sessão científica bolsista camila lima 2015.2
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
FACULDADE DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE EDUCAÇÃO TUTORIAL
Camila Lima Silva
TRATAMENTO DE BIOFILMES ORAIS MULTIESPÉCIES COM PEPTÍDEO
ANTI-BIOFILME
Wang Z, de la Fuente-Núñez C, Shen Y, Haapasalo M, Hancock REW (2015) Treatment of Oral Multispecies Biofilms by an Anti-Biofilm Peptide. PLoS ONE 10(7): e0132512. doi:10.1371/journal. pone.0132512
Salvador – BA – BrasilSetembro, 2015
IntroduçãoBactérias organizadas em comunidade.
Erradicação dos microorganismos responsáveis pelas infecções como principal objetivo do tratamento.
Desafio clínico
(Scott et al., 2007; Fuente Núñez et al., 2013)
CÁRIE
INFECÇÕES NA POLPA
DOENÇA PERIAPICAIS
(Xiao et al., 2012; Chau et al., 2014)
(Haapasalo et al., 2005; Wang et al. 2012)
65% das infecções bacterianas, incluindo doenças orais
Introdução
ORGANIZAÇÃO COMPLEXA E
HETEROGÊNEA
DIFERENTES EXPRESSÕES
GÊNICAS
SUBSTÂNCIAS POLIMÉRICAS EXTRACELU-
LARES
RESISTÊNCIA À ANTIBIÓTICOS
DESENVOLVIMENTO DE NOVOS COMPOSTOS ANTI-BIOFILME E
NOVAS ABORDAGENS
(Kim et al., 2014; Hirt e Gorr 2013; Love 2001)
Introdução
Peptídeos anti-biofilme como alternativas aos agentes de desinfecção tradicionais.
Peptídeos isolados de fontes microbianas com efeitos anti-biofilme contra diferentes espécies presentes na placa bacteriana (S. sanguinis e E. faecalis)
Habilidade para alvos específicos das bactérias
Prevenção da formação do biofilme
(Fuente Núñez et al., 2012 e 2015; Kim et al., 2003; Leung et al., 2005)
(Fjell et al., 2012; Wiradharma et al., 2011)
Introdução
Peptídeo imunoduladorPotente composto anti-biofilme de amplo espectroDesencadeia a perda de nucleotídeos de sinalização de estresse (ppGpp)
Adota diferentes estruturas a depender do ambienteCandidato promissor para tratamento de infecções orais ou componente ativo em produtos odontológicos
PEPTÍDEO 1018
ppGppImportante no
desenvolvimento de múltiplas espécies
presentes no biofilme.
(Fuente Núñez et al., 2014)
(Zhang et al., 2014; Wieczorek et al., 2010; Hosoya et al., 2010)
ObjetivoTestar o(s) efeito(s) do peptídeo anti-biofilme 1018 contra a placa bacteriana oral se formando na presença e ausência dos constituintes da saliva, para avaliar se o peptídeo é adequado para o uso na Odontologia, e a sua atividade em combinação com a Clorexidina.
