síntesis y determinación estructural de péptidos derivados ...diferentes secuencias peptídicas....
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Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de
Dermaseptina con actividad antileishmanial
CARLOS ANDRÉS RODRÍGUEZ VEGA
Universidad Nacional de Colombia - Sede Medellín Facultad de Ciencias Escuela de Química
Maestría en Ciencias Química Proyecto Bicentenario: Actividad citotóxica e inmunomoduladora de
péptidos sintéticos de origen natural - 20101007930 2011
Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de
Dermaseptina con actividad antileishmanial
CARLOS ANDRÉS RODRÍGUEZ VEGA
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ciencias Química
Directora:
PhD. BLANCA FABIOLA ESPEJO BENAVIDES
Grupo de Investigación:
Grupo Fisicoquímica Orgánica
Universidad Nacional de Colombia - Sede Medellín
Facultad de Ciencias
Escuela de Química
Maestría en Ciencias Química
Proyecto Bicentenario: Actividad citotóxica e inmunomoduladora de péptidos sintéticos de
origen natural - 20101007930
2011
Agradecimientos
A Dios, por todas las bendiciones y su compañía durante toda mi vida; por iluminar el camino y fortalecerme en aquellos momentos difíciles, poniendo en mi camino personas valiosas que me ayudaron a superar los obstáculos. A mi familia, especialmente a mi madre Rosana por sus sacrificios que hicieron posible que pudiera superarme cada día. A mis hermanos Ana M. y Rubén, los cuales fomentaron en mi el espíritu de superación. Agradezco sinceramente a la Doctora Blanca Fabiola Espejo Benavides, Directora de mi tesis de maestría, por su apoyo incondicional, confianza y enseñanza durante el desarrollo de mi tesis. Al grupo de investigación en inmunotoxicología (COL 0068495) de la Universidad Nacional de Colombia en Bogotá, bajo la dirección de la Doctora Gabriela Delgado por toda la colaboración brindada en los ensayos biológicos. Hago un agradecimiento especial a Julián Pérez Cordero por su colaboración y valiosa amistad. . A la Universidad Nacional de Colombia por permitir mi ingreso a los estudios de educación superior, acogiéndome con profesores de alto conocimiento y calidad humana. Un especial agradecimiento a la profesora y amiga Luz Mary Salazar Pulido por su apoyo y confianza en mi vida profesional y personal. A mis amigos Diana M. Arango, Ana Cristina Jaramillo, Pablo Andrés Ruiz, y Alejandro Chacón por todo su apoyo y colaboración. Y a todas aquellas personas que de una u otra forma participaron en la realización de esta investigación, hago un sincero agradecimiento.
Resumen y Abstract IV
Resumen
En este estudio se sintetizaron 11 péptidos con posible actividad biológica contra
Leishmania panamensis por medio de síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS), a
partir de aminoácidos N-Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo) protegidos [1], purificados por
liofilización y cromatografía líquida de alta eficiencia en fase reversa (RP-HPLC),
caracterizados por espectrometría de masas y dicroísmo circular (DC), lo cual permitió
establecer la estructura secundaria de carácter helical de los péptidos. Se encontró
actividad contra Leishmania panamensis, lo cual nos lleva al uso potencial como
compuesto activo para el tratamiento de la Leishmaniasis. La mejor acción biológica
contra el parasito se encontró para el péptido DM1, el cual fue capaz de inhibir el
crecimiento de promastigotes de L. panamensis a concentraciones de uso terapéutico,
causando porcentajes de hemólisis y de citotoxicidad relativamente bajos.
Palabras clave: Péptidos sintéticos, leishmaniasis, Leishmania panamensis, Fmoc.
Abstract
In this study we synthesized and evaluated 11 peptides with possible biological activity
against Leishmania panamensis by solid-phase peptide synthesis (SPPS), from amino
acids N-Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) protected [1], purified by lyophilization and
high performance liquid chromatography in reverse phase (RP-HPLC), characterized by
mass spectrometry and circular dichroism (CD), which allowed us to establish the
secondary structure of helical nature of the peptides. We found activity against
Leishmania panamensis, which leads to the potential use as active compound for the
treatment of leishmaniasis. The best biological action against the parasite was found for
the peptide called DM1, which was able to inhibit the growth of L. panamensis
promastigotes at concentrations of therapeutic use, causing hemolysis rates and
cytotoxicity of monocytes relatively low.
Keywords: Synthetic peptides, leishmaniasis, Leishmania panamensis, Fmoc.
Contenido V
Contenido
Pág.
Resumen ......................................................................................................................... IV
Lista de figuras .............................................................................................................. VII
Lista de tablas .............................................................................................................. VIII
Lista abreviaturas ........................................................................................................... IX
Introducción .................................................................................................................... 1
1. Planteamiento del problema y justificación ........................................................... 3
2. Hipótesis ................................................................................................................... 7
3. Objetivos ................................................................................................................... 9
3.1 Objetivo general: ................................................................................................ 9
3.2 Objetivos específicos: ........................................................................................ 9
4. Marco teórico y estado del arte ............................................................................. 11
4.1 Leishmaniasis, enfermedad tropical endémica ................................................. 11
4.2 Péptidos antimicrobianos, Dermaseptinas ........................................................ 13
4.3 Síntesis de péptidos ......................................................................................... 15
4.4 Síntesis de péptidos en fase sólida .................................................................. 16
4.5 Soporte sólido para SPPS ................................................................................ 19
4.6 Disolventes en SPPS ....................................................................................... 19
4.7 Agitación y lavados en SPPS ........................................................................... 20
5. Materiales y métodos ............................................................................................. 21
5.1 Estudios previos y selección de secuencias para síntesis ................................ 21
VI Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina con actividad antileishmanial
5.2 Síntesis química en fase sólida Fmoc de las secuencias .................................. 21
5.3 Purificación de los péptidos .............................................................................. 23
5.3.1 Liofilización .....................................................................................................23
5.3.2 Cromatografía líquida de alta eficiencia ..........................................................23
5.4 Caracterización de los péptidos ........................................................................ 24
5.4.1 Espectrometría de masas MALDI-TOF ...........................................................24
5.4.2 Dicroísmo circular (DC) ..................................................................................24
5.5 Ensayos biológicos ........................................................................................... 24
5.5.1 Hematíes ........................................................................................................25
5.5.2 Monocitos .......................................................................................................25
5.5.3 Parásitos ........................................................................................................25
5.5.4 Péptidos y controles .......................................................................................26
5.5.5 Ensayos de hemólisis .....................................................................................26
5.5.6 Ensayos de citotoxicidad ................................................................................27
5.5.7 Ensayos de efectividad sobre formas extracelulares de L. panamensis. ........28
6. Resultados y discusión ..........................................................................................30
6.1 Estudio previo y análisis bioinformático ............................................................. 30
6.2 Síntesis química Fmoc de los análogos seleccionados ..................................... 34
6.3 Purificación de péptidos .................................................................................... 43
6.4 Caracterización de péptidos .............................................................................. 45
6.4.1 Espectrometría de masas MALDI-TOF ...........................................................45
6.4.2 Dicroísmo circular ...........................................................................................50
6.5 Ensayos biológicos ........................................................................................... 53
6.5.1 Ensayo de hemólisis ......................................................................................53
6.5.2 Ensayo de citotoxicidad ..................................................................................55
6.5.3 Ensayos de efectividad sobre promastigotes de L. panamensis .....................55
7. Conclusiones ..........................................................................................................61
Bibliografía .....................................................................................................................63
Lista de figuras VII
Lista de figuras
Figura 1. Principios de SPPS tomado de [56] ................................................................ 17
Figura 2. Epimerización por medio de la formación de Oxazolonas, tomado de [56]. ... 18
Figura 3. Helical Wheel para DM1 ................................................................................. 33
Figura 4. Helical Wheel para DM17 ............................................................................... 33
Figura 5. Reacciones para la activación de Fmoc-aminoácidos con DCC y HOBt ......... 35
Figura 6. Mecanismo de desprotección grupo Fmoc ..................................................... 37
Figura 7. Reacciones para la prueba de ninhidrina en presencia de un grupo amino. ... 39
Figura 8. Esquema de desanclaje de un pentapéptido en medio ácido ......................... 41
Figura 9. Esquema de formación de dicetopiperazinas, tomado de [92] ........................ 42
Figura 10. Corrida cromatográfica en fase reversa para DM11 ...................................... 44
Figura 11. Formación de piroglutámico a partir de glutamina ......................................... 46
Figura 12. Espectro de masas MALDI-TOF para DM1 ................................................... 47
Figura 13. Espectros de masas MALDI-TOF para análogos de dermaseptina ............... 48
Figura 14. Espectros de DC para análogos de dermaseptina ........................................ 52
Figura 15. Efecto de la concentración de DM1 sobre la supervivencia de L. panamensis
....................................................................................................................................... 57
Figura 16. Gráfico de la distribución de la hidrofobicidad por aminoácido para los
análogos de dermaseptina. ............................................................................................ 58
Lista de tablas VIII
Lista de tablas
Tabla 1. Estudio bioinformático de Dermaseptina S1...................................................... 31
Tabla 2. Secuencias de los análogos seleccionados para el estudio .............................. 32
Tabla 3. Tiempo total y número de ciclos efectuados para la síntesis de los análogos ... 41
Tabla 4. Tiempo total y número de ciclos en los análogos de dermaseptina ................... 43
Tabla 5. Tiempos de retención y pico de masas para los análogos de dermaseptina ..... 45
Tabla 6. Variaciones más comunes de m/z encontradas para los análogos de
dermaseptina .................................................................................................................. 49
Tabla 7. Estructura secundaria de los análogos de dermaseptina por dicroísmo circular
con el programa CONTINLL ............................................................................................ 51
Tabla 8. Actividad hemolítica y citotóxica de los péptidos sobre eritrocitos y monocitos de
sangre periférica humana respectivamente. La concentración media Hemolítica (HC50) y
la concentración letal media (CL50) expresada en μg/mL ................................................ 54
Tabla 9. Eficacia de los análogos de dermaseptina sobre promastigotes de L.
panamensis. La concentración media efectiva (EC50) es expresada en μg/mL. ............. 56
Tabla 10. Secuencias de análogos modificados de DM1 ................................................ 60
Lista de abreviaturas IX
Lista abreviaturas
ACN: acetonitrilo Boc: tertbutoxicarbonilo Bzl: bencilo CE50: Concentración efectiva media CH50: Concentración hemolítica media CL: Leishmania cutánea CL50: Concentración letal media DC: Dicroísmo circular DCC: N,N´-diciclohexilcarbodiimida DCM: diclorometano DIEA: N,N-diisopropiletilamina DMF: dimetilformamida EDT: 1,2-etanoditiol FBS: Suero fetal bovino Fmoc: 9-fluorenilmetoxicarbonilo HF: Fluoruro de hidrógeno HOBt: 1-hidroxibenzotriazol IPA: isopropanol L. panamensis: Leishmania panamensis MALDI-TOF: Matrix-Assisted Laser Desorption of Ions Time-of-Flight NMP: N-metilpirrolidona OMS: Organización mundial de la salud OtBu: t-butil éster PA: Poliamida PAM´s: Péptidos antimicrobianos Pbf: 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo PBS: Buffer fosfato salino PEG: Polietilenglicol PS: Poliestireno entrecruzado RP-HPLC: Cromatografía líquida de alta eficiencia en fase reversa RPMI: medio Roswell Park Memorial Institute SPPS: Síntesis de péptidos en fase sólida TBTU: O-(1H-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetrametiluronio tBu: t-butilo TFA: ácido trifluoroacético TFE: 2,2,2-trifluoroetanol TIS: triisopropilsilano UFA: Unidades arbitrarias de fluorescencia VL: Leishmania visceral
Introducción
Los péptidos antimicrobianos (PAMs) son moléculas muy importantes en el sistema
inmune de muchos organismos, incluyendo el humano. Estos péptidos usualmente son
de tamaño pequeño, con características amfipáticas y carga positiva totalmente definida
[2, 3]. Para los PAMs se ha encontrado actividad contra virus, hongos, bacterias e incluso
contra células tumorales. Los mecanismos de acción de los diferentes péptidos
reportados son demasiados, entre los representativos se encuentran la interacción con
membrana celular, inhibición en alguna de las funciones como la síntesis de ácidos
nucleicos y proteínas, también se reporta acción inmunomoduladora y cicatrizante [4, 5].
El presente estudio propuso sintetizar y evaluar la actividad de 11 péptidos sintéticos a
diferentes concentraciones frente a parásitos de Leishmania. Los resultados indican que
de las once secuencias, solo 1 mostró actividad Leishmanicida contra promastigotes de
L. panamensis nombrado como DM1. La concentración efectiva media (CE50) hallada
fue de 151,9μg/mL con R2 superior a 0.9 para todos los ensayos. Se realizaron las curvas
de viabilidad de L. panamensis vs la concentración empleada para DM1.
