sfc y disfuncin mitocondrial. myhill 2009. español alergias y un mal funcionamiento de la glándula...

Introducción

El síndrome de fatiga crónica es una enfermedadmultisistémica que les roba a sus víctimas su saludy dignidad. Dos de los signos más característicos ydebilitantes del SFC son una resistencia muyreducida y una fatiga post-ejercicio. A veces lafatiga es principalmente mental, y otras esfundamentalmente física. La fatiga se considerafalta de energía, viniendo ésta del procesometabólico básico de la oxidación de los nutrientes.

Una hipótesis ampliamente sostenida (A) es que elmetabolismo en personas con SFC es normal y lafatiga y otros síntomas son debidos a factorespsicológicos. Se sabe que la fatiga física es falta deenergía, pero la fatiga mental es considerada comouna sensación subjetiva caracterizada por una faltade motivación y alerta [1], incluso aunque elcerebro sea el principal consumidor de energíacelular en estado de reposo. Los pacientes puedenmostrar una disposición negativa a la enfermedadque incrementa la severidad de los síntomas [2,3].Sin embargo, si el metabolismo está funcionandoadecuadamente, la fatiga y los síntomasrelacionados deben ser debidos a que la energíaestá siendo malgastada por procesos mentales yfísicos de estrés, ansiedad, tensión y depresión.Los pacientes deberían poder ser ayudados, yposiblemente curados, con una intervenciónpsicológica, p.ej. la terapia congnitivo-conductual.Para explicar el malestar post-ejercicio unahipótesis alternativa (A') es necesaria, pudiendollamarse “falta de acondicionamiento físico” debidoal desuso de los músculos. Sin embargo, lahipótesis A' no se sostiene en la práctica, comoveremos en muchos casos a continuación.

Una hipótesis alternativa (B) es que hay unadisfunción metabólica donde no se produce lasuficiente cantidad de energía. La fuente principalde energía viene de la completa oxidación de laglucosa a dióxido de carbono y agua. El sistemadigestivo produce glucosa, glicerol y ácidos grasos,y aminoácidos. Si hay un problema en el sistemadigestivo, p.ej. fermentación intestinal,hipoclorhidria o insuficiencia pancreática, laproducción de energía se verá afectada y puedeprovocar una fatiga [4]. Estas condiciones puedeny deberían ser comprobadas. Las alergias y un malfuncionamiento de la glándula Tiroides tambiénpueden producir fatiga.

Cuando el sistema digestivo funcionacorrectamente, el torrente sanguíneo se nutre deglucosa y lípidos, donde, junto con el oxígenounido a la hemoglobina en los eritrocitos (glóbulosrojos), son transportados a cada célula del cuerpo.En el citosol de cada célula la glucosa sedescompone, en una serie de reacciones químicasllamadas glicólisis, en dos moléculas de piruvato

que entran en los orgánulos productores deenergía presentes en la mayoría de las células delcuerpo, llamados mitocondrias. Algunos detallesestructurales y el número de mitocondrias porcélula depende de los requerimientos de energíaen cada caso; las células cardiacas, del músculoesquelético, del hígado y del cerebro son las quelas tienen mayor número. La mitocondria generaenergía mediante el metabolismo oxidativo enforma de ATP (adenosín trifosfato) que cuando sehidroliza al bifosfato ADP, libera energía paraproducir contracciones musculares, impulsosnerviosos y cualquier proceso consumidor deenergía, incluyendo la energía química necesariapara sintetizar todas las moléculas complejas delorganismo [5,6]. Así, una disfunción mitocondrialresultará en fatiga y puede producir otros síntomasdel SFC.

Las dos hipótesis no son mutuamente excluyentes.Algunos pacientes pueden satisfacer ambas. Sinembargo hay restricciones; el ritmo metabólicobasal (alrededor de 7000 kJ por día) debe sermantenido y la primera ley de la termodinámica nopuede ser violada.

Hay pruebas evidentes de que la disfunciónmitocondrial está presente en algunos pacientes deSFC. Biopsias musculares estudiadas mediantemicroscopio electrónico han mostradodegeneración mitocondrial anormal [7-9]. Tambiénse han encontrado en biopsias, severas deleccionesgenéticas en el ADN mitocondrial (mtADN), genesque están asociados con la producciónbioenergética [9,10]. Una consecuencia de ladisfunción mitocondrial es un incremento en laproducción de radicales libres, que causan dañooxidativo. Este daño oxidativo y una incrementadaactividad de las enzimas antioxidantes han sidodetectados en especímenes musculares [11].Algunos compuestos esenciales (carnitina y acil-carnitina) necesarios para algunas reaccionesmetabólicas en la mitocondria han sido medidos ensuero, y se han encontrado reducidos en pacientescon SFC [12,13]. Ambos estudios encontraron unacorrelación entre los niveles de carnitina y lacapacidad funcional. También se han encontradoun metabolismo oxidativo reducido [14-16] yconcentraciones más altas de xenobióticos, lactatoy piruvato. En un grupo de pacientes fue observada unadisminución del pH intracelular después deejercicio moderado, y un ratio reducido de síntesisde ATP durante la recuperación fue tambiénmedido [18]. Estos hallazgos sugieren unaafectación en el reciclaje mitocondrial del ADP enATP.

Sin embargo, también hay estudios similares queno confirman la disfunción mitocondrial. Esprobable que esto sea debido a los diferentes

criterios de diagnóstico utilizados. Por ejemplo, elcriterio de Oxford (Oxford criteria) [1], unadefinición propuesta por psiquiatras, requiere solofatiga; "otros síntomas pueden estar presentes"pero no son esenciales. El criterio de los Centrospara el Control de Enfermedades [Centers forDisease Control (CDC)], es más selectivo ya querequiere cuatro síntomas adicionales de una listade ocho [19]. En Inglaterra en 2007 el InstitutoNacional para la Calidad Clínica [National Institutefor Clinical Excellence (NICE)] todavía introdujootro criterio, fatiga más algún otro síntoma, porejemplo dolor de garganta persistente [20]. Al otrolado del espectro están los criterios basados enestudios de pacientes con Encefalopatía Miálgica(EM) [21-23] que han culminado en el consenso decriterios Canadienses [24]; el criterio canadiense esimprobable que incluya a pacientes que satisfagansólo la hipótesis A. Todavía más confuso es elhecho de que ambos criterios, el Canadiense y elnuevo NICE de Inglaterra usan el término EM/SFC(ME/CFS) a pesar de que sus criterios son muydiferentes. Hoy en día el criterio de los CDC esinternacionalmente usado como criterio parapropósitos de investigación a pesar de su falta deprecisión [25]. Esta situación puede cambiar en elfuturo porque el criterio canadiense está ganandouna aceptación más amplia, y una agencia deinvestigación benéfica (ME Research UK) requiereahora ambos criterios, el de los CDC y elCanadiense, para ser usados en los proyectos deinvestigación que financia. Usamos los términosSFC o SFC/EM para el criterio de los CDC y EM/SFCpara el criterio Canadiense. Nuestro estudio tienecomo meta evaluar el rol de la disfunciónmitocondrial, con el objetivo principal de ayudar alos pacientes.

