sêmen refrigerado e congelado para inseminação artificial
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS
Sêmen refrigerado e congelado para inseminação artificialem ovinos
EDUARDO MAZON CORANDIN
Orientador: Benedito Dias de Oliveira Filho
GOIÂNIA
2011
ii
EDUARDO MAZON CORANDIN
SÊMEN REFRIGERADO E CONGELADO PARAINSEMINAÇÃO ARTIFICIAL EM OVINOS
Seminário apresentado junto à
Disciplina Seminários Aplicados do
Programa de Pós-Graduação em
Ciência Animal da Escola de Veterinária
da Universidade Federal de Goiás
Nível: Mestrado
Área de Concentração:Produção Animal
Linha de pesquisa:Biotecnologia e eficiência reprodutiva animal
OrientadorProf. Dr. Benedito Dias de Oliveira Filho – UFG
Comitê de OrientaçãoProfª. Dra. Maria Lúcia Gambarini – UFG
Profª. Dra. Eliane Sayuri Miyagi – UFG
GOIÂNIA
2011
iii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 1
2 REVISÃO DA LITERATURA ..................................................................................................... 3
2.1 Características do sêmen ovino ......................................................................................... 3
2.2 Refrigeração seminal............................................................................................................. 5
2.2.1 Diluentes utilizados para refrigeração do sêmen ....................................................... 5
2.2.2 Métodos para refrigeração seminal................................................................................ 6
2.2.3 Temperatura de armazenamento .................................................................................... 8
2.2.4 Inseminação artificial com sêmen refrigerado .......................................................... 10
2.3 Criopreservação do sêmen ................................................................................................ 11
2.3.1 Diluentes utilizados para criopreservação seminal ................................................. 11
2.3.2. Métodos para criopreservação seminal ..................................................................... 14
2.3.3 Descongelamento do sêmen.......................................................................................... 16
2.3.4 Inseminação artificial com sêmen criopreservado .................................................. 19
2.4 Estresse oxidativo................................................................................................................ 20
2.5 Antioxidantes......................................................................................................................... 21
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS ..................................................................................................... 25
REFERÊNCIAS ............................................................................................................................. 26
iv
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Características de um espermatozóide bovino sem a membranaplasmática. A cabeça com o capuchão acrossomático e a cauda comsuas quatro divisões anatômicas. Cortes transversais da peçaintermediária, peça principal e peça da cauda mostram o núcleo doaxonema central de 9 + 2 microtúbulos, as nove fibras grossasexternas, a bainha mitocondrial, as colunas longitudinais ventral edorsal e as costelas circulares. ......................................................... 3
FIGURA 2 – Proporção de espermatozóides vivos após 72 horas da colheita earmazenagem a 5°C (—) ou 15°C (– –) em diluidor a base de leitedesnatado (♦), OviPro (■), AndroMed (▲), ou INRA 96 (●). ............. 9
FIGURA 3 – Taxa de prenhez com inseminação artificial cervical usando sêmenarmazenado por 0, 24, 48 e 72 h (barra vertical representa 95% deintervalo de confiança para as médias)........................................... 10
v
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Características seminais (média ± desvio padrão) de carneiros das
raças Santa Inês, Dorper e mestiços, na região leste do Rio Grande
do Norte ............................................................................................ 4
TABELA 2 - Diluente Gema de Ovo-Tris Frutose para sêmen de carneiro ............ 6
TABELA 3 - Média e desvio-padrão da motilidade individual progressiva (MIP) de
acordo com o diluente e o tempo de armazenamento do sêmen
ovino.................................................................................................. 9
TABELA 4 - Taxa de fertilidade de ovelhas após inseminação cervical ou intra-
uterina com sêmen refrigerado, após 12 horas da detecção de cio 11
TABELA 5 - Médias e erro padrão dos parâmetros da motilidade espermática
avaliada pelo sistema computadorizado (CASA) e integridade de
membrana plasmática e acrossomal (IP+DIC) do espermatozóide
ovino no sêmen fresco (SF) e no sêmen congelado nos diluidores:
TRIS, TRIS 0,5 e TRIS 1................................................................. 13
TABELA 6 - Motilidade progressiva média do sêmen de carneiros, no estado
nativo (Mpi), após diluição com a fração A (Mp1), após 2 horas da
diluição com a fração A (Mp2), após diluição com a fração B (Mp3),
após 14 horas da diluição com a fração B (Mp4), após a exposição
ao vapor de nitrogênio líquido (Mp5) e 30 dias após o congelamento
(Mp6), submetido a três diluentes (Dil.): Tris-Gema (TG), Leite-Gema
(LG) e Tris-Gema-Leite(TGL).......................................................... 14
TABELA 7 - Valores após descongelamento de sêmen ovino criopreservado com
três diluentes ..................................................................................... 17
vi
TABELA 8 - Valores médios após descongelamento de sêmen ovino
criopreservado com quatro combinações de agente crioprotetores
permeáveis e não-permeáveis ........................................................ 18
TABELA 9 - Média e desvio-padrão da motilidade espermática pré e pós a
criopreservação e integridade de membrana plasmática de sêmen
criopreservado com diluidor a base de Tris-gema contendo glicerol,
diferentes proporções de DMF/GLY e somente DMF ..................... 19
TABELA 10 - Média e desvio padrão de motilidade, motilidade progressiva,
velocidade média de percurso (VMP) e velocidade linear (VLN) de
sêmen ovino acrescido de diferentes antioxidantes e submetidos a
criopreservação............................................................................... 22
TABELA 11 - Média e desvio padrão da integridade de membrana espermática,
integridade acrossomal e atividade mitocondrial de sêmen ovino
acrescido de diferentes antioxidantes e submetidos a
criopreservação............................................................................... 23
TABELA 12 - Média e desvio padrão da motilidade progressiva e integridade
acrossomal de sêmen ovino criopreservado com diferentes
concentrações de antioxidantes...................................................... 23
1 INTRODUÇÃO
A ovinocultura representa uma importante atividade sócio-econômica
em muitos continentes. Em países como Nova Zelândia, Austrália e Uruguai, essa
atividade significa importante fonte de receita, com valores produtivos expressivos
e grande participação nas exportações. O Brasil apresentou, de 2006 a 2009,
17,8% de crescimento no rebanho ovino (IBGE, 2006; IBGE, 2009), com destaque
para as regiões nordeste e sul. No ano de 2009, o Estado de Goiás detinha
186.464 cabeças, o que representava 17% do efetivo da região Centro-Oeste
(IBGE, 2009).
Devido à melhoria do poder aquisitivo do brasileiro o consumo de carne
ovina vem crescendo, principalmente nos grandes centros urbanos,
concomitantemente os consumidores também se tornam mais exigentes, e por
isso, a qualidade do produto ofertado torna-se primordial para alavancar e
consolidar a carne ovina no mercado interno e abrir novas opções de exportação.
Para isso, é necessário ações tanto na parte de manejo, com o uso de
confinamentos na terminação, como na melhoria genética do rebanho nacional,
com programas de melhoramento e utilização de biotécnias reprodutivas. Além da
melhoria da qualidade, também é importante a manutenção da continuidade e da
regularidade na oferta do produto, e para isso, é necessário a organização de
todos os envolvidos nessa cadeia produtiva (SORIO, 2009).
A introdução e utilização de raças mais especializadas, e, utilização de
biotécnias reprodutivas como avaliação da qualidade seminal, inseminação
artificial (IA), transferência de embriões (TE) e fertilização in vitro (FIV), devem ser
desenvolvidas e implementadas para a melhoria da ovinocultura, através da
disseminação genética de indivíduos superiores.