Se estandarizó y se puso a punto la técnica para obtener por medio de síntesis Fmoc, las
diferentes secuencias peptídicas. Para estas secuencias se varió la concentración de
activadores, aminoácidos y naturaleza del solvente, usando una resina Rink amida de
sustitución conocida. La cantidad de péptido obtenido estuvo alrededor de los 50 mg de
péptido/ 100 mg de resina. En este estudio, la síntesis en fase sólida Fmoc resulto ser
una alternativa limpia y óptima para la producción de péptidos con actividad biológica. La
purificación de cada uno de los péptidos se realizó por cromatografía líquida de alta
eficiencia en fase reversa (RP-HPLC) y liofilización. Se logró establecer el gradiente de
solventes ideal para la purificación de cada uno de los péptidos. La caracterización de los
péptidos se realizó por espectrometría de masas MALDI-TOF, en la cual se logró
confirmar las secuencias peptídicas.
2 Introducción
Con ayuda de las herramientas bioinformáticas, usando el servidor Scratch Protein
Predictor (http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/) [6], se realizaron las predicciones de la
estructura secundaria de cada una de las secuencias, las cuales fueron comparadas con
los datos experimentales obtenidos por medio de dicroísmo circular (DC), indicando que
tanto por medio de las herramientas bioinformáticas como por DC el carácter helical de
todas las secuencias estuvo por encima de 41.5%.
Por otro lado, a las máximas concentraciones evaluadas para cada uno de los péptidos,
la citotoxicidad sobre monocitos de sangre periférica humana fue mínima calculándose
concentración letal media (CL50) superiores a 200μg/mL. El estudio del carácter
hemolítico de cada una de las secuencias se evaluó sobre eritrocitos humanos de
donantes sanos grupo O Rh positivo, encontrando porcentajes menores de 6.2% a la
máxima concentración del estudio.
1. Planteamiento del problema y justificación
Las infecciones bacterianas y parasitarias en humanos han aumentado de forma
dramática debido a la aparición de cepas resistentes a los compuestos antibacterianos y
antiparasitarios, por lo que la búsqueda y desarrollo de nuevos compuestos con actividad
antibacterial y antiparasitaria se ha convertido en una prioridad para el control de la
resistencia y multirresistencia que los microorganismos generan en el organismo. Aunque
la resistencia a los péptidos antimicrobianos es mucho menor comparada con antibióticos
convencionales, existen mecanismos de resistencia, tales como la degradación por
proteasas, la liberación de proteínas inhibidoras o cambios en la conformación de la
membrana externa del patógeno [7] que hacen que se busquen y mejoren este tipo de
moléculas. El desarrollo de nuevos agentes antibacterianos requiere de la elaboración
eficaz de compuestos que preferiblemente sean encontrados de manera natural y que
sean viables de obtener por medio de metodologías sintéticas relativamente económicas
y favorables con el medioambiente, haciendo a este tipo de moléculas selectivas y con
alta actividad frente a los diferentes microorganismos que causan diferentes
enfermedades.
La diversidad de péptidos de origen natural que tienen actividad biológica demostrada es
alta. Hasta el momento se encuentran reportadas 21,698 secuencias contra cáncer,
enfermedades cardiovasculares, diabetes, apoptosis entre otras [8]. Se ha encontrado
que la linfa de los insectos, los gránulos de los neutrófilos humanos y la piel de las ranas
contienen péptidos que pueden matar bacterias en medios de cultivos [7]. Además de
destruir directamente microorganismos, algunos son capaces de promover la generación
de cierta inmunidad, particularmente de la inmunidad innata, lo que genera el concepto
de péptidos de defensa innata [9, 10]. A partir de la estructura de los péptidos naturales
se llevan a cabo variaciones en la síntesis para obtener nuevos péptidos que aumenten
la actividad antimicrobiana y presenten baja toxicidad, como es el caso de la actividad
antileishmanial [11, 12].
4
Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina con actividad antileishmanial
Las especies como insectos, animales y plantas que son capaces de sobrevivir y convivir
en un medio ambiente hostil donde un ser humano no podría, eventualmente poseerían
un "sistema inmune" o de defensa que proporciona una mayor posibilidad de
supervivencia. Estas cualidades pueden ser usadas al enfrentarlas a ciertos
microorganismos que causen problemas en el hombre. Si buscamos, localizamos e
identificamos las moléculas secretadas por estos organismos, en su mayoría péptidos,
podremos llegar a encontrar nuevas y efectivas soluciones que permitan tratar y enfrentar
ciertas enfermedades que son resistentes a medicamentos conocidos actualmente.
Uno de los problemas que se ha intentado enfrentar es una enfermedad de tipo
parasitaria denominada Leishmaniasis, que tiene un carácter endémico en regiones de
América, África, Asia y los países europeos meridionales. Según datos de la
Organización Mundial de la Salud (OMS), más de 350 millones de personas en 88 países
corren el riesgo de infección de esta enfermedad tropical. Se cree que cerca de 12
millones de personas están infectadas actualmente, y se esperan de 1-2 millones de
nuevos casos por año [13]. Hasta el momento no existe ninguna vacuna eficaz contra la
leishmaniasis y el único método para tratar la enfermedad consiste en tratamiento con
diferentes fármacos los cuales en su mayoría se han desarrollado a mitad del siglo
pasado [14]. Como la resistencia del parásito frente a los medicamentos usados se
vuelve más frecuente, hay una creciente preocupación de que los fármacos actualmente
se conviertan en tratamientos ineficaces para el control de la enfermedad. En
consecuencia, existe una necesidad apremiante de desarrollar nuevos compuestos que
sean activos contra cepas resistentes de los medicamentos que actualmente se usan
para el tratamiento de la Leishmania. Por tanto, el desarrollo de nuevos agentes
antileishmaniales basados en péptidos con una actividad específica se convierte en una
alternativa de gran interés para combatir la enfermedad.
En este trabajo se realizó el diseño y síntesis de péptidos derivados de Dermaseptina
(ALWKTMLKKLGTMALHAGKAALGAAADTISQGTQ) [12, 15], los cuales fueron
sintetizados por la técnica en fase sólida Fmoc, purificados por Liofilización y HPLC en
fase reversa (RP-HPLC) y caracterizados por espectrometría de masas MALDI-TOF y
Dicroísmo Circular (DC). De los péptidos evaluados, solo 1 presentó actividad contra
Planteamiento del problema y justificación 5
promastigotes de L. panamensis lo cual es un indicio de su potencial actividad
antimicrobiana contra esta especie del parásito Leishmania.
2. Hipótesis
El uso de péptidos como tratamiento contra la Leishmania está muy poco estudiado. Uno
de los estudios reportados consiste en evaluar el potencial antileishmanial de Andropina,
Cecropina A, Cecropina B, Cecropina P1 y Dermaseptina. De los péptidos evaluados,
sólo Dermaseptina presentó actividad Leishmanicida (selectiva frente a Leishmania
major) y a concentraciones iguales o superiores a 12.5 μg/mL presentó actividad
hemolítica y citotóxica [16]. La modificación de las secuencias con actividad demostrada,
abrirá un campo más amplio para el mejoramiento de moléculas biológicamente activas y
de mayor eficacia para el control y tratamiento de la enfermedad. La actividad citotóxica
demostrada de los péptidos sobre la bicapa lipídica y al momento de usarlos vía
sistémica hace que se tenga en cuenta esta actividad para el mejoramiento de
propiedades como carga y estructura de los péptidos [3]. Realizar rompimientos dirigidos
de la secuencia de Dermaseptina con ayuda de herramientas bioinformáticas, tendrá
efecto sobre la actividad antileishmanial de L. panamensis, citotoxicidad y carácter
hemolítico, las cuales estarán relacionadas directamente con la variación de la estructura
secundaria, en especial α-hélice, y de alguna manera con la carga de las moléculas
propuestas.
3. Objetivos
3.1 Objetivo general:
Sintetizar y evaluar 11 péptidos derivados de Dermaseptina que posean acción sobre
promastigotes de Leishmania aumentando la actividad antileishmanial.
3.2 Objetivos específicos:
Adecuar los protocolos necesarios para sintetizar y purificar péptidos con
actividad biológica contra leishmaniasis.
Evaluar la contribución de la estructura de los péptidos en la actividad frente a
Leishmania.
Estudiar la acción biológica de los péptidos sintetizados y compararla con la de
péptidos ya reportados.
Modificar los análogos de Dermaseptina usando herramientas bioinformáticas con
el fin de aumentar la actividad antileishmanial.
4. Marco teórico y estado del arte
4.1 Leishmaniasis, enfermedad tropical endémica
Una de las enfermedades relevantes en los humanos es la Leishmaniasis, causada por
un parásito protozoo que afecta principalmente a vertebrados, incluido el hombre,
perteneciente a la familia Trypanosoniatidae y causante del conjunto genérico de
enfermedades denominado leishmaniasis, las cuales tienen diversos síntomas y
básicamente dependen de la especie de Leishmania y del estado inmunológico del
hospedador [17, 18]. El origen de la enfermedad aún no es muy claro, pero se cree que
su origen es en África migrando posteriormente del viejo mundo a América hace mas de
3 millones de años [19]. Las formas clínicas de la enfermedad son tres: la cutánea, la
muco-cutánea y la visceral o kala azar. La forma más común de la enfermedad es la
cutánea, con un amplio espectro de manifestaciones, que van desde lesiones simples en
la piel, hasta destrucción de tejido en la mucosa [20]. La leishmaniasis visceral es la
forma más severa de la enfermedad, y se caracteriza por síntomas como fiebre
prolongada, agrandamiento del bazo, aumento de las inmunoglobulinas, entre otros. En
la mayoría de los casos, si no es atendida a tiempo, la leishmaniasis visceral puede
causar la muerte [21]. La mortalidad y la morbilidad causadas por leishmaniasis (tanto la
leishmaniasis visceral [VL] y Leishmaniasis cutánea [CL]) solo es superado por la malaria
y la filariasis linfática, llamada comúnmente elefantiasis [22].
La propagación y la gravedad de la enfermedad se ven aumentadas por su coinfección
con VIH en algunos pacientes [23]. El tratamiento para la leishmaniasis, así como para la
tripanosomiasis (otra enfermedad parasitaria causada por kinetoplastidios), es complejo.
La forma más grave de la Leishmania, la VL requiere de un tratamiento con
medicamentos que resulta ser prolongado, costoso y con reacciones adversas en el
organismo. Además, se complica por la resistencia que genera la Leishmania contra los
medicamentos [24, 25]. Esta tendencia a la resistencia de los actuales medicamentos por
12 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
parte del parásito, ha dado lugar a la utilización de fármacos más tóxicos en el
tratamiento de esta infección parasitaria. Esos factores junto con la falta de vacunas
eficaces contra la enfermedad, hacen que el descubrimiento de nuevos agentes
terapéuticos sea una prioridad para la OMS y el mundo entero [26].
Los fármacos actualmente en uso para el tratamiento de la Leishmaniasis se limitan a
cuatro. Los compuestos de primera línea son dos antimoniales pentavalentes,
estibogluconato de sodio (Pentostam) y antimoniato de metilglumina (Glucantime). Estos
compuestos se usaron por primera vez en 1947 y 1950, respectivamente. Son
administrados por vía parenteral en dosis de 10-20 mg Sb/kg/día durante 10 a 30 días.
Las recaídas se producen en todas las formas de la leishmaniasis y en la mayoría de los
casos es la causa de abandono del tratamiento por parte de los pacientes. Sí estos
fármacos no son eficaces, se usan los compuestos de segunda línea que son la
pentamidina (Lomidine) y anfotericina B (Fungizone), introducidos en 1940 y 1959,
respectivamente [24, 27].
Hasta el momento no existen vacunas efectivas que permitan combatir o prevenir la
Leishmaniasis [28], aunque algunos medicamentos experimentales están pasando por
ensayos clínicos. Estos son:
El alopurinol, un fármaco en uso para el tratamiento de la gota. Se supone que
funciona como un sustrato alternativo para la enzima transferasa hipoxantina
guanina fosforribosil (HGPRTase), lo que conduce a la inhibición de la síntesis de
proteínas en el parásito. También es usado para tratar la enfermedad de Chagas
y actualmente para el tratamiento de la leishmaniasis en perros. [29]
El Ambisome, una formulación de anfotericina B en liposomas. Debido a la alta
capacidad de interacción de los macrófagos, las células huésped del parásito
Leishmania, el fármaco se convierte en un objetivo específico y es captado por
estas células. Esto aumenta la eficacia y reduce la toxicidad del fármaco. [30]
El Ketoconazol (Janssen Pharmaceutica), un inhibidor del citocromo P450 y de la
síntesis de egosterol que corresponde a esteroles de la membrana. Además se
usa para el tratamiento tópico de enfermedades sistémicas y otras infecciones por
hongos. También inhibe la síntesis de esteroles en Leishmania e interfiere con su
Marco teórico y estado del arte 13
crecimiento y división intracelulares. Se usa en perros y en seres humanos en
algunos países latinoamericanos [30, 31].
La leishmaniasis representa un reto mundial para el descubrimiento de nuevas
alternativas que permitan controlar y frenar la infección. En Colombia el panorama sobre
la enfermedad no es muy alentador, se tiene reportes que en el periodo comprendido
entre el 2005 al 2009 Colombia registro cerca de 63000 casos de leishmaniasis cutánea,
de los cuales el 50% compromete a militares de las fuerzas armadas colombianas. Una
de las preocupaciones es el aumento de las notificaciones acerca de casos de
Leishmania, reflejando un posible incremento de la transmisión atribuido a factores como
el aumento del contacto humano con ambientes silvestres en donde aumenta el riesgo
por transmisión con la fauna especifica del lugar y a los cambios de los entornos,
incluyendo zonas selváticas donde el acceso al sistema de salud no es el ideal [32, 33].
