a optat pentru utilizarea soluiilor etanolice n detrimentul soluiilor metanolice, a fost faptul c ne-am propus s valorificm extractele obinute prin aplicaii din domeniu alimentar.Timpul nu influeneaz major extracia de acizi fenolici (275-290 nm), astfel n cazul utilizrii etanolului 100% i 80% se obin extracte mai bogate n 3 ore, iar n cazul utilizrii etanolului 60% se obin extracte asemntoare att n 3, ct i n 4 ore.

13Extracte hidrolizateConform datelor prezentate (Figurile I.2-I.12) se constat c valorile absorbanei sunt mai mici, n cazul extractelor brute dect n cazul extractelor hidrolizate, ndeosebi n domeniul specific absorbiei acizilor fenolici (275-290 nm) i flavonoidelor (320-330 nm).La toate tipurile de extracte, att cele obinute cu etanol 100%, cu etanol 80%, ct i cu etanol 60%, hidroliza influeneaz pozitiv cantitatea de acizi fenolici prezent n extracte.n cazul extractelor obinute cu etanol 100% n 4 ore (Figura I.7), temperatura optim de hidroliz pentru obinerea cantitii maxime de acizi fenolici este de 600C (Proba 112). La un timp de extracie de 3 ore, cantitile de acizi fenolici (275-290 nm) sunt aproximativ egale.Cantitatea maxim de acizi fenolici (275-290 nm) la extractele obinute cu etanol 80% n 3 i 4 ore, s-a obinut n cazul hidrolizei la temperatura de 800C.La extractele obinute cu etanol 60% n 3 i 4 ore, temperatura optim pentru obinerea celor mai bogate extracte n acizi fenolici (275-290 nm) este 800C .n zona specific acizi fenolici (275-290 nm), absorbana cea mai ridicat s-a ntlnit n cazul extractelor obinute n 3 ore, cu etanol 80%, hidrolizate la o temperatur de 800C (Proba 241). Deoarece lignanii i derivaii lor, ca i acizii fenolici au absorbiile specifice la lungimile de und de 270-290 nm, amprentele spectrale UV-VIS obinute, indic i prezena acestora n extracte.

B) Determinarea compuilor fenolici totali prin metoda Folin Cioclteun scopul determinarii compuilor fenolici totali, s-a trasat dreapta de etalonare, s- a determinat ecuaia de regresie i coeficientul de corelaie pentru acidul galic, iar rezultatele sunt exprimate n mg GAE/L.

14a) Determinarea compuilor fenolici totali a extractelor brute

Figura I.13 Cantitatea total de polifenoli a extractelor brute n funcie de concentraia solventului etanolic i de timpul de extracieDin datele prezentate se pot sublinia urmtoarele constatri i concluzii:n cazul extractelor brute, cantitatea de compui fenolici totali crete o dat cu scderea concentraiei soluiei de etanol. Astfel, cea mai sczut cantitate de compui fenolici totali o au extractele obinute cu 100%, iar cea mai mare cantitate de compui fenolici totali o au extractele obinute cu 60%. Timpul nu este un factor care influeneaz puternic cantitatea de compui fenolici totali, astfel valorile sunt apropiate att n cazul extractelor obinute n 3 i 4 ore.b) Determinarea compuilor fenolici totali din extractele hidrolizate

Figura I.14 Cantitatea total de polifenoli aFigura I.15 Cantitatea total de polifenoli

extractelor obinute n 4 ore, hidrolizate na extractelor obinute n 3 ore, hidrolizate

funcie de concentraia solventului i den funcie de concentraia solventului i de

temperatura la hidroliztemperatura la hidroliz

16Din datele prezentate se pot sublinia urmtoarele constatri i concluzii:Cantitatea de compui fenolici totali variaz att n extractele brute ct i n extractele hidrolizate, n funcie de concentraia de etanol, timpul de extracie i temperatura la care s-a realizat hidroliza.La extractele obinute cu etanol 100% i cu etanol 80%, hidroliza influeneaz pozitiv cantitatea de compui fenolici totali prezent n extracte, dar la extractele obinute cu etanol 60%, hidroliza o influeneaz negativ.n cazul tuturor extractelor, temperatura optim de hidroliz la care se obine valoarea maxim de compui fenolici totali este de 800C .Cel mai mare coninut de compui fenolici totali, de 908,27 mg GAE / L, s-a ntlnit la extractele obinute n 3 ore, cu etanol 80%, hidrolizate la o temperatur de 800C (Proba 241), pentru care s-a obinut i cea mai mare valoare a absorbanei la amprenta spectrometric UV-VIS a extractelor.Determinarea activitii antioxidante a extractelorc) Determinarea activitii antioxidante a extractelor bruteTabel I.1 Inhibiia (% reducere a DPPH) n funcie de concentraia solventului i timpul deextracie a extractelor brute

ProbaRaport etanol:ap (v:v)Timp de extracie (ore)Temperatura hidroliza ( grd C)Inhibiia (%)

11100:004extracte brute7,75

14100:003extracte brute5,14

2180:204extracte brute21,22

2480:203extracte brute23,34

3160:404extracte brute33,90

3460:403extracte brute31,78

Activitatea antioxidant a extractelor este influenat de concentraia soluiei etanolice utilizate. Aceasta crete o dat cu scderea concentraiei soluiei etanolice folosite la extracie. Astfel, cea mai sczut activitate antioxidant o au extractele obinute cu 100%, iar cea mai ridicat o au extractele obinute cu 60%. Timpul nu este un

factor care influeneaz puternic activitatea antioxidant, astfel valorile sunt apropiate att n cazul extractelor obinute n 3 i 4 ore.d) Determinarea activitaii antioxidante a extractelor hidrolizateTabel I.2 Inhibiia n funcie de concentraia solventului i timpul de extracie a extractelorhidrolizate

ProbaRaport etanol:ap (v:v)Timp de extracie (ore)Temperatura hidroliza ( grd C)Inhibiia (%)

111100:00480-13,09

112100:00460-26,22

141100:00380-13,81

142100:00360-12,35

21180:2048059,44

21280:2046051,78

24180:2038051,48

24280:2036041,30

31160:4048072,95

31260:4046062,42

34160:4038065,08

34260:4036050,56

Din datele prezentate se pot sublinia urmtoarele constatri i concluzii:La extractele obinute cu etanol 100%, hidroliza influeneaz negativ activitatea antioxidant, dar n cazul celorlate tipuri de extracte, hidroliza are o influen pozitiv.Pentru a obine cea mai ridicat activitate antioxidant, temperatura optim este de 800C, fapt ce se coreleaz cu rezultatele amprentei UV-VIS i ale determinrii cantitii de compui fenolici totali.Comparnd activitatea antioxidant a extractelor brute cu cea a celor hidrolizate, se poate observa c aceasta se dubleaza prin hidroliz. Acest fapt se datoreaz ruperii legturilor i deglicozilrii compuilor fenolici. Aceste constatri sunt susinute de ctre muli autori, care au raportat c activitatea antioxidant a compuilor fenolici este mai mare n cazul agliconilor dect n cazul glicozidelor corespunztoare (Kim and Lee, 2004; Fukumoto and Mazza, 2000; Rice-Evans et al., 1997).De asemenea, s-a obinut o corelaie bun ntre coninutul de compui fenolici totali (mg GAE / L) cu activitatea antioxidant a extractelor (%), de R2=0.9004.

