Outer Membrane Protein (OMP) 237 kDa Shigella dysenteriae Sebagai Protein Adhesin pada Enterosit Mencit Galur BALB/c

Ashoka Sulistyasmara*, Enny Suswati**, Ika Rahmawati Sutejo*** Mahasiswa Fakultas Kedokteran Universitas Jember(UNEJ)** Dosen Fakultas Kedokteran Universitas Jember (UNEJ)
Jurusan Pendidikan Dokter, Fakultas Kedokteran, Universitas Jember (UNEJ)
Jln. Kalimantan 37, Jember 68121
E-mail: DPU@unej.ac.id

AbstrakShigella dysenteriae merupakan organisme patogen penyebab penyakit shigellosis. Untuk dapat menyebabkan infeksi shigellosis, S. dysenteriae harus melalui tahapan patogenesis mulai dari proses adhesi, kolonisasi dan invasi. S. dysenteriae mempunyai protein adhesin yang berasal dari OMP yang berperan dalam proses adhesi. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui peranan outer membrane protein 237 kDa S. dysenteriae sebagai protein adhesin pada enterosit mencit galur balb/c. Setelah identifikasi, hasil pemurnian protein dengan cara SDS-PAGE yang berasal dari OMP S. dysenteriae dilakukan uji hemaglutinasi dan uji adhesi secara in vitro. Hasil penelitian menunjukkan bahwa OMP 237 kDa S. dysenteriae berperan sebagai protein adhesin yang ditunjukkan dengan kemampuannya menempel pada enterosit mencit galur balb/c dan menghambat perlekatan bakteri S. dysenteriae lain pada enterosit tersebut. Peningkatan konsentrasi OMP 237 kDa akan menurunkan jumlah perlengketan bakteri S. dysenteriae pada enterosit mencit galur balb/c.

Kata Kunci: Outer membrane protein, Shigella dysenteriae, Shigellosis, protein adhesin.

AbstractShigella dysenteriae is a pathogenic organisms causing shigellosis. To causing shigellosis, S. dysenteriae go through phases of pathogenesis starting from adhesion, colonization and invasion. S. dysenteriae have adhesin protein derived from OMP that play a role in the adhesion process. The aim of this study to determine the role of outer membrane protein 237 kDa S. dysenteriae as adhesin protein in enterocytes of mice strain BALB/c. After identification, the purification of proteins by SDS-PAGE derived from S. dysenteriae OMP followed by hemagglutination test and in vitro adhesion test. The results showed that the 237 kDa OMP S. dysenteriae role as adhesin protein by its ability to attach to BALB / c mice's enterocytes and inhibit the attachment of another bacteria S. dysenteriae on the enterocytes. Increased dose of 237 kDa OMP will decrease the number of bacterial adhesions S. dysenteriae on BALB / c mice's enterocytes

Keywords: Outer membrane protein, Shigella dysenteriae, Shigellosis, adhesion protein.

PendahuluanShigella spp. merupakan salah satu penyebab infeksi diare di negara berkembang. Shigella merupakan penyebab penyakit shigellosis yang menyebabkan 500 ribu anak kecil meninggal di negara berkembang setiap tahunnya [1]. Masalah ini menjadi lebih buruk sebab Shigella menunjukkan resistensi terhadap antibiotika yang digunakan sebagai obat pilihan utama (first line therapy) [2]. Perlu dilakukan upaya pencegahan yang maksimal supaya insidensi penyakit shigellosis menurun sehingga penggunaan antibiotik dapat ditekan. Proses penghambatan terhadap infeksi bakteri S. dysenteriae dapat dilakukan dengan memanfaatkan protein adhesin yang terdapat di dalam Outer Membran Protein (OMP) sebagai faktor antigen [3]. Pengetahuan tentang protein antigen spesifik S. dysenteriae dapat dikembangkan untuk membuatan vaksin yang berasal dari antigen S. dysenteriae [4]. Tujuan penelitian ini untuk membuktikan OMP S. Dysentrieae dengan berat molekul 237 kDa merupakan protein adhesin sel enterosit mencit galur balb/c. Hasil penelitian ini dapat digunakan sebagai dasar penelitian pembuatan vaksin penyakit Shigellosis.