El potencial uso de emulsiones, liposomas y nanopartículas que sean capaces de portar
un fármaco activo contra la enfermedad, ha adquirido mucho interés debido
principalmente a su versatilidad y a las ventajas de este tipo de moléculas al tiempo de
atacar cualquier forma del parasito [28]. La liberación controlada de medicamentos y
moléculas biológicamente activas, en especial nanopartículas, es de gran interés, debido
a que son consideradas partículas “inteligentes” de pequeño tamaño (de 1nm hasta
100nm) que contienen una sección de reconocimiento y una parte terapéutica. La
variedad de este tipo de partículas es alta, se conocen nanopartículas de naturaleza
orgánica e inorgánica con características biodegradables y no degradables [34].
4.2 Péptidos antimicrobianos, Dermaseptinas
En los años sesenta se observó la presencia de un péptido con actividad antimicrobiana
y hemolítica en la piel de un sapo de panza amarilla, Bombina variegata y se le denominó
bombinina por Kiss y Michl [35]. En 1972 Habermann [36] descubrió en el veneno de
ciertas abejas y avispas un péptido que fue denominado melitina. Posteriormente, en
1980 Hans en Estocolmo demostró la presencia de péptidos antibióticos inducibles en la
14 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
hemolinfa de lepidópteros [37]. Se sabe que tanto plantas como animales e incluso
microorganismos comparten un mecanismo de defensa efectivo frente a los patógenos
invasores. Existen trabajos descritos en insectos [37], crustáceos [38], anfibios [39],
mamíferos [40] y plantas [41], bacterias, hongos y virus [42]. En determinadas
circunstancias, y ante un proceso inflamatorio o infeccioso, la presencia de éstos
péptidos antibióticos en diferentes animales y también en los humanos aumenta. Además
se sabe que los péptidos producidos por células eucariotas pueden presentar actividad
antibacteriana, antifúngica, antiparasitaria, antiviral o antitumoral [41].
Los antimicrobianos convencionales, son aquellas moléculas que logran inhibir el
crecimiento o que eliminan totalmente al microorganismo, denominada acción
bacteriostática o acción bactericida respectivamente. La obtención de esos compuestos
activos puede provenir de diferentes fuentes como insectos, anfibios, mamíferos y
plantas para la preparación de productos farmacéuticos. Los antibióticos, como la
penicilina, son moléculas que en la mayoría de los casos tienen actividad antimicrobiana
y fueron obtenidas en un principio por hongos y levaduras. Actualmente, algunos
investigadores obtienen nuevos agentes medicinales partiendo de ventajas naturales de
ciertos países e integrando áreas como la bioquímica, biología molecular y últimamente
la bioinformática, para permitir el hallazgo de novedosos antimicrobianos que son parte
de las líneas primarias de defensa de los organismos [43, 44].
Por otro lado, encontramos las Dermaseptinas
(GLWSKIKEVGKEAAKAAAKAAGKAALGAVSEAV), que corresponden a una familia de
ocho péptidos estrechamente relacionados que fueron aislados originalmente de la piel
de una rana de Sur América (Phyllomedusa sauvagei). Estos compuestos son péptidos
lineales, compuestos de 28 a 34 aminoácidos, con estructura en α-hélices de tipo
anfipática en disolventes apolares [45]. Todos los péptidos conservan residuos de
Triptófano (W) en la posición 3, y una carga positiva atribuible a la presencia de residuos
de Lisina (K) que marcan una cierta distribución en la secuencia [45, 46]. Algunas
dermaseptinas muestran una notable capacidad para inhibir células microbianas de
manera eficiente, rápida e irreversible sin efecto tóxico sobre las células de mamíferos
[47, 48]. Se ha demostrado que las Dermaseptinas también son eficaces contra
Marco teórico y estado del arte 15
protozoos (Leishmania mexicana y Plasmodium falciparum) [49-51], levaduras y hongos
filamentosos (Aspergillus fumigatus y Aspergillus niger) [46, 51].
4.3 Síntesis de péptidos
Los péptidos (del griego πέσσειν Peptein que significa digerir) son moléculas en la
mayoría de los casos biológicamente activas constituidas de aminoácidos. Los péptidos
se pueden explicar como la formación química repetida de enlaces amida, en los cuales,
las funciones carboxilo y amina de L-α-aminoácidos adyacentes son conectados entre sí.
La complejidad de este enlace es muy alta, ya que los L-α-aminoácidos como su nombre
lo indica, tienen dos grupos funcionales, y estos dan la posibilidad de formar especies no
deseadas, por lo cual es necesario proteger ciertos grupos funcionales y únicamente
dejar desprotegidas una de las funciones para lograr el enlace peptídico deseado.
Además, muchos de estos aminoácidos tienen grupos funcionales en su cadena lateral,
lo que hace que deban estar protegidos durante la síntesis. Cuando la secuencia de
aminoácidos es superior a 50 aminoácidos, se denomina proteína, considerando las
proteínas como los compuestos de gran peso molecular, de actividad biológica
reconocida y constituida de péptidos.
La historia de la síntesis química de péptidos inicia desde 1901, cuando Emil Fischer
logró descomponer ciertas proteínas en aminoácidos y también formar de manera
sintética el primer dipéptido de Glicilglicina por hidrólisis de dicetopiperacina de la glicina
[52]. En ese momento solo se realizaban péptidos de un solo tipo de residuo, y el avance
de la síntesis química se vio retrasada. En 1906, Fischer junto con Axhausen sintetizaron
un octadecapeptido L-(G)3-L-(G)3-L-(G)9, para el cual se empleó el primer grupo protector
tipo uretano, etoxycarbonilo (C2H5OCO), el cual abrió la puerta para usar protectores de
este tipo, que son removidos en condiciones básicas. En 1932, Max Bergmann y
Leonidas Zervas, introdujeron el grupo benzyloxicarbonilo como grupo protector, que fue
usado en 1953 para producir una de las primeras hormonas oligopeptídicas, la Oxytocina
por du Vigneaud [52]. Los anteriores métodos se basaban en la adición secuencial de
aminoácidos en solución, que implicaba pasos muy tediosos de purificación y
cuantificación. En 1963, Merrifield realizó la primera síntesis de un tetrapéptido LAGV por
16 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
estrategia en fase sólida, usando una resina de poliestireno como soporte sólido [53]. A
partir de ese momento, la síntesis en fase sólida para la producción de péptidos ha
avanzado considerablemente.
Los métodos de síntesis actualmente se puede dividir en dos grandes clases, Lineal y
Convergente. En la síntesis lineal la elongación secuencial de la cadena peptídica se da
aminoácido tras aminoácido [54]. Es importante resaltar que la síntesis química de los
péptidos se da por la adición de los aminoácidos de manera contraria a la que se da en el
ribosoma, se va adicionando el aminoácido al soporte sólido por su extremo C- terminal
hasta el N-terminal, para evitar la pérdida de la quiralidad de los residuos implicados. En
la estrategia convergente, las unidades que se agregan no son aminoácidos protegidos,
sino que son péptidos protegidos [55].
4.4 Síntesis de péptidos en fase sólida
La síntesis en fase sólida no es una metodología exclusiva para la alternativa secuencial,
pero ha tenido mayor importancia en este tipo de síntesis. La síntesis de péptidos implica
numerosos pasos repetitivos y el uso de un soporte sólido con numerosas ventajas. Los
excesos de los reactivos y de productos secundarios se pueden separar del péptido
insoluble simplemente por filtración y lavados, haciendo que todos los pasos de síntesis
se realicen de manera consecutiva. Los principios de SPPS se ilustran en la figura 1. El
aminoácido C-terminal y N-protegido es anclado a través de su grupo carboxilo a un
grupo hidroxilo (o cloro) o resina con un grupo amina para producir un péptido con
extremo C-terminal de tipo éster o amida respectivamente. Después de anclar el primer
aminoácido, la secuencia deseada se va montando por metodología lineal desde el
extremo C-terminal a N-terminal mediante ciclos repetitivos de n-desprotecciones y
reacciones de acoplamiento de aminoácidos. La cadena lateral de ciertos grupos
funcionales de los aminoácidos debe estar protegida de manera permanente mediante
grupos protectores (Pn) que son estables en las condiciones de reacción utilizadas
durante la elongación del péptido.
El grupo α-amino tiene protección de tipo temporal (T) que es generalmente compuestos
derivados de uretano. El grupo de protección temporal (T) puede ser fácilmente removido
Marco teórico y estado del arte 17
bajo condiciones suaves que preservan la integridad del péptido y reduce la
epimerización (la mayoría de los casos conduce a la formación de Oxazolonas) como se
ilustra en la figura 2. La función protectora de tipo uretano para evitar la epimerización
también explica el predominio de la estrategia de síntesis desde el extremo C-terminal a
N-terminal. Después del acoplamiento, el exceso de reactivos se elimina por filtración y
lavados. La desprotección del grupo protector temporal N-terminal se realiza para permitir
la adición del siguiente aminoácido protegido por N-uretano y activados en su extremo
ácido α-carboxílico. Este proceso (desprotección / acoplamiento) se repite hasta llegar a
la secuencia deseada. En una etapa final, el péptido se libera de la resina y los grupos de
protección de las cadenas laterales (Pn) son eliminados [56].
Figura 1. Principios de SPPS tomado de [56]
18 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
Figura 2. Epimerización por medio de la formación de Oxazolonas, tomado de [56].
En SPPS, se utilizan dos estrategias principales: Boc/Bzl y Fmoc/tBu denominados así
por los grupos protectores T/Pn. La estrategia Boc (terc-butoxicarbonilo) se basa en el
grado de labilidad ácida del grupo protector. El grupo Boc se elimina mediante lavados
con ácidos de fuerza moderada [33% de ácido Trifluoroacético (TFA) en Diclorometano
(DCM)] lo que implica que los protectores de tipo Bzl (bencilo) que se usan para las
cadenas laterales deban ser estables en estas condiciones. Luego de la remoción del
grupo Boc por medio ácido, se debe hacer una neutralización [5% de N,N-
diisopropiletilamina (DIEA) en DCM]. La eliminación de los protectores de la cadena
lateral y separación del péptido al soporte sólido requiere de tratamientos ácidos mas
fuertes como el fluoruro de hidrógeno (HF) anhidro [56]. Debido a que el HF es un ácido
extremadamente fuerte que puede alterar la integridad de la secuencia peptídica y que
necesita de espacios físicos especiales para su manipulación, se desarrollo una
estrategia más suave basada en el grupo Fmoc [1]. Este grupo se elimina con bases de
fuerza moderada [20-25% de piperidina en dimetilformamida (DMF)], a través de una
reacción de β-eliminación. Esta ventaja permite el uso de protectores de tipo t-butilo (tBu)
que son lábiles en presencia de ácidos como el TFA. La ventaja adicional de Fmoc sobre
Boc es el uso de protectores de tipo ortogonal [57, 58], puesto de otra manera, se
pueden eliminar los grupos protectores mediante dos estrategias químicas diferentes,
permitiendo el uso de condiciones ácidas más débiles para la liberación final.
Marco teórico y estado del arte 19
4.5 Soporte sólido para SPPS
A menudo el término "resina" es mal utilizado en lugar de “sistema-linker”,
ignorando el hecho de que la matriz polimérica es igual de importante como la solución
donde se encuentra el aminoácido activado y listo para realizar el acople [59]. Existen en
el mercado muchísimos soportes sólidos disponibles y de gran variedad. La elección del
soporte sólido se da por la secuencia peptídica a sintetizar y al “linker” o brazo
espaciador más adecuado para la síntesis.
La resina que comúnmente se usa para SPPS se basa en una matriz polimérica de
poliestireno entrecruzado (PS). La distribución de ese entrecruzamiento se da por
tamaños que oscilan de 200-400 mesh (que corresponde a un diámetro de alrededor de
50 micras) y una sustitución entre 0.5 a 0,8 mmol/g. Estas características garantizan en
el polímero buenas propiedades de hinchamiento en disolventes típicos de lavados como
DMF y DCM, una buena distribución de los reactivos en toda la zona del polímero,
garantizando la accesibilidad de los reactivos. Para péptidos de tamaño superior (más de
25 residuos) o secuencias “difíciles” se requiere un grado de sustitución menor (0,1-0,3
mmol/g). Resinas a base de poliamida (PA) y polietilenglicol (PEG) son mucho más
hidrofílicas que las PS, por tanto se comportan mejor para secuencias con cierta
dificultad [59].
