Small interfering RNA ( siRNA )

Cristina Teixidó Febrero

Historia

En los 90. Las primeras observaciones de silenciamiento de genes se hicieron al querer mejorar cultivos de interés económico

1990 R. Jorgensen “Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase gene into petunia results in reversible co-supression of homologous genes in trans.” Plant Cell

1997 David Baulcombe Intentar frenar la infección vírica en la planta del tabaco. Introducir genes virales en plantas transgénicas las protegía de la infección por el virus. “A Species of Small Antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants” Science

1998 Andrew Fire y Craig Mello C. elegans. Se puede silenciar la expresión de un gen a través de la introducción del dsRNA correspondiente. Andrew Fire denominó este fenómeno RNAi

2001 Thomas Tuschl. Demostró que siRNAs sintéticos eran capaces de inducir RNAi en células de mamífero “Duplexes of 21-nucleotide RNAmediate RNA interference incultured mammalian cells” Nature

Introducción La ribointerferencia es un mecanismo de silenciamiento post-transcripcional de genes

específicos, ejercido por moléculas de RNA que, siendo complementarias a un RNA mensajero, conducen a la degradación de éste

ARNi es una molécula de RNA que suprime la expresión de genes específicos

El siRNA, ARN pequeño de interferencia, es también conocido como RNA de silenciamiento. Es uno de los tipos de RNA interferente y se produce mediante el procesamiento de la enzima Dicer

Es altamente específico para la secuencia de nucleótidos de su RNA mensajero diana, interfiriendo por ello con la expresión del gen respectivo

Imagen de Dicer

Estructura

Doble cadena de 21-23 pb

Cada hebra de RNA tiene un grupo fosfato 5’ y un grupo hidroxilo (-OH) en 3’

Los siRNA no están presentes en organismos unicelulares, sino que son propios de células eucariotas. Esto sugiere que se trata de una función biológica bastante nueva, que han adoptada las células más avanzadas durante la evolución

Aplicaciones y funciones

Mecanismo de control de la expresión génica Permite estudiar la función de cada gen e identificar genes esenciales en procesos

celulares Regulación del desarrollo y el mantenimiento del genoma Funcionan como un sistema de defensa contra virus, control de transposones o

elementos génicos anómalos. Estrategia terapéutica potencial en enfermedades virales, descubrimiento de

fármacos diana y terapia del cáncer Validar dianas terapéuticas Suelen utilizarse precursores de RNAi, ya sea RNA doble cadena del gen diana a

reprimir o directamente RNA monocatenario complementario al RNAm a silenciar Con cultivos celulares, generalmente el vehículo utilizado son liposomas

.

Vía del RNAi

RNAi transitivo

En plantas, hongos y Caenorhabditis elegans La molécula de siRNA provoca, tras el corte del mRNA diana, la síntesis de nuevos siRNA a

partir de secuencias que están en dirección 5’ del punto de corte, con lo que se amplifica la señal

RNA polimerasas dirigidas por RNA, las cuales aparentemente no existen en humanos

Vía del RNAi

Dicer puede cortar dsRNA a siRNAs de: (A) secuencias propias, (B) virus o (C) miRNAs. Algunos virus generan dsRNA dentro de las células a las que infectan. Las células

infectadas detectan estos dsRNA y montan una respuesta de defensa, que termina con la degradación del RNA invasor

Diseños de los siRNA

Diseño aleatorio.- Selección de 21 bases del ARNm diana sin tener en cuenta la secuencia que tiene en el transcrito - Uso por los investigadores del mecanismo de acción de los ARNi para identificar posibles nuevos parámetros o atributos relacionados con la funcionalidad del ARNi

Diseño racional- Procedimiento informático dirigido a identificar las dianas óptimas del siRNA en un ARNm- Empleo de un complejo algoritmo que incluye amplios análisis bioinformáticos para identificar siRNAs funcionales únicos con efectos secundarios mínimos - Permite elegir un siRNA altamente funcional- Lleva a cabo comparaciones sistemáticas de secuencias- Elimina de forma efectiva los siRNA no funcionales del conjunto de candidatosEl algoritmo emplea un sistema de criterios como el contenido GC, perfiles de estabilidad interna, estructura interna, presencia de bases en posiciones clave, etc

Diseño convencional

Las tres primeras pautas: extremo 5 ’ de la cadena antisentido sea el termodinámico menos estable

Elegir el sitio diana del siRNA Longitud de 21-23 pb sense/antisense con los extremos 3’ salientes y los 5’ fosforilados. AA(N19)TT. En los 3’ va bien usar 2 dt seguidos La cadena con el 5’ termodinámicamente menos estable es la incorporada en el RISC

5’ cadena guía: Tm menos estable (rico en A/U) 5’ cadena pasajera: Tm más estable (rica en G/C)

Diseño convencional Evitar:

Diana esté en un intrón Los 5’ y 3’ de UTRs (untranslated regions) Los primeros 75 - 100 pb des del codón de inicio Secuencias con > 50% GC (30-70%) Secuencias que contengan repeticiones internas

Comparar el candidato con marcadores de secuencia expresados en bases de datos públicas (ej BLAST) para asegurar la especificidad (IMPORTANTE)

Modificaciones químicas haciéndolos más estables Modificar posición 2’ de ERI-1, una ribonucleasa que tiene una actividad 3' 5'

exonucleasa que está implicada en la regulación y en la degradación de los siRNAs

La eficiencia debe ser > 90% a 1-20 nM Recomendación: knockdown del gen con dos siRNAs independientes para controlar la

especificidad del efecto del silenciamiento

Ventajas

Puede sustituir tres métodos: knock-out, dominantes negativos e inhibidores químicos

Disminuye tiempo, coste y aumenta la especificidad

Técnica fácil y rápida

Facilita los análisis sobre tratamientos nuevos para el cáncer, enfermedades inflamatorias o infecciosas

Se pueden realizar experimentos en cualquier tipo celular de interés

Se puede realizar in vivo e in vitro

La eficacia del sistema de interferencia radica en que RISC cataliza múltiples ciclos de interferencia in vivo

Desventajas

Estabilidad Administración

Off-target effects (OTEs) Material foráneo por el SI: respuesta IFN Genes con complementariedad incompleta son downregulados sin darse cuenta

dando problemas en la interpretación de los datos

Los liposomas catiónicos muchas veces son tóxicos para la célula Baja eficiencia de la transfección

Saturación del complejo RISC por un uso de múltiples siRNAs no funcionales Para hacer el knockdown se necesitan dosis muy elevadas. OTE son dosis

dependientes

Ninguno es 100% efectivo (eficiencia 50-90%) Inactivos por tener un SNP o una mutación puntual en el sitio diana

En un futuro Avance de la investigación biomédica

Descubrir funciones biológicas nuevas para comprender mejor los mecanismos de las enfermedades humanas

Tecnologías para aumentar la especificidad, estabilidad y el rendimiento real del silenciamiento

Mínimos efectos secundarios con el mayor silenciamiento específico

Tratamientos nuevos para el cáncer, enfermedades inflamatorias o infecciosas

Desarrollo de nuevas terapias génicas

Descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos

Nueva clase de fármacos

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