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Skript zum Modul MA-CH-BOC 07 „Umwelt- und Radiochemie“ Seminar – Wechselwirkung von Metallen in Biosystemen

Skript zum Masterpraktikum

Modul: Biologie

Wechselwirkung von Metallen in

Biosystemen

Stand: Sommersemester 2011

Fakultät Mathematik/Naturwissenschaften Fachbereich Chemie/Lebensmittelchemie

Professur für Radiochemie


Schwermetalle in der Umwelt

Als Schwermetalle werden Metalle mit einer höheren Dichte als

3,8 g/cm3 bezeichnet. Einige von ihnen sind für den Menschen in

geringen Mengen lebensnotwendig. Zu diesen essentiellen

Schwermetallen zählen die sogenannten Spurenelemente Eisen, Kupfer,

Mangan, Molybdän und Zink. Andere Schwermetalle haben bei

Stoffwechselprozessen keine erkennbare Funktion und sind bereits in

geringen Mengen giftig. Dazu gehören beispielsweise Chrom, Cadmium,

Blei, Quecksilber und Arsen.

Tabelle 1: Toxische Wirkung und essentielle Funktion ausgewählter

Schwermetalle

Schwermetall Toxische Wirkung Essentielle Funktion

Blei gelöstes Blei, Bleiverbindungen,

Bleistäube, Organobleiverbindungen

• kumulative Wirkung (Anreicherung in

Knochen, Zähnen und im Gehirn)

• beeinträchtigt das Nervensystem und

die Immunabwehr

keine

Kupfer • für viele Mikroorganismen bereits in

geringen Konzentrationen toxisch

• verschluckte Kupferverbindungen

verursachen beim Menschen Schwäche,

Erbrechen und Entzündungen im

Verdauungstrakt

Bei Säugern in

verschiedenen Kupfer-

Proteinen z.B.

• für Sauerstoff-

transport

• für Entgiftung

Chrom Cr(VI)

• stark mutagen und cancerogen

• Cr(III) Chromodulin

(wichtiger Komplex im

Kohlenhydrat-, Fett-

und

Proteinstoffwechsel)

Nickel • Nickelmetall = Überempfindlichkeit

• Ni(CO)4 = starkes Inhalationsgift

• Nickelstaub = karzinogen

• Für Methanogenese

methanogener Bakterien

• Ureasen von Bakterien

und Pflanzen

Cadmium • bereits in geringen Konzentrationen

giftig

• krebserzeugend, erbgut- und

fruchtschädigend

• Für die marine

Kieselalge

Thalassiosira

weissflogii

Cadmiumenzym

Metalle kommen auf der Erde sowohl im Wasser als auch im Boden und

sogar in der Luft vor. Am häufigsten sind sie als Erze, fest im

Felsgestein der Erdkruste eingebunden, aufzufinden. Durch natürliche

oder anthropogene Freisetzung können diese Schwermetalle auch ins


Grundwasser und somit in den Nahrungs- und Nährstoffkreislauf

gelangen. Die natürliche Freisetzung von Schwermetallen geschieht

unter anderem durch vulkanische Eruptionen, Verwitterung und

Erosion.

Da viele Metalle wichtige Werkstoffe für den Menschen darstellen und

die moderne Welt auf die technische Nutzung von Metallen nicht mehr

verzichten kann, müssen mehr und mehr Metallvorkommen abgebaut

werden. Durch den Wunsch des Menschen sich die Metalle nutzbar zu

machen, werden immer mehr auch giftige Metalle durch Tage- und

Bergbau in die Umwelt freigesetzt und mobilisiert. Auch während der

Verarbeitung werden durch Abwässer und Abfallstoffe stets Metalle in

unsere Umwelt eingebracht. Dadurch können Metallkonzentrationen zum

Teil so stark erhöht werden, dass sie für die Pflanzen- und Tierwelt

im toxischen Bereich liegen.

Wasserpflanzen & Algen

Bakterien

Bakterien

Wasserpflanzen & Algen

BakterienBakterien

BakterienBakterien

Abb. 1: Eintrag von Schwermetallen in den Nahrungs- und Nährstoffkreislauf.

Schwermetalle können leicht über den Nahrungspfad aufgenommen werden

(Abb. 1). Viele von ihnen werden im Körper schlecht abgebaut oder

reichern sich in den verschiedensten Organen an. Einige Metalle

blockieren sogar biochemische Abläufe im Körper aufgrund ihrer

Ähnlichkeit zu essentiellen Elementen. Eine klare Abgrenzung

zwischen nützlichen und schädlichen Metallen ist nicht immer

eindeutig möglich. Der jedem Chemiker bekannte Satz: „Dosis sola

facit venenum – die Dosis allein macht das Gift“ (Paracelsus 1493-


1541) gilt in besonderem Maße bei der Betrachtung der Schadwirkung

von Schwermetallen. Einige Schwermetalle sind durchaus von

essentiellem Nutzen, wogegen andere als nichtessentiell gelten

(siehe auch Tabelle 1). Essentielle Schwermetalle können bei einer

zu geringen (Mangel) oder zu hohen Aufnahme (Vergiftung) negative

Auswirkungen auf den Organismus haben, wobei nichtessentielle

Schwermetalle schon in sehr geringen Konzentrationen schädigend

wirken (Abb. 2).

Abb. 2: Schematische Darstellung der physiologischen Wirkung von

Schwermetallen.

Darüber hinaus ist die Bioverfügbarkeit von Schwermetallen und somit

deren Toxizität stark abhängig von der vorliegenden chemischen Form.

Bestes Beispiel ist hier das Quecksilber:

metallisch

oral aufgenommen = ungiftig

einatmen der flüchtigen Dämpfe = chronische Vergiftungen

ionisch

Hg (I) z.B. Hg2Cl2 = gesundheitsschädigend,

LD50 (oral, Ratte) = 210 mg/kg

Hg (II) z.B. HgCl2 = sehr toxisch, LD50 (oral, Ratte) = 1 mg/kg

Organoquecksilber Verbindungen extrem toxisch

Uran in der Umwelt

Neben den bisher aufgezeigten Schwermetallen, ist die Freisetzung

radioaktiver Schwermetalle besonders problematisch, da sie neben

ihrer chemotoxischen Wirkung auch radiotoxisch auf Mensch und Tier

wirken. Ein Beispiel für ein radioaktives Schwermetall ist das Uran.

