LIPASASDrs. Alcántara y Sinisterra

Biotransformations GroupFaculty of Pharmacy

Universidad Complutensewww.biotransformaciones.com

Enzimas aisladasCélulas aisladas

Liasas, transferasase isomerasas

K. Faber,Biotransformations in Organic Chemistry, 4th ed, 2000

Lipasas (acilglicerolhidrolasas E.C.3.1.1.3): actúan como catalizadores en reacciones lipolíticas (catabolismo de grasas y aceites) a través de la hidrólisis de los enlaces éster de acilgliceroles.

LIPASAS

Son activas únicamente adsorbidas sobre una interfase oleo-acuosa, “activación interfacial.”

1. Centro activo: tríada catalítica (Ser-His-Asp ó Glu)

Características comunes de las lipasas con otras serinhidrolasas:

2. Hueco oxianiónico: estabiliza el intermedio tetraédrico formado durante la catálisis enzimática a través de la formación de puentes de hidrógeno.

LIPASAS E.C. 3.1.1.1

Lipasas no especíicas.- hidrolizan todas las posiciones del triglicérido: Staphilococcus aureus, Candida rugosa

Lipasa 1,3-específicas .- conducen a 2- acil – monoglicéridos : Rhizopus arrhizus

Lipasa 2-específicas.- conducen a 1,3-diacilgliceridos : Geotrichum candidum

Catalizan la hidrólisis de esteres insolubles en agua, mediante una activación interfacial

Modelo de Verger de activación

Interfacial de las lipasas

TIPO DE LIPASA

K. Faber,Biotransformations in Organic Chemistry, 4th ed, 2000

ENANTIÓMERO RECONOCIDO

K. Faber,Biotransformations in Organic Chemistry, 4th ed, 2000

Residuos de aminoácidos en 11 lipasas mostrando la tríada catalítica, en el Hueco Oxianiónico (en cursiva) y el sitio de unión propuesto (cursiva).

Lipasa

Secuencia de consenso cercana de la Ser

nucleofila Gly-X-Ser-X-Gly

His catalítica Asp/Glu Catalítico

Hueco Oxianiónico

CVL, PCL -Gly85-His86-Ser87-Gln88-Gly89- -His285-Leu286- -Asp263- -Gly16-Leu17-

RML -Gly142-His143-Ser144-Leu145-Gly146- -His257-Leu258- -Asp203- -Gly81-Ser82-

HLL -Gly144-His145-Ser146-Leu147-Gly148- -His258-Leu259- -Asp201- -Gly82-Ser83-

PcamL -Gly143-His144-Ser145-Leu146-Gly147- -His259-Ile260- -Asp199- -Gly83-Ser84-

ROL -Gly143-His144-Ser145-Leu146-Gly147- -His257-Leu258- -Asp204- -Gly82-Thr83-

PPL -Gly150-His151-Ser152-Leu153-Gly154- -His263-Leu264- -Asp176- -Gly76-Phe77-

CAL-B Thr103-Trp104-Ser105-Gln106-Gly107- -His224-Ala225- -Asp187- -Gly39-Thr40-

CRL (lip1) -Gly207-Glu208-Ser209-Ala210-Gly211- -His449-Ser450-c -Glu341- -Gly123-Gly124-

GCL (lip II) -Gly215-Glu216-Ser217-Ala218-Gly219- -His463-Gly464- -Glu354- -Gly131-Ala132-

Asp

His

SerON NH H

O

O(Glu)

NH

HNHN O

HN

O

HN

NH

O

OHN

O

O

O

Asp

His

SerO

C

R1

N N

O(Glu)

NH

HNHN O

HN

O

HN

NH

O

OHN

OO

O

O H

H

R2O O-

Asp

His

SerO

C OR1

N NH

O

O(Glu)

NH

HNHN O

HN

O

HN

NH

O

OHN

O

O

O

Asp

His

SerO

C

R1

N N

O(Glu)

NH

HNHN O

HN

O

HN

NH

O

OHN

O

O

O

O H

H

HO O-

C O

R1

R2O INTERMEDIOTETRAÉDRICO #1

ENZIMA ACILADA

C O

R1

R2OC O

R1

HO

R2OH

OH

H

H2O

INTERMEDIOTETRAÉDRICO #2

MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS LIPASAS

Reconocimiento de alcoholes quirales

Regla de Kazlauskas(J. Org. Chem., 1991, 56, 2656)

HO OHOH

sn-glicerol

12

3

R1

O

O O

O

R3

O

R2

O

sn-Triglicérido

12

3

Alcoholes secundarios

m LHO H

3. Tapadera:Elemento estructural diferenciador de las lipasas.Formada por una porción helicoidal anfipática.Se coloca sobre el centro activo de la enzima cuando está inactiva. Existen dos conformaciones:

Conformación cerrada o inactiva (medio acuoso)

Conformación abierta (en interfase o medio orgánico)Estructura 3D de la RML

Excepciones:Lipasas de Pseudomonas glumae, Pseudomonasaeruginosa y Candida antarctica B, fosfolipasaspancreáticas A2, y la cutinasa de Fusarium solanicarecen de tapadera. Lipasas pancreáticas de nutria y de cobaya: tapadera sin activación interfacial.Lipasa de Staphylococcus hycius: activación interfacial sólo con algunos sustratos.

