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分析計測事業部応用技術部 7 0120-131691
（075）813-1691島津コールセンター
※本資料は発行時の情報に基づいて作成されており、予告なく改訂することがあります。 改訂版は下記の会員制 Web Solutions Navigator で閲覧できます。
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アフラトキシンは強い急性毒性と発ガン性のあるカビ毒
の一種で，日本では総アフラトキシン（アフラトキシン B1，
B2，G1，G2 の総和）を 10 µg/kg を越えて検出される食品は，
食品衛生法第 6 条第 2 号に違反するとされます 1）。
こ れ ま で，L422，L428，L430 で，HPLC や UHPLC を 用
い て ア フ ラ ト キ シ ン 4 成 分（B1，B2，G1，G2） を 一 斉 分 析
す る 方 法 を ご 紹 介 し て き ま し た。 今 回 は， 平 成 23 年 8 月
16 日に通知された試験法 2）に従い，イムノアフィニティカ
ラムを用いた前処理を行った上で，（1）試験法に準拠した
HPLC による定量試験，（2）試験法に準拠した LC/MS によ
る確認試験，（3）Nexera による迅速な定量 / 確認試験につ
いて，妥当性評価の結果と共にご紹介します。
A. Nomura M. Kobayashi K. Watanabe
Fig. 1 総アフラトキシン試験の流れProcedure of Total Aflatoxin Test
Fig. 2 アフラトキシンの構造式Structures of Aflatoxins
■総アフラトキシン試験の流れProcedure of Total Aflatoxin Test
Fig. 1 に通知試験法による総アフラトキシン試験の流れ
を，Fig. 2 にアフラトキシンの構造式を示します。加工食品
や香辛料の場合，有機溶媒を含む溶液で抽出を行った後，イ
ムノアフィニティカラム（IAC）を用いてアフラトキシンを
精製します。これをトリフルオロ酢酸（TFA）で処理してア
フラトキシン B1 および G1 の蛍光強度を増加させ（前処理
（A）），蛍光検出器を接続した HPLC にて定量試験を行います。
基準値を上回る総アフラトキシンが検出された場合は，IAC
からの精製液を乾固後，TFA 誘導体化せず移動相で再溶解し
（前処理（B）），これを LC/MS に供して確認試験を行います。
アフラトキシンには紫外線で分解する，水溶液中ではガラ
ス壁面に吸着するなどの性質があります。分析の際はあらか
じめ洗浄した褐色シラン処理ガラスバイアルやポリバイアル
を使用し，回収率低下を防ぐ注意が必要です。また，実試料
分析時には，1 分析終了ごとに移動相中有機溶媒濃度を上げ，
カラムを洗浄することをお勧めします。
Sample 50.0 g
0.1 mL TFA
(Aflatoxin standard solution)5 g Sodium chloride200 mL Water / Methanol = 2/8 (v/v)
Shake for 5 min
Filtration
(10 mL) : up to 50 mL with Water
Filtration with Glass microfiber filter
(10 mL)
Clean-up by Immnoaffinity column “AFLAKING”
Elution by Acetonitrile (3 mL) Elution by Acetonitrile (3 mL)
Evaporation by N2 gas Evaporation by N2 gas
Standing in dark at room temperature for 15 min
0.9 mL Water / Acetonitrile= 9/1（v/v）
HPLC LC/MS
1.0 mL Mobile phase
(A) (B)
O
O
O
O
CH3
O O
O
O
O
O
CH3
O O
HO
Aflatoxin B1
Aflatoxin B2a
Aflatoxin B2
O
O
O
O
CH3
O O
TFA
Aflatoxin G1
O
O
O
O
CH3
O
O
O
TFA
O
O
O
O
CH3
O
O
O
HO
Aflatoxin G2a
O
O
O
O
CH3
O
O
O
Aflatoxin G2
ApplicationNews
No.L 4 35A
LAAN-A-LC141A
通知試験法に準拠した食品中総アフラトキシンのHPLC による定量試験および LC/MS による確認試験Assay by HPLC and Identification by LC/MS for Total Aflatoxins in Food
高速液体クロマトグラフィーHigh Performance Liquid Chromatography
ApplicationNews
No.
