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Tlamati Sabiduría, Volumen 7 Número Especial 2 (2016)
4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación
Acapulco, Guerrero 21, 22 y 23 de septiembre 2016
4° Encuentro de Jóvenes Investigadores – CONACYT 11° Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación
Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016 Memorias
Separación y semi-síntesis de compuestos con posible actividad
biológica.
Gervacio Javier Marcelino (Becario) Universidad Autónoma de Guerrero (UAGro)
Unidad Académica de Ciencias Naturales Programa de Verano UAGro [email protected]
Área en la que participa: II Biología y Química
Dra. Laura Patricia Álvarez Berber (Asesor) Profesor-Investigador del Centro de Investigaciones Químicas-IICBA
Universidad Autónoma del Estado de Morelos (UAEM) [email protected]
Resumen
El ácido ursólico (ácido 3b-hidroxiurs-12-en-28-oico) es un triterpeno ampliamente conocido por
su variada gama de actividades biológicas. Este ácido fue aislado de su fuente natural, la planta
medicinal Astianthus viminalis (Bignoneasea). Se realizaron modificaciones a la estructura base
del ácido ursólico por medio de reacciones de oxidación y esterificación, lo que permitió la
obtención de los compuestos 3 y 5. Estos compuestos se purificaron mediante cromatografía en
columna y se utilizó la cromatografía en capa fina para el monitoreo de las fracciones obtenidas.
Los compuestos semi-síntetizados se identificaron por medio de resonancia magnética nuclear de 1H y 13C. Se sugiere que los compuestos obtenidos con las transformaciones realizadas puedan
presentar una buena actividad biológica.
Palabras Clave: Triterpenos, Ácido Ursólico, Derivados Semisintéticos.
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Introducción
Actualmente la búsqueda de compuestos con un posible efecto farmacológico es constante.
Las plantas por su parte, son conocidas por producir una variedad de metabolitos biactivos que se
utilizan en el tratamiento de diversas enfermedades. Un ejemplo de estos compuestos son los
metabolitos secundarios, estos tienen un papel importante en la regulación de las interacciones de
la planta con el ambiente que la rodea. Se estima que más del 40% de los medicamentos tienen sus
orígenes en productos naturales. Es importante mencionar que el mecanismo de acción de estas
moléculas bioactivas, puede abrir nuevas vías para el desarrollo o mejoramiento de nuevos
enfoques terapéuticos. (Kashyap, Tuli & Sharma, 2016; Babalola & Shode, 2013)
Un grupo de productos naturales que ha tenido una destacada importancia biológica son los
triterpenos pentaciclicos. Algunos ejemplos de estos compuestos con actividad reportada son, el
ácido betulínico (AB), ácido oleanólico (AO) y ácido ursólico (AU) que se encuentra
abundantemente en plantas, especialmente en hortalizas. Se caracterizan por tener propiedades
como anti-inflamatorio, tripanocida, antirreumático, antiviral, antioxidante, antitumoral y muchas
otras actividades. Estos compuestos farmacológicamente activos han ganado la atención debido a
su índice terapéutico prometedor. (Sandeep y Rajesh, 2015)
Mencionado anteriormente, el ácido ursólico (AU) es un producto natural que representa
uno de los componentes principales de algunas hierbas, utilizadas en la medicina tradicional. El
AU exhibe una amplia gama de actividades biológicas dentro de las que se destacan su potencial
como antiinflamatorio, antiproliferativo, proapoptótico, antimetastásico y antiangiogénico. (Wang,
Jiang, Xiang, Li, Ou, Yang, Shao, Lu, Lin, Chen, Dai y Jia, (2014); Shanmugam, Dai, Prem, Tan,
Sethi y Bishayee (2013)
Estos antecedentes sugieren que el ácido ursólico podría tener un enorme potencial en el
desarrollo de un compuesto bioactivo, que pueda ser candidato para el desarrollo de un fármaco.