XVII

I.4. CONCLUZIICantitatea total de polifenoli variaz n funcie de concentraia soluiei etanolice folosit ca solvent i de timpul de extracie, aa cum reiese i din Figura I.14-15.Experimentele desfurate pentru determinarea cantitii totale de polifenoli din extractele brute i hidrolizate au demonstrat c cea mai mare cantitate total de polifenoli o au extractele brute, obinute n 3 i 4 ore, cu o concentraie de 60% a soluiei etanolice folosite ca solvent.Cea mai mare cantitate de polifenoli a extractelor hidrolizate se gsete n cel obinut n 3 ore prin extracie cu etanol 80%, hidrolizat la temperatura de 800C, Figura I.15.

I.5.1 Analiza cromatografic a extractelorA) Identificarea lignanilor prin analiza HPLCPentru a identifica i cuantifica lignanii din extracte au fost adaptate metodele folosite de Xin Li et al., 2008 i Muir and Westcott 2000 (Li et al., 2008; Muir and Westcott, 2000). Analiza cromatografic s-a efectuat folosind un sistem HPLC Shimadzu, echipat cu un detector UV-VIS DAD i o coloan Zorbax, C18 4.6x 150 mm, 5m. Fazele mobile utilizate au fost acid acetic 1% n ap (A) i metanol (B) iar debitul a fost de 1.2 ml/min. Cuplajul este prevzut cu sistem de injectare automat, volumul de injecie al probei a fost de 20L. Pentru identificarea i cuantificarea lignanilor, au fost utilizate standarde de lignani SECO, LARI, MATA.

I.5.2. Rezultate si discuiia) Analiza HPLC a extractului brut si a hidrolizatelorPentru identificarea lignanilor din extractele vegetale s-au trasat iniial dreptele de etalonare pentru compuii standard.Din analiza cromatografic a extractelor brute a rezultat necesitatea etapei de hidroliz a extractelor, deoarece, aa cum reiese i din literatura de specialitate, lignanii nu sunt liberi, ci sunt legai ntr-un lan oligomeric.

18n urma varierii parametrilor de extracie i de hidroliz au rezultat cantiti diferite de lignani, aa cum reiese i din Tabelul I.3, dar care se ncadreaz n intervalul menionat n literatura de specialitate (Hall et al., 2006; Kasote et al., 2011; Milder et al., 2005; Obermeyer et al., 1995; Oomah, 2002).Tabel I.3 Cantitatea de SECO, LARI, MATA obinut pentru extracte

Raport etanol:ap (v:v)Timp de

extracie (ore)Temperatura Hidroliza (grd C)SECO(g/100 g semine)MATAg/100 g semine)

LARI(g/100 g semine)

100:0048021280,37683,42579,50

100:004609666,36720,01673,09

100:0038019555,24838,16727,94

100:0036010751,79985,88852,08

80:20480155675,161129,88814,96

80:20460199171,843059,371078,20

80:20380191497,161794,37919,38

80:20360182983,181881,291135,95

60:40480208828,871977,45844,29

60:40460304786,442474,361240,58

60:40380164071,392124,091169,43

60:40360315604,532558,511006,23

19Figura I.16 Cantitatea de SECO a extractelor brute i hidrolizate enzimatic (Extracte hidrolizate 1-Trichoderma reesei, Extracte hidrolizate 2-Phanerochaete crysosporium)

Figura I.17 Variaiile concentraiei SECO, obinute prin analiza HPLC a extractelor, n funcie de durata hidrolizei enzimatice aplicate naintea extraciei

Aa cum arat i Figura I.17, cantitatea de lignani obinut pentru extractele prehidrolizate enzimatic (24-258 ore) i ulterior supuse hidrolizei acide, la o temperatur de 800C concentrate i filtrate, este comparabil cu cea obinut n cazul extractelor clasice (nehidrolizate enzimatic). Dup cum se poate observa i n graficul din Figura I.17, n cazul hidrolizei enzimatice timpul optim este de 48 ore, obinndu-se o valoare similar cu extractul clasic. O prelungire a timpului de hidroliz enzimatic duce la obinerea unei cantiti mai mici de SECO datorit activitii fenoloxidazice secundare a enzimelor.n extractele brute analizate prin metoda HPLC, nu au putut fi identificai lignanii SECO, MATA, LARI. Acest fapt sugereaz c aceti agliconi nu exist n form liber n seminele de in. Prin urmare, o hidroliz acid preliminar este necesar pentru a elibera agliconii corespunztori din lanul oligomeric.n urma analizei cromatografice a extractelor hidrolizate s-au identificat SECO n concentraia cea mai mare i LARI, respectiv MATA n concentraii mai mici. De asemenea s-a observat i prezena unor ali compusi care absorb la lungimea de 280 de nm cu o intensitate ridicat, dar care nu au fost identificai conform etaloanelor. Datele

21obinute din analiza calitativ i cantitativ a probelor sunt n conformitate cu literatura de specialitate (lignani totali 330.000 370.000 g/100 g semine) (Hall et al., 2006; Kasote et al., 2011; Milder et al., 2005; Obermeyer et al., 1995; Oomah, 2002).Din figurile de mai sus se poate observa trendul ascendent al concentraiei de SECO, dinspre probele supuse extraciei cu etanol pur ctre probele obinute cu soluii etanolice de 80%, respectiv 60%, att n cazul extraciei de 4 ore ct i n cazul extraciei de 3 ore.Extractul cel mai bogat n SECO este obinut prin extracie cu 60% etanol. Acest aspect este ntrit i de costatarea anterioar, c polifenolii totali sunt n concentraie maxim n acel extract.n plus, probele obinute cu aceeai concentraie a soluiei etanolice, dar hidrolizate la temperaturi diferite ne indic o temperatur optim de hidroliz de 600C, pentru obinerea unei cantiti maxime de lignani.Probele obinute prin hidroliz (2M HCI) timp de 2 ore la 80C au prezentat o activitate antioxidant crescut comparativ cu cele hidrolizate la 60C. Acest lucru s-a ntmplat n ciuda scderii coninutului de SECO, MATA i LARI o dat cu creterea temperaturii de hidroliz. Acest fapt se poate datora i unei hidrolize avansate care conduce la o deglucozilare total lignanilor. Probabil n acest fel se pot obine cantiti mai mari de anhidro-SECO i ali agliconi, care prezint o cretere a activitii antioxidante n comparaie cu SDG, SMG i SECO (Kim and Lee, 2004; Rice-Evans et al., 1997).