La hipótesis B es atractiva porque una disfunciónmitocondrial en varios órganos ofrece una posibleexplicación para muchos de los otros síntomas delSFC y de la EM. Hay pruebas crecientes de que lossíntomas son debidos a disfunciones a un nivelcelular. Se han visto anormalidades en células delsistema inmune [26], y estudios de expresióngenética han revelado anormalidades en genesasociados con células del sistema inmune, célulascerebrales, células del músculo esquelético, con latiroides y con la mitocondria [27,28]. Otro estudioposterior identificó siete fenotipos clínicos [29].Parece que hay tres grupos distintos deanormalidades clínicas que definen el SFC [30]: (a)anormalidades en el flujo sanguíneo y vasculares,como la intolerancia ortostática (sistema vascular),(b) dolor generalizado, y alta sensibilidad acomidas, temperatura, luz, ruido y olores(sensibilización del Sistema Nervioso Central), y (c)fatiga, cansancio y niebla mental (producción deenergía mermada). La hipótesis B consiste en quela falta de energía en el tercer grupo se origina enlas mitocondrias de las células individuales. Pero la

disfunción mitocondrial también puede producir lasanormalidades (a) y (b) porque el ATP producidoen cada célula por sus mitocondrias es la principalfuente de energía para todas las funcionescorporales.

Estas observaciones de las investigacionesbiomédicas en el SFC son muy prometedoras, pero¿cuánto tiempo tienen que esperar los pacientesantes de que haya un progreso real en la mejoríade sus síntomas? En la consulta médica privadaespecializada en el SFC, la meta principal es hacerque los pacientes se sientan y funcionen mejor. Secomienza el tratamiento utilizando el conocimientobiomédico existente para proporcionar una base denutrición, del manejo del estilo de vida y deldescanso. En caso de estar presentes, también seabordan los problemas tiroideos, adrenales y dealergias. La mayoría de pacientes mejora con estasintervenciones. No obstante, en muchos casos lamejoría no es tan grande como quisieran elpaciente y el médico. Cuando uno de nosotros(SM) supo que se comercializaba el kit necesariopara la realización del test “perfil de ATP” se pensóque podría ser útil para predecir el nivel deincapacidad y para identificar cualquier lesiónbioquímica que pudiera ser la causa subyacente. Elkit del test “perfil de ATP”, desarrollado por uno denosotros (JMH), se ha diseñado específicamentepara el SFC y para otras condiciones donde ladisponibilidad de energía está reducida. Seencontró rápidamente que el “perfil de ATP” eramuy útil para predecir el nivel de incapacidad,sugiriendo además cuales eran las intervencionesque más probablemente beneficiarían a lospacientes. A los efectos de este estudio se hanefectuado los tests en una determinada cantidadde pacientes y también en ciertos sujetos sanos.Una vez cotejados, los resultados de los testsmostraron evidencias completamente inesperadas.Antes de informar sobre los procedimientos de lostests y sus resultados, proporcionamos un breveresumen sobre la manera en la que lasmitocondrias producen energía.

Metabolismo energético mitocondrial

En cada célula la glucosa es descompuesta enpiruvato, proceso en el que se produce algo deATP (2 moléculas netas por cada molécula deglucosa). El piruvato y los ácidos grasos entran enlas mitocondrias de cada célula, como muestra deforma esquemática la Figura 1, donde ocurrendos procesos metabólicos coordinados: el ciclo delos ácidos tricarboxílicos (TCA), también conocidocomo ciclo de Krebs, que produce algo de ATP, y lacadena de transporte de electrones (ETC, tambiénllamada Cadena Respiratoria porque utiliza lamayoría del oxígeno que respiramos) que regenerael ATP desde el ADP mediante el proceso de lafosforilación oxidativa (ox-phos). En total se

producen algo más 30 moléculas de ATP por cadamolécula de glucosa, y éstas constituyen lospaquetes más importantes de energía celular,usados para todos los procesos vitales. Además delos alimentos y el oxígeno, las vías metabólicasrequieren todos los nutrientes implicados en laproducción de una gran cantidad de enzimas quecontrolan la multitud de reacciones bioquímicasimplicadas y todos los cofactores necesarios paraactivar las enzimas [31-33]. La mayoría de lasenzimas están codificadas por el ADN nuclear(nADN) de los núcleos celulares y unas pocas estáncodificadas por el mtADN. Algunas de las enzimasdependen de otros órganos. Por ejemplo, lahormona tiroidea es necesaria para el ciclo TCA.Por otra parte el hipertiroidismo, puede desacoplarel proceso ox-phos [34]; o sea que un problematiroideo puede llevar a desarrollar fatiga y estopuede ser analizado. El cuerpo humano contienenormalmente menos de 100 gr. de ATP encualquier instante, pero puede consumir hasta 100Kg. al día. Por esto el proceso ox-phos de reciclajees extremadamente importante y produce más del90% de nuestra energía celular. Las característicasy los procesos más importantes están ilustrados demanera simplificada en la Figura 1 (se puedenencontrar más detalles en cualquier libro de textode bioquímica de nivel pre-universitario, p.ej. [6], yen libros de texto de biología de nivel avanzado de

la escuela secundaria, p.ej. [35]). El ETC culminacon el complejo proteínico ATP sintasa que escomo un motor secuencial reversible en el que seproducen 3 moléculas de ATP a partir de ADP yfosfato inorgánico (P) en cada revolución [36].Debido a la historia evolutiva el ATP se producedentro de la membrana interna de lasmitocondrias, pero se utiliza fuera de ella, en elcitosol, donde libera energía al convertirse en ADPy Pi. Como ión negativo el P es co-transportado devuelta hacía dentro junto con el H+, mientras queel ADP3- es transportado también hacía dentro através de la proteína Translocasa, adeninanucleótido translocasa (TL o ANT),intercambiándose por el ATP4- que sale y entra enel citosol. Aquí hay problemas potenciales porquese sabe que ciertas moléculas específicas (p.ej. laatractilosida) bloquean la transferencia hacía elinterior, mientras otras pueden bloquearla hacía elexterior [37], y existe la posibilidad de que hayaotras moléculas, incluyendo contaminantesambientales que puedan bloquear dichastransferencias. ¿Qué ocurre cuando alguna parte de estas víasmetabólicas celulares funciona incorrectamente? Sino funciona correctamente la fuente de energíamitocondrial pueden aparecer muchos síntomas deenfermedad [38] incluyendo los síntomas del SFC.