Uran kommt in Uranmineralen wie z.B. Uraninit bzw. Pechblende

(Uranoxid), Autunit (Uranylphosphat), Boltwoodit (Uransilikat),

Coffinit (Uransilikat), Carnotit (Uranvanadat), Brannerit

(Urantitanat) vor (Abb. 3).


Abb. 3: Beispiele für verschiedene Uranminerale (www.geo.tu-freiberg.de)

Der Abbau von Uranmineralen erfolgt hauptsächlich für die

Kernenergiegewinnung und zur Herstellung nuklearer Waffen, sowie von

urangemantelten Geschossen. Zum Teil findet sich Uran auch in

Industrieprodukten, wie Düngemitteln und Zement wieder. Neben dem

natürlichen Eintrag von Uran in die Natur, wie z.B. durch

Quellwasser (Problem der Mineralwasserbelastung), besteht

insbesondere durch Sicker- und Flutungswässer von Uran-Halden und –

Gruben, sowie durch die Verwendung urangemangelter Munition ein

deutlicher anthrophogener Uraneintrag in die Umwelt.

Das Gefährdungspotential für den Menschen beruht hauptsächlich auf

den chemischen Eigenschaften des Urans und weniger auf dessen

Radioaktivität. Die Aufnahme von Uran erfolgt nahezu ausschließlich

über die Nahrung und das Trinkwasser und beträgt täglich 1,5 –

2,6 µg. Davon werden allerdings mehr als 90% innerhalb der ersten

24 h über den Urin wieder ausgeschieden. In die Nahrungskette

gelangt es zunächst durch die Aufnahme und Anreicherung in

verschiedenen Pflanzen. Mögliche Folgen einer dauerhaft hohen Uran-

Exposition für den Menschen sind vor allem Nierenschäden,

Entwicklungsstörungen, Schädigungen des Erbgutes und ein

vermindertes Knochenwachstum. Die Uranminerale bergen außerdem neben

ihrer eigenen Toxizität die Gefahr der gasförmigen Alphastrahler

(z.B. Radon-222), die als ihre Zerfallsprodukte entstehen können.

Diese Gase können schwere gesundheitliche Schäden bei der Inhalation

verursachen und gelangen häufig unbemerkt in Wohnhäuser, z.B. über

Kellerräume beim Bau auf uranmineralhaltigen Böden.

Uran tritt in den Wertigkeitsstufen II, III, IV, V und VI auf, wobei

in der Natur die vier- und sechswertigen Verbindungen überwiegen.

Neben vielfältigen Wechselwirkungen mit anorganischen Komponenten

der Geosphäre, spielen ubiquitär verbreitete Mikroorganismen, Algen

und Pflanzen eine entscheidende Rolle bei der Mobilisierung bzw.

Immobilisierung dieses Radionuklids.

Pechblende Autunit Boltwoodit


Abb. 5: Aufbau einer prokaryotischen

Zelle

Zellwand

Zytoplasma-

membran

Plasmid

DNA

Chromosomale

DNA

Ribosomen

Zytoplasma

Flagellum

Zellwand

Zytoplasma-

membran

Plasmid

DNA

Chromosomale

DNA

Ribosomen

Zytoplasma

Flagellum

Abb. 6: Anordnung von Flagellen auf

Bakterien

Bakterien

Bakterien sind mikroskopisch kleine Organismen ohne echten Zellkern.

Zusammen mit den Archaeen werden sie deshalb als Prokaryoten

bezeichnet. Bakterien bilden neben Eukaryoten und Archaeen eine der

drei Domänen des Lebens, in die alle Organismen eingeteilt werden

(Abb. 4).

Abb. 4: Phylogenetischer Stammbaum, (*Last Universal Common Ancestor)

Wichtige Charakteristika von Bakterien (Abb. 5)

Einzeller

Durchschnittliche Größe 0,5 bis 2 μm

Kein Cytoskelett

Kein Zellkern

DNA ist ringförmiges Fadenmolekül

Extrachromosomales Erbmaterial

(Plasmide)

Keine oder nur geringe interne

Gliederung (Organellen,

Kompartimente)

Vermehrung durch Teilung, kurze

Generationszeiten (E. coli: 20

Minuten)

Bakterien können sich mit Hilfe von

Flagellen fortbewegen oder auf

Oberflächen anheften. Bakterienarten

unterscheiden sich in der Anzahl und

LUCA*

Begeißelung

peritrich lophotrich monotrich

Begeißelung

peritrich lophotrich monotrichperitrich lophotrich monotrich


Anordnung der Flagellen auf der Zelloberfläche (Abb.6).Bakterien

lassen sich aufgrund ihrer Gestalt in drei Grundformen unterteilen

(Abb.7-links). Dabei werden kugelige Bakterien als Kokken,

längliche, zylindrische Bakterien als Stäbchenbakterien und

gekrümmte Stäbchen bei kommaförmigen Zellen als Vibrionen und bei

schraubenartigen Zellen als Spirillen oder Spirochäten bezeichnet.

Neben den Grundformen gibt es noch keulenförmige Zellen bzw.

Bakterien, die filamentöse, verzweigte Gebilde ähnlich den

Pilzmycelien formen (Streptomyceten). Die Bakterienzellen können

nach der Zellteilung noch zusammen bleiben, wobei typische Formen

aus mehreren Zellen entstehen (Doppelkokken = Diplokokken,

Kettenkokken = Streptokokken, Haufenkokken = Staphylokokken).