Kow, Lee, Chung, Kim y Lee (2009), proponen la realización de modificaciones en la estructura
base de este triterpeno, para la mejora de su actividad biológica, en este caso antiinflamatoria.
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Figura 1. Modificaciones realizadas por Kow, T. y colaboradores (2009) a la estructura base del triterpeno ácido ursólico, para mejorar la actividad antiinflamatoria. Fuente: Elaboración propia.
Materiales y Métodos
En general todos los reactivos utilizados, fueron obtenidos por proveedores comerciales
y se utilizaron sin purificación adicional. La evolución de las reacciones se observó mediante
cromatografía en capa fina (CCF) utilizando cromatofolios de aluminio de silicagel 60 F254 marca
Merck dotados con indicador UV a 254 nm. La purificación de cada crudo de reacción, realizó
mediante el uso de cromatografía en columna (CC).
Los metabolitos y crudos de reacción obtenidos a partir del presente trabajo, se encontraban
en mezcla por lo que fue necesaria su separación, la separación se realizó por medio de
cromatografía en columna (CC) utilizando gel de sílice, específicamente Sílica Flash (Merck grado
9385, 230-400) como fase estacionaria, los disolventes orgánicos empleados como fase móvil en
la purificación fueron previamente destilados y utilizados en mezclas según el caso. La
cromatografía en capa fina (CCF) de gel de sílice se utilizó como herramienta para el monitoreo
del fraccionamiento realizado en cromatografía en columna (CC), utilizando como revelador
sulfato cérico al 1% en ácido sulfúrico 2N y lámpara UV (Figura 2).
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Figura 2. Metodología descrita mediante imágenes, que muestran los pasos a grandes rasgos del trabajo realizado después de cada reacción, para obtener un producto puro. Fuente: Elaboración
Propia.
Metodología de reacciones
Oxidación de la mezcla natural de ácido ursólico y ácido oleanólico.
La mezcla natural de ácido ursólico y oleanólico fue obtenida de la planta astianthus
viminallis, se partió de un gramo de la mezcla natural de estos triterpenos utilizando la siguiente
metodología: En un matraz redondo de 100 mL provisto de agitación se colocaron 0.5 g (1.15e-3
mol) de la mezcla ácido ursólico- ácido oleanólico y se adicionaron 15 mL de CH2Cl2, la solución
se colocó en un baño de hielo y se añadió gota a gota una disolución que contenía 1.5 eq (0.2833
g) de AMCPB en 15 mL de diclorometano. Finalizada la adición, la mezcla resultante se mantuvo
en agitación a temperatura ambiente durante 24 horas. El crudo de reacción fue neutralizado por
medio de una solución concentrada de Na2CO3 y extraído por triplicado con 30 mL de CH2Cl2, el
crudo de reacción fue purificado por medio de cromatografía en columna hexano:acetato de etilo
(85:15).
Oxidación del ácido ursólico (1) y compuesto 4
Preparación del reactivo de Jones:
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En un matraz redondo de 100 mL provisto de agitación magnética, se adicionaron 0.22g de
CrO3, a continuación el matraz fue colocado en un baño de hielo y se agregaron gota a gota 0.2
ml de H2SO4 concentrado, la mezcla resultante se diluyo con 2 ml de H2O y se mantuvo a esta
temperatura por 30 minutos.
Se preparó una solución de compuesto (1 o 4) con 7 ml de Acetona, la mezcla se colocó en
un baño de hielo y gota a gota se realizó la adición del reactivo de Jones hasta que se mantuvo el
color anaranjado-café, posteriormente se agregó metanol gota a gota hasta la desaparición del color
y se adicionaron 10 ml de una solución de NaOH. La mezcla se transfirió a un embudo de
separación y se extrajo con 30 ml de Diclorometano por Triplicado, el disolvente se eliminó a
presión reducida en un rotavapor obteniéndose el derivado correspondiente, el crudo de reacción
se purifico en cromatografía en columna Hexano:Acetato de Etilo (95:5).