FIGURA 1. Metabolismo energético en una célula y en la mitocondria Fases más importantes y localización del metabolismo energético en una célula humana (izquierda), y detalles simplificados deuna mitocondria que muestra los ciclos metabólicos principales y la cadena respiratoria de fosforilación oxidativa (derecha). Lamembrana mitocondrial externa es muy permeable, mientras que la interna lo es solamente para agua y gases. Proteínasespeciales transportadoras y Translocasas pasan los reactantes a través de ella. Arriba están las proteínas implicadas en la cadenarespiratoria del traspaso de electrones (ETC) y en el traspaso de ATP y ADP entre el citosol y la mitocondria. EL ADP y el Pi soncombinados por la ATP sintasa para fabricar ATP. La Translocasa ADP/ATP se abre hacía fuera (OUT) para transferir ADP a lamatriz y se abre hacia dentro (IN) para trasferir ATP al citosol. La enzima nicotinamida adenina dinucleotido juega un papel

fundamental en su forma oxidada NAD+ y en su forma reducida NADH + H+ en el transporte y en la transferencia de protones(H+) y electrones (e-). Adaptado de: [35] y [5].

Supongamos que la demanda de ATP es más altaque el ritmo al que puede ser reciclado. Estoocurre a los atletas durante la carrera de 100metros. Las células musculares entran en elmetabolismo anaeróbico donde cada molécula deglucosa es convertida en 2 moléculas de ácidoláctico. Este proceso es muy ineficiente (5.2% deproducción de energía comparada con el 100% dela oxidación completa) y solo puede durar unospocos minutos. El incremento de acidez producedolor muscular. Asimismo, cuando la concentraciónde ADP en el citosol incrementa y éste no puedeser reciclado suficientemente rápido en ATP, ocurreotra reacción química. Esto se vuelve importante sihay cualquier disfunción mitocondrial. Dosmoléculas de ADP interactúan para producir una deATP y una de AMP (adenosín monofosfato). El AMPno puede ser reciclado [6] y a consecuencia sepierde la mitad del potencial del ATP. Esto precisade algunos días para reponerse y puede contribuiral síntoma de malestar post-esfuerzoexperimentado por los pacientes [39-43].

Por esto la disfunción mitocondrial que resulta enun deterioro de la producción y del reciclaje delATP es una hipótesis biológicamente plausible, yhay considerable evidencia de que esto es unfactor contributivo en el SFC, al menos en unsubgrupo de pacientes. Nuestro estudio puedeconsiderarse como un test de esta hipótesis.

Métodos

Participantes

Setenta y un pacientes, 54 mujeres de media deedad de 47 (rango de 14 a 75) y 17 hombres demedia de edad de 52 (rango de 20 a 86), fueronseleccionados de un total de 116 pacientesconsecutivos que acudieron a una clínica médicaprivada especializada en SFC/EM. Solamente seexcluyeron a los pacientes si no cumplían loscriterios de diagnóstico para el SFC de los CDC[19] o si se habían realizado el test “perfil de ATP”antes de haberlos visto clínicamente. Seefectuaron, cuando eran apropiados, evaluaciones,tests e intervenciones, por problemas dietéticos yde sueño, alergias, y problemas tiroideos yadrenales. También se les dio consejo sobre elreposo requerido. Después de esta fase semantuvo una reunión con cada paciente durante lacual se les asignó una acordada Habilidadnumérica, la cual fue registrada en las notasclínicas. La Escala integral de Habilidad SFC [44] vade 0 a 10 y se adjunta en el Apéndice A. Sepropuso a aquellos pacientes que no habíanmejorado hasta un nivel clínico aceptable despuésde estas intervenciones que se realizaran el test

“perfil de ATP”. Todos los pacientes participantestenían una puntuación de 7 o menos en la Escalade Habilidad SFC.

Se explicó la naturaleza del test y cada pacienteaccedió (y pagó) a realizarse el test “perfil de ATP”(se necesitaba una muestra de 3 ml de sangrevenosa). El laboratorio que efectuó los tests (BiolabMedical Unit, www.biolab.co.uk) desconocía laHabilidad asociada con cada muestra de sangre. Amedida que se realizaban los test en máspacientes, quedaba patente que los resultados del“perfil de ATP” estaban proporcionandoinformación útil, y se les pidió a los pacientes unpermiso escrito e informado para utilizar demanera anónima los datos de sus tests. Todos lospacientes lo dieron.

Como Director del Laboratorio Biolab y hasta suretiro de ese puesto en 2007, uno de nosotros(JMH) recolectó muestras sanguíneas de cincuentay tres voluntarios sanos. Biolab obtuvo el permisoescrito con el consentimiento informado de cadavoluntario. Se procesaron de la misma manera lasmuestras del grupo de pacientes y del grupo desujetos sanos (de control). El grupo de controlconsistía en 40 mujeres con una media de edad de36 (rango de 18 a 63) y en 13 hombres cuyamedia de edad era de 35 (rango de 18 a 65).

Para ambos grupos todos los procedimientosfueron consistentes con la Declaración de Helsinki(2000) de la “World Medical Association”(www.wma.net) y este informe sigue las guíasdel “International Committee of Medical JournalEditors” (icmje.pdf disponible enwww.icmje.org).

Procedimientos

El ATP está presente en las células, sobre todocomo un complejo con magnesio y es hidrolizado aldifosfato (ADP) como la fuente de energía másimportante para los músculos y otros tejidos. Laconversión de ADP en ATP dentro de lasmitocondrias puede ser bloqueada o parcialmentebloqueada por ciertos contaminantes ambientales.Específicamente, la TL en la membranamitocondrial que controla la transferencia de ADPdesde el citosol y de ATP hacía el citosol, puede serquímicamente inhibida, siendo su eficacia tambiéndependiente del pH. Los cambios en el equilibrioácido-base, la disponibilidad de magnesio y lapresencia de productos metabólicos anormalespueden tener similares efectos que la inhibiciónxenobiótica de la TL.