O desempenho reprodutivo dos animais dita a velocidade com que se
obtém o produto final e possui influência direta na rentabilidade do sistema e no
retorno econômico da atividade, por isso, as biotécnicas da reprodução não são
utilizadas somente para a melhoria da carga genética dos animais, mas também
constitui, juntamente com programas de melhoramento genético, importantes
ações para o incremento e intensificação da produção. Os programas
reprodutivos são bem difundidos e utilizados na bovinocultura nacional, mas no
2
cenário ovino apresenta-se bastante atrasado. O fato de a ovinocultura ainda
apresentar um caráter extrativista ou secundário, pode explicar a pouca difusão e
utilização de biotécnicas reprodutivas entre os produtores.
O uso de sêmen conservado na ovinocultura nacional é uma prática
pouco difundida, pelo caráter extrativista, e ainda apresenta resultados
insatisfatórios, principalmente quando se utiliza sêmen congelado com a
inseminação convencional. Um dos agravantes é a dificuldade de transpor a
cérvix devido a sua anatomia, assim, é necessário o uso de laparoscopia para a
deposição do sêmen dentro do útero, tornando essa técnica muito laboriosa.
Quando se utiliza sêmen fresco ou refrigerado, pode-se optar pela inseminação
artificial com a deposição do sêmen na entrada da cérvix, simplificando a técnica
e viabilizando a sua utilização.
É necessária a difusão de programas reprodutivos entre os produtores
de ovinos para que haja o desenvolvimento desse setor através da melhoria
genética dos rebanhos nacionais, e, o estudo da conservação do sêmen se torna
primordial para a evolução e padronização das técnicas de inseminação artificial e
também para determinar a capacidade reprodutiva do macho. O conhecimento de
antioxidantes que sejam eficientes na manutenção da qualidade seminal após o
processamento, também é um fator que necessita de estudos, pois está
diretamente relacionado com a melhoria dos índices produtivos.
Assim, objetiva-se com essa revisão discutir e discorrer sobre a
utilização de sêmen ovino refrigerado e congelado para inseminação artificial, e
aspectos relacionados à manutenção da qualidade seminal após as etapas de
refrigeração e criopreservação.
3
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Características do sêmen ovino
O sêmen pode ser caracterizado como suspensão celular líquida que
contém gametas masculinos altamente especializados (espermatozóides) e
também secreções dos órgãos acessórios do aparelho reprodutor masculino. O
plasma seminal é constituído pela porção fluida dessa suspensão, que é liberada
na ejaculação. Os espermatozóides (Figura 1) são provenientes dos túbulos
seminíferos localizados no interior dos testículos, os quais contêm uma série de
complexas células germinativas em desenvolvimento, que dão origem aos
espermatozóides, através de uma sequência de eventos denominada
espermatogênese (HAFEZ & HAFEZ, 2004).
FIGURA 1 - Características de um espermatozóide bovino sem a membranaplasmática. A cabeça com o capuchão acrossomático e a cauda comsuas quatro divisões anatômicas. Cortes transversais da peçaintermediária, peça principal e peça da cauda mostram o núcleo doaxonema central de 9 + 2 microtúbulos, as nove fibras grossasexternas, a bainha mitocondrial, as colunas longitudinais ventral edorsal e as costelas circulares.Fonte: HAFEZ & HAFEZ (2004).
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O plasma seminal é a porção fluida do sêmen, incorporada durante a
ejaculação, provenientes das glândulas sexuais acessórias, epidídimos, testículos
e ductos deferentes. Atua como transportador e protetor da células, por isso é um
componente essencial na cobertura natural, principalmente para os ovinos e
bovinos, pois o ejaculado é depositado na vagina (HAFEZ & HAFEZ, 2004).
O núcleo corresponde aproximadamente 35% do peso da célula
espermática, sendo os ácidos nucléicos, proteínas e lipídeos os principais
componentes químicos do espermatozóide, que ainda é rico em fósforo,
nitrogênio e enxofre (HAFEZ & HAFEZ, 2004).
O sêmen do carneiro possui volume do ejaculado relativamente
pequeno, variando de 0,5 a 2,0 mililitros (mL) e concentração espermática entre
dois e cinco bilhões de espermatozóides por mL de ejaculado, sendo comum
nessa espécie encontrar 90% de motilidade (MAIA et al., 2011).
Diferenças entre raças têm sido encontradas na maioria dos
parâmetros seminais de ovinos, principalmente devido à variação no diâmetro
testicular. Em levantamento realizado por MAIA et al. (2011) sobre as
características seminais de carneiros criados no Rio Grande do Norte, observa-se
uma estreita diferença entre raças (Tabela 1).
TABELA 1 - Características seminais (média ± desvio padrão) de carneiros dasraças Santa Inês, Dorper e mestiços, na região leste do Rio Grandedo Norte
Variáveis RaçaDorper (n = 5) Santa Inês (n = 5) Mestiços (n = 6)
Volume (mL) 1,1 ± 0,2 0,98 ± 0,6 1,2 ± 0,4Concentração(x106/ml) 2250 ± 426,4 3018 ± 1405,4 3108,3 ± 2097,1
Motilidade (%) 72,0 ± 26,8 77,0 ± 26,4 74,2 ± 22,9
Vivos (%)* 82,4 ± 17,4 81,0 ± 14,2 85,2 ± 6,9MM (0 - 5) 4,0 ± 1,4 4,0 ± 0,7 3,8 ± 1,5Vigor (0 - 5) 4,2 ± 1,1 4,4 ± 0,9 4,2 ± 0,9TDEF (%) 22,6 ± 9,9 24,2 ± 9,3 18,5 ± 10,4DMA (%) 16,6 ± 7,8 19,4 ± 9,5 15,2 ± 9,2DME (%) 6,2 ± 3,4 4,8 ± 2,8 3,3 ± 3,2PE (cm) 34,5 ± 1,2 34,2 ± 2,14 34,4 ± 4,1*Coloração vital, P > 0,05. MM: motilidade massal, TDEF: total de defeitos espermáticos,DMA: defeitos maiores, DME: defeitos menores.Fonte: MAIA et al. (2011).
5
PACHECO et al. (2009) trabalhando com carneiros da raça Santa Inês
na região sul do Espírito Santo, observaram idade média à puberdade de 210,8 ±
50,8 dias, peso corporal de 36,3 ± 9,2 quilogramas (kg) e perímetro escrotal de
25,2 ± 3,0 centímetros (cm), contudo, ALVES et al. (2006) observaram idade à
puberdade mais precoce (194,6 dias) com animais da mesma raça, criados no
Distrito Federal. Com isso, exalta a necessidade de programas de melhoramento
genético para produção de animais mais precoces.
2.2 Refrigeração seminal
2.2.1 Diluentes utilizados para refrigeração do sêmen
Devido ao pouco volume (0,5 a 2,0 mL) e alta concentração
espermática (2 a 5 x 109 sptz/mL), utiliza-se diluente para aumentar o volume total
do ejaculado e assim obter maior proporção de doses inseminantes. Os diluidores
visam primeiramente o aumento de volume, mas devem também favorecer a
sobrevivência dos gametas masculinos e ser livres de materiais tóxicos para
minimizar o desperdício de células (GONÇALVES et al., 2001).
De acordo com HAFEZ & HAFEZ (2004), um diluente deve fornecer
para os espermatozóides nutrientes e energia, como glicose, proteger as células
do choque térmico, proporcionar um meio tampão e uma pressão osmótica
adequada, inibir a proliferação bacteriana e aumentar o volume do ejaculado.