I.6 ACTIVITATEA ANTIMICROBIAN A EXTRACTELOR

I.6.1 Caracterizarea activitii antimicrobiene a unor extracte de lignani din semine de in brute i hidrolizateO investigare tip screening a extractelor obinute prin metoda difuzimetric a fost aleas pentru a determina activitatea antimicrobian pe trei specii bacteriene Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 25922, precum i pe drojdia Candida parapsilosis ATCC 22019.

XXIII. 6.2 Rezultate i discuii

Tabel I.4

Zonele de inhibiie a extractelor i a antibioticelor de referin

Microorganisme de referinZonele de inhibiie (mm)

Inhibition areas (mm)

Staphylococcus aureusATCC 25923Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853Escherichia coliATCC 25922Candida parapsilosis ATCC 22019

Extract 116109-

Extract 21121415-

Extract 31121315-

Extract 41101212-

Gentamicin1719NDND

Ofloxacin211922ND

AmikacinND2121ND

Kanamicin18-18ND

Cefuroxim26-17ND

Eritromicin201011ND

FluconazolNDNDND-

NistatinNDNDND25

ND nedeterminatS-au observat zone de inhibiie semnificative n cazul tuturor celor 4 extracte brute proaspete nehidrolizate, neconcentrate, att asupra S. aureus (bacterie Gram pozitiv), ct mai ales asupra bacteriilor Gram negativ (Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa), comparabil cu activitatea antibacterian exercitat de antibioticele de referin.n ceea ce privete activitatea antimicotic, se constat c extractele brute, neconcentrate, nu manifest aciune mpotriva Candida parapsilosis.I.7 CONCLUZIIDin concluziile referitoare la datele prezentate n acest capitol se pot constata urmtoarele aspecte:1. Metoda spectrometric UV- VIS este adecvat pentru a face amprenta specific i comparativ a extractelor.

2. Extractele cu cel mai mare coninut de polifenoli totali i cea mai mare activitate antioxidant au fost cele care s-au evideniat i prin amprenta UV-VIS cu cea mai mare valoare a absorbanei (270-290nm).3. Extractele brute i hidrolizate obinut cu etanol 60% i 80% au prezentat o activitate antioxidant remarcabil ntre 21,22 i 72,95%, corelarea dintre aceasta i coninutul de compui fenolici totali este bun (R2 = 0.9004). Probele extrase utiliznd etanol 100%, au fost ineficiente n exprimarea unei activiti antioxidante semnificative, aceast constatare fiind explicabil prin coninutul lor sczut de polifenoli totali (206-241 mg GAE / L).4. Similar cu coninutul total de polifenoli, concentraiile SECO i LARI din extracte cresc pe msur ce concentraia etanolic scade, de la 0,9 mg SECO / 100 g semine pentru extractele etanolice 100% pn la 315 mg SECO / 100 g semine pentru extractele etanolice 60% i de la 0,57 mg LARI / 100 g semine pentru extractele etanolice 100% la 1,2 mg LARI / L pentru extractele etanolice 60% (Tabel I.3). n schimb, cel mai mare coninut de MATA (3,05) corespunde probei obinute cu soluie etanolic 80%.5. Putem trage concluzia c n vederea aplicaiilor practice, unde este vizat preponderent efectul antimicrobian, pot fi folosite att extractele hidrolizate (cu coninut superior de lignani) ct i extractele brute (cu coninut semnificativ de polifenoli totali).

23

CAPITOLUL II.

CARACTERIZAREA COMPARATIV A COMPOZIIEI N LIGNANI A EXTRACTELOR OBINUTE DIN DIFERITE TIPURI DE SEMINE DE INPRIN ANALIZA SPECTROMETRIC

OBIECTIVE I EXPERIMENTEPentru a caracteriza comparativ compoziia i cantitatea de lignani din diferite soiuri de semine de in, s-au urmrit dou obiective, i anume :I. stabilirea variabilitii coninutului de lignani i acizi fenolici n diferite soiuri de inII. stabilirea metodelor optime (de tip spectrometrie UV-VIS, FT-MIR) pentru evaluarea corect a concentraiilor de lignani i acizi fenolici

24

II.1 PROBE ANALIZATE, PROCEDURI DE OBINEREII.1.1. Selectarea materialului vegetalS-au utilizat 7 soiuri de semine de in: Amon din Cehia; Bukoz, Modran i Szafir, Oliwin din Polonia; Cosmin din Romnia, Omega din Canada. Anul n care aceste semine au fost cultivate a fost 2011. n Fig. 1 Sunt prezentate cele 7 soiuri de semine.

Figura II.1 Soiurile de semine de in selectaten scopul realizrii unui studiu comparativ, s-au utilizat att soiuri cunoscute pentru obinerea de fibre cu aplicabilitate preponderent n industria textil, ct i soiuri cunoscute pentru obinerea de semine, care au ca destinaie industria alimentar. Soiurile, cunoscute pentru obinerea de fibre, utilizate n acest studiu au fost: Cosmin, care este un hibrid obinut n Romnia, n anul 1985 din soiurile Lazurnii i Lintex (Ilea, 2009) i Modran (Heller, 2013); iar soiurile, care au ca destinaie industria alimentar, utilizate au fost: Bukoz, Oliwin, Amon, Szafir, Omega (Ganorkar and Jain, 2013; Heller, 2013).a) Obinerea extractelor bruteExtractele au fost obinute din 15 g semine de in mcinate, uscate i degresate, la care s-au adugat 100 ml amestec alcool:ap (60:40), timp de 3 ore, la temperatura de 600C.b) Hidroliza extractelor brute20 ml extract brut a fost hidrolizat cu 3,288 ml HCl, 37%, la temperatura de 600C,

26timp de 2 ore.

c) Neutralizarea extractelor hidrolizateAcidul clorhidric utilizat la hidroliza extractelor brute, a fost neutralizat cu NaOH, pn la pH 7.

d) FiltrareaS-a realizat cu ajutorul filtrelor cu membran polisulfon:poliflorur de vinilen (PSF:PVDF) cu dimensiunea porilor de 0,45 m.

II.3CARACTERIZAREAEXTRACTELORHIDROALCOOLICEDIN SEMINE DE IN DEGRESATE

II.3.1. Materiale i metodea) Amprenta spectrometric UV-VIS a extractelorExtract hidroalcoolic hidrolizat, obinut conform procedurii de mai sus, a fost diluat 1:110. Procedeul de obinere a amprentelor spectrometrice este descris n capitolul anterior.

b) Determinarea compuilor fenolici totali prin metoda Folin CioclteuDeterminarea compuilor fenolici totali prin metoda Folin Cioclteu a fost descris n capitolul anterior.

c) Determinarea activitii antioxidante a extractelorProcedeul dedeterminare a activitii antioxidante a extractelor este descris n capitolul anterior.

d) Caracterizarea extractelor prin analiza spectrometric FT-MIRSpectrometria n infrarou cu transformant Fourier (FTIR) este o metod rapid de caracterizare a extractelor din plante, cu ajutorul creia s-a determinat prezena legturilor chimice proprii polifenolilor, care au n infrarou, frecvene i intensiti de absorbie specifice.

e) Analiza tip Principal Component Analysis (PCA)

Pentru analiza calitativ i cantitativ a fost folosit programul Unscrambler X (Camo, Norvegia). Modelul de calibrare a fost elaborat folosind normalizarea spectrelor. Domeniul spectral 650-1800 cm-1 a fost folosit pentru procesele de calibrare i predicie.