Se han desarrollado unos cuantos métodos paramedir el ATP. Métodos como la espectroscopia conresonancia magnética (MRS) de 31P requieren unosmedios disponibles solamente en grandeshospitales o en institutos de investigación. Sepueden hacer biopsias de músculo esquelético,pero no de órganos vitales, como del corazón,cerebro o hígado. Los métodos que empleanmuestras sanguíneas (específicamente neutrófilos)son relativamente no invasivos y se pueden llevar acabo como tests rutinarios. Además, el flujosanguíneo llega casi a todas las células del cuerpoy lleva mucha información de lo que estáocurriendo. El método para medir el ATP utilizadoen el “perfil de ATP”, data de 1947 cuando McElroyvertió una solución de ATP en colas de luciérnagapulverizadas y observó una brillante luminiscencia,encontrando que la cantidad de luz producida eraproporcional a la concentración de ATP [45]. Asímostró que la energía que contiene el ATP puedeproducir luz y esto llevó al desarrollo de medicionesbioluminiscentes que se pueden realizar de manerarutinaria y reproducible con kits de ensayosbioquímicos comercialmente disponibles y conequipos de bioluminiscencia [46-49]. La luz esproducida cuando el ATP reacciona con la D-luciferina y el oxígeno en presencia de Mg2+ y de laenzima luciferasa. Cuando el ATP es el reactivolimitante, la luz emitida es proporcional al ATPpresente.

El test “perfil de ATP”

El test “perfil de ATP” encuentra 5 factoresnuméricos independientes de 3 series demediciones, (A), (B) y (C) en muestras de sangre(neutrófilos). En el Apéndice B se dan detallessobre las medidas efectuadas y de cómo se hancalculado los factores numéricos. Las 3 series son:

(A). La concentración de ATP en los neutrófilos semide en presencia de un exceso de magnesio quese necesita para las reacciones del ATP. Esto da elfactor ATP en unidades de nmoles por millones decélulas (o fmoles/célula), correspondiente a lamedida de cuánto ATP hay presente. Luego sehace una segunda medición, con sólo el magnesioendógeno presente. El Ratio ATP es el cocienteentre la cantidad de ATP medida con magnesioendógeno y la cantidad medida con magnesioañadido. Esto nos indica qué fracción de ATP haydisponible para el suministro de energía.

(B). La eficiencia del proceso de la fosforilaciónoxidativa se mide al inhibir primero la conversiónde ADP en ATP en el laboratorio con sodio azida.Este producto químico inhibe tanto la proteínamitocondrial citocromo a3 (último paso en el ETC),como la ATP sintasa [50]. El ATP debe entoncesser consumido rápidamente y dar una

concentración baja al ser medido. Luego, seelimina el inhibidor lavando y volviendo a mantenerlas células en una solución tampón. Lasmitocondrias deben entonces rápidamenterecuperar el ATP a partir del ADP y restaurar laconcentración de ATP. El resultado neto da el OxPhos, que es la eficiencia de reciclaje del ADP enATP, proceso que aporta más energía disponiblesegún se requiera.

(C). La TL varía un único sitio de fijación entre dosemplazamientos. En la primera posición el ADP esrecuperado del citosol para ser reconvertido enATP, y en la segunda el ATP producido en lasmitocondrias es traspasado al citosol para liberarsu energía. Se realizan las mediciones atrapandolas mitocondrias en un medio con afinidadcromatográfica. Primero se mide el ATPmitocondrial. Luego, se añade un tampóncontenedor de ADP a un pH que fuertemente incitaa la TL hacía la recolección del ADP para serconvertido en ATP. Después de 10 minutos se mideel ATP en las mitocondrias. Esto nos da el númeroTL OUT. Ésta es la medida de la eficiencia de latransferencia de ADP desde el citosol para sureconversión en ATP en las mitocondrias. En lasiguiente medición se añade un tampón a un pHque fuertemente incita la TL en la dirección dedevolver el ATP al citosol. Después de 10 minutosse lavan las mitocondrias para liberarlas deltampón y se mide el ATP restante en lasmitocondrias y esto da el número TL IN. Esta esuna medida de la eficiencia del traspaso de ATPdesde las mitocondrias al citosol, donde puedeliberar su energía según se requiera.

Resultados

Los factores numéricos individuales

La Figura 2 muestra unas gráficas de dispersión(un punto para cada paciente) de cada uno de los5 factores vs. Habilidad SFC. Como veremos másadelante es conveniente dividir los datos de los 71pacientes en 3 categorías, “muy severo”, “severo”y “moderado”, que tienen más o menos la mismacantidad de entradas (25, 21 y 25). A la derechade cada gráfica de dispersión mostramos unhistograma de proyección estratificado para las 3categorías de Habilidad (para los pacientes) y mása la derecha un histograma para los sujetos decontrol. Si se mira primero el histograma de ATPpara los sujetos de control vemos un valor mínimobien definido, con una larga cola hacía arribahasta un valor máximo de 2.89 fmoles/célula. Elvalor medio es 2.00 ± 0.05 [EEM (Error estándarde la media), n=53] que puede ser comparado conla medición, 1.9 ± 0.1 (EEM=12), hecha hace unos25 años con la misma técnica en un estudio de laenergética de la fagocitosis en neutrófilos[51].

Figura 2. Gráficas de dispersión de los 5 factores (Desde A hasta E) medidos en el test “perfil del ATP” vs. Habilidad SFC. En elmedio están los histogramas de proyección estratificados de las 3 categorías del grupo de pacientes, y a la derecha loshistogramas de proyección del grupo de control. Las gruesas líneas de guiones horizontales corresponden al valor mínimo de cadafactor medido para el grupo de control.

El Síndrome de Fatiga Crónica y la disfunción mitocondrial

El histograma estratificado para lospacientes y para los datos relativos a laHabilidad SFC muestra claramente quealgunos pacientes están en la regiónnormal y que algunos están por debajo,separándose en dos grupos con muy pocosolapamiento. En vez de comparar a lospacientes con la media del grupo de controlcomo se acostumbra, preferimoscompararlos con los valores mínimos delgrupo de control, que está más claramentedefinido. Este método también nos permiteclasificar los pacientes según se encuentrenen la región normal o por debajo. Esto sepuede cambiar fácilmente y se dan todoslos números en la Figura 2.Por tanto mostramos con una gruesa líneade guiones horizontal el valor mínimo decada factor medido en los controles.

La Figura 2A, ATP vs. Habilidad SFC,muestra que la mayoría de los pacientes“muy severos” y “severos” están por debajodel mínimo normal, pero muy pocos estándebajo del 75% de este mínimo. Apuntarque 3 de los pacientes “muy severos”están dentro de la región normal; Éstostienen problemas con uno o más de losotros 4 factores. Sobre el 50% de lospacientes “moderados” están en la regiónnormal. Hay una pequeña correlaciónpositiva que se indica con las cruces“trend”. No hay un suave incremento en elATP con la Habilidad, pero sí un aumentode la fracción de los pacientes por encimade la línea mínima de normalidad.