Materiais e Métodos
O peptídeo 1018 foi sintetizado pelo GenScript, utilizando a fase sólida do 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc)
Estocado e armazenado de forma estéril
SÍNTESE DO PEPTÍDEO
Materiais e Métodos
Método de microdiluição em caldo para medir a concentração inibitória miníma (MIC) em caldo de carne (BHI) e caldo lysogeny (LB)
Três amostras de placa bacteriana foram cultivadas nos meios BHI e LB, e o peptídeo 1018 adicionado em concentrações crescentes (0, 10, 20, 40 e 80µg/ml)
Placas incubadas à 37°C durante 24 horas
CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MINÍMA
MIC menor concentração do peptídeo em que nenhum crescimento foi observado
(Fuente Núñez et al., 2012; Wiegand et al., 2008)
Materiais e Métodos
Discos de hidroxiapatita (HA) estéril utilizados como substrato para o biofilme
Discos de hidroxiapatita revestidos por saliva (sHA) foram preparados para permitir a formação da película de saliva
Placa supragengival coletada da região de primeiros ou segundos molares superiores de três voluntários adultos saudáveis (24-45 anos) caldo BHI
Discos HA e sHA 1,8 ml caldo BHI 0,2 ml placa
MODELO DE BIOFILME
Condições anaeróbias a 37°C por 3 dias
Materiais e Métodos
Três diferentes concentrações do peptídeo 1018 (10µg/ml, 5µg/ml e 1µg/ml) foram adicionadas as placas no início do desenvolvimento do biofilme
Grupo controle: água estéril adicionada ao meio de cultura
Três discos HA e sHA foram submetidos a cada um dos grupos
TESTE DE INIBIÇÃO DO BIOFILME
Condições anaeróbias a 37°C por 3 dias
Materiais e Métodos
Após 3 dias de formação do biofilme, o meio de cultura foi substituído por 1,98ml de BHI fresco
9 discos de HA e sHA cobertos de biofilme foram submetidos a cada um dos grupos de diferentes concentrações do peptídeo (10, 5 e 1µg/ml)
EFEITO ANTI-BIOFILME A LONGO PRAZO EM BIOFILMES PRÉ-FORMADOS
3 HA e sHAINCUBAÇÃO
ANAERÓBICA 37°C24h
3 HA e sHAINCUBAÇÃO
ANAERÓBICA 37°C72h
3 HA e sHAINCUBAÇÃO
ANAERÓBICA 37°C48h1X 3X2X
O grupo controle (água estéril + BHI) foi avaliado em cada ponto de tempo (24, 48 e 72h)
Materiais e Métodos
Doze discos HA e sHA com formação de placa de 3 dias, lavadas e preparadas com soluçao tampão pH 7,0 (PBS) e em seguida imersos em 1ml do peptídeo 1018 (10µg/ml)
- 1 a 3 minutos -1 ou 3 vezes
EFEITO ANTI-BIOFILME A CURTO PRAZO EM BIOFILMES PRÉ-FORMADOS
Materiais e Métodos
24 discos HA e sHA com formação de biofilme de 3 dias preparadas com a solução PBS
I. ÁGUA ESTÉRILII. DIGLUCONATO DE CLOREXIDINA 2%III. 10µg/ml PEPTÍDEO 1018IV. DIGLUCONATO DE CLOXERIDINA 2% + µg/ml
PEPTÍDEO 10182ml da solução por 1 ou 3 minutos
PEPTÍDEO 1018 COMBINADO Á CLOREXIDINA
Materiais e Métodos
Coloração de viabilidade bacteriana e microscopia confocal de varredura a laser
Dois componentes de corante:o SYTO 9 : 480/500 nm CÉLULAS VIVASo IODETO DE PROPÍDO : 490/635 NM CÉLULAS MORTAS
Imagens confocais analisadas e quantificadas (proporção vivas/mortas) Software Imaris 7.2
Proporção florescência verde/vermelha
EXAME MICROSCÓPICO COM LASER CONFOCAL DAS AMOSTRAS
Materiais e Métodos
Três placas adicionais de biofilme tratadas com 10µg/ml do peptídeo (24, 48 e 72h) e examinadas pela microscopia eletrônica
Amostras submetidas á concentrações de etanol (50%, 70%, 80% e 100%) para desidratação.