II.3.2. Rezultate i discuiia) Amprenta spectrometric UV-VIS a extractelor

Figura II.2 Spectrele UV-VIS ale extractelor hidrolizate obinute din diferite soiuri de semine de in (210-400 nm)

De asemenea s-a nregistrat absorbana extractelor, diluate 1:110, la 280 nm.

Amprentele UV- VIS cu cea mai mare intensitate a absorbanei (275-290 nm) au fost cele obinute din semine Amon, urmate de Omega, Bukoz, Szafir, Cosmin, Modran, Oliwin.Deoarece lignanii i derivaii lor absorb la lungimile de und de 270-290 nm, amprentele spectrale UV-VIS obinute, poate indica i prezena acestora n extracte.b) Determinarea compuilor fenolici totali prin metoda Folin CioclteuTabel II.1 Cantitatea de compui fenolici totali a extractelorDenumire semineCompui fenolici totali (mg GAE / L)Compui fenolici totali (mg GAE / 100 materie prim degresat)Compui fenolici totali (mg GAE / 100 semine)

Amon1145,951197,07784,26

Bukoz567,55589,084399,39

XXVII

Cosmin638,88693,99468,51

Modran462,22484,38369,74

Oliwin483,45505,82368,47

Omega1141,731188,843729,58

Szafir725,73752,05505,78

Cel mai mare coninut de compui fenolici totali, de 1145,95 mg GAE / L, s-a ntlnit la extractele obinute din semine Amon, urmat de Omega (1141,73 mg GAE / L), Szafir (725,73 mg GAE / L), Cosmin (638,88 mg GAE / L), Bukoz (567,55 mg GAE / L), Oliwin (483,45 mg GAE / L) i Modran (462,22 mg GAE / L).Amprenta UV-VIS a extractelor se coreleaz pozitiv cu cantitatea de compui fenolici totali, astfel c n extractele cu cea mai mare intensitate a absorbanei (275-290 nm) s-a obinut i cea mai mare cantitate de compui fenolici totali.

c) Determinarea activitii antioxidante a extractelor hidrolizate

Tabel II.2 Activitatea antioxidant a extractelor

Denumire semineInhibiia (%)

Amon66,19

Bukoz47,97

Cosmin45,03

Modran38,13

Oliwin30,57

Omega61,84

Szafir52,81

Extractele hidrolizate din diferite tipuri de semine de in au prezentat o activitate antioxidant remarcabil, oscilnd de la un minim de 30,57 % pentru extractele obinute din semine Oliwin la 66,19 % la extractele obinute din semine Amon.Activitatea antioxidant a extractelor hidrolizate se coreleaz cu coninutul total de polifenoli, obinnd un coeficient de corelaie R2 de 0,8489.

28

d) Spectrele FT- MIR pentru extracte din diferite tipuri de semine de in

Figura II. 3 Spectrele IR comparative, cu regiunile specifice pentru fiecare tip de extract (A - extract obinut din semine Amon, B - extract obinut din semine Bukoz, C - extract obinut din semine Cosmin, M - extract obinut din semine Modran, O - extract obinut din semine Oliwin, OM - extract obinut din semine Omega, S - extract obinut din semine Szafir)Pe lng spectrele FTIR nregistrate pentru extracte, s-au nregistrat i spectrele pentru trei substane etalon: acid ferulic, SECO i SDG. Acestea sunt prezentate n Figura II.4..

54

3621

A c . F e r u l i c

S D G

S E C O

3 0 0 02 5 0 02 0 0 01 5 0 01 0 0 0W a v e n u m b e r ( c m - 1 )

29Figura II.4 Spectrele IR cu regiunile specifice pentru standarde de acid ferulic,SDG, SECO

S-au remarcat diferene ntre amprenta FTIR a extractelor realizate din soiurile destinate obinerii de fibre, C (extract din semine Cosmin) i M (extract obinut din semine Modran) fa de celelalte extracte A (Amon), B (Bukoz), O (Oliwin), OM (Omega), S (Szafir), realizate din soiuri destinate obinerii de semine.

Din analiza comparativ a aspectului spectrelor FTIR se constat c: n zona 1 (600-670 cm-1) apare un semnal att n cazul standardelor, ct i n cazul extractelor obinute, mai proeminent n cazul extractului din semine Cosmin, ceea ce poate ndica o prezen mai abundent a acidului ferulic.

n zona 2 (750-900 cm-1) apar 2 semnale caracteristice att pentru toate cele trei substane standard (acid ferulic, SECO, SDG). Ele pot fi regsite i n spectrul extractului obinut din semine Cosmin i Modran, indicnd nc o dat c n aceste tipuri de extracte exist posibilitatea identificrii acestora.

n zona 3 (1000-1150 cm-1) apar semnale caracteristice att pentru toate cele trei substane standard (acid ferulic, SECO, SDG) ct i pentru probe, ce pot fi atribuite glucozei rezultate din hidroliza lignanilor i a polifenolilor, sau din SDG.

n zona 4 (1200-1450 cm-1) i zona 5 (1500-1700 cm-1) apar diferene care identific coninutul de acizi fenolici ai probelor, respectiv pot fi recunoscute probele care au o cantitate mai mare de acizi fenolici printr-o intensitate i arie mai mare a semnalelor, semnificativ n cazul extractului obinut din semine Cosmin.

31 n zona 6 (2800-3000 cm-1) apar 2 semnale caracteristice att pentru toate cele trei substane standard (Acid ferulic, SECO, SDG) ct i pentru probe, ce pot fi atribuite gruprilor metil din compuii metoxilai sau lanuri alchil, precum i prezenei unor aldehide.

e) Analiza tip Principal Component Analysis (PCA)

Figura II.5 Analiza PCA de difereniere a probelor i a standardelor SECO, SDG i acid ferulic, pe baza amprentei FTIR

Prin analiza PCA a diferenelor ntre profilurile spectrelor s-a obinut gruparea probelor dup structura acestora. Probele A, O, M, C prezinta o grupare satisfctoare, probele B i OM sunt n afara grupului caracteristic, n opoziie (corelaie negativ). O corelaie bun exist ntre proba S i toate cele 3 standarde analizate (SECO, acid ferulic, SDG), avndu-le pe toate n compoziia ei.II.3.3 ConcluziiCu ajutorul analizei spectrometrice UV-VIS s-au putut diferenia toate cele 7 extracte obinute din diferite soiuri de semine de in. La extractele care au avut cea mai mare intensitate a absorbanei (275-290 nm) s-a obinut i cea mai mare cantitate de compui fenolici totali.Coninutul total de polifenoli se coreleaz bine (coeficient de corelaie, R2 de0,8489) cu activitatea antioxidant a extractelor hidrolizate.Prin analiza spectrometric UV-VIS, nu se pot face diferenieri ntre cele 2 tipuri de semine, pentru obinere de fibre i cele care au ca scop consum alimentar.