La Figura 2B muestra el Ratio de ATP vs.Habilidad SFC. La mayoría de pacientes enlas 3 categorías están por debajo delmínimo normal y aproximadamente 1/3 delos pacientes “moderados” están por debajode 75% del mínimo normal. La correlacióncon la Habilidad es ligeramente negativa.Los valores para los sujetos de controlestán sin embargo claramente agrupadoscon un mínimo de 0.65 y una media de0.69.

La gráfica para el Ox Phos en la Figura 2Cmuestra un amplio rango de valores y unafuerte correlación positiva para este factorcon respecto al grupo de pacientes. Laproyección estratificada claramentemuestra que hay dos grupos – por encimay por debajo del mínimo normal y el grupode arriba abarca un rango similar a los

controles. Destacar el alto valor para elúnico paciente con Habilidad SFC=0. Estepaciente también tiene ATP=1.26 y un ATPRatio=0.59 que no están muy por debajode los mínimos normales.

La gráfica TL OUT de la Figura 2D tambiénmuestra dos grupos, sinembargo en estecaso con un pico en las proyeccionesestratificadas, justo por encima del mínimonormal, y esto se ajusta estrechamente conla proyección del grupo de control. Muchospacientes, particularmente los “muyseveros” están muy por debajo del mínimonormal.

La gráfica TL IN de la Figura 2E tambiénmuestra un pico en la región normal. Noobstante, algunos pacientes tienen valoresmuy bajos, incluyendo el paciente conHabilidad SFC=0. El producto TL OUT × TLIN es solamente 0.012 para este pacienteque está gravemente enfermo, mientrasque este producto es 0.17 para el mínimonormal, un múltiplo mayor de 14. Sisolamente se hubiera medido el ATP y elOx Phos no se hubiera detectado la muysevera disfunción mitocondrial de estepaciente. Destacar la fuerte correlaciónpositiva para el TL IN.

La mayoría de pacientes están por debajode lo normal en más de un factor (El[rango] medio es 3.7 [de 2 a 5] para “muyseveros”, 3.5 [de 2 a 5] para “severos” y2.2 [de 1 a 4] para “moderados”). Algunasde estas características están resumidasnuméricamente en la Tabla 1.

Para la mayoría de factores, el porcentajede pacientes que están en la región normalincrementa al ir de “muy severos” a“severos” y a “moderados”. La excepción esel Ratio ATP que disminuye ligeramente,siendo constante el error estadístico delmismo. Tanto el TL IN, como el productoTL OUT × TL IN, incrementan por múltiplosaltos. Para los pacientes de la categoría“moderada” la influencia más importante ensu enfermedad parece ser el Ratio ATP. La Tabla 1 también ilustra la importanciade medir más de un factor. Por ejemplo, sise hubiera medido solamente el ATP, el28% de todos los pacientes se hubieranclasificado como normales, y de habermedido unicamente el Ox Phos, el 32% de

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los pacientes “muy severos” se hubieranclasificado como normales. Correlaciones entre los factores numéricos

También es útil observar las correlacionesentre las parejas de factores numéricos.Los 5 ejemplos más relevantes se muestranen la Figura 3.

En las gráficas de dispersión de la Figura3, la región normal es la región rectangularen la esquina derecha superior definida porlas líneas de guiones mínimas denormalidad. En la gráfica correspondiente alRatio ATP vs. ATP (Figura 3A), la mayoríade pacientes está bastante cerca de laregión normal, menos un grupo pequeñoque está en ATP Ratio ~ 0.35.

En la gráfica Ox Phos vs. ATP (Figura 3B)

hay sólo unos pocos pacientes, todos“moderados”, en la región normal paraambos factores. Algunos de los pacientes“muy severos” y “severos” están en laregión normal para Ox Phos y algunosestán muy por debajo. Observar la notoriacorrelación negativa para los controlesnormales. Esto muestra que para lossujetos normales hay un sistemacompensatorio; p.ej. si el ATP está alto, elOx Phos está bajo y viceversa. Esto es deesperar porque la concentración de ATP esel factor fundamental en el control del ritmodel proceso ox-phos, ajustándose así elsuministro de energía para cubrir sudemanda. No hay evidencia obvia de esteefecto en el grupo de pacientes.

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Tabla 1. Algunas características de los factores medidos en los tests “perfil de ATP” --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Porcentaje de pacientes en la región normal Categoría --------------------------------------------------------------------------------------------------------- ATP Ratio ATP Ox Phos TL OUT TL IN TL OUT×TL IN

------------------------------------------------------------------------------------------todos (N=71) 28 ± 5 28 ± 5 38 ± 6 39 ± 6 52 ± 6 30 ± 5-------------------------------------------------------------------------------------------------------------muy severo 12 ± 7 32 ± 10 32 ±10 24 ± 9 24 ± 9 8 ± 6Severo 19 ± 9 29 ± 10 19 ± 9 38 ±11 48 ± 11 14 ± 8Moderado 52 ± 10 24 ± 9 60 ± 10 56 ± 10 84 ± 8 64 ± 10-------------------------------------------------------------------------------------------------------------Los errores mostrados son ±1 DE (Desviación Estándar), calculados con la distribuciónbinomial.

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Figura 3. Gráficas de dispersión de correlaciones entre las parejas de factores medidos en el “perfil de ATP”. En la gráfica Ox Phos vs. TL OUT (Figura3C) sólo 6 pacientes (todos “moderados”)están en la región normal de ambosfactores. Observar cómo los resultados parael TL OUT muestran 2 grupos, una bandaestrecha a la derecha de la línea de guionesvertical y un grupo esparcido a la izquierdade esta línea. Mirándolo verticalmente,vemos que para el primer grupo, laHabilidad de los pacientes (indicada por las3 categorías) está correlacionada con suvalor de Ox Phos. Hay un granesparcimiento para esta variable, y denuevo parece haber dos grupos, más omenos divididos por la línea del mínimonormal horizontal. Algunos de los pacientesde las 3 categorías están por encima deesta línea, pero tienen problemas con uno omás de los otros factores. Algunos de lospacientes "muy severos" tienen el Ox Phospor debajo del mínimo normal, condiferencias de un orden de magnitud.

En la gráfica Ox Phos vs. TL IN (Figura3D) hay muchos más pacientes en laregión normal para ambos factores, perotambién muchos con valores muy bajospara una o ambas variables.

