serologia para dx de dermatopatias caninas y fel.pdf

24 / / Veterinary Focus / / Vol 18 No 1 / / 2008

La serologa se basa en el uso de anticuerpospara detectar anticuerpos circulantes (inmuno-globulinas) o antgenos. Tcnica empleadafrecuentemente en el diagnstico de las enferme-dades infecciosas, hoy en da es sustituida a menudopor la deteccin del ADN o el ARN de agentes infecciososmediante tcnicas de biologa molecular como lareaccin en cadena de la polimerasa (PCR, rt-PCR).Sin embargo, la deteccin de anticuerpos puedetener algunas ventajas sobre las tcnicas de PCR yen numerosas evaluaciones diagnsticas se empleantcnicas serolgicas especiales para el diagnstico deenfermedades mediadas por el sistema inmune.

Principios de las tcnicas serolgicasSe emplean numerosas tcnicas (Tabla 1, Figura 1).Los principales test rpidos se basan en el enzimoin-munoanlisis de adsorcin (ELISA) y en la inmuno-cromatografa (IC) (Figura 2); y las tcnicas delaboratorio en el ensayo de inmunofluorescenciaindirecta (IFI), el ELISA y la aglutinacin (ltex oeritrocitos) (Figura 3).

Pueden detectarse diferentes isotipos de inmuno-globulina dependiendo de la tcnica o los antisuerosutilizados. Las IgM suelen detectarse en la tcnicaIFI usando anti-IgM-FITC y en todos los casos deaglutinacin en ltex. Las IgG se detectan con lamayora de las tcnicas. Para la deteccin de IgE, seusan las tcnicas ms sensibles como el ELISA o elsistema avidina-biotina. El radioinmunoensayo (RIA)y la bioluminiscencia no se utilizan en la prcticaveterinaria para serologa, sino, principalmente, parala determinacin de hormonas.

Uso de la serologa endermatologa canina y felina

Pascal Prlaud, DVM, ECVD, DESVDClnica Veterinaria de referencia, Pars, FranciaEl Dr. Prlaud se licenci en la Facultad Nacional deVeterinaria de Toulouse. Cre y dirigi un laboratorio deanlisis clnicos en Pars durante 20 aos (CERI). Ha estadotrabajando en una clnica de referencia (dermatologa) desde1987 en Pars y Nantes y ahora es veterinario asociado en una nueva clnica de referencia veterinaria en Pars. PascalPrlaud es presidente honorario del Grupo de DermatologaFrancesa (GEDAC). Su trabajo principal est dedicado a lasenfermedades inmunolgicas, la otologa y la dermatologafelina. Es miembro de la fuerza operativa internacional sobredermatitis atpica canina. El Dr. Prlaud es autor de numero-sos artculos y libros sobre dermatologa canina y felina.

Figura 1. Se comercializan numerosos kits para el diagnsticoserolgico de enfermedades infecciosas en la clnica o en ellaboratorio.

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Vol 18 No 1 / / 2008 / / Veterinary Focus / / 25

Figura 2. Prueba positiva empleando la tcnica deinmunocromatografa (leishmaniosis).

Figura 3.Aglutinacin enltex de criptococopositiva.