Wenn Bakterien auf festen Oberflächen wachsen und sich teilen,

bilden sie Kolonien, deren Morphologie charakteristisch für die

jeweilige Spezies ist. Eine genaue Beschreibung einer isolierten

Kolonie kann eine große Hilfe für die Identifikation von

Mikroorganismen sein. Zur Charakterisierung der Kolonieform wurden

spezielle Umschreibungen der Koloniemerkmale, wie Form, Rand, Höhe,

Größe und Farbe eingeführt (Abb.7-rechts).

ganzrandig wellig filamentös gelappt gezackt geringelt

flach erhöht konvex polsterförmig gebuckelt

punktförmig rund filamentös unregelmäßig wurzelartig spindelförmig

Form

Rand

Höhe


flach erhöht konvex polsterförmig gebuckelt



flach erhöht konvex polsterförmig gebuckeltflach erhöht konvex polsterförmig gebuckelt


Form

Rand

Höhe

Abb. 7: Bakterielle Zellformen (links) und Formen von Bakterienkolonien

(rechts).

Die Zellwand ist die natürliche Abgrenzung eines jeden Bakteriums

zur Umwelt und besitzt eine Vielzahl von Funktionen (Stabilität,

Schutz, Stofftransport). Dadurch ist ihre Struktur und Permeabilität

von entscheidender Bedeutung für die Toxizität von Schwermetallen.

Nach dem Aufbau der Zellwand werden Bakterien in Gram-positive und

Gram-negative Bakterien unterteilt. Beide haben eine

Cytoplasmamembran, auf die die Zellwand aufgelagert ist. Bei Gram-

positiven besteht diese aus vielen Schichten des sogenannten Mureins

(Peptidoglycan), in welches (Lipo)teichonsäuren und Proteine

eingelagert sind (Abb. 8-links). Bei Gram-negativen liegt der

Cytoplasmamembran (innere Membran) nur eine dünne

Peptidoglykanschicht auf, auf der eine zweite, äußere Zellmembran,

die sich aber in Chemie und Aufbau von der Cytoplasmamembran

unterscheidet, aufgelagert ist. Diese äußere Membran durchziehen

Proteine, wie Porine, und auf der Außenseite sind Lipopolysaccharide

http://de.wikipedia.org/wiki/Spirillen

http://de.wikipedia.org/wiki/Diplokokken

http://de.wikipedia.org/wiki/Staphylokokken


HHäände:nde:von 100von 100--10001000

Bakterien/cmBakterien/cm22

AchselhAchselhööhlehle11--10 Mio.10 Mio.


StuhlStuhlca. 100 Mio.ca. 100 Mio.

Bakterien/gBakterien/g

FusssohleFusssohle100.000100.000--1 Mio.1 Mio.


StirnStirncon 10.000 bis con 10.000 bis

100.000 Bakterien/cm100.000 Bakterien/cm22

HaarwurzelnHaarwurzelnca. 1 Mio.ca. 1 Mio.


NasensekretNasensekretca. 10 Mio.ca. 10 Mio.


SpeichelSpeichelca. 100 Mio.ca. 100 Mio.






















































(LPS) aufgelagert, wodurch sie auch als Lipopolysaccharidschicht

bezeichnet wird (Abb. 8-rechts).

Abb. 8: Aufbau der Zellwand von Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien

Vorkommen von Bakterien

Bakterien sind ubiquitär verbreitet. Sie besiedeln alle Lebensräume,

in denen höhere Lebewesen vorkommen. Zusätzlich sind viele Bakterien

in der Lage, auch an Standorten

mit extremen Lebensbedingungen

zu überleben.

Bakterien besiedeln auch den

menschlichen Körper (Abb. 9). Zu

jedem Menschen gehören etwa 10

Billionen (1013) Bakterien. Das

ist etwa 10-mal soviel, wie der

Mensch selbst Körperzellen hat.

Die meisten Bakterien beherbergt

der Dickdarm. Viele Bakterien im

und am menschlichen Körper sind

weder nützlich noch schädlich.

Andere, wie etwa Pneumokokken in

den Atemwegen, können gefährlich

werden, wenn sie sich übermäßig

vermehren (Lungenentzündung).

Doch solange sie von anderen

Bakterien in Schach gehalten

werden, stellen sie keine Gefahr

dar. Der Mensch nutzt einige Stoffwechselprodukte der

Mikroorganismen: Darmbakterien liefern beispielsweise das

lebenswichtige Vitamin K. Zudem produzieren sie Säuren und so

genannte Bacteriocine, die neu eingeschleppte Bakterien oder auch

potenziell krankheitserregende Pilze abtöten oder deren Wachstum

hemmen. Selbstverständlich tragen Darmbakterien auch einen

erheblichen Teil zur Nahrungsmittelverwertung des Menschen bei.

e

Abb. 9: Vorkommen von Bakterien am/im

menschlichen Körper


Wechselwirkungen von Bakterien mit Uran und anderen Schwermetallen

Mikroorganismen sind aufgrund ihres vielseitigen Metabolismus in der

Lage, auf verschiedenste Art und Weise mit Uran und anderen

Schwermetallen in ihrer Umgebung zu interagieren. Dabei beeinflussen

sie die Mobilität und Stabilität der Metalle sowohl durch direkte,

enzymatische, als auch indirekte, nicht-enzymatische Reaktionen. Die

wichtigsten Wechselwirkung von mikrobiellen und pflanzlichen Zellen

mit Uran sowie anderer Schwermetalle sind: die Biosorption, die

Biotransformation, die Biomineralisierung, die intrazelluläre

Aufnahme und die Chelation (Abb. 10).

Unter Biosorption versteht man die Anlagerung von (Schwer)metallen

und Radionukliden an Biomasse oder Biomaterialien. Die Metallbindung

erfolgt an reaktiven Gruppen wie Carboxyl-, Amin-, Hydroxyl-,

Phosphat- und Sulfhydryl-Resten verschiedener Zellwandkomponenten.

Biotransformation ist die durch Mikroorganismen katalysierte

Reduktion bzw. Oxidation von Metallen. Die Oxidationsstufe von Uran

sowie anderer Schwermetalle und Radionuklide bestimmt deren

Löslichkeit, Mobilität und Bioverfügbarkeit.

