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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E EXATAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)
Conceitos Básicos
Instrumentação
Aplicações
Prof. Dr. Renato Zanella
LARP/UFSM, Brasil
HPLC
Princípio da técnica HPLC
Modos de separação
Instrumentação
- Separação (gradiente x isocrático)
- Detecção
Fase Móvel (FM) / Fase Estacionária (FE)
Aplicações
TÓPICOS QUE SERÃO ABORDADOS
Cromatografia Liquida
de Alta Eficiência - HPLC
A cromatografia pode ser conceituada como um método
físico-químico de separação, no qual os constituintes da
amostra a serem separados são particionados entre duas
fases, uma estacionária (FE) geralmente de grande área e
outra que percola através da primeira, a fase móvel (FM).
INTRODUÇÃO
HPLC - Equipamento
Sistema de HPLC
Cromatografia Liquida
de Alta Eficiência - HPLC
Histórico
A Cromatografia Líquida foi inicialmente utilizada comouma técnica preparativa lenta. As teorias existentes nãoexplicavam corretamente o desempenho das colunascromatográficas, o papel da fase móvel e da faseestacionária.
Cromatografia líquida clássica
1903 - Tswett - 1° trabalho em cromatografia líquida
1935 - Adams e Holmes – 1ª resina de troca iônica
1940s - Cromatografia moderna – 1os tratamentos teóricos
1941 - Martin e Synge - cromatografia líquido-líquido
1960s - grande desenvolvimento da cromatografia líquida
1970s - primeiros equipamentos comerciais
HPLC - Histórico
Tswett 1903
A fase estacionária (FE) é geralmente utilizada uma só
vez, porque a amostra pode ser adsorvida de forma
irreversível;
O enchimento da coluna deve ser repetido para cada
separação;
Desperdício de tempo e mão-de-obra
A aplicação da amostra requer tempo e prática;
A vazão do eluente é promovida pela ação da gravidade;
As frações individuais da amostra são coletadas
manualmente o que requer várias horas.
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HPLC - Histórico
Tswett 1903
HPLC - Equipamento
Dificuldades Iniciais
- Baixa vazão - gravidade
- Fase Estacionária - estabilidade, empacotamento
- Detectores - tamanho das celas, rapidez de resposta
Menor HPLC
comercial
HPLC - Aplicações
Aplicações
Proteínas e aminoácidos
Pesticidas
Fármacos
Explosivos
HPAS
Vitaminas
Pigmentos
Açucares
Polímeros
Íons metálicos
Cromatografia Liquida
de Alta Eficiência - HPLC
Usos e Limitações
Na Cromatografia Líquida os compostos a
serem analisados não necessitam ser voláteis
ou termicamente estáveis, mas é necessário que
sejam solúveis na fase móvel (FM) que possuam
uma possível interação com a FE e que possam
adequadamente ser detectadas.
Cromatografia Liquida
de Alta Eficiência - HPLC
Estratégia de Desenvolvimento das Análises por HPLC
Preparo da amostra;
Escolha da FE (coluna)
Escolha da FM (Isocrática; Gradiente; Aditivos);
Volume de injeção;
Otimização do cromatograma;
Detecção;
Aquisição e tratamento dos dados;
Calibração e quantificação;
(Re)Validação.
HPLC - Modos de Separação
Modos de separação (mecanismos)
Adsorção (CLS) SÍLICA - altamente polar
Partição (CLL)
Fase Normal FASE LIGADA - baixa polaridade
Fase Reversa FASE LIGADA - apolar
Par Iônico FASE LIGADA - apolar (adição de íons)
Troca Iônica FASE LIGADA - trocador iônico
Exclusão POLíMEROS - cavidades
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HPLC - Modos de Separação
I- Líquido-Sólido ou por ADSORÇÃO
É baseada na interação do soluto com os centros
ativos fixos de um adsorvente sólido, finamente
dividido, que atua como FE.
ADSORVENTE
ELUENTE SOLUTO
Soluto e eluente são atraídos pelos sítios polares da FE
FM FE
HPLC - Modos de Separação
FE = sólido. Ex.: sílica ou alumina
FM = solventes apolares, comumente hexano,
contendo pequenas quantidades de
modificadores polares como dicloromentano
e 2-propanol.
Utilizada para separação de: ácidos graxos,
álcoois, aminas, antioxidantes, corantes,
fenóis, lipídios, vitaminas lipossolúveis, etc.