4.6 Disolventes en SPPS
En cuanto a los disolventes usados durante la síntesis éstos son de gran importancia ya
que para llevar a cabo el crecimiento de la cadena peptídica, éste debe garantizar el
máximo volumen desplegado de la resina, la interacción de los aminoácidos con la parte
activa y la solubilidad de los aminoácidos activados, para mejorar los rendimientos de los
acoplamientos. Para las PS el DCM presenta una óptima propiedad de hinchamiento o
aumento de volumen en la resina. Para los pasos de acoplamiento el uso de disolventes
polares apróticos como DMF o N-metilpirrolidona (NMP) se prefieren para mejorar la
solubilidad de los reactivos. Alcoholes y el agua no son disolventes adecuados para las
resinas PS ya que reducen el tamaño de la resina, encogiéndola. Esta propiedad es
usada para realizar los lavados y ayudar a retirar de manera eficiente los reactivos en
20 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
exceso. Después de ese encogimiento, la resina se vuelve a hinchar usando DCM o DMF
[56].
4.7 Agitación y lavados en SPPS
Otro factor importante cuando se está realizando un acople es la agitación, ésta no debe
ser brusca como la que se obtiene con agitación magnética, ya que el fenómeno del
acople se da por un la difusión y la interacción entre las partes (aminoácido activado y
resina), con lo que agitaciones vigorosas pueden provocar daños en la resina debido a
que está constituida de granos muy finos y frágiles [56].
Los pasos de lavado se usan para eliminar los productos secundarios y el exceso de
reactivos usados en los pasos de acoplamiento y desprotección. El método simple es
llenar el reactor con el solvente a usar en el lavado, dejarlo en agitación durante un corto
tiempo (1-3 min) y desechar la solución de lavado. Se recomienda hacer varios lavados
con pequeña cantidad de disolvente y no pocos lavados con demasiada cantidad. Los
protocolos de acoplamiento y desprotección varían según el tipo de activador de la
función carboxilo del aminoácido, el tipo de soporte sólido, el tipo de reactor y la
secuencia a sintetizar, al igual que la desprotección final del péptido.
5. Materiales y métodos
5.1 Estudios previos y selección de secuencias para síntesis
Para la selección de las secuencias, se procede a realizar cortes sucesivos de la
secuencia Dermaseptina S1 (ALWKTMLKKLGTMALHAGKAALGAAADTISQGTQ) desde
el extremo N-terminal hasta el C- terminal cada 15 residuos. El número de residuos para
los cortes fue seleccionado por estudios previos de la evaluación de la actividad
antimicrobial sobre análogos de Dermaseptina S1, en donde se encontró que el
fragmento mínimo que posee actividad antimicrobial comparable con la secuencia
original es DS1(1–15)-NH2 [60]. Luego de los cortes se realiza la predicción de estructura
secundaria para cada análogo de Dermaseptina con los servidores Scratch Protein
Predictor (SPP, http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/) [6] y Protein Predictor (PP,
http://www.predictprotein.org/) [61] los cuales muestran la posible conformación
secundaria de cada uno de los residuos en la secuencia peptídica.
Posteriormente se calcula la carga neta de cada uno de los análogos y se hace el
análisis de relación entre estructura secundaria y carga de la molécula, la cual busca
favorecer las secuencias que puedan tener una mayor estructura secundaria en hélice y
una distribución anfipática de carga en la secuencia. Las secuencias seleccionadas
forman parte de la matriz de estudio e intentan ilustrar la contribución de cada residuo en
la posición del péptido.
5.2 Síntesis química en fase sólida Fmoc de las secuencias
La síntesis lineal en fase sólida de los péptidos se lleva a cabo usando la estrategia N-
Fmoc. Los disolventes usados para la síntesis son diclorometano (DCM), isopropanol
22 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
(IPA), N,N'-dimetilformamida (DMF) y 1-metil-2-pirrolidona (NMP). Los activadores que se
usan son N,N´-diciclohexilcarbodiimida (DCC), 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), y
tetrafluoroborato de O-(1H-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (TBTU). Para las
desprotecciones se usa piperidina, ácido trifluoroacético (TFA), 1,2-etanoditiol (EDT),
triisopropilsilano (TIS). Como soporte sólido polimérico se usa una resina Rink Amida de
sustitución 0.40 mmol/g. Los diferentes L-α-aminoácidos (Fmoc-aminoácidos) tienen una
pureza >99%. El grupo protector α-amino terminal en todos los aminoácidos es el 9-
fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). El protector de la cadena lateral para la Lisina (K) y el
Triptófano (W) fue el tertbutoxicarbonilo (Boc), para la Serina (S), Tirosina (Y) y Treonina
(T) fue el grupo tertbutilo (tBu), para la Arginina (R) fue el grupo 2,2,4,6,7-
pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo (Pbf), para el ácido Glutámico (E) y el ácido
Aspártico (D) el grupo protector fue t-butil éster (OtBu) y el resto de aminoácidos usados
no tenían protección en su cadena lateral.
Para las reacciones de activación se usa DCC y HOBt (1:1) en DMF a 5 excesos con
respecto al aminoácido. Los acoples son dejados en agitación constante y a temperatura
ambiente durante 6 horas. Para los acoples que presenten alguna dificultad, se cambia la
estrategia de activación con DCC y TBTU (1:1) en NMP a 7 excesos durante 2 horas. Las
activaciones de la función carboxilo se cumplen como es descrito por Merrifield y
Amblard [53, 56], la cual consiste en formar un éster activo entre el aminoácido y los
reactivos de activación, para posteriormente realizar la reacción del éster con el amino
libre y disponible. Las reacciones de acople de las cadenas peptídicas se ejecutará
siguiendo el procedimiento desarrollado por Albericio y Barany [57, 58], el cual garantiza
un tiempo de reacción adecuado para favorecer la reacción entre el éster del aminoácido
activado y el nuevo amino libre. Después de éste tiempo de acople, viene la liberación
del grupo protector de la función amino y su eliminación del medio de reacción mediante
una serie de lavados. Esto se realiza hasta obtener las secuencias deseadas. Para
comprobar el avance de cada acople se realizan pruebas de ninhidrina según
procedimiento de Merrifield y Van [62, 63], el cual consiste en la reacción entre la función
amino que se encuentra libre con hidrato de ninhidrina para formar un aducto que
presenta una coloración azul. El desanclaje final se realiza por tratamiento de la resina
con 95% TFA, 2% TIS, 2% Agua y 1% EDT durante 2 horas con agitación constante a
Materiales y métodos 23
temperatura ambiente. La extracción del péptido se realiza por medio de lavados
sucesivos con éter etílico frio. Este protocolo de desanclaje y desprotección del péptido
fue establecido por Barany y Kates [58, 64].
5.3 Purificación de los péptidos
5.3.1 Liofilización
La liofilización de los péptidos se realiza en un equipo LABCONCO 117 de 2.5 L. Todas
las muestras se someten a un precongelamiento a -50ºC durante 24 horas. Luego de la
precongelación, las muestras se introducen en un recipiente que se conecta al sistema
de vacío. La temperatura de congelación de la cámara de refrigeración es de -50°C y se
mantiene durante 24 h. La presión del sistema de liofilización se encuentra en valores
cercanos de 0.08 mbar (0,03 ó 0,2 mbar) a una velocidad de 0,5°C/min. Al final del
proceso se obtienen presiones cercanas a 0,01 mbar. El liofilizador cuenta con cierre
manual de la cámara de refrigeración y las muestras después de la liofilización son
retiradas. El péptido obtenido es conservado en un desecador para las pruebas
posteriores. Este protocolo de precongelamiento, liofilización y almacenamiento de los
péptidos liofilizados fue establecido por Zinge P. [65].
5.3.2 Cromatografía líquida de alta eficiencia
La cromatografía (RP-HPLC) de los péptidos se realiza en un cromatógrafo Agilent
Technologies Serie 1200, usando columnas Zorbax Eclipse XDB-C18 RP-18 (5 µm). Los
solventes usados en la cromatografía son metanol, acetonitrilo, agua y ácido
trifluoroacético (TFA) de una pureza grado HPLC. Los péptidos son eluídos mediante el
uso de un sistema de gradiente lineal A/B de 0 a 70 % B (A: Agua desionizada 0.01%
TFA), (B: acetonitrilo 0.01% TFA), a una velocidad de flujo de 1.0 mL/min en la modalidad
analítica y de 5.0 mL/min en la modalidad Semipreparativa. Se inyectan 20 μL de
muestra (1mg/mL) en modalidad analítica y 500 μL (10mg/mL), las cuales se someten a
la corrida cromatográfica correspondiente. El tiempo total de corrida en las dos
modalidades es de 45 minutos a temperatura ambiente. La detección de las señales se
logra mediante el uso de un detector UV-VIS (ultravioleta visible) con un seguimiento a
220 nm de acuerdo al protocolo establecido inicialmente por Choi [66].
24 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
5.4 Caracterización de los péptidos
5.4.1 Espectrometría de masas MALDI-TOF
La caracterización por medio de la espectrometría de masas con desorción iónica
provocada por láser y asistida por matriz con detección de tiempo de vuelo MALDI-TOF
(Matrix-Assisted Laser Desorption of Ions Time-of-Flight), se realiza en un espectrómetro
de masas Bruker Daltonios Serie microflex MALDI-TOF Compass 1.2 aplicando un
campo eléctrico de 3 nanosegundos, a una longitud de onda de 337 nm incidiendo una
luz láser a una intensidad de 50 μJ. La matriz que se emplea es una solución
sobresaturada de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico. La concentración del péptido es de
5.0 x 10-4 mg/μL, sembrando en placa 2.5 μL de una solución que contiene una relación
1:6 de péptido y matriz respectivamente. El protocolo anteriormente mencionado fue
establecido por Rodthongkum [67].
5.4.2 Dicroísmo circular (DC)
Los espectros de DC son procesados por un espectropolarímetro Jasco (Jasco
Internacional Co J-810) usando una cubeta de cuarzo, con una longitud de paso óptico
de 0,1. Los péptidos son leídos a una concentración de 5,0x10-6 M al 30% de
trifluoroetanol (TFE) en un rango de 190-260 nm con una velocidad de 50nm/min y un
ancho de banda de 0.5 nm. Los datos son promediados y se calcula el contenido de
estructuras secundarias incluyendo α-hélice en los péptidos mediante tres programas
que realizan la deconvolución de las señales CONTIN/LL [68], CDSSTR [69] y SELCON3
[70], lo cuales vienen incorporados con el software del equipo.
5.5 Ensayos biológicos
Los ensayos biológicos fueron realizados por el por Doctor José Julián Pérez Cordero, en
el laboratorio del Grupo de Investigación en Inmunotoxicología (COL 0068495) de la
Universidad Nacional de Colombia en Bogotá, dirigido por la Doctora Gabriela Delgado.
Esta colaboración, estuvo enmarcada en un macroproyecto financiado por la
Materiales y métodos 25
Vicerrectoría de Investigación de la Universidad Nacional de Colombia, Convocatoria
Bicentenario, 2009.
5.5.1 Hematíes
Para la obtención de glóbulos rojos se obtuvo sangre periférica de voluntarios sanos O
positivo [Acorde con la normatividad vigente, respecto a la donación de muestras con
fines de investigación, disposiciones legales vigentes emanadas del Ministerio de la
Protección Social de la República de Colombia, Resolución No. 008430 DE 1993 (4 de
Octubre 1993)]. Los glóbulos rojos fueron separados de la sangre completa mediante
centrifugación y diluidos en buffer fosfato salino (Phosphate buffered saline (PBS)) para
su empleo en los ensayos de hemólisis. El protocolo sobre la obtención de los glóbulos
rojos de sangre periférica humana es el establecido por Turpin [71].
5.5.2 Monocitos
Los monocitos se obtienen a partir de la separación de glóbulos blancos por
centrifugación en gradiente de Ficoll (Ficoll-Hypaque, Sigma Aldrich–St Louis. USA) a
2800 revoluciones por minuto (r.p.m.) durante 30 minutos, a partir de muestras de
voluntarios sanos. La fracción de glóbulos blancos, se lava tres veces en PBS mediante
centrifugación siguiendo el protocolo enunciado por Carter [72] y posteriormente
sembrada en cajas de Petri de Poliestireno (BD Biosciences, Falcon) en medio RPMI
1640 [73] (Gibco BRL-life Technologies Inc, Grand Island, NY) durante 2 horas de
incubación, al cabo de las cuales, la fracción no adherente es removida. La fracción de
monocitos adheridos, se recolecta y siembra en cajas de 96 pozos fondo plano (TPP
Tissue Culture Labware 92096, Suiza) e incubada durante 24 horas a 37 ºC con
atmósfera de CO2 al 5%. Después de este periodo, puede ser empleado en los ensayos
de citotoxicidad.
5.5.3 Parásitos
Promastigotes de L. panamensis fueron cultivados en medio RPMI 1640 (Gibco,
Scotland, UK) suplementado al 10% con Suero Fetal Bovino (FBS, Microgen, Bogotá,
Colombia), y L-glutamina (Gibco BRL-Life Technologies Inc, Grand Island, NY) 10X, a 26
26 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
ºC. Los parásitos en fase estacionaria fueron usados en los ensayos de efectividad sobre
formas extracelulares de esta especie de Leishmania.