Unter Biomineralisierung versteht man die Bildung von unlöslichen

Metallpräzipitaten, wie Phosphate, Carbonate und Hydroxide, mit

Hilfe enzymatisch gebildeter Liganden.

ChelationMobilisierung durch z.B.

Siderophore

Biotransformation(nur Mikroorganismen)

Reduktion/Oxidation von Aktiniden

→ Beeinflussung der Löslichkeit

UO22+ UO2

BioakkumulationAufnahme in die Zelle

UO22+

UO22+

2L-

UO

22+

BiosorptionChemische Sorption durch

Komplexierung mit zellulären

Liganden (L)

BiomineralisierungBildung unlöslicher Präzipitate mit

anorganischen Liganden

HPO42- + UO2

2+ UO2HPO4

CO32- + UO2

2+ UO2CO3

2OH- + UO22+ UO2(OH)2

ChelationMobilisierung durch z.B.

Siderophore

Biotransformation(nur Mikroorganismen)

Reduktion/Oxidation von Aktiniden

→ Beeinflussung der Löslichkeit

UO22+UO22+ UO2UO2


UO22+


UO22+UO22+

UO22+

UO22+

2L-

UO

22+



Liganden (L)

2L-

UO

22+

UO

22+



Liganden (L)

BiomineralisierungBildung unlöslicher Präzipitate mit

anorganischen Liganden

HPO42- + UO2

2+ UO2HPO4

CO32- + UO2

2+ UO2CO3

2OH- + UO22+ UO2(OH)2

Abb. 10: Mechanismen der Wechselwirkungen von Schwermetallen am Beispiel

von Uran mit mikrobiellen und pflanzlichen Zellen

d

e


Eine Sonderform der Mobilisierung kann durch chelatierende Agenzien,

wie Siderophoren erfolgen. Siderophoren werden bei Eisenmangel

gebildet und dienen normalerweise der Bindung und dem Transport von

Fe(III). Allerdings interagieren sie ebenfalls über funktionelle

Gruppen, wie Catechol-, Hydroxamat- oder Carboxylgruppen sehr

effektiv mit verschiedenen Metallen und Radionukliden und erhöhen

dadurch deren Mobilität und Bioverfügbarkeit.

Stressantwort von Bakterien

Schwermetalle gehören für alle Lebewesen zu den potentiellen

Stressoren. Wie bereits erwähnt führen dabei hohe Konzentrationen

zur Toxizität. Alle Umweltbedingungen, die nicht dem

Wachstumsoptimum der Bakterien entsprechen, führen in der Zelle zu

Veränderungen die unter „Bakterieller Stressantwort“ zusammengefasst

werden. Da Bakterien als Einzeller direkt allen Umwelteinflüssen

ausgesetzt sind, ist Stress nicht ungewöhnlich, aber oft von sehr

unterschiedlicher Natur. Weitere Stressfaktoren für die Zellen sind

beispielsweise:

Limitation der C, N, S,…-Quelle(n)

Hohe Ionenstärke oder Trockenheit

Zu niedriger oder hoher pH-Wert

Hohe Temperaturen

Welche Faktoren Stress für ein Bakterium darstellen, ist ganz vom

Wachstumsoptimum des jeweiligen Bakterienstammes abhängig.

Stressfaktoren wie Hitze oder hohe Schwermetallkonzentrationen

führen oft zu Fehlfaltung von Proteinen. Diese Proteine verlieren

dabei ihre Funktion und können darüber hinaus in der Zelle

agglomerieren, was im Extremfall zum Zelltod führen kann. Eine

Agglomeration erfolgt in der Regel dann, wenn hydrophobe Reste, die

normalerweise im Inneren des Proteins zu finden sind, durch die

Strukturänderung an die Außenseite des Proteins gelangen.

Zelluläre Stressantwort

Die Erkennung von Stress erfolgt über spezifische und unspezifische

Signalwege. Verallgemeinert lassen sich alle Signalwege in folgende

Teile gliedern:

Erkennung durch einen Rezeptor

Weiterleitung über eine Signalkaskade

Veränderung der Proteinexpression


Die Veränderung der Proteinexpression leitet Maßnahmen zur

Stressbewältigung ein, die sehr unterschiedlich sein können. Hier

einige Beispiele:

Chaperone (spezielle Proteine) helfen andere Proteine richtig

zu falten

Metallakzeptoren binden Metallionen in der Zelle z.B. Proteine

mit Thiolgruppen

Aktiver Transport aus der Zelle, z.B. direkter Ionen Efflux

Oberflächenproteine binden Metallionen und verhindern den

Eintritt in die Zelle

Spezifische Signalwege beinhalten am Anfang der Signalkette einen

Rezeptor für den jeweiligen Faktor. Auf einen allgemeinen Signalweg

soll hier näher eingegangen werden. Die Abbildung 11 zeigt die

allgemeine (RpoE abhängige) Stressantwort, die so in vielen Gram

negativen Bakterien vorkommt. Dieser Signalweg beginnt mit der

Erkennung von denaturierten Proteinen durch RseB. RseB ist

normalerweise mit einem Komplex in der inneren Membran verankert.

Durch die Bindung an denaturierte Proteine löst es sich vom Komplex,

wodurch die Transmembrankomponente RseA proteolytisch abgebaut wird.

Im Cytoplasma ist RpoE, ein Sigmafaktor, am Komplex assoziiert.

Durch den Abbau von RseA wird RpoE freigesetzt. RpoE erkennt die

Promotorregion spezieller Gene, die für eine allgemeine

Stressantwort notwendig sind. RpoE initiiert durch die Anlagerung an

die DNA die Bildung des Transkriptionskomplexes. Die RNA-Polymerase

lagert sich an den Transkriptionskomplex und beginnt mit der

Transkription. Damit beginnt die Expression von Proteinen, die zur

Stressbewältigung dienen.

Abb. 11:

Schematische

Darstellung

der zellulären

Stressantwort

in Gram-

negativen

Bakterien.