En la gráfica TL IN vs. TL OUT (Figura 3E)hay dos grupos, uno en la esquina derechasuperior que corresponde a la regiónnormal para ambos factores, y otro muypor debajo, en el TL IN ~ 0.1. Algunospacientes están también muy por debajodel mínimo normal para ambas variables.

Según los métodos bioquímicos empleadospodríamos esperar cierta correlación entrelos factores TL y Ox Phos, pues ambosestán muy relacionados, interactuandoconjuntamente en el ciclo de reconversióndel ADP en ATP. Sin embargo las gráficasindican que los métodos bioquímicosutilizados permiten separar los factores TLy Ox Phos y medirlos así de maneraindividual.

Creemos que esta es la primera vez quehan sido observados estos efectos demanera tan detallada.

La Puntuación de la Energía Mitocondrial

Las mediciones bioquímicas obtenidas porel “perfil de ATP” separan los procesos degeneración de energía y de reciclaje en 5

pasos. Como en cualquier procesosecuencial, por ejemplo en la producción depotencia eléctrica o en una cadena demontaje, la eficiencia del proceso global esel producto de las eficiencias de los pasosindividuales. Cualquier índice deponderación relativa es irrelevante;únicamente tiene consecuencia dentro deun factor general de normalización. Elproducto de ATP y Ratio ATP es laconcentración celular de ATP en complejocon magnesio y esto corresponde alsuministro de energía disponible en formade ATP. Ox Phos es la eficiencia del ETCque convierte el ADP en ATP. Sin embargo,para producir más energía disponiblemediante el reciclaje del ADP, la proteínaTranslocasa debe encarar de maneraeficiente su sitio de unión hacia fuera, pararecoger el ADP (TL OUT), yalternativamente encararlo hacia dentro (TLIN), para transmitir de manera eficiente elATP desde la mitocondria hacia el citosol,donde su energía pueda ser utilizada.

Hemos concluido que es útil calcular elproducto de los cinco factores, esto es, laeficiencia relativa global de producción deenergía mitocondrial, a la que hemosllamado “Puntuación de EnergíaMitocondrial”. Simplemente multiplicamoslos 5 factores para cada paciente y paracada control. El valor mínimo para loscontroles es 0.182 fmoles/célula. Hemoselegido este valor como nuestro punto denormalización, por el cual hemos dividido laPuntuación de Energía Mitocondrial (Tantopara los pacientes como para los controles),obteniendo de esta forma un valor dePuntuación de Energía Mitocondrial ≥ 1para todos los controles.

En la Figura 4A se muestra una gráfica dedispersión de la Puntuación de Energía paracada paciente y cada sujeto sano decontrol, con respecto a su Habilidad SFC. Lalínea de guiones horizontal indica el valormínimo para los sujetos de control y éste esnuestro valor de normalización de 1.00.Solo uno de los 71 pacientes tiene unaPuntuación de Energía > 1 (exactamentede 1.25, con una Habilidad SFC = 7). Noobstante, este paciente muestra 2 de los 5factores por debajo del mínimo denormalidad.



Destacar el alto grado de correlación entrela Puntuación de Energía y la HabilidadSFC, siendo esto independiente de dóndeesté el valor medio o el mínimo de lossujetos normales. Es natural pensar que esmás probable que la Habilidad SFC de lospacientes dependa de la disfunciónmitocondrial que viceversa, y por estorealmente deberíamos mostrar la HabilidadSFC en función de la Puntuación deEnergía. Sin embargo la Habilidad fuemedida primero, y la Figura 4A muestrade manera convincente que la disfunciónmitocondrial es un factor de riesgo mayor,y esto no ha sido demostrado conanterioridad. También se muestra en laFigura 4A la línea recta de regresiónajustada para las 71 entradas. El ajuste es

bueno, pero no hay ninguna razón para quela relación de dichas entradas debiera seruna línea recta. La Tabla 2 nos muestralos parámetros del ajuste. El error estándarde la pendiente de la línea recta deregresión ajustada es tan pequeño, que laprobabilidad P de la hipótesis nula (p.ej.que la pendiente fuese cero), esextremadamente pequeña, P<0.001,habiendo sido calculada mediante ladistribución t de Student [52]. EL intervalode confianza del 99.9% es 0.092 < β <0.174, donde β es la pendiente verdadera,estando este límite bajo todavía algunoserrores estándar sobre cero.

Figura 4. La Puntuación de Energía Mitocondrial. A. La gráfica de la Puntuación de Energía (MitochondrialEnergy Score) contra la Habilidad SFC (CFS Ability) con un punto para cada paciente. Los puntos para cadacontrol aparecen graficados en la Habilidad SFC = 10. La línea de guiones horizontal en la Puntuación deEnergía=1.00 es nuestra normalización correspondiente al valor mínimo de Puntuación de Energía de loscontroles. B. Gráfica Puntuación de Energía vs. Edad de pacientes y controles.

Tabla 2. Parámetros de la línea recta de regresión ajustada a los datos de la Puntuación de Energía Mitocondrial-----------------------------------------------------------------------------------------------------

Resultados de la línea recta de regresión ajustada-----------------------------------------------------------------------------------------------------

Pendiente 0.132± 0.012 Test-t Observado 11.4 Intersección - 0.123± 0.042 Grados de Libertad 69† R2 0.645* probabilidad P del test-t < 0.001

-----------------------------------------------------------------------------------------------------*R2 (llamado el “coeficiente de determinación” o la “variación explicada”) es el cuadrado del producto del coeficiente de correlación momento-producto.



† Hay 71 puntos de datos y 2 parámetros, pendiente e intersección.

En la Figura 4B, las Puntuaciones deEnergía están graficadas en función de laedad de cada participante. Se cree que lasmitocondrias juegan un papel fundamentalen el proceso de envejecimiento [31, 33]por lo que cabría la posibilidad de que laedad media de los más jóvenes del grupode control en comparación con el grupo depacientes pudiera influenciar nuestrosresultados. Hemos mirado la dependenciade cada uno de los 5 factores con respectoa la edad y no hemos encontrado ningunarelación; esto no es ninguna sorpresa sitenemos en cuenta la amplia extensión devalores de cada factor. La Puntuación deEnergía es una de las medidas más fiablespara la disfunción mitocondrial. En laFigura 4B no hay evidencia dedependencia respecto a la edad en el grupode control, pero la edad máxima es sólo de65 años (se han omitido los puntos de trescontroles debido a que su Puntuación deEnergía era mayor de 2.00, con un máximode 2.83). Hay seis pacientes de edad ≥ 70años, uno “muy severo” con Habilidad=2,uno “severo” con Habilidad=3, y cuatro“moderados” todos con Habilidad=4. Estoscuatro pacientes tienen una Puntuación deEnergía por debajo de la media (0.42) paraesta Habilidad, por lo que sí puede haberuna disminución con la edad. Por otro ladohay un paciente de 33 años que tambiéntiene una Habilidad=4 que está bastantepor debajo de la media. Excluyendo los seispacientes de edad ≥ 70 años, mejoraligeramente la línea recta de regresiónlineal (R2=0.677), pero su efecto esinsignificante sobre los otros parámetros osobre nuestras conclusiones.