Tehnica FT-MIR reprezint o metod rapid i nedistructiv pentru determinarea amprentei specifice a extractelor hidrolizate din seminele degresate, dar i pentru determinarea acizilor fenolici i a lignanilor din extracte.Spectrometria FT-MIR a permis evidenierea amprentei specifice a extractelor investigate, evideniind zonele care sunt specifice i cu intensiti care s permit evaluarea comparativ a grupelor funcionale specifice din fiecare extract.n evaluarea extractelor hidrolizate au fost identificate benzi IR specifice acizilor fenolici i a lignanilor, n regiunile 4 (1200- 1450 cm-1) i 5 (1500-1700 cm-1).Cu ajutorul metodei FT-MIR, regiunea 3 (1000-1150 cm-1) i regiunea 6 (2800- 3000 cm-1), pot fi deosebite extractele obinute din tipuri destinate obinerii de fibre, de soiurile destinate consumului alimentar.

XXXII

CAPITOLUL III.

ANALIZA VARIABILITII DE COMPOZIIE N LIGNANI A EXTRACTELOR OBINUTE DIN DIFERITE TIPURI DE SEMINE DE IN INVESTIGATE PRIN CROMATOGRAFIE

OBIECTIVE I EXPERIMENTEPentru a evalua variaia cantitii de lignani i acizi fenolici din seminele de in, s- au utilizat comparativ tipuri de semine pentru fibre, respectiv pentru obinerea de ulei. S- au urmrit dou obiective, i anume:I. Stabilirea importanei tipului de semine utilizate n evaluarea cantitilor de lignani prezeni n seminele investigate.II. Evaluarea cantitii de lignani i acizi fenolici prezeni n extractele din diferite tipuri de semine de in.

33

III.1 MATERIALE I METODECaracterizarea extractelor prin analiza cromatografic LC-DAD-MSn Capitolul I, s-au observat compui care alturi de lignani absorb la 280 nm, care pot fi acizi fenolici, iar pentru caracterizarea ct mai riguroas a extractelor din punct de vedere al compoziiei, s-a decis optimizarea metodei astfel nct att lignanii ct i acizii fenolici s poat fi cuantificai. Analiza cromatografic descris n Capitolul III, a fost modificat i s-a efectuat folosind un sistem LC-MS Agilent 6110, echipat cu un detector UV-VIS DAD i MS cu un cuadrupol. Coloana de separare a fost Agilent Eclipse XDB- C18 4.6x 150 mm, 5m. Fazele mobile utilizate au fost ap, acetonitril i acid acetic (99:1:0,1) (v:v:v) (A) i acetonitril i acid acetic (100:0,1) (v:v) (B) iar debitul a fost de 0,5 ml/min. Volumul de injecie al probei: 20L.

III.2 REZULTATE I DISCUIIPentru identificarea lignanilor din extractele vegetale s-au utilizat ca standarde SDG, SECO, MATA, LARI i PINO - produse comerciale de puritate HPLC, 99%, achiziionate de la Sigma-Aldrich.Pentru identificarea lignanilor din extractele vegetale s-au trasat iniial dreptele de etalonare pentru compuii standard. n acest scop, s-a preparat o soluie iniial de lignani (SDG, SECO, MATA, LARI, PINO) cu concentraii cunoscute din fiecare compus i diluiile intermediare. S-au efectuat 5 injecii succesive pentru fiecare concentraie cu scopul stabilirii dreptelor de etalonare pentru fiecare compus.n extractele obinute din diferite tipuri de semine de in, au rezultat cantiti diferite de lignani, aa cum reiese i din Figura III.1, care se ncadreaz n intervalul menionat n literatura de specialitate. (Hall i colab., 2006; Jennifer i colab., 2010; Kasote i colab., 2011; Milder i colab., 2005; Obermeyer i colab., 1995; Oomah i colab., 2001; Oomah i colab., 1993).

34

Figura III.1 Variaia cantitii de lignani din extractele n funcie de seminele utilizate In Figura III.2 sunt prezentate valorile comparative ale acizilor fenolici dinextractele hidrolizate, pentru toate probele examinate.

Figura III.2 Variaia cantitii de acizi fenolici din extracte n funcie de seminele utilizateReferitor la compoziia n compui fenolici: Cea mai mare concentraie de acid sinapic a fost obinut pentru extractul obinut din semine Amon, i anume 248,55 mg acid sinapic/100 grame semine. Concentraia maxim de acid cafeic a fost obinut pentru extractul obinut din semine Omega, i anume 45,17 mg acid cafeic/100 grame semine. Cantitatea cea mai mare de acid ferulic a fost obinut pentru extractul obinut din semine Szafir, 6,77 mg acid ferulic/100 grame semine.

36 Extractul cu concentraia cea mai mare de fenoli (acid sinapic, acid cafeic i acid ferulic) a fost cel obinut din semine Amon, i anume 286,77 mg acizi fenolici/100 grame semine.Referitor la compoziia n lignani: Cantitatea cea mai mare de SDG a fost obinut pentru extractul obinut din semine Cosmin 259,43 mg SDG/100 grame semine, urmat de extractul din semine Amon 224,45 mg SDG/100 grame semine. Cea mai mare cantitate de SECO a fost obinut pentru extractul obinut din semine Amon, 190,51 mg SECO/100 grame semine. Cea mai mare cantitate de LARI a fost obinut pentru extractul obinut din semine Omega, 33,57 mg LARI/100 grame semine. Extractul cu cantitatea cea mai mare de lignani (SDG, SECO, LARI) a fost cel obinut din semine Omega, cu un coninut 459,00 mg lignani/100 grame semine. n capitolul 4, s-a determinat cu ajutorul metodei UV-VIS, absorbana extractelor la 280 nm i s-a observat o corelaie pozitiv (R2=0,8908) cu cantitatea total de acizi fenolici i lignani

III.3 CONCLUZIICa i concluzii la datele prezentate n acest capitol putem constata c:Acizii fenolici i lignanii pot fi cuantificai calitativ i cantitativ, n extractele obinute din semine de in, cu ajutorul cromatografiei LC-DAD-MS.Prin corelarea datelor obinute prin spectrometrie UV-VIS (Capitolul II) cu cromatografie LC-DAD-MS, s-a putut elabora o metod simpl, rapid, ieftin de evaluare a extractelor din punct de vedere a cantitaii de acizi fenolici i lignani, care poate fi utilizat att n laborator ct i n industrie.Nu au putut fi determinate diferene ntre cele 2 tipuri de semine de in (pentru obinerea de fibre i cel destinat industriei alimentare) cu metod de determinare a acizilor fenolici i a lignanilor prin cromatografie LC-DAD-MS.Faptul c extractele din semine de in conin acizi fenolici, inclusiv lignani, le recomand pentru utilizarea lor drept aditivi n industria alimentar i cosmetic.