Metode PenelitianKultur S. dysenteriaeBakteri yang digunakan adalah S. dysenteriae strain lokal yang berasal dari feses pasien disentri basiler RSUD dr. Soebandi Jember, setelah bakteri diidentifikasi selanjutnya dibiakkan pada media untuk memperkaya pertumbuhan pili. Metode yang digunakan berdasarkan petunjuk Ehara [5]. Metode ini menggunakan media TCG yang memperkaya pertumbuhan pili S. dysenteriae. Media ini mengandung 0.02% thioproline, 0.3% NaHCO3, 0.15% bactotrypton, 0.2% yeast extract, 0.5% NaCl, 2% bacto agar, 1 mM EGTA dan 1% bimonosodium natrium glutamat kemudian ditambah dengan aquadest hingga mencapai volume 1 liter. Media agar dibuat sebanyak 2 liter dimasukkan ke dalam 50 botol berkapasitas 250 ml secara miring sebanyak masing-masing 50 ml. S. dysenteriae yang telah dipilih ditanam pada media Brain Heart Infusion (BHI) 7,4 g/100 ml dalam 500 ml aquadest yang diinkubasi pada suhu 37 oC selama 4 jam. Suspensi bakteri sebanyak 10 ml dimasukkan dalam setiap botol yang mengandung media TCG. Suspensi bakteri kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 2x24 jam.

Isolasi OMP S. dysenteriaeSebelum mengisolasi OMP dilakukan pencukuran pili dari S. dysenteriae. Hasil koleksi bakteri ditambahkan Tri Chlor Acetat (TCA) dan Phosphat Buffer Saline (PBS) sampai konsentrasi 3% dan dikocok rata, hasilnya diletakkan pada suhu kamar selama 1 jam dan tiap 15 menit dikocok. Koleksi bakteri tadi dimasukkan ke dalam 16 botol bervolume 14 ml disentrifugasi 6000 rpm selama 15 menit pada suhu 4 oC. Pelet diambil dan diresuspensi dengan cairan PBS pH 7,4 dengan perbandingan 1:10. Bakteri dicukur dengan menggunakan mixer sendiri pada suhu 4 oC dengan kecepatan penuh selama 30 menit, diulang sampai 5 kali dengan waktu istirahat 1 menit. Hasilnya dilakukan sentrifugasi selama 30 menit dengan kecepatan 6000 rpm, suhu 4 oC, pili yang terletak di bagian atas diambil dan diberi label pili 1. Endapan diresuspensi dengan larutan PBS pH 7,4 menggunakan cara yang sama seperti diatas dan dikumpulkan dengan cara mencukur ulang sampai beberapa kali, hingga dihasilkan supernatan yang memiliki warna mendekati warna PBS dan menunjukkan tes aglutinasi negatif.Isolasi OMP S. dysenteriae dilakukan dengan modifikasi Evans [6]. Modifikasi pada bagian sampel yang digunakan yaitu bagian endapan terakhir dari perlakuan pencukuran pili. Pelet diresuspensi dengan PBS pH 7,4 sampai 15 kali, kemudian ditambahkan n-octyl B-D-glucopyramide (NOG) konsentrasi mencapai 0,5%. Dilakukan homogenisasi dengan vortex kecepatan penuh selama 1 menit. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm dengan suhu 4 C selama 30 menit. Cairan supernatan diambil dan dilakukan dialisis . Cairan dialisis pada 24 jam pertama digunakan H2O dan pada 24 jam kedua dipakai PBS pH 7,4, perlakuan dilakukan sampai 6 kali.

