sergio h. marshall ix jornadas de investigación en ... · resultados todas las cepas inducen sps....
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Agregando Valor al Conocimiento de SRS:
“Evidencias Moleculares de la Complejidad de
Piscirickettisia salmonis “
Sergio H. Marshall
IX Jornadas de Investigación en Salmonicultura: Ciencia para una Mejor
Industria.
SalmonChile - INTESAL
Puerto Varas, 1 Diciembre 2017
Avances en investigación del Patógeno
Primer reporte en 1989 (Bravo & campos, 1989).
γ-proteobacteria (Fryer & Lannan, 1992).
Sistema de adhesión PAC (P. salmonis Attachment Complex) (Larenas et al., 2004).
Proteínas inmunogénicas para desarrollo de vacunas (Marshall et al., 2007; Whilhelm et al, 2007).
Aparición de isoforma de menor tamaño (Rojas et al., 2008).
Sistema PAC de P. salmonis
2008-2009: intracelular facultativo (Mauel et al., 2008; Gómez et al., 2009).
Infecta macrófagos de peces y produce apoptosis en esas células (Rojas et al., 2010).
identificación de una exotoxina y de los genes de virulencia clpB y vipA (Rojas et al 2013; Isla et al., 2014).
Secuenciación del genoma (Eppinger et at., 2013; Bohle et al., 2014, Yañez et al., 2014; Pulgar et at., 2015).
Piscrickettsia salmonis
α-Proteobacteria
Árbol filogenético 16S
Genoma de alta complejidad
Secuenciación del Genoma de 4 cepas
genes parálogos con formas alélicas desiguales
Gen o Sistema Función Número copias/Variantes
Sistema Dot/Icm (SSTIV) Virulencia 2 ó 3 variantes en cepas
Sistema flagelar Motilidad?? Virulencia?? 1 copia (set completo)
ORFs de Flagelina « A lo menos 4
Chaperona Hfq Regulación expresión 2 variantes
Sistema Secreción Tipo VI Virulencia 1
Sistema Trb (SSTIV) Conjugación?? 1
Sistemas Toxina-Antitoxina Persistencia/resistencia Múltiples tipos (al menos 4)
Operón ribosomal (16S-23S)
Síntesis de proteínas Al menos 2 - 6
Operón groES/EL Virulencia 1
Anquirinas Posibles efectores de virulencia
Al menos 8
La enigmática Piscirickettsia salmonis
Intracelular Facultativa
Escaso Conocimiento de su Biología
No existen Medidas de Control Eficaces
Consorcio de Variantes ?
Consorcio de Variantes: En tamaño (in vitro)
7 días post-infección
30 días post-infección
15 días post-infección
FAM (Microscopía de Fuerza Atómica) Rojas et al., 2009
Consorcio de Variantes: En tamaño (in vivo)
3-D
2-D
MicroscopíadeFuerzaAtómicadesP.s obtenidainvivo Curva de Melting sPs vs LF89
Alineamiento de secuencias sP.s in vivo vs sP.s in vitro
Existe el mismo patrón de «consorcio» en bacterias creciendo en medio libre de
células?
De ser así, existe la inducción en el tiempo de formas pequeñas? (sPs)
La respuesta es SI….en ambos casos con todos los beneficios que ello
implica…….
Metodología
Dado que los tres marcadores tienen baja ligadura su amplificación equivalente es un signo de la existencia del genoma bacteriano completo en el material filtrado
Para confirmar la integridad y el potencial infectivo de cada fracción, alícuotas idénticas de m.o.i. (0.1)
infectaron la línea celular SHK-1 y a los 6 días se determinó la infección en curso por qRT-PCR del marcador ITS.
STRAIN
EM-90 MDM
bact/ml %
Viable
MC1 bact/ml
% Viable
CT
ITS MDM
CT
ITS MC1
CT ICM MDM
CT ICM MC1
CT HFq1 MDM
CT HFq1
MC1
No Filter DAY 5 1,02x1010 ----- 1,3x1010 ----- 15,36 19,23 17,13 20,19 16,75 21,12
Post 0,45 µm. 1,20x107 ----- 2,3x107 ----- 27,20 27,80 28,03 27,13 27,04 26,45
Post 0,22 µm. 2,5x106 ----- 4,14x106 ----- 28,96 28,08 29,56 28,22 28,83 27,21
Post 0,10 µm. 3,4x105 ----- 6,2x105 ----- 29,56 30,33 31,05 29,13 29,60 28,98
No filter DAY 11 1,5x1010 ----- 1,2x1010 ----- 18,02 17,75 17,81 16,57 14,49 26,31
Post 0,45 µm. 2,6x108 ----- 3x108 ----- 29,56 28,25 28,35 29,21 17,07 28,31
Post 0,22 µm. 2,2x106 ----- 2,6x106 ----- 30,02 29.68 29,23 30,96 27,15 30,42
Post 0,10 µm. 1,8x105 ----- 1,6x105 ----- 30,89 30,42 31,55 32,46 30,14 31,95
No Filter DAY 32 4,10x108 75,40 5,78x108 84,10 27,14 27,74 27,33 28,08 26,88 28,12
Post 0,45 µm. 1,82x107 95,10 2,1x107 94,04 29,28 28,82 28,80 29,13 28,63 29,47
Post 0,22 µm. 6,17x106 86,81 5,31x106 86,08 30,06 31,38 30,67 30,98 30,22 30,12
Post 0,10 µm. 9,4x105 75,00 7,03x105 75,00 32,26 32,54 31,10 31,93 31,53 32,05
Evaluación de sPs viables generadas en el tiempo.