EXAME DA MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
Materiais e MétodosCURVAS DE MORTE DO E. faecalis, S. mutans E PLACA BACTERIANA
Enterococcus faecalisÁGAR SANGUEAERÓBIO
Streptococcus mutansÁGAR SANGUEANAERÓBIO
MEIOS BHI E LB
Placa bacteriana coletadas de voluntário se desenvolvendo em discos HA
1,8 ml BHI 0,2 ml suspensão bacteriana (E. faecalis e S.mutans)
Materiais e Métodos
Software SPSS 16.0 para Windows
Padrão desvio das proporções de volume de células mortas e vivas calculados
Homogeneidade da variância determinada por teste Levene
Univariate ANOVA para significância dos resultados (nível 5%)
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Resultados
Potente inibidor de biofilme por atingir ampla variedade de espécies bacterianas
Seguindo o MIC (≥ 80µg/ml), não inibiu o crescimento bacteriano substancialmente
O tratamento com 10µg/ml reduziu significantivamente e quase completamente o biovolume 10x após 72h
ATIVIDADE ANTI-BIOFILME DO PEPTÍDEO 1018
(Wieczorek et al., 2010)
Resultados
10µg/ml
ATIVIDADE ANTI-BIOFILME DO PEPTÍDEO 1018
DISCOS HÁ9% 24h 7% 48h8% 72h
DISCOS sHA8% 24h8% 48h 6% 72h
Resultados
Efeito inibitório do peptídeo reflete a morte de bactérias presentes no biofilme
10µg/ml 70% morte celular após 48h de incubação
Aumento similar foi observado na concentração de 5µg/ml entre o 1º e 2º dia
ATIVIDADE ANTI-BIOFILME DO PEPTÍDEO 1018
Maior número de mortes em todos os grupos comparado ao grupo controle (água estéril)
Resultados
Sob todas as condições testadadas, 5µg/ml reduziu à 50% o biovolume e 1µg/ml à 54%, comparado ao grupo controle
ATIVIDADE ANTI-BIOFILME DO PEPTÍDEO 1018
Resultados
Ativo contra biofilmes pré-formados em ambos os tratamentos (curto e longo prazo) e em ambas as superfícies (HA e sHA)
ATIVIDADE ANTI-BIOFILME DO PEPTÍDEO 1018
ResultadosATIVIDADE ANTI-BIOFILME DO PEPTÍDEO 1018
MORTE BACTERIANA
TEMPO DE EXPOSIÇÃO
CONCENTRAÇÃO DO PEPTÍDEO
FREQUÊNCIA DE APLICAÇÃO
Resultados
Tratamento de curto prazo para avaliar a rapidez com que o peptídeo 1018 age
ATIVIDADE ANTI-BIOFILME DO PEPTÍDEO 1018
44%61% 64%
42%
VALORES DE BIOVOLUME ESTATISTICAMENTE SIGNFICATIVOS MAIS BAIXOS QUE OS CONTROLES NÃO
TRATADOS
Resultados
Reduzido biovolume relacionado a aumento de morte celular (microscopia confocal):
39% (3 tratamentos de 3 minutos em discos HA)
Porcentagem de morte celular menor comparada ao tratamento de longo prazo
ATIVIDADE ANTI-BIOFILME DO PEPTÍDEO 1018
Resultados
A microscopia eletrônica de biofilmes formados durante 3 dias revelou cocos, hastes e filamentos
ATIVIDADE ANTI-BIOFILME DO PEPTÍDEO 1018
Resultados
Curvas de morte num período de 120 minutos para avaliar a atividade de morte celular do peptídeo
O peptídeo conduziu a morte celular de forma tempo-dependente em ambos os meios de cultura (BHI E LB)
Morte substancial do S. mutans e E. faecalis
ATIVIDADE ANTI-BIOFILME DO PEPTÍDEO 1018
Resultados
O efeito do peptídeo + clorexidina foi testado a curto prazo
COMBINAÇÃO DO PEPTÍDEO 1018 E CLOREXIDINA
⇩73%
⇩ 64%
* *
DiscussãoAgentes de desinfecção tradicionais QUÍMICOS
inibem o desenvolvimento do biofilme e afetam o metabolismo bacteriano