Discusión

Los resultados del “perfil de ATP” muestranuna disfunción mitocondrial en losneutrófilos de los pacientes de nuestrogrupo de estudio. Además el grado de estadisfunción está correlacionado de maneramuy precisa con la severidad de suenfermedad. Los neutrófilos son las célulasefectoras principales del sistema inmune, yla disfunción mitocondrial observadaseguramente tenga efectos nocivos en estesistema. Notar que previamente se habíaobservado un incremento de la apoptosisde los neutrófilos en las personas con SFC[26]. Las mitocondrias son partes

funcionales importantes de casi todas lascélulas humanas, pero no podemos afirmara partir del presente estudio que lasmitocondrias de otras células sufran elmismo grado de disfuncionalidad. Labiología humana provee energía a losórganos vitales, a expensas de las partesmenos importantes. No obstante, lasdisfunciones en las células cardiacas y enlas del sistema nervioso central, podríanexplicar respectivamente los grupos deanomalías clínicas vasculares y desensibilización central, mencionadas en laintroducción. De esta manera, nuestrosresultados sugieren claramente que lacausa inmediata de los síntomas delSFC/EM es la disfunción mitocondrial.

No podemos enfatizar lo suficiente laimportancia de un diagnóstico meticulosoutilizando los criterios de los CDC [19], oincluso mejor con los criterios Canadiensesque describen de forma más precisa lossíntomas [24]. (Está disponible una versiónabreviada de estos últimos paraprofesionales de la salud, pacientes ycuidadores en:www.mefmaction.net/Patients/Overviews/tabid/122/Default.aspx; ytambién es españolen:http://www.mefmaction.net/Portals/0/docs//ME%20Overview-Spanish.pdf). Nopuede asegurarse que una selección depacientes con criterios menos selectivosencontrara el alto grado de correlaciónobservado aquí.

Los distintos valores encontrados para losfactores individuales que se conjugan paraobtener la Puntuación de EnergíaMitocondrial, indican que no todos lospacientes están afectados de la mismamanera. Esto puede deberse a la naturalezaheterogénea de los agentes precipitadoreso a las variaciones en la manera en que lospacientes reaccionan a ellos. Los resultadosindican lesiones bioquímicas específicas yalgunas de ellas pueden ser susceptibles demejora con las intervenciones apropiadas.Las mitocondrias necesitan todas susvitaminas esenciales, minerales, ácidosgrasos esenciales y aminoácidos parafuncionar eficientemente [31-33]. Esto esmuy importante desde el punto de vistaclínico de ayudar a los pacientes; el típicoprotocolo poco individualizado y casi



aleatorio que además requiere muchotiempo, puede ser remplazado porintervenciones basadas en información ycomprensión bioquímica [53]. El análisis delos resultados de las intervenciones queestán llevándose a cabo (verwww.drmyhill.co.uk), será el tema deuna futura publicación.

Conclusiones

Hemos demostrado la capacidad y lautilidad del test “perfil de ATP” al confirmary determinar con precisión las disfuncionesbioquímicas en las personas con SFC.

Nuestras observaciones nos permitenseñalar con solidez la disfunciónmitocondrial como la causa inmediata delos síntomas del SFC. No obstante, nopodemos determinar si el daño en lafunción mitocondrial es un efecto primario,o secundario a una o más condicionesprimarias, por ejemplo a la hipoxia celular[30], o al estrés oxidativo, incluyendo unexceso de peroxinitrito [54-58]. Ladisfunción mitocondrial está tambiénasociada a algunas otras enfermedades, yesto no es sorprendente teniendo encuenta el importante papel quedesempeñan las mitocondrias en casi todaslas células del cuerpo, aunque este hechoparece haber sido reconocido sólo en losúltimos años [34, 38, 59, 60].

Las observaciones aquí presentadasdeberían ser confirmadas en un estudiodebidamente planificado y financiado. Sedeberían realizar los tests bioquímicos enlos pacientes con SFC, antes y después delas intervenciones clínicas apropiadas yposiblemente también en pacientes conotras condiciones incapacitantes que cursencon fatiga. También sería bueno poderconfirmar los resultados de los testsbioquímicos en un segundo laboratorio(quizás apoyado por el gobierno).

Agradecimientos

Agradecemos los útiles comentarios de los Dres.Derek Pheby y Neil Abbot.

Dirección para la correspondencia: Norman E.Booth, PhD, ‘Applegate’, Orchard Lane, EastHendred, Wantage OX12 8JW, UK, Teléfono: +44(0)1235 833486 E-mail: [email protected]

Apéndice A – La escala de Bell de HabilidadSFC (Bell CFS Ability Scale) Esta escala es una medición útil y sensible del nivelde actividad y habilidad para funcionar de lospacientes con SFC/EM [44]. Es similar a laPuntuación del Índice de Energía (Energy IndexPoint Score) (EIPS™, www.cfsviraltreatment.com)[61]. Va de 0 a 10 con:

0. Síntomas Severos constantes; confinado en lacama todo el tiempo; incapaz de cuidarse solo.

1. Síntomas Severos en reposo; confinado en lacama la mayoría del tiempo. No sale de casa.Marcados síntomas cognitivos que afectan a laconcentración.

2. Síntomas moderados a severos en reposo.Incapaz de realizar actividad intensa. Actividadglobal del 30-50% de lo esperado. Incapaz de salirde casa excepto en ocasiones puntuales. Confinadoen la cama la mayoría del día. Incapaz deconcentrarse durante más de 1 hora al día.

3. Síntomas moderados a severos en reposo.Severos síntomas con cualquier ejercicio; nivel deactividad global reducido al 50% de lo esperado.Usualmente confinado en casa. Incapaz de realizartareas extenuantes. Capaz de hacer trabajo deoficina durante 2-3 horas al día, pero requiereperiodos de descanso.

4. Síntomas moderados en reposo. Moderados aseveros síntomas con ejercicio o actividad; el nivelglobal de actividad está reducido al 50-70% de loesperado. Capaz de salir una o dos veces porsemana de casa. Incapaz de llevar a cabo tareasextenuantes. Capaz de realizar trabajo sentado encasa durante 3-4 horas al día, pero requiereperiodos de descanso.