Tabla 1.Tcnicas serolgicas

Tcnica

Inmunofluorescenciaindirecta

Enzimoinmunoensayoadsorbente

Inmunocromatografa

Aglutinacin en ltex

Electrosinresis

Ventajas

Numerosos antgenos simples,adaptabilidad a especies

diferentes

Puede desarrollarse como un kitcomercial o para la clnica

Simple

Simple

Especificidad

Limitaciones

Variaciones interlaboratorio, noadaptables al trabajo a gran

escala

Limitado a unos pocos antgenos

Sin control positivo, no adaptadoa mltiples muestras

Lecturas a veces difciles

Laboratorio especializado

Ejemplo

Leishmaniosis, ANA*,toxoplasmosis, ehrlichiosis,anaplasmosis, neosporosis,

borreliosis

FeLV, FIV, leishmaniosis,ehrlichiosis, dirofilariosis,

Sarcoptes scabiei

FeLV, FIV, leishmaniosis,dirofilariosis, Sarcoptes scabiei

Criptococosis, factoresreumatoides, brucelosis

Aspergilosis

InterpretacinLa presencia de anticuerpos circulantes indica unaexposicin previa a un antgeno. No constituye siste-mticamente un marcador de la enfermedad. Puedeobservarse inmunizacin en perros y gatos sanos y laserologa puede no tener un buen valor diagnstico sino hay una clara diferencia entre la poblacin sana yla poblacin enferma (por ejemplo: toxoplasmosis,borreliosis, neosporosis). Cuando hay solapamientoentre ambas poblaciones, es necesario definir unumbral de positividad, que es un compromiso entresensibilidad y especificidad (por ejemplo, leish-maniosis, IgE especfica de alrgeno). Si hay una claradiferencia entre ambas poblaciones, la serologa esuna herramienta diagnstica muy eficaz (es decir,criptococosis, aspergilosis, anticuerpos antinucleares,sarna sarcptica). Pueden observarse resultadosfalsos negativos despus del tratamiento prolongadocon corticosteroides.

Reaccin en cadena de la polimerasa(PCR), cultivo o serologa?En la actualidad, existen tres formas de diagnosticaruna enfermedad infecciosa:- Aislamiento directo: citologa, histologa, cultivo- Aislamiento del ADN o el ARN mediante tcnicas de

PCR directa o inversa (rt- PCR)- Aislamiento de anticuerpos especficos: serologa

Cuando el aislamiento directo es fcil (hongos, bacte-rias, la mayora de los parsitos) las tcnicas indirectascomo la serologa o la PCR no son tiles. Si el aisla-miento es difcil, son obligatorias. Las tcnicas de PCRson muy sensibles si se emplea la sonda adecuada. Sinembargo, esta elevada sensibilidad puede limitar lainterpretacin cuando la presencia de un agenteinfeccioso no es patolgica (por ejemplo, leishmaniosisen reas endmicas). La PCR precisa de un laboratorioespecializado y su coste es superior al de la mayora

*Anticuerpo antinuclear

Positiva

Negativa


de las pruebas serolgicas. Esta es la razn por la cualla serologa es una de las principales tcnicas paradiagnosticar numerosas enfermedades en dermatologacanina y felina (Tabla 2).

Enfermedades infecciosas y fngicasVricasSe han desarrollado numerosos kits de laboratorio ytest rpidos para la clnica para el diagnstico de lainfeccin retrovrica en el gato. Se basan en las tcnicasELISA o de inmunocromatografa para la deteccin deanticuerpos (FIV) y antgenos (antgeno p27 para laFeLV) circulantes. Su sensibilidad y especificidad sonmuy elevadas. Pueden emplearse para diagnosticarla infeccin retrovrica asociada a una dermatosisinfecciosa. Sin embargo, cuando se sospecha unadermatosis vrica, las tcnicas de PCR aplicadas abiopsias cutneas son ms precisas para las infeccionesretrovricas y para otras infecciones vricas, entre ellasel herpesvirus y el calicivirus felinos, el papilomavirus,el moquillo canino y el parvovirus.

Ehrlichia, AnaplasmaRara vez se usa serologa para la infeccin por rickettsiaen Europa, salvo en casos de sospecha de inmuno-deficiencia adquirida asociada a dichas enfermedades(por ejemplo: celulitis bacteriana generalizada, demo-dicosis generalizada del adulto). Las tcnicas de IFIson las ms precisas, desarrolladas para diagnosticarformas crnicas de la enfermedad. Los kit de ELISAdesarrollados para la serologa de Ehrlichia canis sonsuficientemente sensibles cuando se utilizan en reasendmicas, donde la reinfestacin est asociadafrecuentemente a una elevada respuesta de anti-cuerpos.

Bartonella, BorelliaAun cuando se han desarrollado tcnicas serolgicaspara el diagnstico de la infeccin por especies deBartonella y por Borellia burgdorferi (IFI), stas notienen valor diagnstico en dermatologa. Cuandose sospecha de manifestaciones cutneas de estasenfermedades, debe emplearse la PCR.