STRAIN EM-90 CT ITS - MDM CT ITS - MC1
No filter 5 d 19,46 19,46
Post 0,45 25,03 26,22
Post 0,22 31,66 30,98
Post 0,10 35,96 36,09
No filter 11 d. 20,34 21,14
Post 0,45 26,64 27,76
Post 0,22 30,45 30,06
Post 0,10 33,36 33,78
No filter 32 d 30,49 30,48
Post 0,45 30,95 30,66
Post 0,22 31,33 31,42
Post 0,10 31,84 31,61
Evaluación del potencial infectivo de las sPs generadas en el tiempo.
células SHK-1 semi-confluentes infectadas a una m.o.i. de 0,1 por 1 h, lavadas y recuperadas a los 6 días p.i., RNA extraído y la expresión de novo evaluada via ITS - qRT-PCR.
Análisis por Microscopía Confocal. (A) control + (LF-89 no filtrada); (B) idem EM-90 ; (C) EM-90 post 0,22 μm; (D) 1:1 Mezcla EM-90 no filtrada y filtrada. (Anticuerpo específico).
7,5µm 7,5µm
7,5µm
A B
C D
7,5µm : 123,328 nm
: 2,03 µm : 1,93 µm
Resultados
Todas las cepas inducen sPs. en el tiempo. La inducción es independiente del medio utilizado
El cultivo, a los 32 días, mantiene bacterias viables y cuanto mayor es
el tiempo de incubación, mayor es la cantidad de sPs generadas.
Sin embargo, usamos el tiempo de 11 días para hacer nuestros análisis.
Si bien el filtrado de 0,22 a 0,10 μm proporciona estructuras "viables", se recomienda usar las de 0,22 como prototipo de sPs.
Todas las sPs generadas, independientemente del tamaño, parecen ser bacterias completas y conservan su potencial infectivo.
Las sPs aumentan su potencial infectivo después del día 6 y al día 11 es casi equivalente a los obtenidos con las fracciones sin filtrar.
Representan las sPs formas persistentes del ciclo de vida bacteriano????
Es la población de sPs homogénea? En principio no debiera, pues está en el rango de tamaños de
las microvesículas (MVs, OMVs, Exosomas) que se sabe existen en bacterias y particularmente en P. salmonis (Oliver et al., 2016)
Análisis por: Citometría de Flujo: técnica de análisis celular multiparamétrico,
basada en pasar una suspensión de partículas (células) alineadas y de una en una frente a un haz de láser focalizado, donde cada célula dispersa la luz, emite luz fluorescente como consecuencia de la excitación del láser estimando tamaño celular y cantidad de estructuras granulares (complejidad de la muestra), con Intensidades de fluorescencia a diferentes longitudes de onda.
Nanosight: caracteriza nanopartículas (10 a 2000 nm) en solución individualmente, pero también de forma simultánea, por observación directa o por la medición de eventos de difusión, dando resultados de alta resolución para la distribución y concentración del tamaño de las partículas y la fluorescencia distingue partículas marcadas de las naturalmente fluorescentes.
LF-89 T-GIM S-GIM
ANALISIS POR CITOMETRIA DE FLUJO DE P. salmonis a 11 DIAS DE CRECIMIENTO
EM-90
Sobrenadante
Centrifugación 1000g x 5 ‘
100 ml Cultivo Filtración 0,22 um
1 mL muestra
Citometría de Flujo
Pre filtración
sPs en todas
CITÓMETRO DE FLUJO NANO SIGHT
P. salmonis sin filtrar 11 días de cultivo (O.D 3,4) Tamaño de partículas: 146,6 nm. Concentración: 2,32 x 107 partículas/mL.