ADSORÇÃO
HPLC - Modos de Separação
II- Líquido-Líquido ou de PARTIÇÃO
Desenvolvida por Martin e Synge em 1941 para a
separação de vários aminoácidos;
Baseia-se na distribuição das moléculas do soluto
entre duas fases líquidas imiscíveis, de acordo
com as solubilidades relativas. Os componentes
mais solúveis na FE são seletivamente retidos por
ela, enquanto os menos solúveis são
transportados mais rapidamente pela FM;
HPLC - Modos de Separação
A separação do soluto é baseada nas diferenças
relativas de solubilidade na FE e na FM
FM FE
PARTIÇÃO
HPLC - Modos de Separação
Inicialmente o maior inconveniente era asolubilidade da FE na FM. Isso poderia serresolvido de duas maneiras:
saturando a FM por meio de uma pré-coluna, colocadaantes do injetor, que contenha alto percentual de FE,
utilizando materiais que contenham FE quimicamenteligada a um suporte sólido.
É utilizada para compostos de polaridadeintermediária, com massas moleculares < 2000 u.
PARTIÇÃO
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HPLC - Modos de Separação
Líquida ligada em suporte sólido:
As fases quimicamente ligadas são as mais
importantes da HPLC. Todas elas se baseiam nas
possibilidades do grupo silanol reagir no
hidrogênio ou por substituição da hidroxila.
PARTIÇÃO HPLC - Modos de Separação
Principais fases quimicamente ligadas
1. Fases apolares : os principais grupos não polares oupouco polares ligados à silica são:
a) Grupos alquílicos com cadeias de 2, 4, 8, 18 e 22átomos de carbono.
C4 (butila): tR menor que das fases C8 e C18. Utilizadapara separação de peptídios e proteínas.
C8 (octila): Recomendada para materiais ligeiramenteou altamente polares como peptídios pequenos,esteróides, nucleosídeos, fármacos polares.
PARTIÇÃO
HPLC - Modos de Separação
C18 (octadecilsilica ou octadecila; ODS, RP-18): para materiais
apolares ou moderadamente polares, tais como ácidos
graxos, PAHs, ésteres, vitaminas lipossolúveis, etc.
b) Grupos fenílicos: são grupos fenila ou alquilfenila ligadas à
sílica. Possuem poucas aplicações. Recomendada para
grupos moderadamente polares.
PARTIÇÃO HPLC - Modos de Separação
Tratamento Endcapping com trimetilclorosilano
HPLC - Modos de Separação
2. Fases polares : neste caso os grupos ligados à
sílica são polares. Exemplos:
Amino (NH2)
Ciano (CN)
Diol
Cromatografia em fase reversa
HPLC - Modos de Separação
Com base nas polaridades relativas da FE e FM a HPLC pode ser dividida em duas categorias:
Cromatografia em fase normal
A FE é mais polar que a FM
(FE polar e FM apolar)
A FE é mais apolar que a FM
(FE apolar e FM polar)
FN
FR
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HPLC - Modos de Separação
Características da Cromatografia em FN e FR
Fase Normal (FN) Fase Reversa (FR)
Polaridade da FE Alta Baixa
Polaridade da FM Baixa - Média Média - Alta
Fase móvel típica Heptano/triclorometano Metanol/água
Ordem de eluição 1° os menos polares 1° os mais polares
P/ tR do soluto polaridade da FM polaridade da FM
(aumento da força de eluição da FM)
P/ tR do soluto polaridade da FM polaridade da FM
Escolha do modo (Em geral):
• Se a amostra for insolúvel em
água ou apolar – use FN;
• Se for solúvel ou insolúvel em
água, mas polar – use FR
HPLC - Modos de Separação
HPLC - Modos de Separação
FASE REVERSA Vantagens
Freqüentemente compostos não iônicos e ionizáveis podem ser separados usando a mesma coluna e FM com vários aditivos (tampão de pH e reagentes de par iônico);
As colunas de fase hidrofóbica ligadas são reprodutíveis erelativamente estáveis;
A FM predominante, a água, é de fácil obtenção; amostras emsolventes aquosos podem ser diretamente injetadas;
Os modificadores mais utilizados, metanol e acetonitrila, estãoprontamente disponíveis e adequadamente puros;
A ordem de eluição é freqüentemente previsível, baseado no grauhidrofóbico da molécula do soluto.
HPLC - Modos de Separação
III - Exclusão por tamanho (SEC)
Efetua a separação de acordo com
o tamanho efetivo das moléculas.