MalasseziaSe han estudiado IgG o IgE especficas frente a Malasseziaen perros con dermatitis atpica o con dermatitisrecurrente por Malassezia. Esos perros presentan nivelessuperiores de anticuerpos frente a malassezia en compa-racin a la poblacin canina sana. Se han desarrolladodiferentes tcnicas ELISA utilizando extractos alergnicosde Malassezia pachydermatis. Sin embargo, las tcnicasserolgicas no parecen suficientemente fiables encomparacin con las pruebas intradrmicas (1). Adems,no estn claras las indicaciones para este ensayo sero-lgico, ya que no se ha estudiado la inmunoterapia conMalassezia basada en dichas pruebas. Las pruebascutneas con extractos crudos podran constituir unenfoque ms sencillo y fiable para identificar a los perroscon fuerte reaccin alrgica a esas levaduras.

DermatofitosisAun habindose desarrollado algunas tcnicas sero-lgicas para el diagnstico de la infeccin por derma-tofitos, dicho enfoque no es eficaz (falta de sensibilidad,seropositividad persistente) ni est recomendado (2,3).Se consigue un diagnstico definitivo de dermatofitosismediante cultivo micolgico, que es la nica manerade identificar los dermatofitos infecciosos.

Micosis profunda y subcutnea Pueden utilizarse diferentes pruebas serolgicas(por ejemplo, deteccin de antgenos para especies deCryptococcus) para diagnosticar la mayor parte de lasmicosis subcutneas o sistmicas (Tabla 3). Sin embargo,el diagnstico definitivo de esas micosis en dermatologase consigue mejor mediante citologa, histopatologa ycultivo (laboratorio especializado en micologa) y, enalgunos casos, mediante inmunohistoqumica o tcnicasde PCR. En el caso de la criptococosis o la aspergilosissistmicas, las tcnicas serolgicas semicuantitativaspueden ayudar a controlar los animales tratados(por ejemplo, disminucin de ttulos (Figura 4)).

ProtozoosLeishmaniosisLa leishmaniosis es una causa frecuente de enfermedad

Tabla 2.Indicaciones de la PCR y la serologa en la dermatologa felina y canina

Ectoparsitos

Hongos

Bacterias

Micobacterias

Rickettsias

Protozoos

Virus

Examen directo ocultivo

PCR Serologa

++++

+/-+-

-+-++++

- *- **--++-

* Excepto para la sarna sarcptica** Excepto para criptococosis


USO DE LA SEROLOGA EN DERMATOLOGA CANINA Y FELINA

cutnea en el rea mediterrnea y la serologa es latcnica ms ampliamente utilizada para obtener undiagnstico definitivo. La mayor parte de los labora-torios emplean tcnicas IFI o ELISA que proporcionanresultados semicuantitativos. Los kits que puedenrealizarse en las clnicas se basan en tcnicas de ELISAe IC y detectan niveles elevados de anticuerpos. Untcnico de laboratorio debe verificar siempre cualquierresultado negativo de estos anlisis realizados enlas clnicas en un perro que muestre signos clnicoscompatibles con leishmaniosis.

Los signos clnicos de leishmaniosis son variables yla serologa puede ser positiva en perros de reasendmicas sin leishmaniosis clnica. A esto se debe que,si los signos clnicos son muy sugerentes, pueda reali-zarse serologa para confirmar el diagnstico; en otroscasos, pueden realizarse biopsias cutneas para ayudara reducir el diagnstico diferencial (Figuras 5 y 6).

La elevada sensibilidad de la PCR es interesante paralos estudios epidemiolgicos, pero es demasiadoelevada para utilizarse como tcnica de eleccin en eldiagnstico de la leishmaniosis clnica. Los resultadosfalsos positivos son raros con la serologa, ya que nohay reacciones cruzadas con otros microorganismos.Puede observarse serologa negativa cuando losorganismos son fcilmente aislados, como en la formapapular o nodular de la enfermedad.

NeosporosisLa serologa de la neosporosis en el perro puedeconseguirse mediante tcnicas IFI (VMRD) o tcnicasELISA (de kits bovinos). Estas tcnicas son muysensibles y especficas. Sin embargo, la interpretacinno puede hacerse fuera del contexto clnico, ya quenumerosos perros sanos pueden ser seropositivos(del 10 al 20% en la mayora de los pases europeos).La forma cutnea de neosporosis se diagnostica trasel aislamiento de los taquizotos en biopsias cutneaso biopsia mediante aspiracin con aguja fina. Ladiferenciacin con los taquizotos de Toxoplasmagondii puede conseguirse mediante inmunohisto-qumica o PCR en biopsias cutneas.