Soiul romnesc Cosmin, care este un soi hibrid destinat preponderent obinerii de fibre de calitate superioar, dar semine din acest soi, pot fi utilizate cu succes pentru obinerea de extracte bogate n acizi fenolici i lignani. n acest mod planta ntreag de Linum usitatissimum ar putea fi procesat ca o resurs regenerabil de fibre textile, uleiuri comestibile i extracte antioxidante i antibacteriene. Aceste extracte ar putea nlocui cu succes aditivi sintetici n produsele alimentare i cosmetice.

XXXVIICAPITOLUL IV.

OBINEREA I CARACTERIZAREA UNOR PRODUSE CE VALORIFIC POTENIALUL BIOMEDICAL AL LIGNANILORProverbul "S ne fie hrana medicament, iar medicamentul s ne fie hran", formulat de Hippocrate acum aproape 2500 de ani, este valabil i acum i dorete s atrag atenia n special n promovarea ingredientelor sntoase sau componente fiziologice active, cunoscute sub numele de alimente funcionale (Hasler, 1998).Seminele de in, datorit beneficiilor pentru sntate aduse, n special n ceea ce privete cancerul i bolile cardiovasculare, au primit, n ultimul timp, o atenie deosebit din partea nutriionitilor i a cercettorilor.Datorit componentelor bioactive i a nutrienilor din seminele de in, acestea au devenit ingrediente folosite n dieta uman. Seminele de in sunt utilizate pe scar larg pentru realizarea de produse alimentare funcionale. Componentele din seminele de in, care confer o serie de beneficii pentru sntate sunt fibrele, lignanii i acizii grai (Omega-3 i omega 6). Mai mult dect att seminele de in este o surs excelent de proteine, fibre solubile de calitate superioar i compui fenolici (Oomah, 2001).

IV.1 OBINEREA DE ALIMENTE FUNCIONALEPremixurile propuse ca tehnologii de valorificare a compuilor bioactivi cu valoare funcional din coc de in, sunt amestecuri care conin o parte sau toate ingredientele din reet, cu excepia lichidului de hidratare. Se prezint sub form pulverulent i sunt folosite la prepararea pinii i respectiv a produselor de desert. Indiferent dac sunt destinate utilizrii industriale sau casnice, prezint o serie de avantaje legate de eliminarea timpului de dozare a ingredientelor i a riscurilor de dozare eronat, aspect agreat de consumatori pentru scurtarea procesului de preparare.Pinea este un produs destinat consumului uman direct care st la baza piramidei nutriionale i poate afecta sntatea consumatorilor. Pinea este unul din cele mai consumate produse din cadrul industriei alimentare din Romnia.Datorit acestor aspecte, dar i pentru mbogirea pinii cu fibre alimentare i compui biologic activi (acizi grai eseniali, lignani i polifenoli) s-a optat pentru

38introducerea coci de in n compoziia acesteia, prin formularea unor produse alimentare funcionale.Dulciurile de buctrie sunt preparate culinare care se pot servi n momente diferite ale zilei, astfel ele se servesc ca desert la dejun sau cin, la gustarea de la ora 10:00 sau la ora 17:00. Servite la sfritul mesei, confer senzaia de saietate. Dulciurile de buctrie au rolul de a completa valoarea nutritiv 24 de ore, aducnd organismului un plus de glucide att simple (zaharoz, glucoz, fructoz), proteine valoroase i grsimi uor asimilabile, substane minerale i vitamine.Datorit gustului dulce, plcut, pe care l au i aspectului deosebit, dulciurile de buctrie sunt preparate solicitate de toate categoriile de consumatori, unele dintre ele fiind recomandate n diferite diete.De cele mai multe ori, coninutul mare n glucide al dulciurilor, impune consumarea lor n mod raional, excesul de glucide din organism se transform n lipide, care se depun, favoriznd apariia obezitii i a diabetului.Desertul aduce toate beneficiile pe care le poate aduce un desert obinuit, dar n plus, el vine cu un coninut ridicat de fibre alimentare, acizi grai eseniali, lignani, polifenoli i un coninut sczut de glucide.S-au formulat dou premixuri care valorific potenialul biomedical al lignanilor i al acizilor fenolici din coc de in:1. Produs 1: premix pentru pine cu adaos de coc mcinat de in2. Produs 2: premix pentru desert.Produsul 2, premixul pentru desert, face subiectul unui brevet care a aprut n luna aprilie 2013, n Buletinul Oficial de Proprietate Industrial, numr cerere brevet: a 2012 00737.Prin adugarea unor cantiti diferite de ap, din varianta premix se pot obine dou varieti de desert, astfel prin adugarea a 100 mL ap la temperatura de 90-1000C, urmat de o omogenizare de aproximativ 5 min, s-a obinut Desertul 1 (de tip Budinc), iar prin adugarea a 46 mL ap la temperatura de 90-1000C, urmat de o omogenizare de aproximativ 3 min, s-a obinut Desertul 2 (de tip Baton).

39IV.2 CARACTERIZAREA ALIMENTELOR FUNCIONALEIV.2.1 Materiale i metodea) Determinarea coninutului de ap s-a realizat utiliznd metoda STAS 9065/3-73.b) Determinarea coninutului de lipide s-a realizat prin metoda Soxhlet.c) Analiza cromatografic a uleiurilor s-a realizat cu ajutorul metodei GC-MS.d) Determinarea coninutului de protein s-a realizat prin metoda Kjeldahl.

IV.2.2 Rezultate i discuiiPremixul obinut are o compoziie caracterizat de un raport masic ntre carbohidrai, proteine i grsimi de 1,8:0,66:0,27. Carbohidraii, proteinele i lipidele, precum i acizii grai eseniali (omega 3, omega 6, omega 9) i acizii fenolici din compoziia produsului provin att din surse vegetale (coca de in, pudra de cacao, fructoz) ct i din surse animale (laptele praf), pentru a asigura o compoziie ct mai echilibrat i caliti organoleptice superioare, fr a i se aduga colorani, ageni de ngroare sau aromatizani.Dup amestecarea cu ap a premixului n proporie de 1:0,59 n 100 g desert 1 se gsesc aproximativ 10 g fibre totale alimentare, reprezentnd 28,57-50% din cantitatea nutriional recomandat de 20-35 g fibre din alimentaia zilnic.Coninutul ridicat de fibre sporete senzaia de saietate, produsul putnd fi indicat la persoanele care doresc s slbeasc sau s i menin o greutate corporal costant, asigurnd astfel un management al greutii corporale. De asemenea, prin coninutul ridicat de fibre, mbuntete peristaltismul intestinal, previne constipaia, are efect prebiotic, abilitatea consumatorului de a procesa hrana, de a elimina toxinele i a diminua colesterolemia fiind diminuate; contribuie la prevenia unor tipuri de cancer.Carbohidraii care intr n compoziia produsului de tip desert sunt reprezentai de fructoz i lactoz (60,2%), glucide simple care ndulcesc alimentul fr a produce variaii brute ale glicemiei i care prelungesc senzaia de saietate dup consumarea alimentului.(Marcus, 2013)n compoziia produselor formulate intr i acizii grai eseniali (omega 3 i omega 6), cu un raport masic de 1,90:1. Prezena acizilor grai eseniali, precum i raportul masic dintre ei ajut la prevenirea bolilor cardiovasculare, a accidentelor vasculare