5.5.4 Péptidos y controles
Como péptido control fue utilizado CLIP, que corresponde a la cadena peptídica
invariable naturalmente cargada en el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) y
que para el caso del tipo II es reemplazado enzimáticamente dentro de los endosomas
para cargar esta molécula con fragmentos peptídicos en el proceso de presentación de
antígenos [74]. Como control positivo de tratamiento, se usó el isotianato de pentamidina,
el cual se ha convertido en el medicamento de elección para el tratamiento de la LC en
varios países donde la enfermedad es endémica, presentando una eficacia muy similar a
los antimoniales pentavalentes pero con una incidencia menor de efectos adversos [75-
77]. La pentamidina, fue usada en concentraciones seriadas a partir de 10 μg/mL en los
ensayos de citotoxicidad y de efectividad contra la forma extracelular de L. panamensis.
5.5.5 Ensayos de hemólisis
Para determinar la actividad hemolítica de los péptidos de interés, como parte del efecto
no deseado de formulaciones antileishmaniales, se sembraron en cajas de 96 pozos
fondo en V (Corning, USA), 0,1 mL de suspensión de eritrocitos humanos de donantes
sanos grupo O Rh + por pozo, a una concentración de 2% de su hematocrito final en
solución salina fisiológica al 0.9% (Baxter, Colombia). Se evaluaron por duplicado, ocho
concentraciones distintas del péptido, adicionando un volumen de 0,1 mL/pozo de cada
dilución. Fueron incluidos pozos controles con iguales diluciones de CLIP, pentamidina,
eritrocitos sin péptido en Solución Salina correspondiente al 0% de hemólisis, y eritrocitos
en agua destilada estéril como control del 100% de hemólisis. Luego de la incubación a
37 ºC con CO2 al 5% durante 2 horas, las cajas fueron centrifugadas a 3500 r.p.m. y los
sobrenadantes fueron recolectados para la determinación de la concentración de
hemoglobina mediante la determinación de la absorbancia a 550nm en un
espectrofotómetro digital (Ultramark Microplate Reader, Bio-Rad, USA) [78]. Tomando
como control negativo o 100% de viabilidad, las unidades de absorbancia de los
eritrocitos no expuestos a ninguna sustancia y diluidos en solución salina. Las unidades
Materiales y métodos 27
de absorbancia obtenidas de la lectura de la solución de eritrocitos expuestos a agua
destilada estéril, fueron consideradas como 100% de hemólisis y respecto a ella fueron
normalizados los datos obtenidos en unidades de absorbancia de los sobrenadantes de
los diferentes pozos con solución de eritrocitos, expuestos a cada uno de los péptidos y
pentamidina (a sus diferentes concentraciones) siendo calculado entonces, el porcentaje
de hemólisis para cada caso según la siguiente fórmula: % hemólisis a una concentración
X = (Unidades de Absorbancia a concentración X x 100) / unidades de absorbancia de
solución de eritrocitos expuestos a agua destilada. Posterior a la obtención de los
porcentajes de hemólisis, los datos fueron exportados al programa GraphPad Prism 5
Demo Software (GraphPad Software Demo, Inc, La Jolla, CA, USA) [79] para la
obtención de una curva concentración-respuesta y el cálculo de la concentración
hemolítica media (CH50), que equivale a la concentración de un péptido que produce la
lisis del 50% de los eritrocitos en una solución. Cada ensayo se realizó por triplicado y en
tres ocasiones distintas.
5.5.6 Ensayos de citotoxicidad
Para establecer el efecto citotóxico de los PAMs sobre monocitos, se sembraron en cajas
de 96 pozos, 0,1 mL de suspensión celular por pozo, a una concentración de 1 x 105
monocitos/mL en medio RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino (fetal calf
serum FCS) al 5%. Luego de 24 horas de incubación a 37 ºC con CO2 al 5% para permitir
la adhesión celular, se evaluaron por duplicado ocho concentraciones distintas de cada
péptido en RPMI 1640 a partir de 200 μg/mL, adicionando un volumen de 0.1mL/pozo de
cada dilución. Fueron incluidos pozos controles con iguales diluciones de CLIP,
pentamidina, monocitos sin péptido, y uno solo con RPMI 1640. Luego de la incubación a
37 ºC con CO2 al 5% durante 72 horas, la viabilidad celular fue evaluada mediante el
método de Alamar Blue el cual se describe a continuación basado en el protocolo
establecido por Khromykh [80]. Se adicionó resazurina (Sigma Aldrich, USA) a una
concentración de 44mM y luego de 4 horas adicionales de incubación bajo las mismas
condiciones anteriores, se leyeron las unidades arbitrarias de fluorescencia (UFA)
utilizando un espectrofluorómetro (Genios Tecan Plate Reader) y el Software Magellan®).
Los datos obtenidos en UFA, fueron exportados al programa Microsoft Excel 2000 y
procesados para la obtención de los porcentajes de viabilidad celular con cada uno de los
28 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
péptidos y controles a sus respectivas concentraciones. Se consideró como 100% de
viabilidad, las UFA obtenidas de la lectura de los pozos de células no tratadas, ni
expuestas a ninguno de los controles. Los datos obtenidos de los demás tratamientos y
controles, fueron procesados con respecto a éste mediante la fórmula: % de viabilidad a
una concentración X = (UFA a concentración X x 100) / UFA de células en condiciones
normales de cultivo y no expuestas a ningún tratamiento. Estos porcentajes fueron
exportados posteriormente al programa GraphPad Prism 5 Demo Software (GraphPad
Software, Inc, La Jolla, CA, USA) [79] para el trazo de una curva concentración-respuesta
y posterior obtención de la concentración citotóxica media (CL50), la cual corresponde a
la concentración de un péptido, que genera la muerte del 50% de las células en el cultivo.
Cada ensayo se realizó por duplicado.
5.5.7 Ensayos de efectividad sobre formas extracelulares de L. panamensis.
Una suspensión de promastigotes de L. panamensis a una concentración de 2 x 106
promastigotes por mL, fueron expuestos a los péptidos a 8 concentraciones distintas,
obtenidas por diluciones seriadas a partir de 200 μg/mL. Los cultivos fueron sembrados
en cajas de 96 pozos fondo plano (TPP Tissue Culture Labware, Suiza), a 0,1 mL/pozo e
incubados a 26 ºC en RPMI 1640. La viabilidad de los parásitos fue evaluada mediante el
método de Alamar Blue adicionando este colorante a una concentración final de 44mM, e
incubando durante 48 horas a 26 ºC, luego de lo cual, las UFA, derivadas del metabolito
secundario resofurina, fueron determinadas mediante el uso del espectrofluorómetro
Genios Tecan [80]. Los datos fueron transferidos al programa Microsoft Excel 2000 para
su posterior procesamiento considerando las UFA, obtenidas de los pozos con
promastigotes cultivados en las condiciones descritas y no expuestos a ningún
tratamiento (100% de viabilidad). Los datos obtenidos de la lectura de cada uno de los
tratamientos, fueron procesados con respecto al 100% de viabilidad, mediante la fórmula:
% de viabilidad a X concentración = (UFA a X concentración x 100) / UFA de parásitos en
condiciones normales de cultivo y no expuestos a ninguna sustancia. Posteriormente, los
porcentajes obtenidos, fueron exportados al programa GraphPad Prism 5 Demo Software
(GraphPad Software, Inc, La Jolla, CA, USA) para el trazo de una curva concentración-
Materiales y métodos 29
respuesta y la determinación de la concentración efectiva media (CE50), que
corresponde a la concentración de péptido capaz de inducir la muerte del 50% de los
parásitos expuestos. Cada ensayo fue realizado por triplicado y en tres ocasiones
distintas.
6. Resultados y discusión
6.1 Estudio previo y análisis bioinformático
Se realizó una búsqueda del carácter Antimicobacterial y Antileishmanial que presentaba
la secuencia de Dermaseptina S1 (ALWKTMLKKLGTMALHAGKAALGAAADTISQGTQ),
la cual en estudios previos se reporta como posible herramienta terapéutica para el
tratamiento de la Leishmaniasis [81]. Al evaluar la secuencia desde el extremo N-terminal
hacia el C-terminal en el servidor AntiBP Server, se encontraron valores positivos en la
predicción de la acción Antimicrobial para algunos fragmentos. Dichos valores indican la
posible actividad antimicrobiana que está directamente asociada a la secuencia basada
en la información que recolecta el servidor con alrededor de 500 péptidos
antimicrobianos base y una función de base radial junto con un polinomio kernal, que
son propios del software de predicción [82]. En la tabla 1 se muestran los resultados
obtenidos para cada uno de los fragmentos al realizar la evaluación en el servidor. Por
otro lado se realizaron cortes sucesivos de la secuencia original cada 15 residuos
partiendo desde el extremo N terminal, basándonos en los resultados encontrados por
Savoia [60], según el cual secuencia mínima con actividad biológica es de 15 residuos.
A todos los cortes de la secuencia de 15 residuos se les realizó una predicción de la
estructura secundaria con los servidores Scratch Protein Predictor (SPP,
http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/) [6] y Protein Predictor (PP,
http://www.predictprotein.org/) [61] mostrando un valor elevado en la estructura de tipo α-
hélice para la mayoría de los análogos. Como se observa en la tabla 1, el valor
antimicrobial para algunas secuencias es negativo (valores en rojo), lo que nos sugiere
que por predicción dichos fragmentos no poseen carácter antimicrobial.
Resultados y discusión 31
Tabla 1. Estudio bioinformático de Dermaseptina S1
ND Valor no disponible
El valor más elevado de la predicción antimicrobial lo presenta el análogo nombrado
DM1, que también posee un elevado porcentaje helical. La mayoría de los fragmentos
que no poseen acción antimicrobiana por predicción son los que poseen un carácter
catiónico superior a 3 en la secuencia, excepto en las secuencias DM3, DM4, DM7, DM9
y DM10, que a pesar de tener un carácter catiónico, no poseen un valor antimicrobial
aceptable por predicción antimicrobial. El menor valor del carácter antimicrobiano lo
presenta DM20, que corresponde al fragmento con el mayor carácter aniónico en la
secuencia, que en principio estaría de acuerdo a lo reportado para los péptidos, ya que el
primer paso de acción de este tipo de péptidos sugiere la interacción con fosfolípidos de
membrana celular [83], haciendo que para DM20 esta interacción no se realice
efectivamente, lo que genera que la predicción para la secuencia sea negativa. La
selección final de los análogos para ser sintetizados se definió por el alto contenido de α-
hélice y carácter catiónico, que concuerda con la polaridad típica de los péptidos
antimicrobianos, favoreciendo la interacción con la membrana celular y su efecto
inmunomodulador sobre las células. Los resultados de la selección de los análogos son
mostrados en la tabla 2.
Abreviatura Porcentaje Helice Carga Total Score Antimicrobial
DERMs1 A L W K T M L K K L G T M A L H A G K A A L G A A A D T I S Q G T Q 85.3 4 ND
DM1 A L W K T M L K K L G T M A L 60.0 3 1.367
DM2 L W K T M L K K L G T M A L H 53.3 4 0.402
DM3 W K T M L K K L G T M A L H A 40.0 4 -0.205
DM4 K T M L K K L G T M A L H A G 20.0 4 -0.937
DM5 T M L K K L G T M A L H A G K 66.7 4 0.605
DM6 M L K K L G T M A L H A G K A 60.0 4 0.286
DM7 L K K L G T M A L H A G K A A 46.7 4 -0.401
DM8 K K L G T M A L H A G K A A L 13.3 4 0.075
DM9 K L G T M A L H A G K A A L G 60.0 3 -0.825
DM10 L G T M A L H A G K A A L G A 60.0 2 -0.418
DM11 G T M A L H A G K A A L G A A 60.0 2 0.509
DM12 T M A L H A G K A A L G A A A 40.0 2 -0.880
DM13 M A L H A G K A A L G A A A D 26.7 1 -0.781
DM14 A L H A G K A A L G A A A D T 33.3 1 0.183
DM15 L H A G K A A L G A A A D T I 66.7 1 -1.687
DM16 H A G K A A L G A A A D T I S 60.0 1 -1.230
DM17 A G K A A L G A A A D T I S Q 73.3 0 -0.151
DM18 G K A A L G A A A D T I S Q G 66.7 0 -1.909
DM19 K A A L G A A A D T I S Q G T 60.0 0 -1.636
DM20 A A L G A A A D T I S Q G T Q 60.0 -1 -2.135
SECUENCIA
32 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
Tabla 2. Secuencias de los análogos seleccionados para el estudio
El principio estructural fundamental de los PAMs nace en su capacidad de adoptar una
forma en la que los aminoácidos hidrofóbicos y catiónicos son organizados
espacialmente en sectores discretos de la molécula (diseño anfipático). Para las
secuencias seleccionadas y mostradas en la tabla 2, se realizó el diseño anfipático, en
donde se observó la distribución catiónica por una cara de la hélice y una distribución
hidrofóbica para la otra cara. En la figura 3 se muestra la distribución helical de los
aminoácidos para DM1, se puede observar los residuos polares de tipo catiónico en la
parte superior y los residuos de carácter hidrofóbico en la parte inferior de la figura. Este
tipo de distribución anfipática se encontró para la mayoría de los análogos seleccionados,
excepto para DM17, DM19 y DM20, donde la distribución no se da uniformemente y se
presenta una ausencia del carácter catiónico, haciendo que se presente una
conformación polar aniónica por una cara de la hélice y una apolar por la otra cara.