Para melhores resultados, deve-se adicionar o diluente ao sêmen e, após a
mistura cuidadosa promover a avaliação do sêmen diluído para confirmar a sua
viabilidade espermática. Normalmente os diluentes utilizados para preservação de
sêmen de carneiro apresentam pH, capacidade de tamponamento e osmolaridade
adequados, e promovem proteção aos espermatozóides de lesões criogênicas
(SALAMON & MAXWELL, 2000).
Os diluidores mais utilizados são a base de Tris (hidroximetil
aminometano) (MAIA et al., 2008) e leite desnatado (HAFEZ & HAFEZ, 2004). A
gema de ovo (Tabela 2) é comumente adicionada aos diluidores, devido a sua
fração lipoproteíca de baixa densidade e alto peso molecular, promove proteção
6
aos espermatozóides contra o choque térmico, reduz a perda de enzimas
acrossomais e previne alterações de membrana durante o armazenamento
(SALAMON & MAXWELL, 2000). Nos diluidores a base de leite desnatado esse
mecanismo de proteção deve-se também a sua fração protéica (MEDEIROS et
al., 2002).
TABELA 2 - Diluente Gema de Ovo-Tris Frutose para sêmen de carneiroComponente QuantidadeTris (hidroximetil) aminometano 3,634 gFrutose 0,50 gÁcido cítrico, monoidrato 1,99 gGema de ovo 14 mLÁgua destilada 100 mL q.s.p.Fonte: HAFEZ & HAFEZ (2004).
MACHADO et al. (2006) avaliaram o diluidor à base de água de coco
em pó (ACP-102®) para inseminação artificial em ovinos da raça Santa Inês com
sêmen refrigerado à 4 graus Celsius (°C),e, obtiveram taxa de fertilidade de 48%
na inseminação cervical e 70,3% quando utilizaram laparoscopia. Segundo ANEL
et al. (2006), a evolução da tecnologia nos diluidores seminais tem mostrado que
a sobrevivência dos espermatozóides por períodos prolongados é inversamente
proporcional à sua atividade metabólica.
Várias substâncias orgânicas e sintéticas (SALAMON & MAXWUEL,
2000) são utilizadas e lançadas pela indústria para promover proteção aos
espermatozóides durante a diluição, porém, o balanço entre concentração e
interação desses agentes com o meio celular deve ser sempre mensurado.
2.2.2 Métodos para refrigeração seminal
A refrigeração do sêmen ovino diluído é utilizada como principal
método de armazenamento, é caracterizada pela redução da temperatura que
originalmente encontra-se em torno de 37°C para temperaturas próximas a zero
grau Celsius. Nesse período o espermatozóide sofre inibição reversível de seu
metabolismo (CÂMARA & GUERRA, 2011).
7
Para promover essa queda na temperatura, pode-se utilizar
equipamentos convencionais (refrigerador, garrafas térmicas ou caixas
isotérmicas com gelo), ou ainda, equipamentos automatizados. Quando se utiliza
refrigerador (geladeira), as palhetas devem ser colocadas primeiramente em
frascos com águas a 30°C, e posteriormente levadas ao refrigerador e mantidas
até a estabilização da temperatura. No uso de caixas isotérmicas com gelo ou
água gelada, as palhetas devem ser protegidas com algodão hidrofóbico para
evitar o choque térmico devido ao contato direto com o gelo.
A refrigeração do sêmen, de 30°C a 0°C realizada de forma abrupta,
pode ocasionar um estresse letal a algumas células, caracterizado como choque
térmico (WATSON, 2000). O dano as células causados pela queda da
temperatura está relacionado com alterações no arranjo dos constituintes da
membrana devido a mudanças na viscosidade do meio (MEDEIROS et al., 2002).
Uma queda de temperatura lenta também promove tensão na
membrana celular (WATSON, 2000), por isso a curva de refrigeração deve ser
monitorada e padronizada. Bolsas plásticas contendo água são utilizadas com
eficiência para controlar a queda de temperatura quando se utiliza refrigeradores
convencionais (RODELLO, 2006) ou balcão (LIMA et al., 2010).
RODELLO (2006) comparou um equipamento automatizado com
geladeira para refrigeração do sêmen ovino, porém, as palhetas do sêmen foram
colocadas na geladeira entre bolsas plásticas contendo água, a fim de
proporcionar um resfriamento gradativo até estabilização a 5°C. Para a
refrigeração automatizada, utilizou-se o equipamento de fabricação nacional TK
3000®, programado para executar uma queda de temperatura de -0,5°C/minuto.
Ao comparar os dois sistemas, não foi possível encontrar diferença estatística
para os critérios avaliados, ambos apresentaram uma queda de -0,5°C/minuto e
um tempo de 90 minutos para reduzir a temperatura de 32 para 5°C.
Vários métodos podem ser utilizados para promover essa queda de
temperatura, sejam eles automáticos ou manuais, a curva de queda da
temperatura deve ser promovida de maneira constante e homogênea, evitando
variações bruscas que culminam em choque térmico e redução da viabilidade
espermática (WATSON, 2000; MEDEIROS et al., 2002).
8
2.2.3 Temperatura de armazenamento
A redução da temperatura a níveis baixos é utilizada para deprimir o
metabolismo dos espermatozóides e prolongar a sua vida fértil (ANEL et al.,
2006), possibilitando o seu armazenamento e utilização por um maior período de
tempo. O armazenamento do sêmen na forma líquida apresenta facilidade no seu
processamento, mas, possui um tempo hábil bastante limitado.
Utilizam-se várias temperaturas no armazenamento do sêmen
refrigerado, entretanto as temperatura de 15°C (YÁNIZ et al., 2005; DRUART et
al., 2009), 5°C (BUCAK & TEKIN, 2007; ROJERO et al., 2009; LIMA et al., 2010)
e 4°C (SOUSA et al., 2010) são as comumente utilizadas.
O armazenamento do sêmen na temperatura de 4°C promove a
redução no metabolismo dos espermatozóides, economia das reservas
energéticas e boa conservação da motilidade, enquanto a preservação seminal a
15-20°C mantém o atividade celular, tornando os espermatozóides mais sensíveis
aos metabólicos tóxicos (DECUADRO-HANSEN, 2004).
Quando se utiliza o sêmen fresco, esse deve ser mantido à
temperatura em torno de 30°C e utilizado no menor tempo possível, pois nessa
condição a motilidade e viabilidade seminal reduzem rapidamente. Quando se
refrigera o sêmen, este pode ser armazenado e utilizado até 48 horas após a
colheita (ROJERO et al., 2009), porém ocorre uma queda acentuada na
fertilização após 24 horas na inseminação artificial cervical (ANEL et al., 2006;
O’HARA et al., 2010).
O sêmen mantido a temperatura de 15°C possui um tempo útil bastante
inferior aqueles acondicionados a 4-5°C, e para que tenha índices satisfatórios
recomenda seu uso até 8 horas após o processamento (ANEL et al., 2006). Por
isso, os diluentes são empregados no intuito de aumentar o tempo de
armazenamento seminal.
SOUSA et al. (2010) compararam diluentes comerciais ao tradicional
Tris-Gema sobre a viabilidade in vitro de células espermáticas de ovinos da raça
Dorper submetidos ao processo de refrigeração à 4°C e armazenados por um
período de até 48 horas. Nota-se, na Tabela 3, uma grande diferença nos valores
de motilidade individual progressiva para os tratamentos Equimix e Equimix-
9
Gema, sendo que, o tratamento à base de Tris-Gema proporcionou proteção às
células até 24 horas de armazenamento, e, como se trata do mesmo diluente
comercial os autores atribuíram o fato devido à adição de 20% de gema de ovo.