Metode SDS-PAGEMonitoring berat molekul dikerjakan dengan menggunakan SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electroforesis) [7]. Sampel protein dipanaskan 100 oC selama 5 menit dalam larutan penyangga yang mengandung 5 mM Tris HCl pH 6.8, 2-mercapto ethanol 5%, w/v sodium dodecyl sulfate 2,5%, v/v gliserol 10% dengan warna pelacak bromophenol blue. Di OMPh mini slab gel 12.5% dengan tracking gel 4%. Voltase yang digunakan 125 mV. Bahan yang digunakan adalah coomasive brilliant blue dan molekul standar sigma low range marker.

Pemurnian Fraksi Protein OMPMetode yang dilakukan seperti yang telah dikerjakan oleh Ehara dengan modifikasi [8]. Hasil SDS-PAGE koleksi OMP gel, gelnya dipotong lurus pada berat molekul yang diinginkan dan potongan pita tersebut dikumpulkan dan dimasukkan dalam membran dialisis atau selophan menggunakan cairan penyangga elektroforesis, running buffer. Hasil potongan gel dilakukan elektroelusi menggunakan elektroforesis frontal apparatus aliran 50 volt selama 50 menit. Hasil elektroelusi tersebut dilakukan dialisis dengan cairan penyangga PBS pH 7,4 sebanyak 1 liter selama 24 jam, setelah itu cairan PBS diganti dengan volume yang sama dan dilakukan dialisis selama 24 jam. Cairan hasil dialisa tersebut dilakukan uji hemaglutinasi.

Uji HemaglutinasiUji hemaglutinasi dikerjakan menurut petunjuk dari Li [9]. Pengenceran sampel dibuat konsentrasi pada microplate V, dimana tiap sumur diberi cairan PBS bervolume 50 l. Kolom yang digunakan yaitu kolom 1-10 dan 12 (kolom 11 dikosongi) sementara baris yang digunakan yaitu baris A (hanya 1 baris). Pada kolom 1 baris A diisi dengan hasil pemurnian fraksi protein OMP sebanyak 50 l, dihomogenkan dengan pipet sebanyak 17 kali, lalu 50 l dipindahkan ke kolom 2 baris A. Cairan dihomogenkan dengan pipet lagi, dan seterusnya proses diulang sampai kolom 10 baris A, hingga terkahir diambil cairan sebanyak 50 l dari kolom 10 baris A untuk dibuang. Tiap sumur ditambahkan suspensi darah merah mencit konsentrasi 0,5% volume sama dan diletakkan dalam suhu kamar selama 1 jam. Besarnya titer ditentukan dengan pengamatan adanya aglutinasi darah merah pada pengenceran yang terendah.Isolasi Enterosit MencitIsolasi enterosit dilakukan menurut metode Weisser [10]. Mencit galur balb/c dianastesi dengan menggunakan kloroform, kemudian bagian diambil bagian ususnya untuk dipotong secara longitudinal dengan panjang 5 cm. Usus halus dicuci dengan PBS pH 7,4 yang mengandung 1 mM dithiothretiol pada suhu 4 oC sampai tampak bersih. Usus mencit galur balb/c dimasukkan dalam cairan yang mengandung 1,5 mM KCl, 9,6 mM NaCl, 27 mM Na Citrat, 8 mM KH2SO4 dan 5,6 mM Na2SO4 dengan pH 7,4. Jaringan dinkubasi pada shaking inkubator selama 15 menit, dengan suhu 37oC. Supernatan dibuang dan jaringan dipindahkan dalam cairan yang mengandung 1.5 mM EDTA dan 0.5 mM dithiothretiol. Jaringan yang berada dalam cairan yang mengandung EDTA dan dithiothretiol disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan penuh, kemudian supernatan dibuang. Jaringan dicuci dengan menggunakan PBS dan disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 1000 rpm, dan diulang selama 3 kali. Enterosit diisolasi dengan melakukan suspensi pada jaringan dengan menggunakan PBS steril dan selanjutnya dihitung dengan menggunakan spektrofotometer panjang gelombang 560 nm sampai konsentrasi 106 /ml. Satu tetes suspensi jaringan diletakkan pada obyek glass kemudian difiksasi diatas api bunsen lalu dicat dengan menggunakan safranin atau gram D dan diamati dibawah mikroskop.