Lactonizacion del Anillo A para los compuestos 2
A partir del compuesto 2
En un matraz de 100 mL provisto de agitación magnética, se agregó 0.0713 g del
compuesto 2 y se disolvió con 5 mL de CHCL3, la mezcla se colocó en agitación en baño de
hielo. Por otra parte se pesó la cantidad de 0.0814g de AMCPB y se solubilizo en 2 mL de CHCl3.
Posteriormente se añadió gota a gota al matraz anterior y se mantuvo durante 30 min a esa
temperatura, transcurrido este tiempo la mezcla de reacción se agito a temperatura ambiente
durante 72 hora. El crudo de la reacción se neutralizo con Na2CO3, realizando extracciones por
triplicado con 30 mL de CHCL3, el crudo de reacción se purifico por medio de cromatografía en
columna en Hexano:Acetato de Etilo (85:15).
Esterificación con yoduro de metilo del compuesto 1
En un matraz bola con agitador magnético se colocaron 0.1028 g de ácido ursólico y
0.03732 g (1.2 eq) de K2CO3 la mezcla se solubilizo con 6 mL de CHCl3 en un baño de hielo con
agitación 15 minutos, después se adiciono gota a gota 2 mL de DMF y pasados 10 min se
adicionaron 0.029 mL de yuduro de metilo. El matraz se mantuvo a temperatura de reflujo durante
2 horas. El crudo de reacción se purifico en cromatografía en columna en Hexano:Acetato de etilo
(99:1).
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Técnicas de caracterización de los compuestos obtenidos
Los espectros de resonancia magnética nuclear de protón (RMN 1H), carbono 13 (13C), se
determinaron en el equipo Varian UNITY de 400 MHz, empleando como disolvente principal
cloroformo deuterado (CDCl3), los desplazamientos químicos (δ) están reportados en partes por
millón (ppm), las constantes de acoplamiento (J) en Hz y la multiplicidad de las señales está
indicada por medio de las siguientes abreviaturas: (s) singulete, (d) doble o doblete, (t) triple, (c)
cuarteto, (dd) doble de doble y (m) múltiple.
Resultados
Los resultados de las reacciones realizadas fueron los siguientes:
Tabla 1. Transformaciones realizadas y rendimientos obtenidos en cada una.
Reacción Rendimiento Compuesto obtenido
Oxidación 1 57.21% Compuesto 1
Oxidación 2 70% Compuesto 2
Reacción de Baeyer-Villiger 3 31% Compuesto 3
Esterificación 4 78.4% Compuesto 4
Oxidación 5 84% Compuesto 5
Figura 3. Compuestos semisíntetizados e identificados por medio de RMN 1H y 13C. Fuente: Autoría Propia
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Datos espectroscópicos compuesto 3 y 5
Tabla 2. Datos obtenidos de los espectros de RMN 1H y 13C, para el compuesto 3.
RMN 1H (CDCl3, 400 MHz):ᵟ (ppm) 5.20 (pseudo-t,J=3.6,3.6, H-12); 2.53 (m, H-2); 2.14
(d,J=11.2 Hz, H-18); 1.40 (s, H-23); 1.34 (s, H-24); 1.07 (s, H-25); 1.01 (s, H-27); 0.89 (d,J= 6
Hz, H-29); 0.79 (d,J= 6.4 Hz, H-30); 0.76 (s, H-26).
RMN 13C (CDCl3, 100 MHz): ᵟ (ppm) 182.80(C, C28); 175.60 (C, C3); 138.08 (C, C13); 125.84
(CH, C12); 86.53 (C, C4); 54.86 (CH, C5); 52.81 (CH, C18); 48.23(C, C17); 47.63 (CH, C9);
42.46(C, C14); 40.01 (CH2, C1); 39.77(C, C8); 39.27 (CH, C19); 39.00 (CH, C20); 38.43 (C, C10);
36.85 (CH2, C22); 32.53 (CH2, C2); 32.30 (CH2, C7); 30.81(CH2, C21); 28.08 (CH2, C15); 26.00
(CH3, C23); 24.26 (CH2, C16); 23.84 (CH2, C11); 23.55 (CH3, C27); 23.14 (CH3, C24); 21.34(CH3,
C30); 21.34 (CH2, C6); 17.32 (CH3, C29); 17.18 (CH3, C26); 16.55 (CH3, C25).