5. Síntomas moderados en reposo. Moderados aseveros síntomas con ejercicio o actividad; el nivelglobal de actividad está reducido al 70% de loesperado. Incapaz de hacer tareas extenuantes,pero capaz de realizar ligeras tareas o trabajo deoficina durante 4-5 horas al día, pero requiereperiodos de descanso.

6. Síntomas leves a moderados en reposo. Lalimitación en las actividades diarias se notanclaramente. Funcionamiento general del 70% al90%. Incapaz de trabajar a jornada completa entrabajos que requieran actividad física (incluyendosimplemente estar de pie), pero capaz de trabajara jornada completa en actividades ligeras (estandosentado) si el horario es flexible.

7. Síntomas leves en reposo; algunas limitacionesen las actividades diarias se notan claramente. Elfuncionamiento global está cerca del 90% de loesperado, excepto para actividades que requieranesfuerzo. Capaz, pero con dificultades, de trabajara jornada completa.

8. Síntomas leves en reposo. Los síntomasempeoran con el esfuerzo. Sólo se percibe una



mínima limitación en aquellas actividades querequieren esfuerzo. Capaz de trabajar a jornadacompleta, con dificultades en aquellos trabajos querequieran esfuerzo.

9. Ningún síntoma en reposo. Síntomas leves con laactividad. Un nivel normal de actividad global;capaz de trabajar a jornada completa sindificultades.

10. Ningún síntoma en reposo o con ejercicio; nivelnormal de actividad general. Capaz de trabajar orealizar tareas caseras a tiempo completo sindificultades.

Apéndice B – Los tests “perfil de ATP”

Los tests “perfil de ATP” fueron desarrollados yllevados a cabo en la unidad médica Biolab,Londres, GB (www.biolab.co.uk), donde uno denosotros (JMH) fue Director de Laboratorio hastasu retiro en 2007. Las muestras de sangre serecibieron en tubos de heparina de 3 ml y erantestadas y procesadas en un máximo de 72 horasdesde la venipuntura. Describimos aquí brevementelas 3 series de mediciones, (A), (B) y (C) y cómo secalcularon los 5 factores numéricos. (Se puedenobtener los detalles paso por paso contactando aJMH en [email protected]).

Se separan los neutrófilos mediante lacentrifugación de gradiente de densidadHistopaqueTM, según el Procedimiento Sigma® No.1119 (1119.pdf disponible enwww.sigmaaldrich.com). Se comprueba la purezacelular mediante microscopio óptico y se evalúa laconcentración celular utilizando un contador decélulas automático. La medición cuantitativa de labioluminiscencia del ATP se realizó usando el Kit deEnsayo de Bioluminiscencia de Células SomáticasAdenosina 5’-trifosfato (ATP) (Sigma®) [Sigma®

Adenosine 5’-triphosphate (ATP) BioluminescentSomatic Cell Assay Kit, (FLASC)], de acuerdo con elBoletín Técnico Sigma® (Technical Bulletin No.BSCA-1 (FLASCBUL.pdf). En este método seconsume el ATP y se emite luz cuando la luciferasade la luciérnaga cataliza la oxidación de la D-luciferina. La luz emitida es proporcional al ATPpresente, y se mide con un espectrómetrofluorescente Perkin-Elmer LS 5B equipado con un(flow-through micro cell). Se utiliza el Sigma® ATPStandard (FLAA.pdf) como control y como métodoadicional de control de calidad para comprobar larecuperación. Hay kits similares disponibles deotros proveedores, p.ej. el sistema de ensayo ATPENLITENTM (ENLITENTM ATP Assay System) [BoletínTécnico en www.promega.com), y ahora haydisponibles instrumentos accesorios, p.ej. “ModulusLuminescence Modules” (ver las instrucciones deaplicación:

www.turnerbiosystems.com/doc/appnotes /PDF/997_9304.pdf).

(A). Se mide primero el ATP con un exceso demagnesio añadido mediante la Mezcla de EnsayoSigma® (Sigma® ATP Assay Mix) lo cualproporciona el resultado a. Esto es el primer factor,

la concentración del ATP en las células completas,ATP=a en unidades de nmoles/106 células (ofmoles/célula) .

Se repite la medición únicamente con el magnesioendógeno presente, utilizando los mismos reactivosproducidos en el propio laboratorio sin magnesioañadido, dando el resultado b en las mismasunidades. El ratio, c = b/a, e el segundo factor, elRatio ATP.

(B). Para medir la eficiencia de conversión del ADPen ATP vía el proceso ox-phos, se utiliza elresultado ATP, a (con exceso de magnesio), yentonces se inhibe la conversión en el laboratoriocon sodio azida durante 3 min y se obtiene elresultado d (también con exceso de magnesio).Luego se elimina el inhibidor de laboratoriolavándolo con un tampón salino y las mitocondriasdeberían recuperar (otra vez durante 3 min)rápidamente los niveles de ATP a partir del ADP.Esto proporciona el resultado e en las mismasunidades. La eficiencia de conversión Ox Phosviene determinada por: f = [(e – d) / (a – d)].

(C). Para medir la efectividad de la Translocasa(TL) en la membrana mitocondrial se destruyen lascélulas y se atrapan las mitocondrias en pellas enun medio de afinidad cromatografía adulterado conuna baja concentración de atractilosida. Estoinmoviliza las mitocondrias mientras se eliminan losotros componentes de las células al lavarse. Lostampones utilizados en este momento liberan lasmitocondrias dejando la atractilosida como soportesólido que no interviene más en el proceso. Laconcentración de ATP mitocondrial se mide,obteniendo el resultado g, en unidades depmoles/millones de células. Para la siguientemedición algunas pellas son sumergidas en unasolución tampón (que actúa como un citosolartificial), que contiene ADP con un pH = (5.5 ±0.2) , que incita a la Translocasa a recoger el ADPpara convertirlo en ATP en la mitocondria. Despuésde 10 minutos el ATP se mide de nuevo, dando elresultado h en las mismas unidades. El factor TLOUT es el incremento fraccional de ATP j = [(h – g) / g].

Para las siguientes mediciones se sumergen laspellas en un tampón que no contiene ADP y seestimula a la TL para que deje de recoger ADP, yen su lugar transfiera ATP al citosol artificial a unpH = (8.9 ± 0.2). Después de 10 minutos se mideotra vez el ATP mitocondrial dando el resultado k,siendo el factor TL IN la disminución fraccional l = [(g – k) / g]. Referencias

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