O modelo in vitro utilizado no presente estudo mimetiza o modelo de biofilme in vivo:- Multiespécies- Interação com a película de saliva
(Baehni e Takeuchi, 2003)
(Shen et al., 2009 e 2011)
DiscussãoRecentemente desenvolvidos e identificados, peptídeos anti-biofilme sintéticos, oferecem nova abordagem para controle do biofilme
Potente atividade anti-biofilme - Inibição do desenvolvimento- Estimula morte de microorganismos
Amplo espectro atua através da ligação e degradação de nucleotídeos envolvidos na formação e manutenção do biofilme
(Fuente Núñez et al., 2012; Leung et al., 2005; Tao et al., 2011)
(Fuente Núñez et al., 2014)
DiscussãoNo presente estudo, o peptídeo 1018 desencadeou a morte celular em biofilmes formados durante 3 dias com concentrações abaixo da MIC (80µg/ml)
10µg/ml peptídeo 1018 suprimiu crescimento em
75%
AMPLO ESPECTRO E ATIVIDADE
DIVERSIFICADA vs. PLACA BACTERIANA
(Fuente Núñez et al., 2014; Baehni e Takeuchi 2003)
Espécies específicas e bactérias residuais após tratamento, não foram identificadas.
Não houve diferença significativa na porcentagem de volume de células mortas e biovolume nos discos HA e sHA
PELÍCULA DE SALIVA NÃO DEGRADA O
PEPTÍDEO 1018
PEPTÍDEO LL-37 COM ATIVIDADE REDUZIDA
PELA SALIVA E FLUÍDOS CORPORAIS
Discussão
(Bucki et al., 2008)
DiscussãoCom relação a aplicabilidade, o peptídeo 1018 tem sido demonstrado atóxico na concentração de 200µg/ml para fibroblastos e 375µg/ml para células vermelhas do sangue
(Steinstraesser et al., 2012; Wieczorek et al., 2010)
DiscussãoAtividade de espectro bacterianoDesinfectante oral mais utilizadoAção não específicaConcentração associada à efeitos colaterais
Shen et al., 2009 e 2010 demonstrou a morte de 46% do biofilme pela ação da clorexidina à 2% durante 3 minutos. Atividade menor comparada ao peptídeo 1018
Clorexidina
DANOS À MEMBRANA E
INIBIÇÃO ENZIMÁTICA
PERDA IRREVERSÍVEL DE CONSTITUINTES
CITOPLASMÁTICOS
REAGE COM GRUPOS NEGATIVOS
NO ENVELOPE CELULAR
(Shen et al., 2011; Athanassiadis et al., 2007)
(Brown et al., 1986)
DiscussãoKim et al., 2003, relatou efeito inibitório sinérgico de peptídeos catiônios e CHX no crescimento de Streptococcus orais usando o teste MIC
No estudo, a combinação do peptídeo 1018 + CHX não reduziu o biovolume ao comparar a ação isolada de cada componente, porém o tratamento combinado levou a um aumento significativo na quantidade de célular mortas no biofilme
A saliva não interfere na ação isolada ou combinada da CHX e peptídeo 1018
DiscussãoLimitações do estudo:
Espécies coletadas dos voluntáriosPeptídeo 1018 mais efetivo contra espécies específicas (S. mutans)Contagem de células mortas (bactérias em suspensão)Efeito inibitório do peptídeo preservado a longo prazo?
Aplicação múltipla para melhores resultados
Pasta de dentes, colutório, goma de mascar
Atividade anti-biofilme dentro de 3 minutos
POTENTE ATIVIDADE ANTI-
BIOFILME
EFEITO DE MORTE CELULAR COM A
CHX
TERAPIA ANTIMICROBIANA
CONTRA INFECÇÕES
DiscussãoPEPTÍDEO 1018
Remoção mecânica diária para controle do crescimento ainda é necessária, porém a aplicação do peptídeo 1018 pode contribuir para controle eficaz do biofilme.
Referências