41cerebrale, a unor tipuri de cancer, menine sntatea sistemului nervos, osos i moduleaz rspunsul imun al organismului.(Amiano et al., 2014)n coca de in, care se regsete n compoziia produselor formulate, s-a constatat prezena semnificativ a acizilor fenolici (225,78 mg GAE/100 g coc) i a lignanilor (de pn la 473,40 mg SECO/100 g coc, 4,58 mg MATA/100 g coc, 1,75 mg LARI/100 g semine). Aceti compui au prezentat o activitate antioxidant (de pn la 72,95%) i activitate antimicrobian remarcabil (de pn la 15 mm). Toi aceti produi, pe lng contribuia lor n prevenirea unor tipuri de cancer (Saarinen et al., 2003), a bolilor coronariene (Penumathsa et al., 2008), a hipercolesteolemiei (Prasad, 1997), reprezint conservani naturali eficieni n pstrarea calitilor produselor.Datorit posibilitii pregtirii Desertului 2 sub forma unui baton, ambalat ca porie individual, acesta poate fi ncadrat ntr-un stil de via activ. Prin acest mod, se previne oxidarea compuilor prezeni expunerea la aer i la umiditate nemaifiind o problem, comparativ cu ambalarea unei porii mai mari din care consumatorul s serveasc cte o porie.

IV.3 CONCLUZIICererea crescnd a pieei pentru produse alimentare dietetice, cu coninut sporit de fibre i alte substane biologic active poate fi echilibrat prin diversificarea sortimentelor de produse, trend n care se nscriu i produsele cu formulri inovative propuse. Acestea valorific fibrele solubile i insolubile, acizii grai polinesaturai omega 3 i omega 6, precum i compuii cu valoare funcional ridicat (acizii fenolici i lignanii) ai seminelor de in.

CONCLUZII GENERALE

Conform scopului lucrrii, activitatea experimental inclus prezentei teze a fost optimizarea extraciei lignanilor, studiul variabilitii n compoziie a lignanilor din diferite soiuri de semine de in, precum i formularea de alimente funcionale care valorific potenialul biomedical al acestora.n raport cu obiectivele cercetrilor proprii putem formula urmtoarele concluzii:A fost optimizat metoda de extracie a lignanilor, metodele utilizate au inclus spectrometria UV-VIS, spectrometria n infrarou de tip FTIR, cromatografia lichid de nalt performana (HPLC), precum i analiza potenialului microbiologic al lignanilor.S-a stabilit variabilitatea de compoziie n lignani i acizi fenolici a extractelor provenite din diferite soiuri de semine de in. A fost stabilit profilul specific fiecrui extract utiliznd metode de analiz complementare, i anume metode spectrometrice de tip UV-VIS, spectrometrie n Infrarou Mediu (FT-MIR) i metode cromatogrtafice LC- DAD-MS.S-au obinut dou tipuri de premixuri i trei tipuri de preparate care valorific potenialul biomedical al lignanilor. Compoziia acestora a fost caracterizat din punct de vedere al coninutului de fibre totale, solubile i insolubile, cantitatea de uleiuri, coninut de acizi grai omega 3, omega 6 i omega 9, glucide, proteine.Cercetrile efectuate sunt un punct de plecare util pentru investigarea in vitro sauin vivo a aciunii acestor preparate. Originalitatea studiilor este conferit de: Design-ul i adaptarea unor tehnici de extracie i analiz a probelor noi

Analiza detaliat prin metode analitice performante a compoziiei celor apte soiuri de semine de in, acordnd o atenie deosebit acizilor fenolici i lignanilor Elaborarea unor produse care valorific potenialul biomedical al lignanilor, fiind coautor al unui produs cu caracter inovativ (Radu and Pag, 2013)

XLIIBIBLIOGRAFIE1. Abdel-Hameed, E.-S. S. (2009). Total Phenolic Contents And Free Radical Scavenging Activity Of Certain Egyptian Ficus Species Leaf Samples. Food Chem 114(4): 1271-1277.2. Amarowicz, R. &Pegg, R. B. (2006). Content Of Proanthocyjanidins In Selected Plant Extracts As Determined Via N-Butanol/Hcl Hydrolysis And A Colorimetric Assay Or By Hplc A Short Report. Pol. J. Food Nutr. Sci. 15(56): 319-322.3. Amiano, P., Machon, M., Dorronsoro, M., Dolores Chirlaque, M., Barricarte, A., Sanchez, M. J., Navarro, C., Huerta, J. M., Molina-Montes, E., Sanchez-Cantalejo, E., Urtizberea, M., Arriola, L., Larranga, N., Ardanaz, E., Quiros, J. R., Moreno-Iribas, C.&Gonzalez, C. A. (2014). Intake Of Total Omega-3 Fatty Acids, Eicosapentaenoic Acid And Docosahexaenoic Acid And Risk Of Coronary Heart Disease In The Spanish Epic Cohort Study. Nutr Metab Cardiovasc Dis 24(3): 321-327.4. Cornwell, T., Cohick, W. &Raskin, I. (2004). Dietary Phytoestrogens And Health.Phytochem 65(8): 995-1016.5. Dean, J. (2003).Current Market Trends And Economic Importance Of Oilseed Flax. In Flax- The Genus Linum(Eds A. Muir And N. D. Westcott). Taylor & Francis Crc Press.6. Fukumoto, L. R. &Mazza, G. (2000). Assessing Antioxidant And Prooxidant Activities Of Phenolic Compounds J. Agric. Food Chem. 48(8): 3597-3604.7. Ganorkar, P. M. &Jain, R. K. (2013). Flaxseed -- A Nutritional Punch. Intern Food Res J 20(2): 519.8. Grubesic, R. J., Vukovic, J., Kremer, D. &Vladimir-Knezevic, S. (2005). Spectrophotometric Method For Polyphenols Analysis: Prevalidation And Application On Plantago L. Species. J Pharm Biomed Anal. 39(3-4): 837-842.9. Hall, C., Tulbek, M. C., Xu, Y. &Steve, L. T. (2006).Flaxseed. In Advances In Food And Nutrition Research, Vol. Volume 51, 1-97: Academic Press.10. Hasler, C. M. (1998). A New Look At The Ancient Concept. Chem. Industry 2: 84-89.11. Heller, K. (2013).Crop Management Of Fibre Flax In Europe. In Summer School.Catania-Italy.12. Ilea, V. (2009). Genetic Resources And Breeding Fiber Flax For Next Century. Sci Bull Escorena 1: 9-12.13. Jhala, A. J. &Hall, L. M. (2010). Flax (Linum Usitatissimum L.): Current Uses And Future Applications. Austr J Of Basic & Appl Sci. 4(9): 4304-4312.14. Jiang, Z. R., Ahn, D. U. &Sim, J. S. (1991). Effects Of Feeding Flax And Two Types Of Sunflower Seeds On Fatty Acid Compositions Of Yolk Lipid Classes. Poult Sci. 70(12): 2467-2475.15. Kasote, D. M., Hegde, M. V. &Deshmukh, K. K. (2011). Antioxidant Activity Of Phenolic Components From N-Butanol Fraction (Pc-Bf) Of Defatted Flaxseed Meal. Am. J. Food Technol. 6(7): 604-612.16. Kennelly, J. J. (1996). The Fatty Acid Composition Of Milk Fat As Influenced By Feeding Oilseeds. Anim Feed Sci Tech. 60(3-4): 137-152.