Uji AdhesiUji adhesi dilakukan menurut modifikasi Nagayama [11]. Proses uji adhesi dimulai dengan membiakkan bakteri S. dysenteriae dalam nutrient broth pada suhu 37 oC pada tabung reaksi, kemudian diinkubasi selama 4 jam. Bakteri dipanen melalui proses sentrifugasi 6000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 oC. Supernatan dibuang, pelet diresuspensi dengan cairan PBS 1 ml lalu proses sentrifugasi diulang sampai 3 kali. Pelet diresuspensi dengan cairan PBS sampai warnanya setara standar Mc Farland (108 bakteri/mm3). Pembuatan kelompok kontrol, suspensi bakteri diambil sebanyak 1 ml, lalu dihomogenkan dengan 1 ml enterosit mencit galur balb/c, dan diinkubasi shaking waterbath dengan goyangan pelan selama 30 menit pada suhu 37 oC. Campuran bakteri dan enterosit mencit tersebut disentrifugasi 1000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang, pelet ditambah cairan PBS 200 l, lalu proses sentrifugasi diulang sampai 2 kali. Pelet diambil dan diresuspensikan dengan 50 l cairan PBS. Suspensi diambil dengan mikropipet sebanyak 10 l, diletakkan di atas obyek glass, difiksasi di atas api bunsen. Preparat dicat menggunakan pengecatan gram lalu diamati di bawah mikroskop untuk mengetahui indeks adhesi S. dysenteriae pada enterosit mencit galur balb/c.Kelompok perlakuan dibuat dengan pengenceran protein OMP S. Dysenteriae. Tahap pertama dilakukan preparasi konsentrasi protein pada tabung ependof untuk membuat protein OMP dengan konsentrasi 1, , , 1/8, 1/16, dan 1/32. Selanjutnya setiap dosis ditambahkan suspensi enterosit sebanyak 300 l kemudian digoyang pada shaking inkubator pada suhu 37 oC selama 30 menit. Kemudian dalam setiap campuran tersebut ditambahkan suspensi bakteri sebanyak 300 l yang diperoleh dari kultur S.dysenteriae. Campuran diinkubasi dengan shaking inkubator selama 30 menit pada suhu 37 oC. Selanjutnya disentrifugasi 1500 rpm pada suhu 4 oC selama 3 menit, kemudian supernatan dibuang dan diganti dengan PBS kemudian dihomogenkan dan disentrifugasi dengan kecepatan yang sama. Kemudian sentrifugasi diulang sekali lagi dengan mengganti supernatan dengan larutan PBS. Setelah itu endapan diambil dan dibuat hapusan pada gelas objek dan dilakukan pewarnaan gram. Preparat siap diamati dengan menggunakan mikroskop pembesaran 1000 kali.

Pewarnaan GramPewarnaan gram dilakukan dengan cara mengambil endapan sejumlah 20 l darisetiap tabung ependof kelompok kontrol dan perlakuan kemudian membuat hapusan. Endapan yang diambil dibuat hapusan pada obyek glass dan difiksasi dengan api bunsen. Setelah dibuat hapusan, preparat siap diberi pewarnaan gram. Awalnya preparat digenangi cat gram A yang berisi Kristal violet selama 1 menit. Setelah 1 menit, genangan dibuang dan dibilas dengan air. Preparat kemudian diberi cat gram B yang berisi lugol dengan cara meneteskan lugol diatas preparat hingga tergenang dan diamkan selama 1 menit. Setelah 1 menit, genangan lugol dibuang dan preparat dibilas dengan air. Preparat selanjutnya ditetesi cat gram C yang berisi alkohol 96% selama 5-10 detik hingga cat yang masih menempel pada preparat terlihat luntur. Setelah luntur, teteskan cat gram D yang berisi safranin dan diamkan selama setengah menit, setelah itu genangan cat D dibuang, dibilas dengan air, dan dikeringkan dengan tisu.