No entanto, a utilização de gema de ovo pode diferenciar os
tratamentos devido à grande variabilidade da sua composição (ANEL et al., 2006),
dificultando a padronização dos diluentes. Nota-se que o diluente tradicional Tris-
Gema pode ser utilizado para conservação do sêmen a 4°C por um período de
até 48 horas, corroborando com ROJERO et al. (2009).
TABELA 3 - Média e desvio-padrão da motilidade individual progressiva (MIP) deacordo com o diluente e o tempo de armazenamento do sêmen ovino
Tempo (horas) Equimix Equimix-Gema Tris-Gema
0 76,67±10,41 80,00±5,00 81,67±2,89
12 35,00±8,66 75,00±5,00 80,00±5,00
24 30,00±5,00 65,00±13,23 78,33±2,89
36 16,67±2,89 36,67±15,28 73,33±2,89
48 3,67±2,31 10,33±12,86 68,33±2,89Fonte: Adaptado de SOUSA et al. (2010).
O’HARA et al. (2010) avaliaram a viabilidade espermática de sêmen de
carneiros refrigerados nas temperaturas 5°C e 15°C no armazenamento até 72
horas após a colheita, e observaram que a viabilidade permaneceu relativamente
constante entre 24 e 72 horas para o sêmen refrigerado a 5°C, enquanto que no
armazenamento do sêmen a 15°C a viabilidade declinou linearmente (Figura 2).
FIGURA 2 – Proporção de espermatozóides vivos após 72 horas da colheita earmazenagem a 5°C (—) ou 15°C (– –) em diluidor a base de leitedesnatado (♦), OviPro (■), AndroMed (▲), ou INRA 96 (●).Fonte: O’HARA et al. (2010).
10
A taxa de prenhez após a inseminação artificial cervical com sêmen
refrigerado a 5°C utilizando o diluidor INRA 96 também apresentou queda com o
aumento do tempo de armazenamento (Figura 3), mas, obteve um índice
satisfatório (52,2%) quando a sua utilização foi em até 24 horas, se mostrando
uma alternativa viável.
FIGURA 3 – Taxa de prenhez com inseminação artificial cervical usando sêmenarmazenado por 0, 24, 48 e 72 h (barra vertical representa 95% deintervalo de confiança para as médias).Fonte: O’HARA et al. (2010).
2.2.4 Inseminação artificial com sêmen refrigerado
O sêmen de carneiros, assim como nas demais espécies, pode ser
utilizado para inseminação artificial na forma fresca, refrigerado ou congelado
(ROJERO et al., 2009). As técnicas para a inseminação artificial incluem
deposição do sêmen no canal vaginal, transcervical e intra-uterina.
A inseminação artificial mais utilizada em ovinos é a vaginal e
transcervical, e, se consegue resultados satisfatórios quando utiliza sêmen fresco
ou refrigerado a 15°C, porém é necessário considerar o curto prazo de
armazenamento e a necessidade de uma alta concentração de espermatozóide
por dose (ANEL et al., 2006). Por outro lado, a utilização de sêmen fresco ou
refrigerado reduz a eficiência do carneiro, pela necessidade de uma dose elevada
de sêmen, e carece de maior organização no manejo reprodutivo da propriedade.
De acordo com O’HARA et al. (2010), em situações peculiares o uso de
sêmen refrigerado a 5°C pode ser utilizado até três dias após a colheita e
processamento, porém a taxa de prenhez reduz drasticamente com o passar do
tempo (Figura 3).
11
Ao avaliar a inseminação artificial intra-uterina ou cervical em ovelhas
no sul do México, ROJERO et al. (2009) encontraram valores aceitáveis na taxa
de prenhez quando utilizaram inseminação artificial cervical (43,7%) com sêmen
armazenado por 12 horas à temperatura de 5°C, porém, os valores foram bem
superiores (75,0%) quando utilizaram inseminação artificial intra-uterina através
de laparoscopia (Tabela 4).
TABELA 4 - Taxa de fertilidade de ovelhas após inseminação cervical ou intra-uterina com sêmen refrigerado, após 12 horas da detecção de cio
Inseminação n Ovelhas prenhes Taxa de fertilidade (%)Cervical 16 07 43,7b
Intra-uterina 16 12 75,0a
a,bLetras minúsculas indicam diferenças (p<0,05) entre locais de inseminaçãoFonte: ROJERO et al. (2009).
DRUART et al. (2009) analisaram o trânsito espermático no trato
genital feminino após inseminação artificial com sêmen armazenados sob
refrigeração a 15°C por 24 horas, utilizando microscopia confocal in situ e
observaram que a proporção de espermatozóides móveis com deslocamento
linear e sua migração da cérvix em direção à tuba uterina foi afetada pela
refrigeração e armazenamento do sêmen. Com isso, mostra-se a necessidade de
estudos a fim de melhorar as técnicas de refrigeração do sêmen, objetivando o
aumento da fertilidade e consequente melhora nos índices zootécnicos.
2.3 Criopreservação do sêmen
2.3.1 Diluentes utilizados para criopreservação seminal
O glicerol é o crioprotetor mais utilizado, possui a capacidade de
penetrar a membrana celular e diminuir o estresse osmótico intracelular causado
pela desidratação, entretanto, dependendo da concentração utilizada, sua
toxidade pode ocasionar danos na membrana e consequente redução da
motilidade espermática (MEDEIROS et al., 2002).
A adição de gema de ovo e/ou antioxidantes é utilizada para reduzir a
concentração do glicerol e minimizar seu efeito tóxico (SALAMON & MAXWELL,
12
2000). Segundo ANEL (2006), adição de glicerol em duas etapas com diferentes
temperaturas representa o melhor balanço entre citotoxidade e criopreservação.
Por apresentarem características crioprotetoras, a gema de ovo é
comumente utilizada nos diluidores de sêmen para minimizar os efeitos deletérios
do choque térmico. Segundo MAIA et al. (2008), a adição de surfactantes ao
diluidor à base de gema de ovo melhora significativamente a qualidade seminal e
fertilidade após o processo de criopreservação, devido à manutenção da
motilidade e integridade das membranas.
A gema de ovo atua no meio extracelular protegendo a membrana
plasmática das crioinjúrias (SALAMON & MAXWELL, 2000). O efeito da interação
entre as lipoproteínas de baixa densidade (LDL) da gema de ovo com a
membrana celular promove diminuição na perda de fosfolipídeos da membrana e
aumenta sua tolerância ao processo de criopreservação (ANEL et al., 2006).
Outras substâncias como: dimetilsulfóxido (DMSO), etilenoglicol,
albumina, açúcares, surfactantes, proteínas de peixe, etc. têm sido avaliadas
como agentes crioprotetores, entretanto nota-se efeito inferior ao glicerol
(SALAMON & MAXWELL, 2000).
Em trabalho realizado por MAIA et al. (2008), os autores estudaram o
efeito da adição do detergente lauril sulfato de sódio (OEP) ao diluente Tris
contendo 20% de gema de ovo, sob a viabilidade seminal após o congelamento e
descongelamento do sêmen de carneiros da raça Santa Inês. Foi utilizado três
diluidores, o diluidor controle (Tris) sem adição de OEP, e dois diluidores a base
de Tris adicionado OEP nas concentrações de 0,5 e 1,0% (TRIS 0,5 e TRIS 1).
Conforme observado na Tabela 5, o processo de criopreservação causou efeito
deletério à integridade da membrana plasmática e acrossomal do espermatozóide
ovino, diminuindo a qualidade seminal em relação ao sêmen fresco.