En todas las secuencias seleccionadas se observa un porcentaje helical mayor a 60%, lo
que sugiere que la distribución de tipo anfipática mostrada en la figura 3 para DM1, es
adecuada para todos los análogos e indica la cercanía espacial de cada uno de los
residuos. El tipo de residuo con los cuales existe una mayor interacción y el tamaño de
dichos residuos, también nos brinda una idea aproximada del grado de dificultad que se
puede dar al intentar acoplar un residuo en la síntesis química, y brinda una luz acerca
de la forma en la que la cadena peptídica se va plegando para adquirir su estructura
secundaria de tipo helical.
Abreviatura Porcentaje Helice Carga Total Score Antimicrobial
DERMs1 A L W K T M L K K L G T M A L H A G K A A L G A A A D T I S Q G T Q 85.3 4 ND
DM1 A L W K T M L K K L G T M A L 60.0 3 1.367
DM5 T M L K K L G T M A L H A G K 66.7 4 0.605
DM6 M L K K L G T M A L H A G K A 60.0 4 0.286
DM9 K L G T M A L H A G K A A L G 60.0 3 -0.825
DM10 L G T M A L H A G K A A L G A 60.0 2 -0.418
DM11 G T M A L H A G K A A L G A A 60.0 2 0.509
DM16 H A G K A A L G A A A D T I S 60.0 1 -1.230
DM17 A G K A A L G A A A D T I S Q 73.3 0 -0.151
DM18 G K A A L G A A A D T I S Q G 66.7 0 -1.909
DM19 K A A L G A A A D T I S Q G T 60.0 0 -1.636
DM20 A A L G A A A D T I S Q G T Q 60.0 -1 -2.135
SECUENCIA
Resultados y discusión 33
Figura 3. Helical Wheel para DM1
Para la secuencia DM17 y DERMs1 el valor de helicidad es 73.3% y 85.3%
respectivamente, lo cual sugiere que el tipo de distribución helical sea mayor, Aun así,
para DM17 la distribución anfipática no es la mejor (figura 4). Debido a que DM17 no
presenta un carácter catiónico, la distribución de los aminoácidos polares se hace de
manera uniforme, lo que impide que la carga positiva del péptido quede sectorizada hacia
una cara de la hélice.
Figura 4. Helical Wheel para DM17
Este tipo de estudio bioinformático es de gran importancia antes de realizar la síntesis
química de péptidos, ya que permite predecir de alguna manera la estructura secundaria
de las secuencias, la distribución espacial de los aminoácidos y la posible actividad
antimicrobial de los péptidos, convirtiéndose en una valiosa herramienta predictiva para
la construcción de análogos de una secuencia determinada. Es importante resaltar que a
pesar de que los valores de predicción bioinformática en la mayoría de los casos son
Helical Wheel From 1 to 16
Ala 1
Leu 2
Trp 3
Lys 4
Thr 5
Met 6
Leu 7
Lys 8
Lys 9
Leu 10
Gly 11
Thr 12
Met 13
Ala 14
Leu 15
Helical Wheel From 1 to 16
Ala 1
Gly 2
Lys 3
Ala 4
Ala 5
Leu 6
Gly 7
Ala 8
Ala 9
Ala 10
Asp 11
Thr 12
Ile 13
Ser 14
Gln 15
34 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
confiables, estos criterios no pueden ser los únicos para la selección de las secuencias
candidatas a síntesis, ya que dichos valores no necesariamente se ajustan a los
resultados reales de las secuencias y solo con la síntesis, caracterización y evaluación
de la actividad biológica para cada secuencia, es posible confirmar o no, los valores
predichos por el estudio bioinformático.
6.2 Síntesis química Fmoc de los análogos seleccionados
La síntesis de todos los análogos se llevó a cabo por tecnología Nα-Fmoc en fase sólida.
Se usó como soporte sólido una resina Rink Amida [84], la cual presentaba un grado de
sustitución de 0,40 mmol/g. La síntesis de los análogos se inició con la adición del primer
aminoácido del extremo C-terminal, para lo cual se realizó el enlace peptídico entre el
grupo carboxilo del aminoácido y el grupo amino de la resina. En todas las secuencias
este primer acople requirió de un segundo ciclo, para lo cual se aumentó el número de
excesos de los activadores y del tiempo de reacción. La razón para que este acople
tenga un mayor grado de dificultad radica en que el soporte sólido es una resina que
tiene propiedades mecánicas específicas, principalmente la capacidad de hincharse y
comprimirse, las cuales por el tamaño relativamente pequeño de la resina y la poca
disponibilidad del sitio amino, hace que requiera mayor esfuerzo para la formación del
primer enlace peptídico junto con mayor tiempo. Para todos los acoples fue necesario
realizar una preactivación con DCC y HOBt en NMP durante 10 minutos, lo cual favorece
que el aminoácido a acoplarse se encuentre activado por el grupo carbonilo para
posteriormente generar el enlace peptídico de una manera más eficiente. En los acoples
que después de un segundo intento no daban la coloración amarilla típica de amino
protegido en la prueba de ninhidrina [62], se aumentaba el numero de excesos a 10.
El primer paso para realizar el enlace peptídico es la activación del grupo carbonilo de
cada aminoácido, dicha activación se realiza mediante la adicción de DCC y HOBt en un
solvente aprótico como es la DMF o NMP. El aminoácido protegido por el grupo Fmoc en
su amino, forma en primer paso un éster, O-acilisourea, que rápidamente se convierte en
N-acilisourea, ésta última insoluble en el medio de reacción. La O-acilisourea formada en
Resultados y discusión 35
presencia de HOBt forma un éster activo de benzotriazol, que es la especie final que
reacciona con el grupo amino libre disponible para realizar el enlace peptídico. El
mecanismo de reacción entre un aminoácido y el grupo amino de la resina es mostrado
en la figura 5. Para que las reacciones 5a, 5b y 5c se presenten, se deja durante 10
minutos aproximadamente el aminoácido a acoplar con los excesos de los activadores
DCC y HOBt a temperatura ambiente y con agitación constante, tiempo en el cual
empieza a aparecer un precipitado que corresponde a la N-acilisourea formada, que se
muestra en la figura 5b. La conversión de la O-acilisourea a N-acilisourea (figura 5b) es
una reacción lenta y se ve minimizada con la adición de HOBt, para formar el éster activo
de benzotriazol, siendo ésta una reacción rápida (figura 5c) [85].
Después de los pasos de preactivación, reacciones 5a, 5b y 5c, el éster activo de
benzotriazol formado se deja en agitación constante y a temperatura ambiente durante
un tiempo aproximado de 6 horas, en el cual se realiza la reacción de acople entre el
grupo amino libre y el grupo carboxilo activado (figura 5d). Esta reacción se realiza en un
solvente aprotico NMP ó DMF, el cual garantiza que el soporte sólido se encuentre en las
condiciones adecuadas para realizar la reacción.
La remoción del grupo protector amino Fmoc se realiza con lavados de piperidina al 25%
(ó 35%) en DMF durante un corto tiempo. La piperidina es una base que remueve
eficientemente el grupo Fmoc del medio, formando un aducto dibenzofulveno de
piperidina que absorbe fuertemente en la region UV, es soluble y facilmente removible
del medio de reacción mediante varios lavados cortos con DMF [56, 86, 87]. El
mecanismo de desprotección para la posterior remoción del grupo Fmoc es mostrado en
la figura 6. En el paso 6a se muestra el ataque de la piperidina al proton del grupo Fmoc,
formando una especie inestable que rápidamente hace una deslocalización electrónica
para dar los subproductos obtenidos en 6b. En los pasos 6d y 6e se muestra el aducto
final formado entre la piperidina y el grupo Fmoc removido. La remoción del grupo Fmoc
usando piperidina puede ser monitoreada por espectroscopia UV (270-312 nm) [88], ya
que el aducto presentado en 6e es un subproducto que absorbe en la region UV, el
seguimiento de ese aducto es un procedimiento común usado en los sintetizadores de
péptidos automatizados pero no es muy usado en la SPPS manual [56].
36 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
Figura 5. Reacciones para la activación de Fmoc-aminoácidos con DCC y HOBt
Para los lavados de remoción de los subproductos con DMF, es muy importante que toda
la piperidina sea removida del medio eficientemente para que no genere reacciones de
desprotección en pasos de la sintesis donde no es adecuado su uso. Ademas de los
lavados con DMF, se hacen lavados con IPA y con DCM para garantizar la remoción de
la piperidina y de los subproductos del medio de reacción. La reacción de desprotección
en todos los casos fue verificada mediante el uso de la prueba de ninhidrina, arrojando
un color azul, confirmando que la reacción de desprotección fue adecuada y que existen
grupos amino libre disponibles para el siguiente paso de la sintesis.
NO
OH
RH
Fmoc H
t-Bu
+N C N N
NH
O
O NH
R
Fmoc
t-Bu
a
Fmoc-Aminoácido diciclohexilcarbodiimida(DCC) O-acilisourea
N
NH
O
O NH
R
Fmoc
t-BuNH
O
N
O
NHR
Fmoct-Bu
b
O-acilisourea N-acilisourea
N
NH
O
O NH
R
Fmoc
t-Bu
+ NN
N
OH
NN
N
O
O R
NH
t-Bu
Fmoc
c
O-acilisourea HOBt éster activo de benzotriazol
NN
N
O
O R
NH
t-Bu
Fmoc+
CH3
NH2
CH3
NH
OR
t-Bu
NHFmoc
d
éster activo de benzotriazol grupo NH2 disponible Acople formado
Resultados y discusión 37
Figura 6. Mecanismo de desprotección grupo Fmoc
a
b
c
d
NH2
+
+O
NH O
NH
R
O
CH3
O
CH3
O
O
NHPEG
O
C-
+
NH
O
NH O
NH
R
O
CH3
O
CH3
O
O
NHPEG
OH
O
NH O
NH
R
O
CH3
O
CH3
O
O
NHPEG
O
C-
NH- O
NH
R
O
CH3
O
CH3
O
O
NHPEG
CH2
++ OO
CH2
+NH
C-
NH+
NH- O
NH
R
O
CH3
O
CH3
O
O
NHPEG
+NH2
+
NH2O
NH
R
O
CH3
O
CH3
O
O
NHPEG
+NH
38 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
e
La sensibilidad de la reacción de ninhidrina como prueba cualitativa y cuantitativa para
determinar aminas primarias es muy alta. En la figura 7 se muestra las reacciones
primordiales para la prueba de ninhidrina con un aminoácido. En los primeros pasos de la
figura 7 se ilustra la reacción del hidrato de ninhidrina con el grupo amino de un
aminoácido, reacción que involucra el desplazamiento de un grupo OH por un grupo NH2
(figura 7b), paso que es determinante en la velocidad de reacción según reportes de
Friedman [89]. Los productos de la reacción de un aminoácido con ninhidrina son CO2
(figura 7c), un aldehído (RCHO) (figura 7d), y un aducto de ninhidrina denominado
purpura de Ruhemann (figura 7f). La etapa 7c corresponde a una descarboxilación que
según reportes no es la etapa determinante de la reacción debido a que esta reacción es
unimolecular y no está sujeta a impedimentos estéricos marcados [89]. La reacción de
ninhidrina se lleva a cabo a 100 ºC durante 5 minutos, tiempo en el cual el hidrato de
ninhidrina en piridina es capaz de reaccionar con el grupo NH2 del aminoácido para
formar un color purpura intenso que corresponde a la formación del aducto mostrado en
la figura 7f. Si en el medio no existe un grupo amino disponible para realizar la reacción,
la solución queda de un color amarillo claro y corresponde a un resultado negativo para
la prueba de ninhidrina. Basados en el mecanismo descrito para la reacción de
ninhidrina, se ha confirmado que la prueba es negativa para aminos unidos directamente
a átomos de carbonos terciarios o para aminas terciarias impedidas estéricamente [89].
Según los resultados esperados para la prueba de ninhidrina, esta reacción se usa en la
síntesis de péptidos para determinar si en el medio de reacción existen grupos NH2
disponibles que aún no hayan formado el enlace peptídico descrito en la figura 7d.
Cuando en el medio el grupo amino se encuentra protegido por el grupo Fmoc, la prueba
de ninhidrina da negativa, pero sí en cambio el grupo amino protegido ha sido sometido a
C-
NH+ N
Resultados y discusión 39
la etapa de desprotección con piperidina, en el medio se encontraran grupos NH2 libres
que hacen que la prueba de ninhidrina sea positiva dando un color purpura intenso.
Figura 7. Reacciones para la prueba de ninhidrina en presencia de un grupo amino.
Para cada paso de acople y desprotección fue necesario llevar a cabo la prueba de
ninhidrina, la cual era el indicativo cualitativo para evaluar el avance de SPPS. Cada
prueba contó con un blanco, que sirvió como comparativo para calificar la prueba de
ninhidrina. Es importante anotar que para muchos otros compuestos la prueba de
ninhidrina da positiva sin presentar la estructura mostrada en la figura 7f. Entre los
compuestos que presentan la prueba de ninhidrina positiva de forma “anormal” son por
ejemplo los aminoácidos polifuncionales como arginina, asparagina, cisteína y triptófano,
los iminoácidos como la prolina y el ácido pipecólico, las aminas aromáticas como la
anilina, y otros compuestos como la fructosa, ácido levulínico, los iones cianuro entre
O
O
OH
OH
O
O
O + OH2
a
O
O
O +NH2
O
OH
R
O
O
N
O
OHR
+ OH2
b
O
O
N
O
OHR
O
O
N
R
+OO
c
O
O
N
R
OH2+
O
O
NH2
O
RH
+
d
O
O
NH2 +
O
O
O
O
O
N
O
O
+ OH2
e
O
O
N
O
O
O
O
N
O
O
H
f
40 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
otros. Este tipo de compuestos presentan reacción de ninhidrina denominada “no clásica”
[89].