4317. Kim, D. O. &Lee, C. Y. (2004). Comprehensive Study On Vitamin C Equivalent Antioxidant Capacity (Vceac) Of Various Polyphenolics In Scavenging A Free Radical And Its Structural Relationship. Crit Rev Food Sci Nutr. 44(4): 253-273.18. Li, X., Yuan, J. P., Xu, S. P., Wang, J. H. &Liu, X. (2008). Separation And Determination Of Secoisolariciresinol Diglucoside Oligomers And Their Hydrolysates In The Flaxseed Extract By High-Performance Liquid Chromatography. J Chromatogr A. 1185(2): 223-232. Doi: 210.1016/J.Chroma.2008.1001.1066. Epub 2008 Jan 1031.19. Marcus, J. B. (2013).Carbohydrate Basics: Sugars, Starches And Fibers In Foods And Health: Healthy Carbohydrate Choices, Roles And Applications In Nutrition, Food Science And The Culinary Arts. In Culinary Nutrition, 149-187 San Diego: Academic Press.20. Meagher, L. P. &Beecher, G. R. (2000). Assessment Of Data On The Lignan Content Of Foods. J Food Comp Anal 13(6): 935-947.21. Milder, I. E., Arts, I. C., Van De Putte, B., Venema, D. P. &Hollman, P. C. (2005). Lignan Contents Of Dutch Plant Foods: A Database Including Lariciresinol, Pinoresinol, Secoisolariciresinol And Matairesinol. Br J Nutr 93(3): 393-402.22. Molist, F., De Segura, A. G., Gasa, J., Hermes, R. G., Manzanilla, E. G., Anguita,M. &Perez, J. F. (2009). Effects Of The Insoluble And Soluble Dietary Fibre On The Physicochemical Properties Of Digesta And The Microbial Activity In Early Weaned Piglets. Anim Feed Sci Tech 149(34): 346-353.23. Muir, A. D. &Westcott, N. D. (2000). Quantitation Of The Lignan Secoisolariciresinol Diglucoside In Baked Goods Containing Flax Seed Or Flax Meal. J Agric Food Chem 48(9): 4048-4052.24. Obermeyer, W. R., Musser, S. M., Betz, J. M., Casey, R. E., Pohland, A. E.&Page, S. W. (1995). Chemical Studies Of Phytoestrogens And Related Compounds In Dietary Supplements: Flax And Chaparral. Proc Soc Exp Biol Med 208(1): 6-12.25. Ogborn, M. R. (2003).Flaxseed And Flaxseed Products In Kidney Disease. InFlaxseed In Human Nutrition, Second Edition: Aocs Publishing.26. Oomah, B. D. (2001). Flaxseed As A Functional Food Source. J Sci Food Agri81(9): 889-894.27. Oomah, B. D. (2002).Phytoestrogens. In Methods Of Analysis For Functional Foods And Nutraceuticals: Crc Press.28. Penumathsa, S. V., Koneru, S., Zhan, L., John, S., Menon, V. P., Prasad, K.&Maulik, N. (2008). Secoisolariciresinol Diglucoside Induces Neovascularization- Mediated Cardioprotection Against Ischemia-Reperfusion Injury In Hypercholesterolemic Myocardium. J Mol Cell Cardiol 44(1): 170-179. Epub 2007 Oct 2004.29. Prasad, K. (1997). Dietary Flax Seed In Prevention Of Hypercholesterolemic Atherosclerosis. Atherosclerosis. 132(1): 69-76.30. Radu, D. G. &Pag, A. I. (2013).Aliment Funcional Pentru Managementul Greutii Corporale. 1-8 Romania.31. Rice-Evans, C., Miller, N. &Paganga, G. (1997). Antioxidant Properties Of Phenolic Compounds. Trends Plant Sci 2(4): 152-159.32. Saarinen, N., Santti, R. &Makela, S. (2003).Mechanism Of Anticancer Effects Of Lignans With A Special Emphasis On Breast Cancer. In Flaxseed In Human Nutrition, Second Edition: Aocs Publishing.

4433. Singh, K. K., Mridula, D., Rehal, J. &Barnwal, P. (2011). Flaxseed: A Potential Source Of Food, Feed And Fiber. Crit Rev Food Sci Nutr 51(3): 210-222.34. Smeds, A. I., Eklund, P. C., Sjoholm, R. E., Willfor, S. M., Nishibe, S., Deyama,T. &Holmbom, B. R. (2007). Quantification Of A Broad Spectrum Of Lignans In Cereals, Oilseeds, And Nuts. J Agric Food Chem. 55(4): 1337-1346. Epub 2007 Jan 1330.35. Thompson, L. U. &Cunnane, S. C. (2003). Flaxseed In Human Nutrition. Aocs Press.36. Vaisey-Genser, M. A. &Morris, D. H. (2003).Introduction History Of The Cultivation And Uses Of Flaxseed. In Flax-The Genus Linum (Eds A. D. Muir And N. D. Westcott). Taylor & Francis.37. Wrolstad, R. E., Acree, T. E., Decker, E. A., Penner, M. H., Reid, D. S., Schwartz,S. J., Shoemaker, C. F., Smith, D. &Sporns, P. (2005).Strategies For Measurements Of Colors And Pigments. In Handbook Of Food Analytical Chemistry, 201-215: John Wiley& Sons, Inc.

46Activitatea experimental din cadrul stagiului de doctorat i finalizarea acestei teze s-au efectuat n cadrul Proiectului POS-CCE 210/2010, Plantele liberiene, resurse regenerabile strategice pentru economia european, acronim BASTEURES, desfurat n cadrul Institutului de Cercetare-Dezvoltare-Inovare n tiine Tehnice i Naturale al Universitii Aurel Vlaicu din Arad, finanat din fonduri structurale de ctre Comunitatea European i Guvernul Romniei n perioada 2010-2013.