A adição de OEP nos níveis de 0,5 e 1,0% promoveu melhora
significativa na motilidade espermática, motilidade progressiva e integridade de
membrana em relação ao diluidor sem adição de OEP (Tabela 5). A queda da
motilidade do espermatozóide é uma característica encontrada frequentemente
em sêmen congelados, isso se deve principalmente ao estresse da
criopreservação que a célula é submetida, por isso, recorre-se a utilização de
crioprotetores como a gema de ovo e glicerol.
13
TABELA 5 - Médias e erro padrão dos parâmetros da motilidade espermáticaavaliada pelo sistema computadorizado (CASA) e integridade demembrana plasmática e acrossomal (IP+DIC) do espermatozóideovino no sêmen fresco (SF) e no sêmen congelado nos diluidores:TRIS, TRIS 0,5 e TRIS 1
Parâmetro Sêmen CongeladoSF TRIS TRIS 0,5 TRIS 1
MT (%) 93,7 ± 0,7a 34,3 ± 2,5c 65,0 ± 3,7b 69,9 ± 5,0b
MP (%) 55,4 ± 2,0a 24,4 ± 1,9c 38,9 ± 2,6b 39,1 ± 3,6b
VAP (μm/s) 158,0 ± 5,9a 116,1 ± 3,6b 121,3 ± 3,7b 120,4 ± 3,4b
VSL (μm/s) 115,2 ± 4,4a 102,5 ± 3,4b 96,6 ± 3,1b 92,0 ± 3,3b
VCL (μm) 286,5 ± 12,1a 187,5 ± 5,0c 214,6 ± 7,1b 210,9 ± 6,5b
ALH (Hz) 10,4 ± 0,4a 6,6 ± 0,2c 8,6 ± 0,2b 8,1 ± 0,3b
LIN (%) 41,2 ± 1,1a 55,1 ± 0,7a 46,8 ± 0,8b 45,3 ± 0,5b
IM (%) 70,0 ± 2,3a 13,8 ± 2,3c 28,8 ± 2,3b 32,4 ± 2,3b
Média seguida de letras diferentes na mesma linha difere entre si a P<0,05.MT: motilidade total; MP: motilidade progressiva; VAP: velocidade de trajeto; VSL:velocidade progressiva; VCL: velocidade curvilinear; ALH: amplitude de deslocamentolateral de cabeça; LIN: linearidade e IM: membrana plasmática intacta.Fonte: MAIA et al. (2008).
O efeito crioprotetor dos diluidores Tris-gema aditivado com OEP tem
efeito direto sobre as membranas espermáticas, reduzindo o estresse osmótico
da adição do glicerol devido ao aumento da permeabilidade da membrana, o que
explica a maior motilidade do TRIS 0,5 e TRIS 1, em relação ao grupo controle
(MAIA et al., 2008). O grupo sem adição de OEP sofreu maior estresse osmótico
e maior desidratação celular, reduzindo a motilidade devido à maior lesão da
membrana. Esse fato reflete a importância da utilização de crioprotetores que
promovem a máxima proteção dos espermatozóides à crioinjúria.
Estudando a influência do leite em pó desnatado sobre a motilidade
progressiva e integridade de membrana plasmática, CARVALHO et al. (2008)
também verificaram redução gradual da motilidade progressiva dos
espermatozóides, submetidos ao processo de criopreservação, para três
diluidores testados (Tris-Gema, Leite-Gema e Tris-Gema-Leite), conforme
observado na Tabela 6. Nota-se que o diluente convencional à base de Tris-
Gema possui efeito crioprotetor nas etapas de congelamento e descongelamento
do sêmen, por isso se mostrou mais eficiente na manutenção da motilidade
14
espermática progressiva após a exposição do sêmen ao vapor de nitrogênio
líquido (Mp5) e 30 dias após o congelamento (Mp6).
TABELA 6 - Motilidade progressiva média do sêmen de carneiros, no estadonativo (Mpi), após diluição com a fração A (Mp1), após 2 horas dadiluição com a fração A (Mp2), após diluição com a fração B (Mp3),após 14 horas da diluição com a fração B (Mp4), após a exposiçãoao vapor de nitrogênio líquido (Mp5) e 30 dias após ocongelamento (Mp6), submetido a três diluentes (Dil.): Tris-Gema(TG), Leite-Gema (LG) e Tris-Gema-Leite(TGL)
Dil. Mpi Mp1 Mp2 Mp3 Mp4 Mp5 Mp6
TG 68,4 ±9,5a
65,6 ±11,0a
63,1 ±12,3a
60,3 ±11,2a
52,5 ±12,7a
29,1 ±13,6a
46,5 ±21,7a
LG 68,4 ±9,5a
61,1 ±10,4a
56,6 ±11,5a
50,3 ±10,2a
41,4 ±12,8b
18,8 ±10,7b
26,1 ±17,1b
TGL 68,4 ±9,5a
63,7 ±12,1a
60,3 ±12,3a
56,9 ±12,6a
49,1 ±12,3a
22,8 ±9,9b
32,1 ±17,5b
a,bMédias seguidas das mesmas letras na coluna não diferem entre si (P<0,05).Fonte: CARVALHO et al. (2008).
2.3.2. Métodos para criopreservação seminal
A criopreservação é um processo que envolve as fases de redução de
temperatura, desidratação celular, congelamento e descongelamento do sêmen
(MEDEIROS et al., 2002). A criopreservação pode ser realizada de várias
maneiras, contudo, para o sucesso do processo todas as etapas devem ser
realizadas de forma harmoniosa.
Para a criopreservação pode-se utilizar caixas isotérmicas com
nitrogênio líquido (N2), porém, mesmo que viável esse método possui difícil
padronização das curvas de queda de temperatura. Por isso, a indústria
especializada investe em pesquisas a fim de lançar aparelhos automatizados que
apresentem uma curva homogênea e padronizada (RODELLO, 2006).
Atualmente, existem dois métodos para a criopreservação de gametas:
congelamento lento e a vitrificação. Segundo ARAV et al. (2002) o congelamento
lento possui a vantagem de utilizar uma baixa concentração de crioprotetores em
relação a vitrificação, porém por ser um método rápido e simples, a vitrificação
reduz o choque térmico sofrido pela diminuição gradual da temperatura.
15
A primeira parte da amostra a congelar é a água intracelular, por isso a
taxa de queda de temperatura no congelamento lento é o principal fator que
determina a sobrevivência dos espermatozóides. No caso da vitrificação, utilizava-
se a imersão direta no N2 (-196°C), hoje com o avanço tecnológico o nitrogênio
pode chegar a temperaturas de -210°C, aumentando a taxa de congelamento,
porém essa queda de temperatura drástica pode ocasionar fraturas na membrana
com redução no potencial de fertilização dos espermatozóides (ARAV et al.,
2002).
A temperatura entre -5°C e -50°C é definida como um ponto crítico,
pois nessa temperatura a taxa de congelamento determina se a célula permanece
em equilíbrio com seu meio extracelular ou torna progressivamente super
congelada, elevando a possibilidade de desidratação e formação de gelo
intracelular (KUMAR et al., 2003).
Também se utilizam suspensão no vapor de nitrogênio líquido, com
posterior imersão no líquido para o congelamento do sêmen, nesse caso, o que
determina a velocidade da queda da temperatura é à distância com o nitrogênio
líquido e o tamanho das palhetas (LEBOEUF et al., 2000). Segundo SALAMON &
MAXWELL (2000), a curva de queda de temperatura ideal para o congelamento é
uma parábola, conseguida com uma distância de 4-6 centímetros entre as
palhetas e o nitrogênio líquido.