Figura 4. Electrosinresis positiva de una serologa paraAspergillus fumigatus. Ntense los mltiples arcos.

Tabla 3.Pruebas serolgicas utilizadas en el diagnstico de la micosis

Micosis

Aspergillosis

Criptococosis

Esporotricosis

Blastomicosis

Histoplasmosis

Coccidiomicosis

Pitiosis

Lagenidiosis

Prueba serolgica

Electrosinresis (suero)

Aglutinacin en ltex

(suero, LCR, Orina)

ELISA (Ag o Ac)

Aglutinacin en ltex

Inmunoprecipitacin

ELISA

ELISA

Sensibilidad

Baja

Alta

Alta

Baja

Baja

Alta

Baja

Especificidad

Alta

Alta

Baja

Baja

Baja

Alta

Baja

Mejores mtodos diagnsticos

TAC

Citologa, histopatologa, cultivo

(PCR para C. neoformans)


Citologa, histopatologa,

inmunohistoqumica, cultivo


inmunohistoqumica, cultivo, PCR



inmunohistoqumica, cultivo, PCR

Citologa, histopatologa,inmunohistoqumica, cultivo, PCR


ToxoplasmosisLos signos cutneos de toxoplasmosis pueden debersedirectamente a infeccin de la piel (dermatitis nodular)o ser secundarios (lceras debidas a vasculitis, convul-siones parciales que imitan prurito). La serologa estil, ya que un resultado negativo tiene un elevadovalor predictivo negativo. Sin embargo, niveles eleva-dos de IgG no tienen valor diagnstico. El diagnstico

de toxoplasmosis puede conseguirse con serologade IgM positiva o aislamiento del microorganismo(citologa, histopatologa, PCR).

EctoparsitosSarna sarcpticaLa sarna sarcptica es una de las principales causas deprurito violento y, a veces, de prurito crnico o leve.Como el aislamiento del organismo suele ser difcil, laserologa puede ofrecer una alternativa diagnstica muytil. Se han desarrollado tcnicas serodiagnsticas dela sarna sarcptica para el cerdo en Suecia, donde laenfermedad es endmica. La adaptacin de esta pruebaserolgica al perro llev a la comercializacin de un kitELISA. Su sensibilidad (85%) y especificidad (90%)son elevadas cuando se comparan perros sanos conperros que tienen sarna sarcptica (4). Sin embargo, en laprctica, esta prueba se usa en casos de prurito crnicopara descartar el diagnstico de sarna sarcptica(Figura 7). Estos perros a menudo han sido tratados concorticosteroides y varios productos acaricidas. En esosperros se desconoce la eficacia de la tcnica y a menudoobservamos resultados en una zona gris. Sin embargo,incluso despus de una corticoterapia prolongada, laserologa sigue siendo positiva cuando hay numerososparsitos.

Figura 5. Leishmaniosis en un Yorkshire Terrier de edadavanzada: el diagnstico diferencial abarca al menos ellinfoma epiteliotrpico, la dermatofitosis, la leishmaniosis y la demodicosis.

Lesiones levemente sugerentes

Biopsias cutneas (citologa)

No sugerente

Serologa

Lesiones muy sugerentes

Sugerente Negativo o zona gris

PCRpiel, ganglios

linfticos,mdula sea

Negativa

LEISHMANIOSIS

Aislamiento de los microorganismos

Positiva

Positiva

Figura 6. Papel de la serologa y la PCR en el diagnstico de la leishmaniosis cutneaen el perro.

Figura 7. Sarna sarcptica. Si no se asla ningn parsito, la serologa para Sarcoptes scabieipuede ayudar a definir eldiagnstico de sarna sarcptica.