Verwendete Bakterienstämme

Die im Praktikum verwendeten Bakterienstämme gehören den Gattungen

Pseudomonas, Escherichia, Sporosarcina und Bacillus an. Dabei

handelt es sich zum Einen um Gram-negative Bakterienstämme

(Pseudomonas und Escherichia), zum Anderen um Gram-positive

sporenformende Bakterien (Sporosarcina und Bacillus). Pseudomonaden

sind ubiquitär in der Natur verbreitet. Sie sind typische Bewohner

von Böden und Gewässern. Auch Sporosarcinen und Bacilli sind in

solchen Habitaten zu finden, allerdings sind Sporosarcinen weit

seltener und in geringerer Anzahl vorhanden. Sporosarcinen bilden

ebenso wie Bacilli bei schlechten Wachstumsbedingungen Endosporen

aus, welche robuste Überdauerungsformen darstellen. In Sporen ist

der Metabolismus auf ein Minimum reduziert, so dass diese weder

Wasser noch Nährstoffe noch Sauerstoff benötigen. Deswegen können

sie sehr lange unter schlechten Bedingungen überleben. Aus diesen

Sporen bilden sich bei verbesserten Wachstumsbedingungen neue

Zellen. Der verwendete Stamm der Gattung Eschericha – Escherichia

coli – ist dagegen ein typischer Bewohner des Darmes von Mensch und

Tier. Daher gilt der Nachweis dieses Bakterium in der Außenwelt,

insbesondere in Wasser und in Lebensmitteln, als Indikator für

fäkale Verunreinigungen.

Alle im Praktikum verwendeten Stämme sind nicht pathogen, neutrophil

(Wachstumsoptimum bei pH~7), mesophil (Temperaturoptimum ~30 °C) und

besitzen einen aeroben Stoffwechsel, d.h. sie benötigen für ihr

Wachstum Sauerstoff (Aerobier) bzw. tolerieren diesen (fakultative

Anaerobier).


Abb. 13: Sterilwerkbank

Mikrobiologisches Arbeiten

Allgemeines

Arbeiten in einem mikrobiologischen Labor erfordern die üblichen

Sicherheitsvorkehrungen, wie sie von chemischen Laboratorien bekannt

sind.

tragen von Laborkittel, Handschuhe, Schutzbrille und festem

Schuhwerk (keine Sandalen oder ähnliches)

tragen von langer Beinbekleidung, auch wenn es noch so warm ist

im Labor sind Essen, Trinken, Rauchen, Schminken, Aufbewahrung

von Nahrungsmitteln, Tabakwaren, und Kosmetika verboten

den Anweisungen der Praktikumsassistenten ist Folge zu leisten

Abfälle werden gesammelt und nach Beenden der Arbeiten

autoklaviert

Besonderheiten beim mikrobiologischen Arbeiten

Mikrobiologisches Arbeiten setzt die Anwendung

steriler Techniken voraus. Verwendete Geräte,

Arbeitsmaterialien und Arbeitsoberflächen müssen von

lebenden Mikroorganismen oder deren Ruhestadien

befreit werden. Die dazu verwendeten Verfahren

werden Sterilisation oder Entkeimung genannt. Nur

durch die Verwendung von sterilen Arbeitsmaterialien

kann eine ungewollte

Kontamination der Nährlösungen

und -platten mit fremden

Mikroorganismen vermieden

werden. Zur Sterilisation

werden unterschiedliche

Techniken eingesetzt. Kolben,

Flaschen und viele Lösungen

lassen sich durch feuchte

Hitze im Autoklaven (Abb. 12) bei 121°C und

1 bar Überdruck für 20 min sterilisieren.

Kleine Geräte wie Spatel oder Pinzetten werden

Abb. 12: Autoklav


Abb. 14: Ausglühen der Impföse

in 70%igen Ethanol getaucht und anschließend

in der Brennerflamme abgeflammt, Impfösen werden ausgeglüht.

Hitzeempfindliche Lösungen können durch Sterilfiltration von Keimen

befreit werden. Es ist ebenfalls darauf zu achten, einen Eintrag von

Kontaminationen über die Hände zu vermeiden. Daher ist es beim

mikrobiologischen Arbeiten unerlässlich, vor und nach dem sterilen

Arbeiten, die Hände zu waschen und zu desinfizieren. Zusätzlich

sollten stets Handschuhe getragen werden.

Weiterhin sollten sämtliche Arbeiten, die sterile Bedingungen

erfordern, unter einer sogenannten Sterilwerkbank (Abb. 13)

durchgeführt werden. Vor Beginn und nach Beenden der Arbeiten werden

die Arbeitsoberflächen (z.B. Oberfläche in der Sterilwerkbank)

desinfiziert. Dies kann unter anderem durch das Einsprühen und

Abwischen mit 70%igen Ethanol geschehen. Bei Flächen, die größer als

1 m² sind, werden spezielle Desinfektionsmittel verwendet, die

schwerer entflammbar sind. Da unsere Labore auch für gentechnische

Arbeiten der Stufe S1 (nicht humanpathogen) zugelassen sind, gelten

darüber hinaus spezielle Hygieneanweisungen (siehe Anhang).

In mikrobiologischen Laboratorien werden einige Arbeiten wiederholt

und routinemäßig durchgeführt. Zu diesen Arbeiten gehören unter

anderen:

Das Herstellen von Agarplatten und Nährmedien

Das Animpfen von Nährmedien

Das Ernten von Zellen

Das Ausplattieren von Kulturen auf Agarplatten

Die Wichtigsten dieser Arbeiten, welche auch für den entsprechenden

Praktikumsversuch benötigt werden, werden hier kurz erläutert.

Handhabung Impföse und Ausstreichen von Kulturen auf Agarplatten

Sterilisation der Drahtspitze einer

Impföse durch Ausglühen, d. h. schräg von

oben in die Flamme eines Gasbrenners

halten, bis der Draht glüht (3 mal

wiederholen) siehe Abbildung 14

nach dem Abkühlen, die sterile Öse in das

Kulturmedium tauchen

durch die Oberflächenspannung bildet sich

in der Öse ein Flüssigkeitsfilm, der

genügend Zellen enthält, welche dann

entsprechend auf einer Agarplatte, ohne

zu sehr aufzudrücken, ausgestrichen

werden

anschließend die Impföse durch Ausglühen

erneut sterilisieren


Sterilisation von Lösungen

Hergestellte Lösungen werden in einem Erlenmeyerkolben gegeben

und mit einem Wattestopfen verschlossen.