RODELLO (2006) obteve bons resultados ao comparar um sistema
automatizado (TK 3000®) para congelamento de sêmen com um sistema manual
utilizando geladeira/vapor de nitrogênio líquido. Para o congelamento em vapor de
nitrogênio líquido as palhetas com o sêmen, após atingirem a temperatura de 5°C,
eram transferidas para um caixa de polietileno (isopor) contendo 5,5 litros de
nitrogênio líquido. As palhetas eram expostas na posição horizontal a três
centímetros do vapor de nitrogênio líquido, por 20 minutos, e posteriormente
submersas no nitrogênio líquido e armazenadas em raques em botijão criogênico.
Para análise da qualidade seminal, os seguintes tratamentos foram avaliados:
refrigeração em geladeira e congelamento em vapor de nitrogênio líquido,
refrigeração em geladeira e congelamento automatizado, refrigeração
automatizada e congelamento em vapor de nitrogênio líquido, refrigeração e
congelamento automatizado. Ao analisar o sêmen in vitro após o
16
descongelamento, não foi possível detectar diferenças entre os sistemas
analisados quanto aos parâmetros avaliados.
KUMAR et al. (2003) utilizaram uma taxa de criopreservação lenta
(-1°C/min) e duas rápidas (-30°C/min e -50°C/min) para avaliar o efeito da
criopreservação sob os parâmetros qualitativos do sêmen de bovinos, ovinos e
caprinos. Segundo os autores, a peça intermediária e cauda dos espermatozóides
ovinos (envolvidos na geração e propagação do movimento) podem ser
vulneráveis a taxas de congelamento lento, enquanto os espermatozóides
caprinos possuem a motilidade espermática prejudicada pela criopreservação
rápida. Contudo, independente da espécie, a taxa de -30°C/minuto foi mais
eficiente na contra a crioinjúria, sendo recomendada entre as temperaturas de -
5°C e -50°C.
Conclui-se que a criopreservação do sêmen, assim como a
refrigeração, podem ser realizadas de maneira eficiente no campo, e com
resultados semelhantes aquelas realizadas em laboratórios automatizados,
porém, destreza e atenção são decisivos no resultado final. A comprovação da
eficácia de métodos simples faz com que essa biotecnologia seja passível de
utilização em todos os criatórios, e, sem a necessidade de um alto investimento
em equipamentos a técnica é atrativa e com benefícios em curto prazo.
2.3.3 Descongelamento do sêmen
Na utilização do sêmen criopreservado, a fase de aquecimento é tão
importante para a sobrevivência dos espermatozóides quanto o processo de
congelamento, os espermatozóides que sobreviveram à temperatura de -196°C
são submetidos ao aquecimento e atravessam novamente a zona crítica de -15°C
a -60°C (SALAMON & MAXWELL, 2000).
A fim de melhorar os índices de fertilidade, vários sistemas de
descongelamento foram elucidados. O descongelamento em altas temperaturas
(60-75°C) é semelhante a 38-42°C, quanto à motilidade, integridade de
acrossoma e fertilidade dos espermatozóides (SALAMON & MAXWELL, 2000).
Porém, segundo LEBOEUF et al. (2000), o descongelamento do sêmen a 37°C é
mais adequado em condições práticas por excluir o risco de superaquecimento.
17
Um método simples e comumente utilizado para o descongelamento de
sêmen é utilizando água em banho maria na temperatura de 37°C, de 20 a 30
segundos (ÇOYAN et al., 2011; MOUSTACAS et al., 2011). Para minimizar os
efeitos nocivos da criopreservação e posterior descongelamento sob os gametas
masculinos, são utilizados diluentes, crioprotetores e antioxidantes.
SANDOVAL et al. (2007) avaliaram três diluidores e quatro
combinações de agentes crioprotetores para a criopreservação de sêmen de
ovinos. O experimento foi dividido em duas etapas: na primeira avaliaram o efeito
protetor de dois diluentes à base de Tris (224 mM e 150 mM) e um diluente a
base de leite desnatado. Nota-se (Tabela 7) que os diluentes à base de Tris,
proporcionaram maior proteção em comparação com o diluidor à base de leite
desnatado, principalmente na concentração de 224 mM. As diferenças
observadas entre os dois primeiros foram atribuídas às concentrações de Tris,
ácido cítrico e frutose, utilizados em cada diluidor.
TABELA 7 - Valores após descongelamento de sêmen ovino criopreservado comdois diluentes a base de Tris e um diluente à base de leitedesnatado
Diluentes Motilidade progressiva Espermatozóides vivos2
Tris (224 mM) 69,29 ± 6,76a 63,12 ± 4,64a
Tris (150 mM) 37,40 ± 5,76b 34,86 ± 6,50b
Leite desnatado 23,39 ± 6,58c 23,22 ± 8,23c
Sêmen fresco1 89,05 ± 3,76 86,58 ± 6,081Sem diluir2Com acrossoma intactoa,b,cLetras diferentes dentro da mesma coluna indicam diferenças significativas (p<0.05)Fonte: Adapatado de SANDOVAL et al. (2007).
Na segunda etapa os autores testaram quatro combinações de agentes
crioprotetores, sendo um permeável e outro não permeável: Glicerol – Trealose,
Glicerol – Sacarose, Etilenoglicol – Trealose e Etilenoglicol – Sacarose. Observa-
se que, independentemente do tipo de crioprotetor não permeável (Trealose ou
Sacarose), a qualidade seminal após o descongelamento foi estatisticamente
maior para os grupos que utilizaram o glicerol como crioprotetor permeável
(Tabela 8). Segundo os autores, o fato dos espermatozóides ovinos apresentarem
18
uma maior susceptibilidade aos efeitos tóxicos do etilenoglicol pode ter sido
devido à concentração utilizada (2,25%).
TABELA 8 - Valores médios após descongelamento de sêmen ovinocriopreservado com quatro combinações de agentecrioprotetores permeáveis e não-permeáveis
Crioprotetores Motilidadeprogressiva
Espermatozóidesvivos2
Integridade demembrana
Glicerol+Trealose 64,1 ± 4,8a 57,8 ± 6,9a 62,5 ± 2,8a
Glicerol+Sacarose 64,2 ± 5,4a 55,7 ± 6,1a 59,6 ± 1,3a
Etilenoglicol+Trealose 44,1 ± 4,3b 37,5 ± 3,9b 40,3 ± 8,3b
Etilenoglicol+Sacarose 48,5 ± 3,5b 41,5 ± 4,1b 37,5 ± 3,6b
Sêmen fresco1 83,6 ± 7,8 82,5 ± 2,7 66,9 ± 3,61Sem diluir2Com acrossoma intactoa,b,cLetras diferentes dentro da mesma coluna indicam diferenças significativas (p<0.05)Fonte: Adaptado de SANDOVAL et al. (2007).
Em contrapartida, MORAES et al. (1998) e BRISOLA et al. (1999)
avaliaram o efeito do etilenoglicol em substituição ao glicerol como agente
crioprotetor e concluíram que o sêmen ovino criopreservado com etilenoglicol na
concentração de 0,5 mM proporciona motilidade e vigor semelhante ao glicerol,
porém é mais eficiente para preservar a integridade das membranas
espermáticas. O etilenoglicol apresenta melhor proteção às membranas
espermáticas devido à sua maior velocidade de penetração celular,
proporcionando uma diminuição da alta concentração de sais no interior do
espermatozóide (MORAES et al., 1998).