Enfermedades inmunolgicasEnfermedades cutneas autoinmunesAnticuerpos antinuclearesSe observan elevados niveles de anticuerpos anti-nucleares en el 97% al 100% de los casos de lupussistmico y esta prueba es la piedra angular deldiagnstico de la enfermedad (5). Los ttulos mselevados se observan en los casos ms graves y dis-minuyen durante el tratamiento. Estos anticuerpostienen diferentes especificidades antignicas (Tabla4) que inducen varios aspectos de inmunofluore-scencia. Los anticuerpos anti-ADN son raros y los anti-Sm y anti-tipo 1 son muy sugerentes de lupus sistmico.

La principal tcnica serolgica empleada es la IFI,usando hgado de rata o clulas de Hep 2 como sustrato(Figura 8). Ttulos superiores a 1/160 se considerangeneralmente elevados. Como pueden observarse anti-cuerpos antinucleares en otras enfermedades conestimulacin policlonal del sistema inmune (es decir, laleishmaniosis, dirofilariosis) o en algunos perros sanos(Pastor Alemn), el diagnstico de lupus sistmico sebasa en la apreciacin de, al menos, cuatro criteriosdiagnsticos (Tabla 5).

Anticuerpos anti-desmoglenaLos autoanticuerpos implicados en el desarrollo delpnfigo foliceo (anti-desmoglena 1) y el pnfigovulgar (anti-desmoglena 3) pueden emplearse comoherramienta diagnstica. Se han desarrollado diferentestcnicas, desde una IFI de la piel o el esfago hasta unELISA de gran especificidad. Sin embargo, esas tcnicasestn dedicadas a la investigacin de laboratorio y lasensibilidad de este enfoque es mala por el momento.

Endocrinopata autoinmuneLa deteccin de anticuerpos anti-tiroxina o anti-tiro-globulina puede ser interesante para el diagnstico detiroiditis autoinmune, ya que es la causa principal dehipotiroidismo en el perro. La mayora de las tcnicasestn basadas en el ELISA o en la hemaglutinacin yson especficas para el perro. Esos anlisis puedenayudar a clasificar el hipotiroidismo, pero no son tilesen la prctica clnica. No pueden considerarse para eldiagnstico precoz de hipotiroidismo. La indicacinprincipal de dicha serologa es la observacin degrandes discrepancias entre la tiroxinemia y los signosclnicos: niveles elevados de T4 libre con sntomas dehipotiroidismo. Dichas discrepancias pueden debersea anticuerpos anti-T4 cuando se emplea una tcnicacompetitiva. Los anticuerpos anti-T4 del paciente

bloquean los anticuerpos marcados lo que provoca unresultado que muestra un nivel elevado de FT4. Enesos casos, debe controlarse la dosis de FT4 con unatcnica de dilisis en equilibrio.

Enfermedades cutneas alrgicasLa deteccin de alrgenos especficos IgE, conocida

Tabla 4.Especificidad de los anticuerpos antinuclearesobservados en el lupus sistmico canino (5)

Total de anticuerpos antinucleares

Anti-ADN

Anti-histonas

Anti-ANE*

Anti-Sm

Anti-RNP

Anti-tipo 1

Anti-tipo 2

Anti-SSA

Anti-SSB

Anti-HMG 1

Anti-HMG 2

100%


como test de alergia in vitro, es ampliamente utilizada.Sin embargo, suelen desconocerse sus indicaciones ylmites reales y los laboratorios comerciales a menudoprometen un rendimiento diagnstico no realista.

La nica indicacin de las pruebas de alergia en derma-tologa es elegir los alrgenos para una inmunoterapiaespecfica de alrgeno areo en el perro (6). No tienevalor diagnstico para otros alrgenos (alimento (7,8)),no permite el diagnstico de enfermedad alrgica y notiene valor diagnstico conocido en el gato ni en elcaballo. Los niveles de IgE felinos son, de hecho, idnticosen los gatos sanos y en los gatos con enfermedadescutneas alrgicas con todas las tcnicas conocidas (anti-IgE policlonales, anti-IgE monoclonales o FCrI) (9,10).

En la prctica, el diagnstico de las enfermedades cut-neas alrgicas se basa en criterios epidemiolgicos yclnicos, y no en los resultados de las pruebas de alergia(Tabla 6) (11). Por ejemplo, la observacin de prurito ylesiones dorsolumbares es ms eficaz para diagnosticarla alergia a la picadura de las pulgas que ningunaprueba de alergia.