Der Stopfen wird noch mit Aluminiumfolie abgedeckt und mit etwas

Autoklavier-indikatorband versehen.

Anschließend werden die Kolben bei 121 °C für 20 min

dampfsterilisiert.

Bei Agarlösungen sollten die Kolben bis zum Gießen der Platten

nach dem Autoklavieren im 70 °C-Brutschrank aufbewahrt werden,

um ein vorzeitiges Erstarren des Agars zu verhindern.

Ansetzen von Agarplatten

Agar in Erlenmeyerkolben einwiegen und mit destilliertem Wasser

vermischen

Kolben mit Sterilstopfen verschließen, mit Aluminiumfolie

abdecken und einem Stück Autoklavierband versehen

Dampfsterilisation bei 121 °C für 20 min; anschließend

Aufbewahrung der Kolben im 70 °C-Brutschrank bis zum Gießen der

Platten

Der warmen Agarlösung unter leichtem Rühren und sterilen

Bedingungen entsprechende (je nach Art des herzustellenden

Mediums) sterile Nährbestandteile

zugeben.

Noch warme Lösung in sterile

Petrischalen ausgießen, so dass etwa

eine Agardicke von 0,5 cm entsteht

(Abb. 15)

Platten zum Abkühlen leicht geöffnet

in Brennerflammennähe und unter der

Sterilbox stehen lassen.

Wenn die Agarplatten fest geworden

sind, werden die Platten abgedeckt und am Boden mit der

Bezeichnung des Medium beschriftet.

Abb. 15: Gießen von Agarplatten


Ausplattieren von Kulturen

Entnehmen von 50 µl oder 100 µl einer

Bakterienkultur und Pipettieren dieses

Volumens auf die Mitte einer

Agarplatte.

Abgeflammten Drigalskispatel zunächst

zum Erkalten auf einen keimfreien Teil

der Agarplatte halten

gleichmäßiges Verteilen der aufgetragen

Flüssigkeitsmenge auf der Agar-

oberfläche (Abb. 16)

Erneutes Abflammen des Drigalskispatels

und Abstellen im Ständer

Bedienung des Lichtmikroskops

Das Ziel der Mikroskopie ist die Beobachtung und Charakterisierung

der eingesetzten Bakterienstämme.

Aufbringen von 5 µl verdünnter

Bakteriensuspension (OD600 = 0,5) auf einen

Objektträger and Abdecken der Probe mit

einem Deckgläschen (Abb. 17)

Vergrößerung der Bakterien mit dem

inversen Lichtmikroskop Zeiss Axiovert

S 100 (Abb. 18)

Untersuchung der Probe zunächst mit

dem 40x Objektiv bei 400facher

Vergrößerung der Zellen

Dazu die Probe auf dem Objekttisch

einspannen, das 40x Objektiv an den

Objekttisch heranbewegen und die Probe

scharf stellen (Phasenkontrast (PH) 2

beachten)

Betrachtung der Bakterien in der 1000

fachen Vergrößerung mit dem 100 x

Objektiv. Dazu den Objektivwechsler auf

die Position des 100 x Objektivs bewegen

Abb. 16: Handhabung des

Drigalskispatels beim

Ausplattieren

Abb. 18: Lichtmikroskop Zeiss

Axiovert S 100

Abb. 17: Mikroskopisches

Präparat


und auf das 100 x Objektiv einen

kleinen Tropfen Immersionsöl

aufbringen.

Den Objektträger nach oben gedreht die Probe auf dem

Objekttisch positionieren, das Objektiv langsam an die Probe

heranbewegen und scharf stellen.

Beobachtung der Bakterien über die Kamera auf dem Bildschirm und

Aufnahme jeder Bakterienprobe

Kultivierung von Bakterien

Unter der Kultivierung von Mikroorganismen versteht man deren

gezielte Vermehrung durch die Verwendung definierter Kulturmedien

und die Schaffung optimaler Wachstumsbedingungen (Temperatur, pH-

Wert, O2-Zufuhr). Dabei unterscheidet man zwischen Flüssigkulturen

(Bioreaktor oder Schüttelkolben) und festen Nährmedien (Agarplatten)

(Abb. 19).

Im Versuch erhalten Sie frisch gewachsene Flüssigkulturen in

Nutrient Broth Medium. Dieses Komplexmedium enthält Hefeextrakt und

peptisch verdautes Fleischprotein (Pepton) Die Zusammensetzung

dieser Extrakte ist nicht genau definiert. Sie liefern aber alle

wichtigen Wachstumsfaktoren, wie Aminosäuren, Mineralsalze, sowie

Kohlenstoff und Stickstoffquellen.

Abb.19: Mit Bakterien bewachsene Schüttelkolben (links); Agarplatten

(rechts)

Im Gegensatz dazu wird für die im Versuch verwendeten Agarplatten

ein spezielles Medium verwendet, das sehr wenig Phosphat enthält.

Phosphat ist ein wichtiger Nährstoff für Bakterien und ein Baustein

vieler organischer Verbindungen. Gleichzeitig führt Phosphat aber

auch zu einer Komplexierung der gelösten Schwermetalle. Bei einer zu

hohen Phosphatkonzentration kann es daher zur Ausfällung

anorganischer Phosphatkomplexe kommen, welche nicht mehr

bioverfügbar sind.


Wachstum von Bakterien (Abb. 20)

Die Vermehrung der Bakterien erfolgt asexuell durch Zellteilung. Das

kann durch Querteilung, Knospung oder Sporenbildung geschehen.