SILVA et al. (2006) avaliaram o efeito da dimetilformamida, associada
ou não ao glicerol, como crioprotetor para congelamento de sêmen de caprinos, e
não observaram diferença estatística entre os tratamentos (7% de glicerol; 3,5%
de glicerol e 3,5% de dimetilformamida; 5% de dimetilformamida) para motilidade
espermática e vigor, analisados em testes in vitro. Os tratamentos também
tiveram a mesma eficiência na manutenção da integridade celular, indicando que
a DMF pode ser utilizada como agente crioprotetor em sêmen de caprinos.
Ao testar a influência da dimetilformamida (DMF), associada ou não ao
glicerol (GLY), na efetividade da criopreservação de sêmen de ovinos,
MOUSTACAS et al. (2011) observaram que, com o aumento da concentração de
19
DMF, houve redução significativa na qualidade seminal in vitro (motilidade,
parâmetros cinéticos e integridade de membrana) após a criopreservação,
conforme demonstrado na Tabela 9. A dimetilformamida não produziu efeitos
tóxicos imediatamente ao ser adicionado, porém, após a descongelação a
motilidade espermática foi significativamente reduzida nos tratamentos que
continham DMF em relação ao tratamento controle (5% Glicerol).
TABELA 9 - Média e desvio-padrão da motilidade espermática pré e pós acriopreservação e integridade de membrana plasmática de sêmencriopreservado com diluidor a base de Tris-gema contendo glicerol,diferentes proporções de DMF/GLY e somente DMF
Crioprotetor(%)
Motilidade pré-congelamento (%)
Motilidade pós-congelamento (%)
Integridade deMembrana
Plasmática (%)5GLY1 73,3 ± 3,2 43,9 ± 6,4 16,6 ± 5,34GLY-1DMF2 71,1 ± 4,8 26,9 ± 3,1* 8,0 ± 2,63GLY-2DMF3 73,9 ± 3,9 2,6 ± 0,9* 3,1 ± 0,8*2GLY-3DMF4 70,0 ± 5,8 1,4 ± 0,5* 8,7 ± 6,41GLY-4DMF5 70,0 ± 4,7 0,7 ± 0,3* 1,4 ± 0,3*2DMF6 75,0 ± 2,6 1,2 ± 0,5* 3,0 ± 0,8*3DMF7 73,3 ± 4,9 0,4 ± 0,1* 1,0 ± 0,5*4DMF8 75,6 ± 3,7 0,4 ± 0,1* 1,2 ± 0,5*5DMF9 64,4 ± 7,2 0,1 ± 0,1* 1,0 ± 0,2*
15% GLY (Controle); 24%GLY/1%DMF; 33%GLY/2%DMF; 42%GLY/3%DMF;51%GLY/4%DMF; 62%DMF; 73%DMF; 84%DMF; 95%DMF.Asterisco na mesma coluna significa diferença entre os tratamentos e o grupo controle(p<0,05).Fonte: Adaptado de MOUSTACAS et al. (2011).
Segundo MOUSTACAS et al. (2011), a DMF não possui efeito
crioprotetor satisfatório sobre o sêmen de ovinos como em outras categorias
animais (caprinos, caninos, eqüinos e suínos) devido às diferenças existentes na
estrutura da membrana espermática.
2.3.4 Inseminação artificial com sêmen criopreservado
Apesar de encontrar no mercado equipamentos modernos para
criopreservação de sêmen, a inseminação artificial com sêmen congelado só
apresenta resultados satisfatórios de fertilização quando o sêmen é depositado
diretamente no útero através de laparoscopia (LIMA et al., 2010). São vários os
20
fatores que afetam a sobrevivência do espermatozóide ovino criopreservado
como: diluidor, concentração do crioprotetor, embalagem para o envasamento do
sêmen, velocidade de congelação e descongelação, e, qualidade do sêmen
destinado ao processo de criopreservação (SALAMON & MAXWELL, 2000).
CRUZ JÚNIOR (2006) descreveu as características morfológicas da
cérvix de ovelhas da raça Santa Inês e encontrou cinco tipos de orifício externo,
anéis com diâmetro pequeno e formato de funil e presença de fundos de saco
entre os anéis, o que mostra a grande variação entre animais e a impossibilidade
de transpor a cérvix com aplicadores convencionais. A cérvix constitui a primeira
barreira no trânsito espermático, e apresenta como um fator limitante na migração
dos espermatozóides da vagina até o útero (DRUART et al., 2009).
Quando se utiliza a criopreservação associada à sincronização de estro
em ovelhas, é necessário ultrapassar a cérvix e depositar o sêmen em região
profunda do útero para se conseguir taxas de prenhez aceitáveis (ANEL et al.,
2006).
De acordo com ANEL et al. (2006), a inseminação artificial por
laparoscopia possui limitação devido à sua complexidade, custo elevado (em
comparação com o valor do animal), necessidade de técnicos treinados e
problemas relacionados com o bem-estar animal, assim, a laparoscopia deve ser
uma técnica utilizada até que as limitações da inseminação transcervical sejam
contornadas.
2.4 Estresse oxidativo
A perda de motilidade após o processamento do sêmen é decorrente
principalmente do estresse oxidativo, o qual leva a formação de radicais livres,
oxidantes e espécies reativas do metabolismo do oxigênio (ROS), e, a diluição ou
lavagem do sêmen causa diminuição da concentração natural de antioxidantes,
promovendo menor resistência das células a essas substâncias (MAIA &
BICUDO, 2009).
O manejo reprodutivo adotado na propriedade converge diretamente na
capacidade produtiva dos animais, pois a permanência dos animais em condições
de estresse e uma nutrição desbalanceada levam a um aumento da produção de
21
ROS e/ou redução da disponibilidade de antioxidantes, levando à redução nos
índices reprodutivos (ANDRADE et al., 2010).
Todos os sistemas biológicos formam os ROS quando na mitocôndria o
oxigênio sofre redução tetravalente para a formação de H20, formando os
intermediários reativos como: superóxido (O2-), hidroxiperoxila (HO2
+), hidroxila
(OH+), peróxido de hidrogênio (H2O2) e óxido nitroso (NO-). Os organismos
aeróbios forma e degradam às ROS, pois, pequenas quantidades são
necessárias para o funcionamento das células e processo de fertilização, porém,
quando produzidos em excesso sobrecarregam as defesas antioxidantes dos
espermatozóides, prejudicando o funcionamento fisiológico das células devido ao
estresse oxidativo (NORDBERG & ARNÉR, 2001).
A produção de ROS ocorre normalmente nos indivíduos, por isso a
manipulação do sêmen deve ser criteriosa para minimizar a produção de radicais
oxidativos e proporcionar também proteção celular contra essas substâncias. A
redução do estresse oxidativo e controle dos danos causados pela queda de
temperatura devem ser elucidados para o aumento do potencial reprodutivo na
espécie ovina.
2.5 Antioxidantes
O plasma seminal ovino é um dos responsáveis pela manutenção da
qualidade, pois possui substancias como proteínas (MOURA et al., 2010) e
antioxidantes que protegem os espermatozóides de injúrias (HAFEZ & HAFEZ,
2004). Porém a lavagem realizada durante o processamento do sêmen reduz a
capacidade protetora do plasma, assim, a adição de antioxidantes sempre é
valida e necessária para manter e preservar a qualidade seminal.
A célula possui dois sistemas de defesa antioxidante para se proteger
dos efeitos deletérios da formação de ROS, um sistema enzimático e outro não
enzimático. O complexo enzimático é formado pelas enzimas: a) superóxido
dismutase (SOD), b) catalase (CAT), c) peroxiredoxinas (Prx), d) glutationa
(GSH), e) glutationa redutase (GR) e f) glutationa peroxidase (GPx). O sistema
não enzimático é conhecido por substâncias sintéticas e que são suplementados
através da dieta, formados por compostos de baixo peso molecular, como
22
vitaminas C e E, selênio, ubiquinonas, ácido úrico e ácido lipóico (NORDBERG &
ARNÉR, 2001).