Tabla 3. Datos obtenidos de los espectros de RMN 1H y 13C, para el compuesto 3.
Polvo amorfo blanco
FM= C30H46O4
Masa calculada 470.34
Cristales incoloros
FM= C31H48O3
Masa calculada 468.72
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MN 1H (CDCl3, 700 MHz):ᵟ (ppm) 5.26 (pseudo-t,J=3.5,J=6.8, H-12); 3.60 (s,3H-1´); 2.53 (ddd,
Jgem=16.8 Hz, Jaa=9.8Hz, Jae=4.9Hz); 2.37 (ddd, Jgem=16.1 Hz, Jea=7 Hz, Jee=3.5 Hz); 2.24
(d,J=11.2 Hz, H-18); 1.81 (s,3H-24); 1.81 (s,3H-23); 1.04 (s,3H-25); 1.03 (s,3H-27); 0.94 (d, 3H-
29, J=6.3 Hz, H-19); 0.86 (d,J=6.8, 3H-30, J=6.3 Hz, H-20); 0.79 (s,3H-26).
RMN 13C (CDCl3, 100 MHz): ᵟ (ppm) 177.85 (C, C28); 138.39 (C, C13); 125.75 (CH, C12); 66.01
(CH, C1’); 55.41 (CH, C5); 51.07 (CH, C18); 48.27 (C, C17); 47.76 (CH, C9); 42.25 (C, C14);
39.75 (C, C8); 39.30 (C, C4); 38.09 (CH2, C1); 38.94(C, C10); 38.83(CH2, C22); 37.17(CH, C19);
36.95(CH, C20); 33.26(CH2, C7); 30.92 (CH2, C21); 28.35 (CH2, C15); 28.19 (CH3, C23); 27.42
(CH2, C2); 24.41 (CH2, C16); 23.75 (CH3, C27); 23.50 (CH3, C30); 21.41 (CH2, C11); 18.52 (CH3,
C29); 17.29 (CH2, C6); 17.24 (CH3, C26); 15.83 (CH3, C24); 15.67 (CH3, C25).
Discusión y conclusiones
El ácido ursólico fue obtenido de su fuente natural, donde se sabe se encuentra con su
isómero el ácido oleanólico, por ello, la obtención de este compuesto no se puede realizar mediante
métodos de separación convencionales. Debido a una pequeña diferencia en la estructura de estos
dos isómeros en los metilos de la posición 29 y 30 presentes en el ácido ursólico y juntos en el
carbono 30 del ácido oleanólico, se observa que el ácido oleanolico presenta menor impedimento
estérico en el doble enlace de su estructura, esto hace que pueda reaccionar con mayor facilidad al
formar un epóxido con su doble enlace, lo que se logra mediante una reacción de epoxidación,
donde el agente oxidante encargado de la trasformación es el ácido metacloroperbenzoico
(AMCPB), debido a la reactividad del epóxido formado la reacción culmina con la formación de
una lactona con el carbono de la posición 28 del ácido oleanólico (Figura 5).
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Figura 4. Epoxidación del doble enlace del ácido oleanólico, con lo que se observa una cambió en
la polaridad de los compuestos. Fuente: Autoría Propia
Por medio un monitoreo a la reacción se puede observar una diferencia en la polaridad del
nuevo compuesto, la placa se realizó en una sistema de elución 70:30 Hexano:Acetato de Etilo, el
ácido sigue teniendo la misma polaridad, pero en la lactona generada se observa un incremento de
la polaridad (Figura 6), seguido de esto se realizó la separación en cromatografía en columna para
la obtención de ácido ursólico puro.
Figura 5. Diferencia de polaridad después de la epoxidación del doble enlace del ácido oleanólico. Fuente: Autoría Propia.