Column : Shim-pack FC-ODS (150 mmL. × 4.6 mmI.D., 3 µm)Mobile Phase : Water / Methanol / Acetonitrile = 6/3/1 (v/v/v)Flow Rate : 0.8 mL/minColumn Temp. : 40 °CDetection : RF-20Axs, Ex at 365 nm, Em at 450 nmRF Cell : Conventional CellCell Temperature : 25 °CInjection Volume : 20 µL
■（1）試験法に準拠したHPLCによる定量試験−真度および併行精度の確認−(1) Assay by HPLC - Accuracy and Precision -
アフラトキシンを添加した市販焙煎ピーナッツを Fig. 1
（A）の方法で処理し，試験法に準拠した条件で HPLC にて
分析し，その回収率（真度）と再現性（併行精度）を確認し
ました。分析条件を Table 1 に示します。
焙 煎 ピ ー ナ ッ ツ に は， ア フ ラ ト キ シ ン B1 お よ び G1 は
0.8 µg/kg， ア フ ラ ト キ シ ン B2 お よ び G2 は 0.2 µg/kg に な
るように添加しました（総アフラトキシンで 2 µg/kg）。繰
り 返 し 試 験（n=5） に よ る 各 成 分 の 回 収 率 と 併 行 精 度 を
Table 2 に示します。回収率は 76 〜 100 % となり，試験法
記載の妥当性評価における真度の目標値（70 〜 110 ％）を
満たしました。一方，併行精度は 5.7 〜 9.6 % であり，これ
も目標値（20 % 未満）を満たしました。
Fig. 3 アフラトキシン添加焙煎ピーナッツのクロマトグラム （HPLC による定量試験）
Chromatograms of Roast Peanuts Spiked with Aflatoxins (Assay by HPLC)
Fig. 4 焙煎ピーナッツマトリクスの MRM クロマトグラム （上段）アフラトキシン添加，（下段）添加なし
Chromatograms of Roast Peanuts Matrix (Upper) Spiked, (Lower) Unspiked
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 min
0
5
10mV
2
4
1
3
■ Peaks1. Aflatoxin G2a (G1)2. Aflatoxin B2a (B1)3. Aflatoxin G24. Aflatoxin B2
■ Peaks1. Aflatoxin G2 : 331.10>245.00(+)2. Aflatoxin G1 : 328.90>242.95(+)3. Aflatoxin B2 : 315.10>258.95(+)4. Aflatoxin B1 : 313.10>240.95(+)
4
3
2
1
Spiked
Unspiked
5.0 7.5 10.0 12.5 min
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
Table 1 分析条件Analytical Conditions
Table 2 HPLC 定量試験における真度，併行精度Accuracy and Precision of Assay by HPLC
Table 4 MRM 分析条件MRM Mode Parameter
Aflatoxin B1 Aflatoxin B2 Aflatoxin G1 Aflatoxin G2
Recovery (%) 79 90 76 100
%RSD 9.6 8.9 7.3 5.7
Compound Transition Dwell time(ms) CE (V) Resolution
(Q1, Q3)Aflatoxin B1 313.10 > 240.95 200 -40 UnitAflatoxin B2 315.10 > 258.95 200 -33 UnitAflatoxin G1 328.90 > 242.95 200 -30 UnitAflatoxin G2 331.10 > 245.00 200 -32 Unit
市販焙煎ピーナッツにアフラトキシン標準液を添加せずに
Fig. 1（B）の方法で乾固処理し，残渣を 10 % アセトニトリ
ル溶液 1 mL で溶解することでマトリクス試料溶液（ブラン
ク試料溶液）を調製しました。マトリクス試料溶液とアフラ
トキシン混合標準溶液を 1 : 1 で混合し，各 0.05，0.25，0.5，
2.5，5 µg/L 標 準 添 加 マ ト リ ク ス 試 料（ 各 0.2，1，2，10，
20 µg/kg 相当）を調製して，トリプル四重極型 LC/MS/MS
である “LCMS-8030” にて分析を行いました（n=6）。Fig. 4 に，
0.5 µg/L 標準添加マトリクス試料の MRM ※クロマトグラム
を，Table 3 および Table 4 に分析条件を示します。LCMS-
8030 が確認試験に充分な感度を有していることがわかりま
す。※ MRM･･･Multiple Reaction Monitoring
■ （2）試験法に準拠したLC/MSによる確認試験(2) Identification Test by LC/MS
[HPLC]Column : Shim-pack FC-ODS (150 mmL. × 2.0 mmI.D., 3 µm)Mobile Phase : 10 mmol/L Ammonium acetate water / Methanol = 3/2 (v/v)Flow Rate : 0.2 mL/minColumn Temp. : 40 °CInjection Volume : 6 µL[MS]Probe Voltage : +4.5 kV ESI-Positive modeNebulizing Gas Flow : 3 L/minDrying Gas Flow : 15 L/minDL Temp. : 250 °CHeat Block Temp. : 400 °C