Pengamatan Indeks Adhesi dengan MikroskopPengamatan dilakukan dengan meletakkan preparat di mikroskop, pembesaran mikroskop diatur dengan pembesaran 1000 kali, kemudian di atas preparat ditetesi minyak emersi sebanyak 1 tetes, selanjutnya dilakukan penghitungan indeks adhesi dengan menghitung jumlah perlekatan bakteri S. dysenteriae pada enterosit mencit galur balb/c sejumlah 100 sel yang dihitung dengan tiga kali pengulangan. Analisis DataAnalisis data yang digunakan adalah analisis data statistik, menggunakan Analysis of variance (ANOVA) dan uji regresi linear sederhana.

Hasil PenelitianPeran outer membrane protein 237 kDA Shigella dysenteriae sebagai protein adhesin pada sel enterosit mencit galur balb/c ditunjukkan dengan jumlah perlekatan bakteri pada 100 sel enterosit mencit galur balb/c. Jumlah perlekatan bakteri pada 100 sel enterosit mencit disebut dengan indeks adhesi. Uji hemaglutinasi merupakan langkah awal sebelum melakukan perhitungan indeks adhesi. Uji hemaglutinasi bertujuan untuk mengetahui potensi suatu protein dalam menghambat aglutinasi eritrosit. Uji hemaglutinasi didasarkan pada kesamaan reseptor eritrosit dengan reseptor enterosit pada hewan coba dengan jenis yang sama. Protein akan berikatan dengan reseptor eritrosit sehingga reseptor eritrosit penuh dan tidak mampu berikatan dengan eritrosit lain sehingga aglutinasi terhambat yang ditandai dengan tidak terbentuknya dot atau bekuan. Uji hemaglutinasi dilakukan dua kali, yaitu uji pertama pada hasil pencukuran OMP dan uji kedua pada protein OMP yang telah melewati tahap elektroforesis (SDS-PAGE) dan pemurnian berat molekul dominan. Hasil uji hemaglutinasi pertama terdapat pada Tabel1.

Tabel 1 Uji Hemaglutinasi OMP S. dysenteriae pada enterosit mencit galur balb/c

MateriKonsentrasi

11/21/41/81/161/321/641/1281/2561/512K-

OMP 1----+++++++

Keterangan: (-) tidak terjadi aglutinasi; (+) terjadi aglutinasi

Hasil uji hemaglutinasi menunjukkan pada OMP memiliki protein yang dapat menghambat perlekatan eritrosit pada konsentrasi 1/8. Penelitian kemudian dilanjutkan dengan melakukan dialisis dari hasil isolasi protein OMP untuk membersihkan OMP dari NOG. Hasil dialisis kemudian dilakukan proses elektroforesis dengan metode SDS-PAGE untuk mengetahui dan mendapatkan berat molekul protein. Hasil SDS-PAGE dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1. Hasil SDS-PAGE protein OMP S. dysenteriae

Profil protein pada hasil SDS-PAGE dari pencukuran bertingkat pada OMP S. dysenteriae menunjukkan adanya beberapa protein yang dominan, antara lain protein dengan berat molekul 237 kDa, 90 kDa, dan 13 kDa. Pada penelitian ini yang digunakan adalah protein dengan berat molekul 237 kDa. Gel hasil proses SDS-PAGE tersebut dipotong pada berat molekul 237 kDa, lalu dimurnikan melalui proses elektroforesis dan dialisis untuk memperoleh protein murni dari OMP S. dysenteriae. Protein yang dihasilkan dari proses tersebut diuji hemaglutinasi pada enterosit mencit galur balb/c, hasilnya dapat dilihat pada Tabel 4.2.