A coluna é recheada com material
com poros de tamanho controlado.
Fases Estacionárias
poliestireno poroso
sílica - poros controlados
gel - base orgânica ou aquosa
Fases Móveis
aquosa - filtração em gel
orgânica - permeação em gel
Aplicações:
Separações de polímeros, proteínas,
Gorduras, ... por tamanho. Moléculas
maiores eluem primeiro.
HPLC - Modos de Separação
III - Exclusão por tamanho (SEC)
HPLC - Modos de Separação
IV - Troca IônicaDeterminação de cátions e ânions
Resinas trocadoras de íons: As modernas resinastrocadoras de íons são fabricadas a partir de polímerosporosos com superfície modificada com grupostrocadores iônicos.
Trocadores catiônicos:
Forte: sulfônico
Intermediário: fosfônico
Fraco: carboxílico
Trocadores aniônicos:
Forte: amônio quaternário
Intermediário: dietilamino
Fraco: p-amino carboxílico
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HPLC - Modos de Separação
IV - Troca Iônica
HPLC - Modos de Separação
Mecanismo+
FEContra-íonÍon do soluto
Um composto iônico
que forma um par iônico
com um componente da
amostra, de carga
oposta, é adicionado à
FM. Este par iônico, é
um sal, que se comporta
como uma molécula
orgânica neutra, que
pode ser separada por
cromatografia em fase
reversa.
V - Par Iônico O pré-requisito é que o contra-íon forme um íon par com características
hidrofóbicas e seja atraído pela FE apolar.
Para separações que não são adequadas por FR ou troca iônica.
HPLC - Modos de Separação
Reagentes de Par Iônico
Para cátions: ácido octanosulfônico
Para ânions: sais de tetrabutilamônio
Vantagens da Cromatografia de Par Iônico (IPC):
Adição de reagentes aumenta retenção;
Grau de aumento de retenção depende da hidrofobia
do reagente;
IPC tem maior eficiência do que troca iônica;
IPC pode alterar permanentemente a FE;
HPLC - Modos de Separação
VI- Quiral
As fases quirais são materiais que quando
empregadas como FE ou introduzidos na fase
móvel, permitem a separação de isômeros
ópticos de misturas racêmicas ou dos
compostos racêmicos em matrizes de uso geral.
VII- Afinidade
Emprega interações específicas entre um tipo de
molécula do soluto e uma segunda molécula que
está ligada covalentemente (imobilizada) na FE.
HPLC - Fase Móvel
FASE MÓVEL (FM)
A escolha da fase móvel depende:
Tipo de coluna
Substâncias a serem separadas
Em geral:
Se a amostra for insolúvel em água ou não-polar use FN
Se a amostra for solúvel em água ou não-solúvel mas polar use FR
HPLC - Fase Móvel
FASE MÓVEL (FM)
Cuidados com os solventes
Eliminação de impurezas
água, solventes orgânicos
solução tampão
Uso de filtros no reservatório da FM
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HPLC - Fase Móvel
Desgaseificação da FM
Vácuo Ultra-som Corrente de hélio
HPLC - Fase Móvel
Principais características que a FM deve apresentar:
Ter alto grau de pureza ou ser facilmente purificável;
Dissolver a amostra sem decompor os componentes;
Não decompor ou dissolver a FE;
Ter baixa viscosidade;
Ser compatível com o detector utilizado;
Ter polaridade adequada para permitir uma separação conveniente
para todos os componentes da amostra.
Deve-se levar em conta ainda:
Propriedades físico-químicas que afetam a solubilidade, a partição, a
adsorção e portanto a separação;
Propriedades físicas que dificultem o manuseio das bombas,
detectores e das colunas;
Propriedades que afetam a segurança;
Custo.
HPLC - Fase Móvel
Seleção do solvente
Pode ser usado puro ou mistura de dois ou mais solventes.Geralmente a mistura de apenas dois solventes é suficiente.
Fatores que devem ser considerados:
Força do solvente (º): Uma medida relativa da polaridade dosolvente (habilidade de deslocar o soluto). Escala baseada emsílica ou alumina;
Índice de Polaridade (P’): um índice relativo usado para osmétodos que utilizam fase reversa.