Bringt man Bakterien aus einer über Nacht gewachsenen Kultur in eine

frische Nährlösung, so befinden diese sich zunächst in der lag-

Phase. Während dieser Phase adaptieren sich die Bakterien an die

Wachstumsbedingungen. Dabei werden Enzyme synthetisiert, die zur

Verwertung der verfügbaren Nährstoffe benötigt werden. In der

darauffolgenden exponentialen Phase (log Phase) kommt es zur

exponentiellen Vermehrung der Bakterien. Bei logarithmischer

Darstellung der Zellzahl über der Zeit, entspricht der in dieser

Phase lineare Anstieg, der spezifischen Wachstumsrate des

Organismus, welche der Anzahl der Teilungen pro Zelle und

Zeiteinheit entspricht. Infolge des schnellen Wachstums kommt es zur

Reduktion der Nährstoffe und gleichzeitig einer Anreicherung mit

(z.T. giftigen) Stoffwechselprodukten im Medium. Dadurch treten die

Bakterien in die stationäre Phase ein, in der es zu einem

Gleichgewicht zwischen Vermehrung und Tod der Bakterien kommt. Die

weitere Verschlechterung der Bedingungen führt zum Absterben der

Kultur (Absterbephase).

Abb. 20: Schematische Darstellung einer bakteriellen Wachstumskurve.


Metalltoleranztest

Das Wachstum auf Agarplatten dient im Praktikumsversuch der

Quantifizierung der koloniebildenden Einheiten (CFU = ‘colony

forming units’).

Bringt man die einzelnen Bakterien auf einen festen Nährboden und

bebrütet diese Platten ein bis zwei Tage bei ca. 30 °C, so vermehren

sich die einzelnen Bakterien zu sichtbaren Bakterienkolonien. Die

Anzahl der gewachsenen Kolonien entspricht dabei der Anzahl der auf

den Nährboden aufgebrachten und vermehrungsfähigen Bakterien. Im

Versuch wird immer die gleiche Anzahl Bakterien auf Platten mit

unterschiedlichen Schwermetallkonzentrationen aufgetragen. Ein

Unterschied in der Anzahl der gewachsenen Kolonien ist daher allein

auf die wachstumshemmende Wirkung der Schwermetalle zurückzuführen.

In den frisch gewachsenen Übernachtkulturen kann ein Bakterientiter,

d.h. die Anzahl der Bakterien pro ml Kulturmedium, von bis zu 1010

erreicht werden. Da eine solche Bakterienanzahl keine

Einzelkolonien, sondern einen Bakterienrasen auf der Platte bilden

würde, muss die Zellsuspension deutlich verdünnt werden. Für ein

gutes Auszählen sollte ein Wert von 30 bis 300 Kolonien pro Platte

angestrebt werden. Im Praktikumsversuch werden die gewaschenen

Zellen bis zu 1:10.000 bzw. bis 1:100.000 bzw. 1:1.000.000 verdünnt

und von diesen Suspensionen werden je 50 µl auf die Agarplatten

aufgetragen (Abb. 21).

Abb. 21: Schematische Darstellung zur Verdünnung einer Bakteriensuspension

Geeignete Verdünnungsstufen


Anhand der Anzahl der gewachsenen Kolonien können die minimale

Hemmstoffkonzentration (MHK50) und die minimale bakterizide

Konzentration (MBK) ermittelt werden. Die MHK50 entspricht dabei der

Konzentration des Schwermetalls, die das Wachstum von 50 % der

Kolonien hemmt. Die MBK ist die niedrigste Konzentration, bei der

das Wachstum der Bakterienstämme auf der Agarplatte vollständig

gehemmt wird und makroskopisch nicht mehr nachzuweisen ist.

Lochtest

Der Lochtest ist ein weiteres Verfahren zur

Tolleranzbestimmung von Mikroorganismen.

Zumeist findet er Verwendung bei der

Empfindlichkeitsprüfung von Bakteriestämmen

gegenüber Antibiotika. Hier im

Praktikumsversuch werden jedoch verschiedene

Metalllösungen auf ihre wachstumshemmende

Wirkung getestet. Dabei wird die Metalllösung

in ein Loch in der Mitte der Agarplatte

gegeben. Durch die Diffusion der Lösung bildet

sich ein Konzentrationsgradient aus. Sind die

Testbakterien gegenüber einer gewissen

Metallkonzentration empfindlich, werden sie im Wachstum gehemmt und

der Impfstrich wird nicht vollkommen ausgebildet. Die Bakterien

stellen ihr Wachstum in mehr oder minder großer Entfernung vom Loch

ein (Abb. 22). Die Länge des unbewachsenen Impfstrichs zeigt den

Umfang der Wirkung des Metalls in entsprechender Konzentration an.

Abb. 22: Metalltolleranztest


ANHANG: Kurzbetriebsanweisung für gentechnische Arbeiten gem. § 12

Abs. 2 GenTSV (SICHERHEITSSTUFE 1)

Raum: P430 und P433 im Gebäude 8a (Forschungszentrum Dresden-

Rossendorf)

BBS (Uniklinikum): B. Schild Tel.: 458 2808

Notruf/Alarmzentrale über Tel.: 112 oder Tel.: 3333

1. Art der gentechnischen Arbeiten

In der Anlage sind nur gentechnische Arbeiten der Sicherheitsstufe 1

zulässig.

Gehandhabte biologische Agentien: Archaea-, Bakterien- und

Hefekulturen der Risikogruppe1

2. Verhalten im Labor

Grundsatz: Jede zum Arbeiten im Kontrollbereich berechtigte Person

ist dafür verantwortlich, dass eine Freisetzung von gentechnisch

veränderten Organismen (GVO) verhindert wird.

Allgemeine Verhaltensregeln: Grundlegend gelten die Verhaltensregeln

sauberer mikrobio-logischer, radiochemischer und gentechnischer

Arbeiten. Insbesondere ist darauf zu achten, dass:

Türen und Fenster während der Arbeiten geschlossen sind.

innerhalb der gentechnischen Anlage eigenständige

Schutzkleidung zu tragen ist.

Essen, Trinken und Rauchen untersagt ist.

das Pipettieren mit dem Mund grundsätzlich untersagt ist.