Por otro lado las reacciones realizadas se monitorearon mediante CCF y se observaron las
trasformaciones realizadas al compuesto de partida (Figura 7).
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Figura 6. Esquema de reacciones realizadas. Fuente: Autoría propia
Mediante las transformaciones se obtuvieron los compuestos 3 y 5, se tiene la hipótesis de
que estos compuestos puedan tener una buena actividad biológica, con lo que es de suma
importancia verificar su identidad, esto fue realizado mediante RMN 1H y 13C (Anexo 1 espectros).
Los datos espectroscópicos fueron comparados con las referencias que se tienen en el laboratorio,
en la tabla 2 y 3 se muestran los resultados de los desplazamientos químicos que confirman las
estructuras de los compuestos.
Por último se debe mencionar que se logró la purificación del ácido ursólico, a partir de la
mezcla de estos isómeros que se encuentra naturalmente en las plantas el ácido ursólico y el ácido
oleanólico. Tomando como materia prima al ácido ursolico se semi-síntetizaron 2 compuestos
finales 3 y 5 que se sugiere puedan tener actividad biológica.
Agradecimientos
Por medio de esta estancia, obtuve nuevos conocimientos, los cuales me serán de gran
utilidad para mi formación académica, por lo que agradezco:
En primer lugar al programa Verano UAGro, por permitirme participar como joven
investigador en el 4° Encuentro estatal de jóvenes investigadores-CONACyT.
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También a la Universidad Autónoma de Guerrero por apoyarme con los trámites
correspondientes para obtener este logro. Así mismo al investigador, Dra. Laura Patricia Álvarez
Berber, por aceptar ser asesor del proyecto de investigación que desarrollé durante esta estancia.
De igual manera a la Autora M.C. Maritza Leonor Maldonado Santiago por estar conmigo
en el Proyecto “Separación y semi-sintesis de compuestos con posible actividad biológica” que
lleve a cabo durante este periodo, quien mostró disponibilidad e interés para obtener un trabajo
adecuado.
También quiero darle gracias a Dios, hermanos y Padres Marcelino Gervacio Pineda y
Francisca Javier Villalva por tener su apoyo incondicional para seguir adelante en mi formación
educativa.
Referencias
Babalola, I. T. & Shode, F. O. Ubiquitous Ursolic Acid : Ursolic Acid : A Potential Pentacyclic
Triterpene Natural Product. J. Pharmacogn. Phytochem. 2013, 2, 214–222.
Kashyap, D., Tuli, H. S. & Sharma, A. K. Ursolic acid (UA): A metabolite with promising
therapeutic potential. Life Sci. 2016, 146, 201–213. doi: 10.1016/j.lfs.2016.01.017
Kow, T., Lee, B., Chung, S., Kim, D-H. & Lee, Y. Synthesis and NO Production Inhinitory
Activities of Ursolic Acid and Oleanolic Acid Derivatives. Bull. Korean Chem. Soc. 2009, 30, 119-
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Jichuang Wang, Zhou Jiang, Liping Xiang, Yuanfang Li Minrui Ou, Xiang Yang, Jingwei Shao,
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apoptosis and glycolysis. Sci. Rep. 2014, 4, 5006.
Sandeep R. & Rajesh K; Variations in Pentacyclic Triterpenoids in Different Parts of Four
Ocimum Species Using Reverse Phase-High Performance Liquid Chromatography. The National
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Shanmugam MK, Dai X, Prem A, Tan BKH, Sethi G, Bishayee A. Ursolic acid in cancer
prevention and treatment : Molecular targets, pharmacokinetics and clinical studies. Biochem
Pharmacol. 2013; 85(11):1579-1587. doi:10.1016/j.bcp.2013.03.006.
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Anexo 1
Espectro 1. RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) compuesto 3.
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Espectro2. RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) compuesto 3.
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Espectro 3. RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) del compuesto 5.
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Espectro 4. RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) del compuesto 5.