HPLC - Fase Móvel
Parâmetros de alguns solventes utilizados em HPLC:
Solvente Parâmetro de Polaridade Viscosidade
Solubilidade ( ) ( P’) ( a 25 °C, cP)
Hexano 0,1 0,30
Triclorometano 4,1 0,57
Tolueno 8,9 2,3 0,55
Diclorometano 10,68 3,4 0,43
Etanol 4,3 1,08
THF 9,88 4,0 0,46
Acetonitrila 13,14 6,2 0,34
Metanol 15,85 6,6 0,54
Água 25,52 10,2 0,89
HPLC - Fase Móvel
FORÇA DE ELUIÇÃO
FASE NORMAL FASE REVERSA
Hexano Água
Tolueno Metanol
Acetona Acetonitrila
Acetonitrila Acetona
Metanol Tolueno
Água Hexano
Fraco
Forte
HPLC - Fase Móvel
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HPLC - Fase Móvel HPLC - Fase Móvel
HPLC - Fase Móvel
Preparing Buffered Mobile Phases for Reversed Phase HPLCWhen Should a Mobile Phase be Buffered?
In RP HPLC, the retention of analytes is related to their hydrophobicity. Themore hydrophobic the analyte, the longer it is retained. When an analyte isionized, it becomes less hydrophobic and, therefore, its retention decreases.Acids lose a proton and become ionized when pH increases and bases gain aproton and become ionized when pH decreases (See Figure).
As acids lose a proton and become
ionized (with increasing pH), their
retention decreases. As bases gain
a proton and become ionized (with
decreasing pH) their retention
decreases.
Therefore, when separating mixtures containing acids and/or bases by RPHPLC, it is necessary to control the pH of the mobile phase using anappropriate buffer in order to achieve reproducible results.
HPLC - Fase Móvel
The robustness of an HPLC method is often dependent on mobile phase pH
For the most robust methods, it is recommended that separations be developed at amobile phase pH where the retention of analytes are little affected by changes in pH.When separating bases, for example, acidic mobile phases usually show betterreproducibility than neutral mobile phases. As can be seen in the Figure,methylamphetamine is fully protonated at a pH less than 3 and its retention is notaffected by slight changes in mobile phase pH. However, at a pH of 7, closer to itspKa, a change in pH of only 0.2 units will shift retention by almost 9%.
A change in mobile phase pH from 7.0 to 7.2
will cause the retention of methylamphetamine
to increase from 13.6 minutes to 14.8, an
almost 9% increase. However, at a mobile
phase pH of 2.8, there is a negligible change in
retention with an increase of 0.2 pH units.
When developing a reversed phase method for
basic compounds, like methylamphetamine,
you can expect a more robust method when
using acidic mobile phases.
HPLC - Fase Móvel
Selecting the Right Buffer
Often reversed phase methods are developed using buffers that have little or no bufferingcapacity at the specified mobile phase pH. Methods that specify a phosphate buffer in the pHrange of 4 to 6, or an acetate buffer in the range of 6 to 7 are not uncommon. These buffers arenot just useless in these pH ranges, they complicate the preparation of mobile phaseunnecessarily and give the analyst a false sense of controlling the reproducibility.
Optimum buffering capacity occurs at a pH equal to the pKa of the buffer. In general, you canexpect most buffers to provide adequate buffering capacity for controlling mobile phase pHonly within 1 unit of their pKa.
Since it is becoming more common to find HPLC interfaced to MS, volatile buffers for LC-MSapplications are indicated.
Buffer Concentration
The concentration of the mobile phase buffer usually
has little effect on retention in reversed phase HPLC,
just as long as the buffer concentration is high
enough to control pH. A buffer concentration in the
range of 25 to 50 mmol L-1 is adequate for most
reversed phase applications.
HPLC - Fase Móvel
Influência do pH da FM na ordem de eluição em FR
C18, 150 x 4.6 mm, MeCN/water (20/80) with different mobile phase pH (10mM
phosphate buffer adjusted with HClO4).
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HPLC - Fase Estacionária
COLUNAS ANALÍTICAS (FE)
Permitem a separação de pequenas quantidades do
material a ser analisado;
São constituídas de um tubo de algum material inerte.
O aço inoxidável é o material mais freqüentemente
utilizado;
Tem diâmetro interno uniforme, capaz de resistir às
pressões em que será usada e a possíveis sobre-
pressões ocasionais;
HPLC - Fase Estacionária
Diâmetro interno (d.i.) entre 3 a 5 mm. As colunas com
microdiâmetros apresentam d.i. entre 0,05 e 2 mm;
Comprimento das colunas entre 10 e 50 cm, com
exceção da cromatografia por exclusão onde as vezes
utilizam-se colunas de comprimento maior ou várias
colunas conectadas em série;
São normalmente retas, pois apresentam uma perda na
eficiência quando são dobradas.