Alcoholes primarios

MH

O

L

.............His His.............O

M

H

L

His .............

LM

HO His .............

LH

OM

b. Permutación H/O c. Permutación M/L d. Permutación M/Ha. Esquema general

m LHHO

m

L

H OH

Reconocimiento de ácidos quirales

1. en forma de cueva (lipasas de Rhizomucor y Rhizopus).

Clasificación de las lipasas según la geometría del centro activo (Pleiss, Chem. Phys. Lipids, 1998, 93, 67):

A B C

Representación del centro activo de las lipasas de Rhizomucor miehei y Candida rugosa. (A) Orientación lateral donde los residuos se encuentran perpendiculares a la figura y se indican por una linea continua; (B) Forma del centro activo desde una visión frontal; (C) Forma del centro activo visto desde arriba.

RML: 18 Å de longitud, 4,5 Å de anchura en la base, y 6 Å en la superficie de la proteina. La parte donde se localiza la tapadera tiene una altura de 12 Å, y al

otro lado tiene una altura de 8 Å

CRL: 22 Å de largo con un diámetro

de aproximadamente 4 Å.

2. en forma de embudo (lipasas de Candida antarctica, Pseudomonas y páncreas de mamífero y cutinasa).

3. en forma de tunel (la lipasa de Candida rugosa).

Ser 144 (catalítica)Zona de reconocimiento del ácido de la RML

Zona de reconocimiento del ácido de la CRL Ser 209 (catalítica)

Phe296

Phe296

Botta, Biochim. Biophys. Acta, 1997, 1337, 302. Manetti, Biochim. Biophys. Acta, 2000, 1543, 146.

Superposición de los centros de reconocimiento de los ácidos arilpropiónicos de las lipasas de RML y CRL

Phe296

Modelo cinético de resolución de una mezcla racémica

Relación de velocidades. Medida de la enantioseletividad

= E

Reacciones catalizadas por lipasas

INTERESTERIFICACIÓN

ACIDOLISIS

TRANSESTERIFICACIÓN (ALCOHOLISIS)

ESTERIFICACIÓN

R1

O

OR2+ R3 OR4

Olipasa

+O

OR4R1 R3

O

OR2

R1

O

OR2+ R3 OH

Olipasa

+O

OR2R3 R1

O

OH

R1

O

OR2HOR3+

lipasaR1

O

OR3HOR2+

R1

O

OHHOR2+

lipasaR1

O

OR2

R1

O

OR2

lipasa, H2OR1

O

OHHOR2+

HIDRÓLISIS DE ESTERES

SÍNTESIS DE PEROXIESTERES

SÍNTESIS DE AMIDAS

SÍNTESIS DE TIOESTERES

R1

O

OR2HOOR3+

lipasaR1

O

OOR3HOR2+

R1

O

OR2HSR3+

lipasaR1

O

SR3HOR2+

R1

O

OR2H2NR3+

lipasaR1

O

NHR3HOR2+

Resolución cinética de compuestos quirales a través de una estrategía hidrolítica:

Hidrólisis de ésteres racémicos con el estereocentro en la zona del alcohol (sustratos tipo I).

Resolución cinética de compuestos quirales a través de transferencia de acilo.

Resolución Cinética de racematos con lipasas

R1

CH

R2 O R3

Olipasa, H2O R1

CH

R2 OHR2CH

R3 O R3

O

+

Hidrólisis de ésteres racémicos con el estereocentro en el grupo ácido (sustratos tipo II).

R1

CH

R2 COR3 lipasa, H2O

O

R1CH

R2 COH

O

R2CH

R1 COR3

O+

R2

CH

R1 OH

lipasa G R3

O

R2CH

R1 O R3

O R2CH

R1 OHdisolv.orgánico

R2

CH

R1 COH

O

lipasa R3

disolv.orgánico

HO R2CH

R1 COH

O

R1CH

R1 COR3

O+

+

APLICACIONES

R1 R2

OH

lipasa deRh. miehei

Lipozyme IM20

disolvente orgánico+

R3

O

O

R4 R1 R2

OH

R1 R2

O+

R3

O

+HO

R4

O

R4

(R,S)

R1= Ph-, Bn-, 1-naftil, 2-naftil.R2= Me-, Et-, Pr-.