Tabel 2 Uji Hemaglutinasi OMP S. dysenteriae 237 kDa pada enterosit mencit galur balb/c

BMKonsentrasi

11/21/41/81/161/321/641/1281/2561/512

237 kDa------++++

Keterangan: (-) tidak terjadi aglutinasi; (+) terjadi aglutinasi

Protein OMP S. dysenteriae dengan berat molekul 237 kDa mampu menghambat proses aglutinasi sampai pengenceran dengan konsentrasi 1/32. Hasil tersebut menunjukkan bahwa protein tersebut mempunyai kemampuan adhesi terhadap eritrosit mencit galur balb/c dari konsentrasi awal yaitu konsentrasi 1 sampai konsentrasi 1/32.Didasarkan pada kesamaan reseptor enterosit dengan reseptor enterosit pada hewan coba dengan jenis yang sama, maka Protein OMP 237 S. dysenteriae yang merupakan protein adhesin akan berikatan dengan reseptor enterosit mencit galur balb/c sehingga reseptor enterosit mencit penuh dan tidak dapat berikatan dengan reseptor lain pada bakteri S. dysenteriae, dengan kata lain akan menghambat perlekatan bakteri S. dysenteriae pada sel enterosit mencil galur balb/c. Untuk membuktikan outer membrane protein 237 kDa S. dysenteriae sebagai protein adhesin pada sel enterosit mencit galur balb/c maka dilakukan perhitungan indeks adhesi pada mikroskop dengan mengamati jumlah perlekatan bakteri pada sel enterosit. Hasil penelitian menggunakan 7 kelompok perlakuan dengan konsentrasi protein OMP yang berbeda yaitu konsentrasi 1, konsentrasi , , 1/8, 1/16, 1/32 dan kelompok tidak disalut protein (kontrol). Hasil Keterlibatan protein OMP dengan berat molekul 237 kDa dalam menghambat perlekatan S. dysenteriae terhadap enterosit mencit galur balb/c dapat dilihat pada Gambar 2.

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)

(g)

(a) Adhesi saat disalut protein OMP konsentrasi 1(b) Adhesi saat disalut protein OMP konsentrasi (c) Adhesi saat disalut protein OMP konsentrasi (d) Adhesi saat disalut protein OMP konsentrasi 1/8(e) Adhesi saat disalut protein OMP konsentrasi 1/16(f) Adhesi saat disalut protein OMP konsentrasi 1/32(g) Adhesi Shigella dysenteriae tanpa disalut protein OMP (kontrol)

Gambar 2 Uji adhesi dengan berbagai konsentrasi OMP

Pengaruh protein OMP 237 kDa S. dysenteriae dalam menghambat perlekatan bakteri yang terlihat pada Gambar 2. Hal ini menunjukkan bahwa protein OMP S. dysenteriae dengan berat molekul 237 kDa yang disalutkan pada sel enterosit mencit galur balb/c merupakan protein adhesin karena melekat dan berikatan dengan reseptor sel enterosit sehingga membuat reseptor enterosit jenuh yang dibuktikan dengan adanya hambatan pada bakteri S. dysenteriae lain untuk melakukan perlekatan dengan sel enterosit. Hasil perhitungan indeks adhesi S. dysenteriae dapat dilihat pada Tabel 3 dan Gambar 3.

Tabel 3 Hasil perhitungan indeks adhesi S. dysenteriae pada enterosit mencit galur balb/c dengan menggunakan OMP S. dysenteriae dengan berat molekul 237 kDa

Gambar 3 Grafik rata-rata hubungan antara konsentrasi protein OMP S. dysenteriae yang disalutkan pada enterosit mencit galur balb/c dengan indeks adhesi bakteri S. dysenteriae pada enterosit mencit galur balb/c

Dari hasil perhitungan indeks adhesi diperoleh asumsi bahwa semakin kecil konsentrasi OMP yang disalutkan pada enterosit, semakin banyak jumlah perlekatan bakteri S. dysenteriae pada sel enterosit, dengan kata lain indeks adhesi semakin besar, sebaliknya semakin besar konsentrasi protein OMP yang disalutkan pada protein enterosit, semakin sedikit jumlah perlekatan bakteri S. dysenteriae pada enterosit, dengan kata lain indeks adhesi semakin mengecil.