Table 3 分析条件Analytical Conditions
L 4 35A
また，標準添加法によるアフラトキシン定量の有効性を確
認するために，マトリクス検量線の直線性と再現性を確認し
ました。Fig. 5 に検量線を，Table 5 に 0.25，0.5，5 µg/L のピー
クの平均面積値および再現性を示します。0.05 〜 5 µg/L の
範囲において寄与率 r2=0.999 以上の良好な直線性が得られ，
再現性も良好であることが確認されました。
このように，LCMS-8030 において，確認試験が可能であ
ること，また標準添加マトリクス検量線による定量も有効で
あることが確認されました。
Table 5 平均面積値と再現性（n=6)Average and Repeatability of Peak Area (n=6)
0.25 µg/L 0.5 µg/L 5 µg/LArea %RSD Area %RSD Area %RSD
Aflatoxin B1 1010 6.37 2033 3.92 22936 1.49Aflatoxin B2 3156 1.87 6481 5.09 66012 0.54Aflatoxin G1 2209 6.07 4517 3.74 45841 1.45Aflatoxin G2 2296 5.96 4749 4.74 47250 0.83
Fig. 5 標準添加マトリクス検量線（焙煎ピーナッツ，0.05 〜 5 µg/L）Calibration Curves of Matrix Samples Spiked with Aflatoxins (Roast Peanuts, 0.05 - 5 µg/L)
0.0 2.5 （µg/L）0
5000
10000
15000
20000
Area
1 2 3
4
5 G2
r2 = 0.9994345
0.0 2.5 （µg/L）0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
Area
1 2 3
4
5 G1
r2 = 0.9997543
0.0 2.5 （µg/L）0
10000
20000
30000
40000
Area
1 2 3
4
5 B2
r2 = 0.9999882
0.0 2.5 （µg/L）0
10000
20000
30000
40000
50000Area
1 2 3
4
5 B1
r2 = 0.9999481
■（3）Nexeraによる迅速な定量試験，確認試験(3) Rapid Assay and Identification by UHPLC ”Nexera” with LCMS-8030
通知試験法の HPLC による定量試験では TFA 誘導体化を行
う一方，基準値を上回る総アフラトキシンが検出された場合
の確認は TFA 誘導体化を行わずに分析することとなってい
るため，LC/MS 分析のためには再度，Fig. 1（B）の方法で
前処理を行う必要があります。しかしながら，定量試験にお
いて誘導体化処理を行なわず直接検出で十分な感度で検出が
できれば，Fig. 1（B）の方法のみでサンプルを調製し，定
量試験および確認試験を同一処理サンプルで行うことができ
ます。これにより，煩雑な前処理をやり直す必要はありませ
ん。また，分析に超高速液体クロマトグラフ（UHPLC）を
用いれば，更なる効率化が可能となります。
Fig. 6 に，アフラトキシン添加焙煎ピーナッツを Fig. 1（B）
の方法で前処理し，島津 UHPLC “Nexera” で定量試験を行っ
た例を，Table 6 に分析条件を示します。添加量はアフラト
キ シ ン B1 お よ び G1 は 2.4 µg/kg， ア フ ラ ト キ シ ン B2 お よ
び G2 は 0.6 µg/kg です。繰り返し試験（n=5）による各成
分の回収率と併行精度を Table 7 に示します。回収率 76 〜
80 %，併行精度 4.5 〜 6.5 % といずれも試験法記載の妥当性
評価目標値を満たしました。本分析方法の感度はアプリケー
ションニュース L422，L430 で示した通り非常に良好である
ことも併せ，本方法がアフラトキシンの迅速な定量試験に有
効であることが確認できました。
Column : Shim-pack XR-ODSⅡ（100 mmL. × 3.0 mmI.D., 2.2 µm）Mobile Phase : Water / Methanol / Acetonitrile = 6/3/1 (v/v/v)Flow Rate : 1.0 mL/minColumn Temp. : 50 °CDetection : RF-20Axs Ex. at 365 nm, Em. at 450 nmRF Cell : Conventional cellCell Temp. : 25 °CInjection Volume : 10 µL
Fig. 6 アフラトキシン添加焙煎ピーナッツのクロマトグラム（直接検出） （10 µL 注入）
Chromatograms of Roast Peanuts Spiked with Aflatoxins (Direct Detection) (10 µL injected)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 min
0
5
10
15
mV
4
3
2
1
■ Peaks1. Aflatoxin G22. Aflatoxin G13. Aflatoxin B24. Aflatoxin B1
Table 6 分析条件Analytical Conditions
Table 7 直接検出，UHPLC 法での回収率と併行精度Accuracy and Precision of Assay by UHPLC without Derivatization
Aflatoxin B1 Aflatoxin B2 Aflatoxin G1 Aflatoxin G2
Recovery (%) 76 77 77 80
%RSD 4.5 5.1 6.1 6.5
分析計測事業部応用技術部 7 0120-131691
（075）813-1691島津コールセンター
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No.