R3= Me-, Et-, Pr-, Ph-, R4= H-, Me-

(S) (R)

I. E. De FuentesTesis Doctoral, UCM, 2002

Ph Me

OH

lipasa deRh. miehei

Lipozyme IM20iPr2O

+Me

O

O

H Ph Me

OH

Ph Me

O+

Me

O

(R,S) (S) (R)REACCIÓN TEST

A. R. Alcántara y colsChem. Phys. Lipids, 1998, 93, 169

FACTORES QUE DEBEN CONTROLARSE

R1 ∗

R2

OH

O

R3 Nu

AW

1. VARIABLES CONTÍNUAS

DISOLVENTE(logP)

TEMPERATURA

AGITACIÓN

RELACIÓNMOLAR

2. VARIABLES DISCRETAS

ESTRUCTURA DEL ALCOHOL, DEL DONADOR DE ACILO, PUREZA DE LA PREPARACIÓN ENZIMÁTICA, NATURALEZA DEL SOPORTE

con un centro estereogénico, de forma que la actividad biológica en los tratamientos mencionados reside fundamentalmente en el enantiómero S presentando el isómero R efectos secundarios indeseables en algunas ocasiones.

Dentro de este grupo de fármacos, el propranolol (1-isopropilamino-3(1-naftoxi)-2-propanol) se considera el compuesto de referencia. Se ha comprobado que la actividad beta-bloqueante de su isómero S es 100 veces superior a la del isómero R. Es más, el isómero R presenta un efecto secundario como contraceptivo masculino.

ArO ∗

HN

OH

Los beta-bloqueantes constituyen el grupo más importante dentro de los fármacos adrenérgicos.Utilizados en el tratamiento de: hipertensión

arritmiasangina de pechociertos tipos de ansiedad.

Una familia de estos compuestos, muy vendidos, presentan estructura de ariloxiaminopropanol, v.g.:Sumial, atenolol etc.

APLICACIÓN PRÁCTICA

ArO ∗

HN

OH

Ar nombre

propranolol

atenolol

NH

pindolol

O

oxprenolol

Ar-OH

OCl N

,1)

2) HCl (1h, 0-5ºC)Ar

O ClOH

2.- Resolución cinética de los racematos empleando una lipasa

1.- Síntesis de los intermedios racémicos de estructura de halohidrina.

METODOLOGÍA:

I. Borreguero.Tesis Doctoral, UCM, 1999.

ArO Cl

OH O R1

OR2

lipasadisolvente orgánico

ArO (R) Cl

OH

+

Ar = 1-naftilo,1a2-naftilo,1bo-tolilo, 1cp-tolilo, 1d

1

R-1

R1 = Me, Et, Pr, -CH2Cl, -(CH2)10CH3R2 = H, Me

ArO (S) Cl

O

O

R1

S-2

OBJETIVO:

Optimizar un proceso quimioenzimático de obtención de sintones quirales para obtener estos compuestos enantioméricamente puros.

1.- Síntesis de los intermedios racémicos de estructura de halohidrina

Ar-OHO

Cl+Ar

O ClOH

ArO

O+N

ab

HCl (0-5ºC)

Ar = 1-naftilo, t = 46 h, conversión > 99%, rendimiento > 90%Ar = 2-naftilo, t = 26 h, conversión > 99%, rendimiento > 90%Ar = o-tolilo, t = 72 h, conversión > 99%, rendimiento > 90%Ar = p-tolilo, t = 120 h, conversión > 99%, rendimiento > 90%

2.- Resolución cinética de los racematos de 1 empleando una lipasa

O ClOH O

O

lipasadisolv. orgánico

O(R)

ClOH

+

1

O(S)

ClO

O

R1

S-2R-1

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900Tiempo (h)

0

10

20

30

40

50

60Conversion (%)

Lipozyme IM20

HLL

PPL

CAT. mg t (h) X (%)

Pto.13

ee1(%) Pto.1 ee3

(%) Eb EFc

HLL 106 547 30 S-(+) >99 R-(-) 32 >100 0.73

PPL 106 817 8 S-(+) 65 R-(-) 3 5 0.36

IM20 15 340 53 S-(+) >99 R-(-) 78 >100 0.71

CONDICIONES ESTANDAR: SUSTRATO 1a, AGENTE ACILANTE = ACETATO DE VINILO (R1 = Me, R2 = H), RELACIÓN MOLAR 1/3, DISOLVENTE = iso-OCTANO, T = 30ºC

2.1.- Influencia de la temperatura

0 100 200 300 400 500 600Time (h)

0

10

20

30

40

50

60

Yield (%)

4ºC

25ºC

37ºC

50ºC

60ºC

0 100 200 300 400 500 600Time (h)