La etapa de desanclaje se realiza mediante la adición de TFA (80%-97%) y compuestos
que sean capaces de capturar y eliminar los grupos protectores de cadenas laterales
denominados “scavengers”. Se realiza el desanclaje con el porcentaje adecudado de
TFA y “scavengers” dependiendo de los aminoácidos presentes y grupos protectores de
las cadenas laterales de los aminoácidos. El esquema de desprotección para péptidos
sintetizados mediante técnica Fmoc es mostrado en la figura 8, donde se muestra
claramente la función del TFA y de los “scavengers”. En la figura 8 se muestra el
desanclaje de un pentapéptido con TFA y los “scavengers” necesarios que son Anisol,
EDT, fenol y agua. Dependiendo de la secuencia obtenida se escogen los “scavengers” y
su porcentaje en el desanclaje final [56]. Los péptidos son recogidos sobre éter etílico
frío, con lo que se logra observar la precipitación de un sólido blanco que corresponde al
péptido libre obtenido. Mediante la filtración y lavados con éter etílico al péptido, se
realiza la remoción de las especies formadas entre los diferentes “scavengers” usados en
el desanclaje y los grupos protectores de las cadenas laterales, garantizando la remoción
efectiva de especies no deseadas. El rendimiento promedio calculado para las diferentes
síntesis fue de 74%. Este valor de rendimiento es relativamente alto si se tiene en cuenta
la pérdida de material en cada ensayo de ninhidrina, ya que por cada residuo se deben
hacer como mínimo 2 ensayos de verificación con ninhidrina que son de tipo destructivo.
Los tiempos de reacción para cada análogo de dermaseptina son mostrados en la tabla
3. El mayor tiempo de síntesis fue requerido para el análogo DM18, con un total de 465
horas y 24 ciclos, 9 ciclos más de los 15 ciclos necesarios para completar la síntesis.
Esta dificultad puede explicarse debido a la presencia de glicina en el extremo C-
terminal, que puede adoptar fácilmente una conformación Cis resultando el enlace amida,
lo que hace que la ciclización para formar dicetopiperazinas sea muy probable (ver figura
9) [90, 91].
Resultados y discusión 41
Figura 8. Esquema de desanclaje de un pentapéptido en medio ácido
Tabla 3. Tiempo total y número de ciclos efectuados para la síntesis de los análogos
TFA:tioanisol:EDT:fenol:agua 82.5:5:2.5:5:5
CH3
NH
O
O
NH
O
CH3
CH3
CH3O
O
O
CH3
CH3
CH3
NH
O
O
NH
NH
O
CH3
CH3
NH
O
NH2
S
OH
O
NH
OH
O
O
OH
NH
O
O
NH2
NH
O
CH3
CH3
NH
O
NH3
+
SH
CH3
CH3
CH3OHF3C
O
O
CH3
CH3
CH3
S+
CH3
CH3
CH3
CH3
S S
Ph
Ph
CH3
CH3
CH3
Ph
Péptido tiempo total (h) Ciclos
DM1 326 17
DM5 409 21
DM6 278 15
DM9 325 17
DM10 326 17
DM11 405 20
DM16 416 21
DM17 440 22
DM18 465 24
DM19 390 20
DM20 330 17
42 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
Figura 9. Esquema de formación de dicetopiperazinas, tomado de [92]
Para los diferentes análogos de dermaseptina se presentó una mayor dificultad en los
últimos acoples de las síntesis con el aminoácido Lisina (K). La Lisina debido a su
carácter catiónico presenta efectos de repulsión de carga en la estructura del péptido, lo
que explicaría la dificultad de añadirse a la secuencia peptídica que se está formando. La
dificultad obtenida en los últimos acoples de la síntesis se explica debido al impedimento
estérico que presenta la estructura de los péptidos que van tomando su conformación
helical y la repulsión que generan los residuos, en especial Lisina y Triptófano en la
estructura. Al evaluar los tiempos de reacción para los análogos, se comprobó la
dificultad que tienen los últimos acoples en la síntesis peptídica, ya que necesitan más
tiempo de reacción y se evidenció que para aminoácidos de menor tamaño y de carácter
menos polar, el acople requiere menor tiempo, ver tabla 4. En general los análogos de
dermaseptina presentaron un grado de dificultad elevado con el fragmento de la
secuencia AAA, debido a que el posible plegamiento e interacciones de tipo hidrofóbico
desfavorecen que el nuevo aminoácido llegue efectivamente al punto de reacción.
Podemos observar también que los aminoácidos en mayor proporción dentro de los
análogos de dermaseptina son alanina, leucina y lisina, lo que verifica la alta helicidad de
las secuencias, ya que estos aminoácidos son considerados buenos formadores de
hélice [93].
Resultados y discusión 43
Tabla 4. Tiempo total y número de ciclos en los análogos de dermaseptina
6.3 Purificación de péptidos
Luego de realizar el desanclaje de los análogos de dermaseptina (figura 8) y los lavados
con éter etílico, el péptido obtenido es disuelto en agua desionizada y congelado a -70 ºC
durante 12 horas. Luego los péptidos son liofilizados durante 24 horas con lo cual se
logra obtener el péptido sólido. Después de la liofilización cada péptido se purifica por
cromatografía líquida de alta eficiencia en fase reversa, en donde se obtiene el gradiente
de ACN-AGUA efectivo para la separación de los péptidos en modalidad analítica, que se
usan de igual manera en la modalidad semipreparativa. Al realizar la corrida
cromatográfica se obtuvieron en algunos casos más de dos picos significativos, un
ejemplo se muestra en la figura 10, a tiempo de retención de 17,8 min, 19,0 y a 19,1 min
para el análogo DM11. La presencia de los tres picos en el cromatograma posiblemente
se debe a subproductos de la reacción o a una posible deleción en uno de los acoples, lo
cual es confirmado después por masas. Las corridas cromatográficas para la mayoría de
los análogos muestran un único pico que corresponde al péptido obtenido, el cual es
verificado por espectrometría de masas MALDI-TOF y discutido más adelante. Los
tiempos de retención para cada pico representativo de los análogos son mostrados en la
tabla 5. Para la mayoría de los análogos se encontraron tiempos de retención
relativamente similares y cercanos a 18 min haciendo corridas cromatográficas en
Aminoácido tiempo (h) Ciclos
A 1235 65
G 721 35
L 578 28
K 385 20
T 321 17
M 200 10
H 132 7
D 81 5
I 150 8
Q 180 9
S 109 6
W 18 1
44 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
modalidad analítica, los cuales sirvieron para la posterior corrida en modalidad
semipreparativa. Para las corridas de DM5, DM11, DM17 y DM19 se encontraron más de
un pico representativo (valores mostrados en verde), los cuales fueron separados por
HPLC en modalidad semipreparativa y analizados por espectrometría de masas.
Es importante resaltar que para todos los análogos de dermaseptina a pesar de
encontrar un solo pico por HPLC, todos fueron recolectados en modalidad
semipreparativa y las fracciones recolectadas fueron liofilizadas y conservadas en un
desecador para los estudios posteriores. El mayor tiempo de retención se encontró para
DM1, lo cual no es lógico inicialmente, ya que es uno de los péptidos con carga
relativamente alta (+3), lo que indica una mayor polaridad comparado con otras
secuencias. Esta diferencia se puede explicar por medio de la rueda helical (helical
wheel) para DM1 (figura 3), la cual muestra claramente una buena organización de los
residuos apolares sobre una de las caras de la hélice y cuenta con la ventaja de tener un
residuo heterocíclico aromático apolar como el W, el cual aumenta el efecto de
disminución de la polaridad sobre toda la secuencia debido a su tamaño y disposición
sobre la hélice.
Figura 10. Corrida cromatográfica en fase reversa para DM11
min17 18 19 20 21
mAU
0
100
200
300
400
500
600
700
VWD1 A, Wavelength=220 nm (DERMASEPTINAS\DM11000001.D)
17.
809
19.
004
19.
131
20.
503
Resultados y discusión 45
Tabla 5. Tiempos de retención y pico de masas para los análogos de dermaseptina
Abreviatura tRa MH
+b MH
+c
DM1 21,566 1705,4 1704,047
DM5 16,586 1600,2 1599,140
DM6 18,176 1570,2 1568,955
DM9 18,386 1438,9 1438,071
DM10 18,301 1381,8 1380,937
DM11 19,131 1339,8 1339,135
DM16 18,644 1353,7 1353,130
DM17 15,276 1344,7 1545,156
DM18 15,473 1330,6 1330,077
DM19 18,634 1374,7 1274,893
DM20 15,566 1374,7 1374,069 a tR es el tiempo de retención en minutos determinado por RP-HPLC analítica.
b El pico de masas (MH+) calculado con valores de literatura. C El pico de masas (MH+) fue obtenido por MS MALDI-TOF.
6.4 Caracterización de péptidos
6.4.1 Espectrometría de masas MALDI-TOF
Las señales obtenidas por espectrometría de masas se resumen en la tabla 5. Se
observan las masas para los diferentes iones moleculares. Debido al tipo de técnica es
posible encontrar dichos iones sin presentar una fragmentación de la muestra. Para los
análogos DM17 y DM19 no se encontró el pico de ion molecular con la masa que
indicaba la secuencia adecuada (valores en rojo tabla 5). Para DM17 se encontró el pico
de m/z de 128.129 que posiblemente corresponde a la ciclización intramolecular de la
glutamina N-terminal que conlleva a la formación de residuos de ácido piroglutámico
mostrados en la figura 11 [94]. De igual manera se encontró un pico de m/z de 287.273
para DM19 que es igualmente explicado por la ciclización intramolecular de la glutamina
en el extremo N-terminal. Aunque la formación de piroglutámico en Fmoc normalmente
no se presenta debido a las condiciones básicas que se mantienen a lo largo de la
síntesis [95], esta puede ocurrir lentamente a pH básico o neutro y se favorece en
condiciones ácidas [96]. La adición de HOBt como activador en la síntesis, pudo generar
46 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
que el pH del medio de reacción se acidificara a tal punto que la ciclización intramolecular
en estas dos secuencias se favoreciera. [97].
Figura 11. Formación de piroglutámico a partir de glutamina
La mayoría de péptidos sintéticos tienden a formar aductos salinos en la placa donde se
siembra la muestra para MALDI-TOF. Los aductos de los péptidos que se encuentran
comúnmente son los formados por iones como sodio Na+ (+22 Da), potasio K+ (+38 Da)
y los aductos múltiples formados por Na+ K+ (+30 Da) [96]. Estos aumentos en la
relación m/z por parte de los iones sodio y de los iones potasio en todos los péptidos fue
encontrada. En general, los picos de ión molecular en los análogos de dermaseptina,
excepto en DM17 y DM19, indican que la síntesis química de los péptidos se llevó en
gran medida de manera adecuada, permitiendo obtener las secuencias peptídicas
deseadas.
En la figura 12 se muestra el espectro de masas MALDI-TOF para la DM1. Se puede
observar un pico en m/z en 1775.111 que corresponde a un pico con masa +71.064 con
respecto a la secuencia de DM1, que posiblemente es debido a la adición de un residuo
de alanina dentro de la secuencia. En la secuencia DM1 (ALWKTMLKKLGTMAL) están
presentes 2 residuos de alanina, una al comienzo de la secuencia y otra al final. Cuando
se estaba acoplando la primera alanina que corresponde a la más cercana del extremo
C-terminal, esta presentó problemas en el primer ciclo y tuvo que montarse con un nuevo
ciclo, pero lamentablemente el nuevo ciclo se realizó al día siguiente, lo que pudo
favorecer que parte del grupo protector Fmoc se haya retirado del extremo amino, para
que posteriormente llegara una nueva alanina a formar un nuevo acople, formando así la
posible secuencia (ALWKTMLKKLGTMAAL) con la alanina que ingresa en el segundo
ciclo.
O
O
NH2
OH
NH2
-NH3
O
ONH
OH
Glutamina Acido piro-glutámico
Resultados y discusión 47
Figura 12. Espectro de masas MALDI-TOF para DM1
Es importante anotar que el desprendimiento del grupo Fmoc se lleva a cabo bajo
condiciones básicas, y que esta se pudo ver favorecida si el soporte sólido no se
encontraba totalmente seco cuando se dejo para el segundo ciclo, que corresponde a un
tiempo relativamente largo, y que si a eso se le suma que el pH del medio fue
relativamente básico, se favorece la desprotección. Es importante resaltar que la
intensidad del pico de m/z 1775.111 es muy superior al encontrado para DM1 con m/z
1704.047 debido a que la especie 1775.111 posee una mayor facilidad para ionizarse por
MALD-TOF, pero que dichas intensidades de las señales no me da un indicativo de la
concentración de la especie, lo que si hacen los cromatogramas de HPLC, lo cual se
discutió anteriormente.