HPLC - Fase EstacionáriaHPLC - Fase Estacionária
HPLC - Fase Estacionária
Estrutura da sílica(5 µm) esférica eirregular
Superfície da
FE C-18Forno da coluna
HPLC - Fase Estacionária
Efeito multicanal (Difusão de Eddy)
Inicial FE Final
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HPLC - Fase Estacionária
Pré-coluna (coluna guarda)
São de 2-5 cm de comprimento com o mesmo d.i. da coluna eapresenta as mesmas características;
Tem como objetivo reter sólidos que podem entupir os filtros dacoluna e em muitos casos reter materiais que por reações químicaspodem precipitar sobre a FE;
É colocada entre o injetor e a coluna;
Tem o mesmo recheio da coluna ou similar da usada na coluna.
HPLC - Fase Estacionária
Fases Estacionárias
Suportes Exemplos Uso (%)
Sílica Alta área superficial, 75
Poros grandes
Polímero Polimetacrilatos; PS-DVB 20
Polietilenoglicol; Polidextrinas
Alumina Neutra, Ácida 2
Outros Carbono grafite, zircônia 3
HPLC - Fase Estacionária
Eficiência das colunas de HPLC
Tamanho da Diâmetro dos Área Eficiência
Partícula (µm) Poros (Å) Superficial (m2/g) (pratos/m)
3 120 170 100 000
5 120 170 60 000
7 300 100 40 000
Alargamento dos picos em
função da vazão da FM e do
diâmetro das partículas da FE
HPLC - Fase Estacionária
Diferentes d.i. das colunas e as respectivas vazões da FM
utilizadas nas diferentes escalas de trabalho da HPLC
HPLC - Fase Estacionária
Characteristics of Various LC Modes
LC mode Inner diameter Injection volume Flow rate
(mL/min)
Conventional 3–6 10 –50 L 0.5–2
Microbore 0.5–2 mm 0.5–2 L 10–300
Packed micro-capillary 0.2–0.5 mm 0.1 L 1–10
Drawned packed capillary 50 –200 mm 10 nL 0.1
Open tubular 5–25 mm 1 nL 0.1
HPLC - Fase Estacionária
Sistema para HPLC preparativa
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HPLC - Fase Estacionária
Reducing Capillary ID to Improve Sensitivity for
Concentration-Limited Samples
min0 2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5
200 ng Biphenyl
Column: Zorbax SB C18
0.3mm
0.5mm
1mm
4.6mm
Less peak dispersion
HPLC - Fase Estacionária
Escolha da fase estacionária mais adequada
Classe da Alcano, alceno, Éter, cetona, Álcool, Amina
Substância alcino, aromático tioéter, éster, amida, Ác. Carbox.
Polaridade Apolar Média Polar
Solubilidade Hexano, éter, THF, dioxano, cetona, água,
Tolueno, acetonitrila, acetato de metanol
diclorometano etila
Fase normal Fase reversa Fase reversa
Sílica gel C18, C8, C4, fenil C18, C8, fenil
FE (adequada) Alumina CN, NH2, Diol
Fase normal
sílica gel
HPLC - Bomba
Bombeamento da Fase Móvel
Devem operar a pressões de até 500 atm com a mesma
precisão e exatidão de operações a pressão quase
ambiente;
As vazões empregada vão de 0,005 até 5 mL/min;
Não devem ser corroídas pela fase móvel;
Reprodutibilidade e constância da vazão.
HPLC - Bomba
Tipos de Bombas
a. Pressão constante:
a.1. Bombas pneumáticas- o líquido é deslocado mediante
a pressão exercida por um gás inerte a alta pressão:
pode ser feita diretamente sobre o líquido ou sobre o
recipiente comprimível que o contém.
Vantagens: - pressão regulada pelo cilindro
- sistema barato
- não há pulsação
Desvantagens: - pressão limitada pelo cilindro
- dissolução de gás no solvente
- não se pode fazer gradiente
- não se pode reciclar
HPLC - Bomba
b. Fluxo constante:
b.1. Bombas tipo seringa- um êmbolo ou pistão é
movimentado de forma contínua e uniforme por um
motor de precisão comprimindo o líquido contido em
uma câmara de um certo volume.