0

20

40

60

80

100

Substrate´s e.e. (%)

4ºC

25ºC

37ºC

50ºC

60ºC

T (ºC) c (%)

e.e of R-2a (%) E EF

4 17

42

48

34

Tiem

po d

e reacció

n=

24 h

ora

s

39

18 18 0.88

25 59 18 0.81

37 74 20 0.80

50 43 17 0.83

60 56 27 0.88

2.2.- Influencia de logP

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Time (h)

0

10

20

30

40

50

60

Yield (%)

tricloroetano

ciclohexano

dodecano

isooctano

metilciclohexano

nonano

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Time (h)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Substrate´s e.e. (%)

tricloroetano

ciclohexano

dodecano

isooctano

metilciclohexano

nonano

disolvente logP c (%) e.e of R-2a (%) E EF

1,1,1-tricloroetano

Ciclohexano

Metilciclohexano

isooctano

Nonano 5.1 45 64 16 0.78

Tiem

po d

e reacció

n=

24

h

ora

s

2.5

dodecano

42 15 0.81

3.2

34

43

48

49

60 16 0.80

3.7 73 19 0.79

4.5 71 14 0.74

436.6 59 15 0.78

2.2.- Influencia del agente acilante

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150Time (h)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Yield (%)

acetato de vinilo

butirato de vinilo

propionato de vinilo

laurato de vinilo

anhidrido acético

cloroacetato de vinilo

acetato de isopropenilo

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150Time (h)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Substrate´s e.e. (%)

Agente acilante T(h) CONV. (%) ees (%) E EF

24 12

----

12

14

>100

>100

>100

144

0.74

----

0.72

0.74

----

----

48

24

4

6

Laurato de vinilo 6 8 >99 ----

Anhidrido acético- 14 9

Acetato de isopropenilo ----- ----

Cloroacetato de vinilo 49 69

Acetato de vinilo 59 71

Propionato de vinilo 59 >99

Butirato de vinilo 62 >99

O ClOH O

O

Lipozyme IM20isooctano

O(R)

ClOH

+

1a

O(S)

ClO

O

S-2aR-1aT = 37ºC, t = 4 h

conversión = 55%, ee1 > 99%, E = 27

O(R)

ClOH

R-1a NH2

O(S)

HN

OH

PROPRANOLOL

2.3.- Condiciones optimizadas

Desymmetization on 1,3-propranodiols

Gracia-Urdiales et al. Chem rev. 2005,105, 313-354

Syntehsis of antitumor antibiotiv(+) FR900482. The synthesis of (S)-8 is the key step

Synthesis of pheromone from Dannau chrysippus

Desymmetrization of different 1,3-propanodiols- 2-substituted

Takabe et al. Tetrahedron: Asymmetry 2000, 13, 1967

The resolution was performed with Pseudomonas cepaciaLipase The yields were moderated and the presence ofDiacetates was noticeable in many cases.

The enantiopreference is related to the structure of theAmide group.

Contrarily, the nature of the alkyl group of the acetate (R3 ) wasnot very important

Desymmeetrization of different 1,3-propanodiols- 2-substituted

Takabe et al. Tetrahedron: Asymmetry 2000, 13, 1967

Pro-S recognitionThe interaction is controlled by the interaction of H-N with the amideGroup from the active site.

Pro-R recognitionThe N,N-disubstituted amides cannotInteract by H-bondingTherefore the R-recognition isFavored

In both cases the primary alcoholInteracts with the acylated serine

Desymmeetrization of of meso-compounds with quaternary center.It is a challenge for synthetic organic chemists.

Fukuyama et al. (JACS 2003, 125, 4048) reported the synthesis of Leutroducsin ( stimulant of growing cell colonies).The synthesis of the key intermediate (19) is performed with lipase from C. rugosa.

The monoester 21 (key intermediate in Vitamine-K analogous) is prepared using CALB.Chenevert et al. Tetrahedron Lett. 2002,43,7971

Synthesis of nuleoside prodrugs

NH

N

N

O

NH2N

O

OHOH

HHHH

HO

CH3

NH

N

N

O

NH2N

O

OHOH

HHHH

O

CH3

O

H3C

Vinyl acetateCandida antarct ica lipase

99% yield

Anti-leukaemic produg- Glxaxo-SmithKline

Raso & Voss Appl.Ctatal. A: Chemical 221,145-158(2001)

Enzymatic alcoxycarbonylation

Enzymatic synthesis of amides catalyzed by lipasesNon conventional synthesis

ALCÁNTARA et al. : Candida rugosa lipase-catalysed resolution of racemic acids, esters or amines in slightly hydrated organic media. Food Technol. Biotechnol. 2004 , 42, pp. 343-354