Kanülen und sonstige spitze Verbrauchsmaterialien zur

Entsorgung getrennt zu sammeln sind.

bei allen Arbeiten die entsprechenden Bedienungsanleitungen und

Schutzvorschriften zu beachten sind.

der für die gentechnische Anlage erstellte Hygieneplan generell

zu befolgen ist.

3. Lagerung/Entsorgung

Die längerfristige Lagerung aller GVO erfolgt bei -80°C im Raum

P433.

Bakteriell kontaminiertes Material (Kulturen, Kulturgefäße

etc.) muss getrennt nach festen und flüssigen Abfällen im Labor

in dafür bereitstehenden, geeigneten Behältern gesammelt

werden.


Alle mit GVO kontaminierten Materialien, die den S1-Bereich

verlassen, müssen entweder vorher dekontaminiert

(Vernichtungssterilisation im Autoklaven, Desinfek-tionsmittel)

oder sicher eingeschlossen sein.

Sind die GVO mit radioaktiven Stoffen in Berührung gekommen,

sind die Anforder-ungen bei der Sammlung und Entsorgung von

radioaktiven Reststoffen zu beachten. Die

Vernichtungssterilisation erfolgt dann nur im Autoklaven

SANOclav im KB6, R228 unter dem radiochemischen Abzug.

4. Verhalten nach Laborunfällen mit biologischen Agenzien

Der oberste Grundsatz ist, Mensch und Umwelt vor Schaden zu bewahren

Erst überlegen, dann handeln!

Bei Freisetzung (z.B. Verschütten) von GVO Mitarbeiter warnen

und Vorgesetzte (Projektleiter und ggf.

Strahlenschutzbeauftragten) sofort informieren.

Kleine Mengen verschüttetes biologisches Material unter

entsprechendem Selbstschutz (Kittel, Handschuhe) sofort

aufsaugen und die biologisch kontaminierten Oberflächen nach

den Methoden des Hygieneplans desinfizieren.

Bei größeren Unfällen eine weitere Person zu Hilfe rufen,

gegebenenfalls frische Schutzkleidung anlegen, zwei Paar

Schutzhandschuhe anziehen und biologisch kontaminierten Bereich

großflächig mit Zellstofftüchern abdecken, diese dann mit

bereitstehendem Desinfektionsmittel tränken, Einwirkungszeit

abwarten und dann aufwischen. Siehe Hygieneplan!

Beachte: Erst Dekontamination von Personen und Kleidung, dann von

Flächen und Geräten vornehmen.


Hygieneplan für die gentechnische Anlage der Sicherheitsstufe S1 in den

Räumen P430, P433 im Gebäude 8a des Forschungszentrum Dresden-Rossendorf

e.V.

Was Wann Womit Wie Wer

Pflege der Hände nach dem Händewaschen Handcreme: Hausmarke Pflegen Jeder, der im Labor

arbeitet

Allgemeine Instrumente nach jeder möglichen

Kontamination mit GVOs

Autoklav Sterilisation im Autoklaven,

Sterilisationszeit 20 min bei

121°C, Reinigung erst nach dem

Sterilisieren

der jeweilige Benutzer

Thermolabile Instrumente nach jeder möglichen


Präparat:

4 %-ig Korsolex AF

Desinfizieren und Reinigen:

unter Verwendung von

Handschuhen mit

Einwegtüchern einreiben,

gegebenenfalls in Lösung

einweichen, mind. 15 min

einwirken lassen


Werkbänke

Oberflächen von Geräten

und Inventar

vor und nach jeglicher

gentechnischer und

mikrobiologischer Arbeit

Präparat:

70-%-iger Ethanol verg.

(Fläche<1qm)

1 %-ig Kohrsolin



Handschuhen mit

Einwegtüchern einreiben, 1h

einwirken lassen


Fußböden nach jeder möglichen


Präparat:

3 %-ig Kohrsolin,



Handschuhen mit

Einwegtüchern einreiben, 4h

einwirken lassen

Jeder Verursacher,

Allg.: Reinigung zentral

(zweimal wöchentlich)

Schutzkleidung alle 1 – 3 Wochen Textilsack Sammeln: Reinigung durch eine

Fachfirma


nach jeder

möglichen/stattgefundenen


Präparat:

2 %-ig Kohrsolin

oder Autoklav

12h Einwirkzeit oder

Autoklavieren, Reinigung durch

eine Fachfirma


Persönliche

Schutzausrüstung

(Handschuhe)

nach Beendigung der Arbeit

oder öfter

nach jeder möglichen

Kontamination wechseln

In Autoklaviersäcken

sammeln

Entsorgung über allgemeinen

Laborabfall

Autoklavieren


Bakteriell kontaminierte

Abfälle

sofort in geeigneten Behältern Sammeln, Autoklavieren, der jeweilige Benutzer

…, welche zusätzlich

radioaktiv kontaminiert

sind

sofort in geeigneten Behältern Autoklavieren: nur im

Autoklaven SANOclave im

radiochemischen Abzug KB6,

P228, Öffnen erst nach

vollständigem Erkalten


Händereinigung/ hygienische Hände-

desinfektion

Vor Aufnahme jeglicher

gentechnischer und

mikrobiologischer

Arbeit

und nach Beenden jeglicher

gentechnischer und

mikrobiologischer

Arbeit

Händedesinfektions-präparat: Softaman

Präparat aus

Direktspender,

Dosierung: 2-3 Hübe

Jeder, der im Labor

arbeitet

Waschen;Abtrocknen mit Einmalhandtuch aus

Handtuchspender;

Desinfektionspräparat

entnehmen, verteilen und

einreiben, mind. 30 sec

einwirken lassen; Desinfektionspräparat

entnehmen, verteilen,

einreiben, mindestens 30sec einwirken lassen;

erst danach Hände

waschen; Abtrocknen mit Einmalhandtuch aus

Handtuchspender

skript zum masterpraktikum modul: biologie wechselwirkung ... · mikroorganismen sind aufgrund...

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