Vantagens: - fluxo constante
- não há pulsação
Desvantagens: - reabastecimento lento
- o fluxo é parado durante o
reabastecimento
- não se pode fazer gradiente
Solução: pode-se utilizar colunas de microdiâmetro onde o
volume da fase móvel necessário é pequeno.
HPLC - Bomba
b.2. Bombas reciprocadoras ou de pistões- mediante o
movimento de pistões e através de sistemas de válvulas,
ocorre o bombeamento da FM.
- Utiliza-se uma bomba com dois pistões, de tal forma que
quando um succiona a FM o outro expulsa o líquido para
fora da bomba.
Vantagens: - fluxo constante
- pode-se fazer gradiente
- alimenta o sistema continuamente
Desvantagens: - pode ocorrer pulsação do fluxo
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HPLC - Bomba
Detalhes do funcionamento
de uma bomba de HPLC
Sistema gradiente com mistura
da FM a baixa pressão
Sistema gradiente com mistura
da FM a alta pressão
HPLC - Bomba
Exemplo de cromatogramas obtidos com separação
isocrática (inferior) e gradiente (superior)
Tempo (min)
HPLC - Sistema de Injeção
Sistema de introdução da amostra
Existem basicamente 3 tipos de injetores: seringa, válvula
e automáticos.
1. Injetores tipo seringa:
Vantagens: são baratos
Desvantagens: - aplica a amostra diretamente na coluna
- dificuldade de injetar volumes precisos
- deve-se vencer a pressão da bomba
2. Injetores tipo válvula:
Introdução da amostra é efetuada com um “loop” externo
Vantagens:
- injeta volumes precisos
- “loop” de diferentes tamanhos
(mais utilizados: 20 e 100 µL)
HPLC - Sistema de Injeção
HPLC - Sistema de Injeção
Injetor do tipo válvula Rheodyne
Posição de carregamento Posição Injeção
HPLC - Sistema de Injeção
3. Injetores automáticos:
- São injetores de válvula controlados por microprocessador;
- Permite Injetar diferentes volumes das amostras que sãocolocadas em um carrossel, conforme programação prévia;
- A pressão da seringa é suficiente para a amostra passar a válvulade controle.
Vantagens: - todas as do injetor tipo válvula
- injeta amostras automaticamente
Desvantagens: - preço
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HPLC - Detectores
DETECTORES PARA HPLC
Tem a função de monitorar o efluente da coluna e
fornecer a medida detectada do soluto;
Funciona de acordo com diferentes princípios, mas
todos geram sinal elétrico que é proporcional a alguma
propriedade do analito;
A resposta do detector pode ser relacionada com a
quantidade de analito, portanto o detector deve ser
calibrado com cada espécie de interesse;
A escolha do detector é de acordo com as
características dos analitos.
HPLC - Detectores
DETECTOR SINAL CROMATOGRÁFICO
HPLC - Detectores
Características ideais de um detector:
Alta sensibilidade;
Boa estabilidade e reprodutibilidade;
Resposta linear;
Resposta rápida, independente da vazão;
Insensível a trocas de temperatura e pressão;
Alta confiabilidade e fácil uso;
Seletividade, precisão, exatidão;
Não destruir a amostra.
Sistemas de Detecção:
Qualquer propriedade química ou física que pode ser medida em
solução pode, em princípio, ser utilizada para a detecção.
Propriedades da solução: mede alguma mudança ocorrida na FM. Ex. Índice
de refração e eletroquímicos.
Propriedades do soluto: mede uma propriedade específica do soluto.
Ex. Espectrofotométrico UV-vis e DAD.
HPLC - Detectores
Principais detectores:
Espectrofotometria UV e Visível
- Detector por Arranjo de Diodos (DAD)
Fluorescência (FD)
Índice de Refração (RI)
Espalhamento de Luz (ELSD)
Espectrometria de Massas (MS)
Eletroquímicos: Constante dielétrica, Amperométrico,
Condutométrico, Polarográfico e Potenciométrico
HPLC - Detectores
Choosing a Detector
RI UV/VIS Fluoresc MS
Response Universal Selective Selective Selective
Sensitivity4
microgram 5
nanogram3
picogram1
picogram
Linear Range 10 10 10 10
Flow Sensitive Yes No No Yes
Temperature Sensitive
Yes No No No
HPLC - Detectores
1. Detector Espectrofotométrico (UV e Visível)
É o detector mais popular em HPLC;
Mede as variações na absorção da luz na regiãode 190 a 370 nm (UV) e de 370 a 700 nm (Visível).