IgE anti-caninaLas tcnicas de inmunoglobulinas se basan en elmismo principio y utilizan un suero anti-IgE canino(Figura 9) con una tcnica de elevada sensibilidad(es decir, avidina biotina), ya que la concentracinde IgE es muy baja en comparacin con otros isotipos.A menudo se discute la especificidad del suero anti-IgE, pero esto no constituye el principal criterio decalidad de una administracin de IgE. De hecho, lasensibilidad y la especificidad analticas de la tcnicano muestran correlacin con la sensibilidad ni laespecificidad diagnstica. Por ejemplo, anticuerposanti-IgE monoclonales o FCrI recombinanteshumanos (hFCrI) son reactivos con baja afinidad(12). Dado que la unin con la IgE es dbil, esnecesario un tiempo de incubacin ms prolongado oun suero menos diluido. Esto puede aumentar elriesgo de unin inespecfica y de menor especificidadde la tcnica. Por consiguiente, los anticuerpospoliclonales pueden ser igual de eficaces que losmonoclonales o que los FCrI reactivos en la prctica.La calidad de la tcnica depende de cmo se utilicenesos reactivos.

Tabla 5.Criterios ARA* adaptados al diagnstico del lupus canino (5)

Eritema

Lupus cutneo

Fotosensibilidad

lceras orales

Artritis

Inflamacin serosa

Signos renales

Signos del sistema nervioso

central

Signos hematolgicos

Signos inmunolgicos

Anticuerpos antinucleares

Localizado o piel expuesta a la luz (cara)

Despigmentacin, eritema, lceras (cara: nariz, prpados, labios)

Empeoramiento de las lesiones despus de la exposicin solar

Boca o faringe

2 o ms articulaciones sin deformacin

Derrame pleural o pericrdico estril

a) Proteinuria >0,5 g/l o b) cilindruria o hematuria microscpica o hemoglobinuria

a) Convulsiones o b) Alteraciones del comportamiento

a) Anemia hemoltica con reticulocitosis o b) Leucopenia (



Lmites tcnicos Las principales dificultades en la determinacin de IgEespecficos de alrgeno son: la calidad de los extractosalergnicos, la necesidad de controlar cada alrgeno yla definicin de un umbral positivo para cada alrgeno.De hecho, en la mayora de los laboratorios se empleaun control negativo (mezcla de suero de perros sanos oatpicos con pruebas cutneas negativas) y un controlpositivo para un total de hasta tres alrgenos. Sinembargo, la fijacin de IgE es muy variable, dependiendode cada alrgeno. Esto explica por qu la interpretacines posible para alrgenos areos para los que existe uncontrol positivo, pero no para el resto de alrgenos.

Los niveles de IgE especficas de alrgenos areos sonms elevados en perros atpicos, pero existe un gransolapamiento entre la poblacin sana y la poblacinatpica. Si el umbral de positividad es demasiadobajo, la tcnica es demasiado sensible y el valorpredictivo positivo del resultado es malo. Si el umbral

es suficientemente elevado como para limitar losresultados falsos positivos, el valor predictivo positivodel resultado es correcto, pero en la mayora de loscasos la sensibilidad es baja (del 70% al 40%, depen-diendo de los alrgenos).

ConclusinComo cualquier anlisis de laboratorio, debe utilizarseuna prueba serolgica cuando se sospecha una enfer-medad especfica. La interpretacin ser siempre difcilcuando se use serologa como prueba de deteccinselectiva evaluada fuera del contexto de los datosclnicos y epidemiolgicos. La serologa no debe aban-donarse en favor de tcnicas de PCR, ya que ambasson complementarias.

1. Edad de comienzo entre los 6 meses y los 3 aos

2. Prurito sensible a los esteroides

3. Otitis externa bilateral

4. Eritema peribucal o queilitis

5. Pododermatitis bilateral anterior

Figura 9. Los reactivos anti-IgE utilizados en tcnicas in vitrono constituyen la clave de la calidad de la posologa.

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BIBLIOGRAFA

Tabla 6.Principales criterios diagnsticos para el diagnstico de la dermatitis atpica

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