初版発行：2012年3月
Fig. 7 焙煎ピーナッツマトリクスの MRM クロマトグラム （上段，実線）アフラトキシン標準添加，（下段，破線）添加なし
Chromatograms of Roast Peanuts (Upper, Solid Line) Spiked, (Lower, Dashed Line) Unspiked
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 min
0
100
200
300
400
500
600
700
4
3
2
1
SpikedUnspiked
■ Peaks1. Aflatoxin G2 : 331.10>245.00(+)2. Aflatoxin G1 : 328.90>242.95(+)3. Aflatoxin B2 : 315.10>258.95(+)4. Aflatoxin B1 : 313.10>240.95(+)
また，LCMS-8030 は UHPLC に対応可能な LC/MS/MS で，
上記 Nexera による高速分析との組合わせによりアフラトキ
シンの迅速な確認試験も可能にします。
Fig. 7 に，Fig. 4 と 同 じ 試 料 を Table 8 お よ び Table 9 の
条件で高速分析した MRM クロマトグラムを示します。アフ
ラトキシン 4 成分を 4 分以内に溶出でき，さらに，高速条件
でも確認試験で求められる感度を充分に有していることがわ
かります。
Fig. 8 に HPLC 条件での分析（Fig. 5）と同様に標準添加
マトリクス試料を用い作成した検量線を示します。0.05 〜
25 µg/L の濃度範囲において寄与率 r2=0.999 以上の良好な
直線性が得られています。各アフラトキシン濃度 0.25 µg/L
の標準添加マトリクス試料の面積値再現性（%RSD，n=6）
は，B1：14.24 %，B2：5.33 %，G1：5.45 %，G2：18.9 % で
あり，高速分析でも十分な再現性が得られることが確認され
ました。
Table 9 MRM 分析条件MRM Mode Parameter
Compound Transition Dwell time(ms) CE (V) Resolution
(Q1, Q3)Aflatoxin B1 313.10 > 240.95 100 -40 UnitAflatoxin B2 315.10 > 258.95 100 -33 UnitAflatoxin G1 328.90 > 242.95 100 -30 UnitAflatoxin G2 331.10 > 245.00 100 -32 Unit
[HPLC]Column : Shim-pack XR-ODS Ⅱ（100 mmL. × 2.0 mmI.D., 2.2 µm）Mobile Phase : 10 mmol/L Ammonium acetate water / Methanol = 3/2 (v/v)Flow Rate : 0.45 mL/minColumn Temp. : 50 °CInjection Volume : 6 µL[MS]Probe Voltage : +4.5 kV ESI-Positive modeNebulizing Gas Flow : 3 L/minDrying Gas Flow : 15 L/minDL Temp. : 250 °CHeat Block Temp. : 400 °C
Table 8 分析条件Analytical Conditions
Fig. 8 標準添加マトリクス検量線（焙煎ピーナッツ，0.05 〜 25 µg/L)Calibration Curves of Matrix Samples Spiked with Aflatoxins (Roast Peanuts, 0.05 - 25 µg/L)
0 100
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
1 2 3 4
5
6
0 100
25000
50000
75000
100000
125000
150000
175000
1 2 3 4
5
6
0 100
50000
100000
150000
200000
250000
1 2 3 4
5
6
0 10 20 （µg/L） 20 （µg/L） 20 （µg/L） 20 （µg/L）0
25000
50000
75000
100000
125000
150000
175000
1 2 3 4
5
6
r2 = 0.9990951r2 = 0.9994246r2 = 0.9995010r2 = 0.9991188
AreaAreaAreaArea
G2G1B2B1
［参考文献］1）「アフラトキシンを含有する食品の取扱いについて」（平成 23 年 3 月 31 日厚生労働省食安発 0331 第 5 号）2）「総アフラトキシンの試験法について」（平成 23 年 8 月 16 日，食安発 0816 第 1 号）
2012.3
L 4 35AL 4 35A
Ａ改訂版発行：2012年 4 月