Analisis dataData yang diperoleh diolah menggunakan uji one way Anova untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan yang signifikan dari tiaptiap perlakuan, namun sebelumnya diuji terlebih dahulu dengan uji Kolmogorov-Smirnov. Uji ini bertujuan untuk mengetahui apakah data yang diperoleh terdistribusi normal atau tidak. Berdasarkan hasil uji Kolmogorov-Smirnov didapatkan data p = 0,645. Dengan nilai p > , dimana = 0,05 maka dapat dikatakan bahwa data tersebut terdistribusi normal.Data kemudian diuji homogenitasnya dengan menggunakan metode Levene. Dari hasil uji Levene didapatkan nilai p = 0,106. Dengan nilai p > , maka dapat dikatakan bahwa data tersebut memiliki varian data yang homogen.Berdasarkan hasil uji Kolmogorov-Smirnov dan uji Levene dapat disimpulkan bahwa data terdistribusi dengan normal dan memiliki varian data yang homogen sehingga memenuhi syarat uji one way Anova. Dengan menggunakan uji one way Anova didapatkan nilai p = 0,000. Karena p < 0,05 maka dapat disimpulkan bahwa setidaknya ada perbedaan indeks adhesi yang bermakna diantara 7 kelompok perlakuan.Untuk mengetahui kelompok mana saja yang memiliki perbedaan yang bermakna, analisis data dilanjutkan dengan uji Post-Hoc Multipel Comparison LSD. Dari hasil uji Post-Hoc Multiple Comparison LSD dapat dilihat perbedaan indeks adhesi bakteri S. dysenteriae antar konsentrasi. Perbedaan dinilai bermakna apabila nilai < 0,05.Selanjutnya data diuji dengan regresi linier, dengan uji regresi linier didapatkan nilai R2 (R Square) pada model summary regresi linier sebesar 0,787. Angka R2 disebut juga koefisien diterminasi, besarnya angka diterminasi sebesar 0,787 atau sama dengan 78,7%. Angka tersebut menunjukkan bahwa sebesar 78,7% dari nilai indeks adhesi dipengaruhi oleh variabel besarnya konsentrasi OMP yang diberikan, sedangkan sisanya dipengaruhi oleh faktor lain di luar model regresi linear.Selanjutnya data dianalisis dengan uji Anovab untuk mengetahui bentuk hubungan antara kedua variabelnya. Dari hasil uji Anovab didapatkan nilai sig. = 0,000. Oleh karena nilai sig. < 0,05, maka dapat dikatakan nilai yang didapat adalah signifikan. Signifikan berarti ada pengaruh antara variabel bebas (konsentrasi protein OMP S. dysenteriae 237 kDa) terhadap variabel terikat (indeks adhesi bakteri S. dysenteriae).Bentuk umum persamaan regresi dinyatakan dengan Y = a + bX. Y adalah variabel terikat (indeks adhesi) dan X adalah variabel bebas (konsentrasi). Berdasarkan uji regresi linier, didapatkan nilai a dan b sebesar 591,156 dan -598,735 sehingga persamaan garis menjadi Y = 591,156 598,735X. maka diketahui nilai b = -598,735 dimana b = koefisien regresi. Nilai b bernilai negatif ini menunjukkan peubah yang satu akan bertambah besar dan peubah yang lain bertambah kecil, maka dapat disimpulkan bahwa semakin besar nilai dosis protein OMP semakin kecil nilai indeks adhesinya.