1.1. Tipos:
Comprimento de onda fixo (ex. 254 nm);
Comprimento de onda variável;
Detector de Arranjo de Diodos (DAD).
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HPLC - Detectores
1.2. Aplicações:
- Compostos que absorvem no UV-Vis
1.3. Vantagens:
- Alta sensibilidade;
- Não é destrutívo.
- Permite trabalhar com gradiente;
- Responde a larga faixa de concentração;
- Relativamente insensível a variação de T e vazão da FM;
1.4. Desvantagens:
- Detecta somente substâncias que absorvem no UV-Vis
HPLC - Detectores
Esquema de um Detector Espectrofotométrico
com variável
HPLC - Detectores HPLC - Detectores
HPLC - Detectores
UV and MS (SIM) chromatograms of nicotine and its metabolites. Mobile phase: 85% CH3CN/
9% H2O/ 6% 50 mM pH 2.7 Ammonium formate buffer; Flow rate: 0.5 mL/min; Injection volumen: 5 μL;
Nicotine: 10 ng/μL, SIM=163 m/z; Cotinine: 9.8 ng/μL, SIM =177 m/z; HOC: 6.7 ng/μL, SIM=193 m/z;
Cone voltage: 70V, Dwell time: 0.5 second, Probe temperature: 500 C; Needle voltage: 4 kV.
HPLC - Detectores
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Esquema do Detector de Arranjo de Diodos (DAD)
HPLC - Detectores
HPLC - Detectores
Take peak spectrum
Compare
Chlortoluron ?
250 300
W a v e l e n g t h (nm)
250 300
W a v e l e n g t h (nm)
UV-Vis Spectra Acquired with Diode Array Detector (DAD)
Cromatograma de isoflavonas (100 μg mL-1) com os respectivos espectros obtidos por DAD. Coluna: Nova
Pak C-18 (150 x 3,9 mm), 4 μm; Fase móvel: água + 0,1% ácido acético glacial, pH 3,5 (A); acetonitrila + 0,1 %
ácido acético glacial (B). Vazão: 1,0 mL min-1. Gradiente: 21% de B por 8 min; 21% até 27% B em 4 min; 27%
de B por 3 min; 27% até 31% B em 5 min; 31% para 40% B em 3 min; 40% até 50% B em 2 min; 50% de B por 5
min; 50% até 21% B em 5 min; 21% B por 3 min. Volume de injeção: 10 μL. Detecção: UV-vis com varredura
espectral de 200 a 400 nm, monitorado em 254 nm. Temperatura da coluna: 35 ºC. (Tese Marcelo Ribani, 2008)
Isoflavonas
por
HPLC-DAD
HPLC - Detectores
UV chromatogram at 270 nm of three sulfa drugs and a plot of UV Spectra
collected from each peak's Apex, Inflection and two offset points, to demonstrate
comparison of spectra collected at various points across the peak.
HPLC - Detectores
Quantificação de HPAs
por HPLC-DAD
2. Detector de Fluorescência
Baseia-se na medida da luz emitida pelas substânciaspreviamente irradiadas com luz UV.
2.1. Aplicação: Na detecção de compostos fluorescentes,(vitaminas (ex. riboflavina), micotoxinas, HPAs, etc) ecompostos derivatizados (ex. aminas).
2.2. Vantagens:
- Muito sensível
- Não é destrutivo
- Permite gradiente
2.3. Desvantagens:
- Poucas substâncias são
naturalmente fluorescentes
HPLC - Detectores
16
2. Detector de Fluorescência
HPLC-FluorescênciaAminoácidos em plasma
HPLC-FD após derivatization pré-coluna com o-phthaldialdehyde (OPA)Coluna: Ultrasphere ODS; Gradiente (THF:metanol: acetato de sódio 0,05 M (pH 5,9) 1:19:80 até metanol:
acetato de sódio 0,05 M (pH 5,9) 4:1); Vazão: 1 mL/min; volume de injeção: 20 µL;
λ Excitação 330 nm — λ Emissão 450 nm
Preparo de amostra (plasma):• Desproteinização com ácido tricloroacético 10% e centrifugação;
• Adição de 100 µL de solução OPA e 300 µL de borato de sódio;
• Adição de padrão interno;
• Após 1 min injetar 20 µL
HPLC - Detectores
One of the most used derivatizating agents
is DnsCl which reacts with either primary
and secondary amino groups,
and even tertiary amines in extreme
reaction conditions, providing very stable
derivatives and combining the unique
feature of being both fluorescence and
detectable in the UV region.