Os antioxidantes endógenos podem ser insuficientes contra os efeitos
nocivos de ROS durante o armazenamento prolongado do sêmen, então, a adição
de antioxidantes tem sido utilizado para melhorar a motilidade espermática e a
integridade da membrana em sêmen manipulados (BUCAK & TEKIN, 2007). Em
estudo realizado com caprinos por BUCAK et al. (2009), os autores observaram
que a adição dos antioxidantes glutamina e ácido hialurônico melhoraram a
motilidade espermática e integridade de membrana plasmática após o
congelamento e descongelamento do sêmen.
ÇOYAN et al. (2011) avaliaram o efeito da adição de dois
antioxidantes, cisteína e ergotioneína, em diferentes concentrações (1 mM, 2 mM
e 4 mM) sobre os parâmetros espermáticos após o descongelamento de sêmen
de ovinos. De acordo com a Tabela 10, a adição de ergotioneína aumentou a
motilidade, velocidade média de percurso (VMP) e velocidade linear (VLN),
enquanto a adição de cisteína se mostrou mais eficiente na manutenção da
integridade da membrana espermátcia e atividade mitocondrial (Tabela 11). De
acordo com os dados, os autores concluíram que a ergotioneína e cisteína
melhoraram, respectivamente, os parâmetros de motilidade e atividade
mitocondrial após a criopreservação, porém, elucida que os efeitos dos
antioxidantes devem ser estabelecidos também in vivo.
TABELA 10 - Média e desvio padrão de motilidade, motilidade progressiva,velocidade média de percurso (VMP) e velocidade linear (VLN) desêmen ovino acrescido de diferentes antioxidantes e submetidos acriopreservação
Grupos Motilidade % MotilidadeProgressiva % VMP (μm/s) VLN (μm/s)
Controle 69,0 ± 2,3bc 19,6 ± 1,1a 109,7 ± 2,6a 97,6 ± 2,8bc
Cisteína 1 mM 74,3 ± 2,0abc 20,7 ± 1,7ab 105,6 ± 3,2a 90,0 ± 3,1cd
Cisteína 2 mM 72,5 ± 2,8abc 15,3 ± 1,8bc 103,5 ± 1,8a 87,1 ± 1,4d
Cisteína 4 mM 67,5 ± 4,3c 16,1 ± 1,8d 105,3 ± 3,7a 85,8 ± 3,5d
Ergotioneína 1 mM 78,1 ± 2,5ab 25,9 ± 2,2d 117,2 ± 2,0b 103,7 ± 2,4ab
Ergotioneína 2 mM 81,3 ± 2,3a 31,0 ± 2,7cd 123,5 ± 1,1b 108,8 ± 1,0a
Ergotioneína 4 mM 80,6 ± 2,9a 32,4 ± 2,2d 121,7 ± 1,6 b 105,6 ± 1,7a
P <0,05 <0,05 <0,001 <0,001a,b,c,dLetras diferentes na mesma coluna demonstram diferenças significativas.Fonte: ÇOYAN et al. (2011).
23
TABELA 11 - Média e desvio padrão da integridade de membrana espermática,integridade acrossomal e atividade mitocondrial de sêmen ovinoacrescido de diferentes antioxidantes e submetidos àcriopreservação
Grupos Integridade deMembrana %
IntegridadeAcrossomal %
AtividadeMitocondrial %
Controle 60,4 ± 1,8bc 36,42 ± 2,6 35,3 ± 7,0bc
Cisteína 1 mM 67,6 ± 3,8ab 39,2 ± 2,6 66,6 ± 10,6a
Cisteína 2 mM 72,8 ± 6,9a 34,5 ± 3,8 67,4 ± 6,1a
Cisteína 4 mM 60,7 ± 1,7bc 40,0 ± 7,4 57,7 ± 19,3ab
Ergotioneína 1 mM 50,5 ± 3,6c 36,6 ± 5,3 26,9 ± 5,8c
Ergotioneína 2 mM 51,6 ± 3,3c 32,3 ± 5,8 28,5 ± 8,8c
Ergotioneína 4 mM 52,0 ± 2,8c 28,7 ± 4,3 18,7 ± 6,6c
P <0,001 - <0,05a,b,cLetras diferentes na mesma coluna demonstram diferenças significativas.Fonte: ÇOYAN et al. (2011).
RUIZ et al. (2007) também avaliaram o efeito de dois antioxidantes
para a criopreservação de sêmen de ovino. Foi utilizado um diluidor a base de
Tris, acrescido dos antioxidantes Tempo (2,2,6,6 tetrametil-1-piperidiniloxil) e
Tempol (4-hidroxi 2,2,6,6 tetrametil-1-piperidiniloxil) em diferentes concentrações
(0,5 mM; 1,0 mM e 2,5 mM). Conforme Tabela 12, a adição de 0,5 mM do
antioxidante Tempo reduziu a perda de motilidade progressiva (78,9 ± 4,7) e
integridade de acrossoma (69,9 ± 6,4) em relação ao grupo controle (66,9 ± 4,8 e
58,4 ± 5,6), contudo esse efeito não pode ser observado com o uso do
antioxidante Tempol, que inclusive ocasionou redução na qualidade seminal.
TABELA 12 - Média e desvio padrão da motilidade progressiva e integridadeacrossomal de sêmen ovino criopreservado com diferentesconcentrações de antioxidantes
Tratamentos Motilidade Progressiva Integridade Acrossomal
Sem antioxidante 66,9 ± 4,8b 58,4 ± 5,6bTempo 0.5 mM 78,9 ± 4,7a 69,9 ± 6,4aTempo 1.0 mM 66,1 ± 8,0b 57,5 ± 6,7bTempo 2.5 mM 48,9 ± 4,5c 43,8 ± 5,0cTempol 0.5 mM 45,1 ± 5,7c 40,4 ± 5,8cTempol 1.0 mM 34,5 ± 4,7d 31,8 ± 4,9dTempol 2.5 mM 21,7 ± 5,0e 22,7 ± 3,6ea,b,c,d,eIndicam diferenças significativas dentro da coluna (p<0,005)FONTE: RUIZ et al. (2007).
24
É importante salientar que o uso de antioxidantes se faz necessário
devido aos procedimentos realizados durante a criopreservação, como exemplo
diluição e lavagem, que reduzem a proteção dos antioxidantes naturais. Porém o
uso indevido pode levar a redução do potencial de fertilização dos
espermatozóides e consequente queda dos índices reprodutivos.
25
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A eficiência reprodutiva se faz necessária para a intensificação da
ovinocultura nacional e multiplicação de genótipos superiores, a fim de obter
produtos em quantidade e qualidade que atenda todos os mercados.
As biotécnias reprodutivas como refrigeração e criopreservação do
sêmen constituem importantes ferramentas na difusão da inseminação artificial
em ovinos, que atualmente se encontra com níveis ainda insatisfatórios. As
pesquisas com o sêmen, a busca por substâncias que minimizam as injúrias
causadas pela queda de temperatura e a padronização nos processos de
congelamento e descongelamento seminal, são necessárias para o incremento e
disseminação na utilização de sêmen refrigerado e congelado para inseminação
artificial.
As busca por melhores resultado deve ser maciça e crescente, pois a
melhora nos resultados, principalmente in vivo, é primordial para alcançar um
patamar reprodutivo com eficiência satisfatória, e, colocar carne ovina de
qualidade acessível a todos.
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