Pembahasan Pembahasan merupakan bagian terpenting dalam artikel ilmiah. (Pada bidang ilmu tertentu, hasil dan pembahasan dijadikan dalam satu bagian dengan judul Hasil dan Pembahasan). Teknik penulisan pembahasan sebagai berikut. 1)Penulisan judul Pembahasan, tekniknya sama dengan penulisan judul bagian-bagian lainnya. 2)Naskah diuraikan dalam beberapa paragraf tanpa subbagian dan hanya membahas hasil yang didapat itu sesuai dengan hipotesis atau tidak, serta ditulis dengan bahasa yang jelas dan dalam kalimat yang tidak terlalu panjang, dengan jarak 1 spasi langsung di bawah judul Pembahasan dengan jarak 1,5 spasi. 3)Dalam penyajiannya harus mempunyai alur dan kerangka pemikiran yang sistematis; dan agar lebih menarik, pembahasan dimulai dari kata-kata kunci. 4)Harus dititik-beratkan pada implikasi penelitian (teoritis dan aplikatif).

Kesimpulan dan SaranKesimpulan dari hasil penelitian ini yaitu protein OMP dengan berat molekul 237 kDa merupakan protein adhesin dari Shigella dysenteriae pada enterosit mencit galur balb/c.Saran yang dapat diberikan dari hasil penelitian ini adalahperlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengembangkan antigen yang berasal dari OMP 237 kDa S. dysenteriae sebagai vaksin untuk menurunkan insidensi penyakit shigellosis.

Daftar PustakaWiller E. M., Lima R. L., & Giugliano L. G. 2004. In vitro adhesion and invasion inhibition of Shigella dysenteriae, Shigella flexneri and Shigella sonnei clinical strains by human milk proteins. BMC Microbiology, 4:18.

Herwana, E. 2006. Efek Hambatan Zink Sulfat Terhadap Pertumbuhan Shigella spp.Universa Medicina, Vol. 25 (1): 1-6.

Wilson, J.W., Schurr M. J., & LeBlanc, C. L., et al. 2002. Mechanisms of Bacterial Pathogenicity. Postgrad Med J, 78: 216-224.

Sudhakar, Padhmanand, & Subramani, P. 2005. Review: Mechanisms of Bacterial Pathogenesis and Targets for Vaccine Design. Journal of Young Investigators. Vol. 13 (5).

Suswati, E., & Mufida, D. C. 2010. Protein Hemaglutinin Outer Membran Protein (OMP) 35 kDa sebagai Protein Adhesin Proteus Mirabilis pada Vesika Urinaria Kelinci. Jurnal Natur Indonesia, 12(2): 136-142.

Mufida, D. C., Bumi, C., & Fatmawati, H. 2009. Peran Protein Membran Luar 55 kDa Salmonella thypi isolate Jember Sebagai Protein Hemaglutinin dan Adhesin. Berk. Penel. Hayati, 15: 1116.

Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana, 26.

Ehara, Ishibashi M, Ichinose M, Iwanaga Y, Schimotori M, Naito S. 1986. Purification and Partial Characterisation Fimbriae of Vibrio cholera 0-1, Vaccine 5(3): 2836.

Li Xin, Johnson ED, Mobley TLH, 1999. Requirement of MrpH for Mannosa-Resistent Proteus Like fimbriae Mediated Hemaglutination by Proteus mirabilis, Infection and Immunity, 67: 282233.

Winarsih S, Sumarno. & Roekistiningsih. 1997. Kajian Fungsi dan Sifat Immunogenitas Protein Hemaglutinin 32kDa dan 20 kDa pada Helicobacter pylori; Majalah Kedokteran Universitas Brawijaya. 13(2): 135-141.

Nagayama, Oguchi K, Arita T, Honda MT, 1995. Purification and Characterizations of a Cell-Associated Hemaglutinin of Vibrio parahaemoliticus, Infection and Immunity 63: 198792.

Ashoka Sulistyasmara, et al., Outer Membrane Protein Shigella dysenteriae 237 kDa Sebagai Protein Adhesin pada Enterosit Mencit Galur Balb/c UNEJ JURNAL XXXXXXXXX 2012, I (1): 1-