Caracterización cuali y cuanti de las nanopartículas (< 0.22)
P. salmonis (0,5 O.D; 2 días) Tamaño de partículas: 109,5 nm Concentración: 1,33 x 106 partículas/mL
P. salmonis (0,99 O.D; 3 días) Tamaño de partículas: 111,3 nm Concentración: 1,9 x 106 partículas/mL
FASE EXPONENCIAL FASE ESTACIONARIA TEMPRANA
P. salmonis (1,4 O.D; 5 días) Tamaño de partículas: 107,3 nm Concentración: 2,9 x 1010 partículas/mL
P. salmonis (3,4 O.D; 11 días) Tamaño de partículas: 122,0 nm Concentración: 9,5 x 1010 partículas/mL
FASE ESTACIONARIA FASE ESTACIONARIA TARDIA
Caracterización cuali y cuanti de las nanopartículas (< 0.22)
Que tenemos hasta ahora: Una población de P.salmonis NO es homogénea, predominando
las sPs que se enriquecen en el tiempo.
Las sPs, que son formas infectivas, están dentro de una población también heterogénea de nanopartículas (OMVs, Exosomas, etc)…
Esta poblaciòn, que incluye las formas sPs infectivas, cambian su composición en forma dinámica durante la cinética de crecimiento.
La pregunta siguiente es: …..habrá uniformidad en el contenido y calidad de las proteínas constituyentes de la fracción sPs (< 0.22µm)
La respuesta es NO!!
Análisis de expresión de proteínas en Pisciricktessia salmonis:
Normales vs sPs.
Metodología Tres cepas de Pisciriketssia salmonis caracterizadas fueron crecidas en idénticas condiciones en
medio para generar tanto fenotipo normal como fenotipo pequeño:
LF89 (muchos pasajes)
EM90 (muchos pasajes)
GIM 35 (de campo recién recuperada)
Filtración por 0.45 µm y luego por 0.22 µm para separar los dos fenotipos a los 11 días
Cada muestra se digiere con tripsina y se analiza por espectrometría de masas, comparando la
diferencia de perfiles de expresión para cada cepa, entre fenotipo normal vs fenotipo pequeño (sPs)
RESULTADOS
Se encuentran proteínas que se expresan diferencialmente en cada
fenotipo, y existen también diferencias entre las cepas utilizadas.
Proteína LF89 EM90 GIM-35
1 71% 56% 37%
2 46% 50% 42%
3 74% 61% 31%
4 73% 37% 45%
5 66% 69% 27%
6 74% 68% 20%
7 66% 68% 27%
8 36% 26% 18%
9 75% 67% 43%
10 73% 60% 47%
11 44% 65% 30%
12 55% 47% 21%
13 75% 34% 29%
14 81% 59% 48%
15 72% 62% 38%
16 67% 64% 52%
17 62% 50% 31%
18 78% 59% 38%
LF89 EM90 GIM-35
19 139% 173% 216%
20 146% 289% 386%
PequeñavsNormal
NormalvsPequeña
Expresión diferencial de 12 proteínas
en tres cepas de Piscirickettsia
salmonis
Con dos fenotipos de crecimiento:
pequeña (sPs) y normal
min. máx.
1 2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
LF89 71% 46% 74% 73% 66% 74% 66% 36% 75% 73% 44% 55% 75% 81% 72% 67% 62% 78%
EM-90 56% 50% 61% 37% 69% 68% 68% 26% 67% 60% 65% 47% 34% 59% 62% 64% 50% 59%
CepaGIM-35 37% 42% 31% 45% 27% 20% 27% 18% 43% 47% 30% 21% 29% 48% 38% 52% 31% 38%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
IncrementoenlaExpresión
Proteína
ExpresióndeproteínaFenotipopequeñovsnormal
Aumento de la expresión de 18 proteínas en el fenotipo pequeño vs fenotipo normal
Aumento de la expresión de 2 proteínas en el fenotipo normal vs fenotipo pequeño
19 20
LF89 139% 146%
EM-90 173% 289%
cepaGIM-35 216% 386%
0%
50%
100%
150%
200%
250%
300%
350%
400%
450%
IncrementoenlaExpresión
Proteína
Expresióndeproteína
Fenotiponormalvspequeño
Conclusiones. P salmonis tanto in vivo, in vitro y creciendo en un
sistema libre de células se comporta como un «consorcio» de formas y tamaños diferentes.
Dentro de este «consorcio» o agrupación, pareciera que existe un equilibrio dinámico entre sus componentes que fluctúan en el tiempo.
Esta fluctuación es variable entre diferentes aislados y pareciera depender del grado de «acostumbramiento « que tenga un aislado cuando se manipula in vitro.
En consecuencia, se requiere profundizar el conocimiento y comportamiento de la bacteria, principalmente in vivo y diseñar las estrategias adecuadas para su control.
Grupo de Trabajo Sergio Marshall
Fernando Gómez
Constanza Cárdenas
Fanny Guzmán
Marisela Carmona
Nicolás Ojeda
Carolina Salazar
Gabriela Carril
Patricio Flores
Alvaro Labra
Cristián Muñoz
Omar Luna