Mechanism of the derivatization
reaction: Derivatization reaction of BAs with
dansyl-chloride
3. Detector de Índice de Refração
Baseia-se na medida da diferença do índice de refração daFM na presença das substâncias. Para aplicações gerais.
3.1. Detecta: Quantidade
3.2. Vantagens:
- Praticamente todas as substâncias são detectáveis
- Não é destrutivo
3.3. Desvantagens:
- Sensibilidade menor que UV
- Sensível a diferenças de T, vazão e pressão da FM
- Não permite fazer gradiente
HPLC - Detectores
3. Detector de Índice de Refração
Esquema de dois detectores de índice de refração
HPLC - Detectores
4. Espalhamento de Luz (Evaporative Light-Scattering Detector - ELSD)
As partículas de uma amostra passam através da cela onde são aquecidas comum feixe de luz incidente e a quantidade de luz espalhada é medida com umafotomultiplicadora. Em alguns equipamentos um gás é usado para concentrar aspartículas na câmara de detecção.
Representação do detector
de espalhamento de luz
destacando as etapas da
detecção
Aplicação principal:
análise de lipídeos
HPLC - Detectores
17
HPLC - Detectores
5. Detector de Massas (LC-MS e LC-MS/MS)
Fornece o registro da separação cromatográfica einformações a respeito da identidade dos analitos.
Os analitos, após separação, são fragmentados no detector permitindo a identificação e quantificação.
5.1. Vantagens:
- Fornece massa molecular dos analitos
- Identifica os fragmentos
5.2. Desvantagens:
- Requer operador experiente
- São caros
HPLC - Detectores
++
Heated nitrogen drying
gas
Dielectric capillary
entrance
Nebulizer (gas
shown in red)
Solvent spray
Electrospray Ions
-4000 V
Evaporation Rayleigh
Limit
Coulomb
Explosion
Evaporation Analyte Ion
API - Electrospray Ionization
100http://www.noble.org/PlantBio/MS/ion_tech_main.html
Electrospray Ionization (ESI)
(Eletronebulização)
Componentes principais de um sistema LC-MS
Ion Optics Detector
Spray Chamber
VL Model
SL Model has one Skimmer
Mass Filter
LC-MS/MS
Compound Mass
1. morphine 286 > 152
2. oxymorphone 302 > 227
3. hydromorphone 286 > 185
4. codeine 300 > 152
5. 6-MAM 328 > 211
6. oxycodone 316 > 240
7. hydrocodone 300 > 199
Total Ion Chromatogram
Multiple reaction monitoring (MRM)
18
LC-MS/MSCarbamate analysis by LC/MS
Column: Ultra Carbamate, 100 x 4.6 mm, 3 µm
Conc.: 100 µg/L each
Mobile Phase: A: 90:10 water:methanol + 10 mM ammonium formate
B: 10:90 acetonitrile:methanol + 10 mM ammonium formate
Gradient: 90:10 A:B to 10:90 A:B from 0-15 min; Flow-rate: 0.25 mL/min
Mode: ESI+
HPLC - Detectores
6. Detectores Eletroquímicos:
6.1. Detector da Constante Dielétrica: Mede as mudanças
na polaridade da FM que passa através da cela.
6.2. Detector Amperométrico: Um potencial
conhecido é aplicado através de um
eletrodo (ex. carbono vítreo), e a
ocorrência de redução ou oxidação de
uma espécie pode ser medida. O
potencial do eletrodo de trabalho e
auxiliar é mantido constante.Geralmente, o trabalho é limitado a uma
classe específica em cada análise.
HPLC - Detectores
6.3. Detector de Condutividade:
Adequado para a detecção de íons em solução;
Baseia-se na medida da condutância (G) das soluções
eletrolíticas dos efluentes da coluna ou supressora. [G = 1/R]
Microcélula termostatizada e sob aplicação de um potencial (V).
A Lei de Ohm [I = (V-Ed)/R] é obedecida e a corrente medida (I)
dependerá do potencial aplicado entre os dois eletrodos.
HPLC - Detectores
HPLC - Quantificação
Resposta do
Detector
HPLC - Quantificação
Obtenção da
curva analítica
Verificação da
Linearidade