En la figura 13 se presentan los espectros de masa MALDI-TOF para todos los análogos
de dermaseptina. En cada uno de los espectros se logró identificar la señal que
corresponde a la secuencia del análogo, las cuales se resumen en la tabla 5, excepto
para los análogos DM17 y DM19. También se logró identificar la mayoría de las señales
presentes en todos los espectros, debidas a la adición o deleción de ciertos residuos, a
48 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
ciclizaciones y a otros fenómenos ocurridos en la síntesis, las cuales se resumen en la
tabla 6. En la tabla 6 se muestran las variaciones en la relación m/z encontradas para los
análogos de dermaseptina, en donde se puede observar que algunos análogos de
dermaseptina aún contienen estructuras propiamente debidas al desanclaje final.
Figura 13. Espectros de masas MALDI-TOF para análogos de dermaseptina
DM5 DM6
DM9 DM10
DM11 DM16
DM5 DM6
DM9 DM10
DM11 DM16
Resultados y discusión 49
Tabla 6. Variaciones más comunes de m/z encontradas para los análogos de
dermaseptina
DM17 DM18
DM19
DM20
DM19 DM20
Variación en masa
promedioVariación debida a:
±71.09 Alanina (A)
-57.07 Glicina (G)
137.16 Histidina (H)
113.17 Isoleucina (I)
±128.19 Lisina (K)
113.17 Leucina (L)
128.14 Glutamina (Q)
87.09 Serina (S)
- 101.12 Treonina (T)
200.46 Aducto HMP (hidroximetilfenil)/TFA
93.20 1,2-etanoditiol (EDT)
22.05 Sodio (Na+)
38.00 Potasio (K+)
60.05 Sodio Potasio (Na+K+)
56.18 t-butyl (tBu)
-17.20 Acido piroglutamico de Q
32.13 Oxidación de M
162.07 Fmoc unido a péptido
44.93 disodio (Na+Na+)
96.87 Trifluoroacetil (TFA)
117.45 Éster de Hidroxibenzotriazol (HOBt)
50 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
6.4.2 Dicroísmo circular
Se realizó dicroísmo circular para cada uno de los análogos sintetizados, y se encontró
para todas las secuencias que el porcentaje de estructura en α-hélice es el mayoritario
comparado con los demás porcentajes de las conformaciones de estructura secundaria
(ver tabla 7). Al comparar los valores de predicción de la estructura secundaria por medio
bioinformático (ver tabla 2) con los valores obtenidos por dicroísmo circular (ver tabla 7),
se encuentra que en la mayoría de las secuencias, excepto en DM6, DM9, DM17 y
DM20, el porcentaje de α-hélice encontrado por dicroísmo circular es superior al de la
predicción bioinformática. Estos resultados demuestran que la mayoría de análogos de
dermaseptina como se había descrito por bioinformática, adoptan una estructura de tipo
helical, y que muy posiblemente esta conformación favorece la formación de hélices
anfipáticas mencionadas y evaluadas anteriormente por medios bioinformáticos. El
menor valor de de helicidad lo presentó DM9, encontrando también que es uno de los
que tiene mayor porcentaje de estructura al azar junto con DM20. Esto se podría explicar
de alguna manera con la hidrofobicidad de los residuos y el desfavorecimiento de la
hélice de tipo anfipática para estas dos secuencias. Por otro lado se puede observar que
para análogos de dermaseptina las conformaciones de tipo hojas beta y giros no son
favorecidos debido a que los residuos presentes en la secuencia no permiten este tipo de
conformación.
Al observar los datos de la tabla 7, se observa que no existen datos para la secuencia
DM19, esto es debido a que el dicroísmo circular de esta secuencia no es posible
calcularla con el programa CONTINLL que trae incorporado el equipo. Sin embargo, al
observar el espectro de dicroísmo circular (figura 14j) se observa la misma tendencia del
espectro para secuencias helicales (figura 14a, 14b y 14f), lo que demuestra que
posiblemente la conformación de la estructura secundaria para el péptido DM19 es
igualmente helical. En la figura 14 se muestran los espectros para los análogos de
dermaseptina. En los espectros se observan los dos mínimos de la curva de dicroísmo,
uno cercano a los 205 nm y el otro sobre 225 nm, que indican el carácter de organización
en forma helical de los péptidos, que es observable para todos los espectros DC de los
análogos prácticamente en igual proporción. Todos los espectros fueron corridos en agua
con 30% de TFE.
Resultados y discusión 51
Tabla 7. Estructura secundaria de los análogos de dermaseptina por dicroísmo circular
con el programa CONTINLL
SD: Sin deconvolución
Se puede observar que todos los espectros presentan la misma tendencia debida a
estructuras de tipo helical, y al posible efecto que tiene el trifluoroetanol en la estructura
de algunos péptidos (figura 14). Este cosolvente ayuda a estabilizar la hélice α debido
posiblemente a que su constante dieléctrica es relativamente baja (26.69) comparada
con la del agua (78.50) [98] y posee un momento dipolar alto, lo cual promueve el
plegamiento de la cadena peptídica, favoreciendo así la formación de puentes de
hidrógeno intramoleculares que estabilizan la hélice. Este posible plegamiento debido al
favorecimiento de los puentes de hidrógeno intramoleculares en el péptido, hacen que el
agua sea expulsada de los alrededores del péptido [99], acompañado con una
disminución de la constante dieléctrica del medio [100]. En varios estudios se ha
encontrado que para péptidos en agua con concentraciones mayores o iguales de 30%
de TFE, se favorece la interacción hidrofóbica entre parte de las cadenas laterales de
ciertos residuos lo que conlleva al plegamiento de la estructura secundaria del péptido
[101, 102].
Péptido % Hélice% Hojas
beta% Giro % Al azar
DM1 98.1 1.8 0.0 0.1
DM5 100.0 0.0 0.0 0.0
DM6 55.5 2.4 14.4 27.7
DM9 41.5 4.8 18.2 35.5
DM10 85.8 0.0 1.1 13.1
DM11 100.0 0.0 0.0 0.0
DM16 77.3 2.6 5.9 14.2
DM17 42.1 0.5 24.8 32.6
DM18 74.4 0.0 0.0 25.6
DM19 SD SD SD SD
DM20 48.6 0.0 3.9 47.5
52 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
Figura 14. Espectros de DC para análogos de dermaseptina
a b
c d
e f
-3.00E+05
-1.00E+05
1.00E+05
3.00E+05
5.00E+05
190 200 210 220 230 240 250 260
Elli
p. M
ol
Wavelength (nm)
DM1
-2.00E+05
-1.00E+05
0.00E+00
1.00E+05
2.00E+05
190 200 210 220 230 240 250 260
Elli
p. M
ol
Wavelength (nm)
DM5
-1.32E+05
-8.80E+04
-4.40E+04
0.00E+00
4.40E+04
190 210 230 250
Elli
p. M
ol
Wavelength (nm)
DM6
-1.50E+05
-1.00E+05
-5.00E+04
0.00E+00
5.00E+04
190 210 230 250
Elli
p. M
ol
Wavelength (nm)
DM9
-2.00E+05
-1.00E+05
0.00E+00
1.00E+05
2.00E+05
190 210 230 250
Elli
p. M
ol
Wavelength (nm)
DM10
-2.00E+05
-1.00E+05
0.00E+00
1.00E+05
2.00E+05
190 210 230 250
Elli
p. M
ol
Wavelength (nm)
DM11
-3.00E+05
-2.00E+05
-1.00E+05
0.00E+00
1.00E+05
2.00E+05
190 210 230 250
Elli
p. M
ol
Wavelength (nm)
DM16
-8.00E+04
-6.00E+04
-4.00E+04
-2.00E+04
0.00E+00
190 210 230 250
Elli
p. M
ol
Wavelength (nm)
DM17
g h
i j
k
-4.80E+05
-1.80E+05
1.20E+05
4.20E+05
7.20E+05
190 210 230 250
Elli
p. M
ol
Wavelength (nm)
DM19
-3.00E+05
-2.00E+05
-1.00E+05
0.00E+00
1.00E+05
190 210 230 250
Elli
p. M
ol
Wavelength (nm)
DM18
-1.50E+05
-1.00E+05
-5.00E+04
0.00E+00
5.00E+04
190 210 230 250
Elli
p. M
ol
Wavelength (nm)
DM20
Resultados y discusión 53
6.5 Ensayos biológicos
6.5.1 Ensayo de hemólisis
En este estudio se encontró que todos los análogos de dermaseptina evaluados
presentan baja actividad hemolítica sobre eritrocitos humanos. Los datos son
presentados en la tabla 8, en la cual se observa que la concentración hemolítica media
(HC50) para todos los péptidos es superior a la concentración máxima del estudio (200
μg/mL). En la cuarta columna se observan los porcentajes de hemólisis a la máxima
concentración del estudio calculados para cada secuencia. El mayor efecto hemolítico lo
genera DM17 (6.16%), seguido de DM20 (5.61%) y DM5 (4.99%), en donde DM17 y
DM20 tienen un efecto mínimo sobre los glóbulos rojos, lo cual es conveniente para la
acción de los péptidos sobre células humanas. De los 3 péptidos que presentaron el
mayor efecto hemolítico, el menor efecto lo muestra DM5, posiblemente a que su carga
total es +4, la cual es mayor a la de DM17 (0) y DM20 (-1), lo que dificulta la interacción
de tipo electrostática con el glóbulo rojo.
g h
i j
k
-4.80E+05
-1.80E+05
1.20E+05
4.20E+05
7.20E+05
190 210 230 250
Elli
p. M
ol
Wavelength (nm)
DM19
-3.00E+05
-2.00E+05
-1.00E+05
0.00E+00
1.00E+05
190 210 230 250
Elli
p. M
ol
Wavelength (nm)
DM18
-1.50E+05
-1.00E+05
-5.00E+04
0.00E+00
5.00E+04
190 210 230 250
Elli
p. M
ol
Wavelength (nm)
DM20
54 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
Los controles usados en el estudio fueron eritrocitos diluidos en solución salina sin
exposición a ninguna sustancia que corresponden al control negativo o 100% de
viabilidad y eritrocitos expuestos a agua destilada estéril considerado como control
positivo el cual genera el 100% de hemólisis. Aparte de los péptidos se evaluó el carácter
hemolítico que presentan la pentamidina y el péptido CLIP, los cuales corresponden a un
medicamento de elección para el tratamiento de la LC en varios países y a la cadena
peptídica invariable naturalmente cargada en el complejo mayor de histocompatibilidad
(CMH) respectivamente. A la máxima concentración de los péptidos evaluada, se
encontraron porcentajes de hemólisis inferiores al 6.16% con HC50 superiores a
200μg/mL.
Tabla 8. Actividad hemolítica y citotóxica de los péptidos sobre eritrocitos y monocitos de
sangre periférica humana respectivamente. La concentración media Hemolítica (HC50) y
la concentración letal media (CL50) expresada en μg/mL
Péptido HC50 (μg/mL)CL50 en DC
(μg/mL)
% hemólisis a la
máxima
concentración
DM1 >200 >200 1.82
DM5 >200 >200 4.99
DM6 >200 >200 2.15
DM9 >200 >200 1.47
DM10 >200 >200 2.65
DM11 >200 >200 1.05
DM16 >200 >200 1.80
DM17 >200 >200 6.16
DM18 >200 >200 2.03
DM19 >200 >200 2.05
DM20 >200 >200 5.61
Pentamidina > 10 > 10 < 1
Clip >200 >200 < 1
Resultados y discusión 55
6.5.2 Ensayo de citotoxicidad
El efecto citotóxico sobre células monocitos de sangre periférica humana fue mínimo en
todos los péptidos evaluados, lo cual se reporta en la tabla 8. Estos resultados muestran
que los análogos de dermaseptina pueden llegar a ser usados como herramienta
terapéutica, ya que a concentraciones relativamente altas (>200 μg/mL) no se genera
citotoxicidad sobre células humanas sanas. La posibilidad del uso de estos análogos
como posible tratamiento contra LC, es viable solo para aquellas secuencias activas
contra el parasito, sin efectos sobre células humanas a las concentraciones de péptido
de uso terapéutico.
A las máximas concentraciones evaluadas para cada uno de los péptidos, la citotoxicidad
sobre monocitos de sangre periférica humana fue mínima calculándose CL50 superiores
a 200μg/mL. Estos datos se muestran en la tabla 8.
6.5.3 Ensayos de efectividad sobre promastigotes de L. panamensis
De los péptidos evaluados, sólo se detectó actividad leishmanicida contra promastigotes
de L. panamensis en un péptido, el análogo denominado DM1. Para este péptido, la
CE50 hallada fue de 151,9μg/mL con R2 superior a 0.9 para todos los casos, ver tabla 9.
Al observar los valores de la eficacia sobre L. panamensis presentados en la tabla 9, se
puede observar que la pentamidina presenta una concentración media efectiva casi 100
veces menor (EC50<1,25μg/mL) comparado con el único análogo activo contra L.
panamensis DM1 (EC50=151,9μg/mL), lo que indica que este medicamento es más
activo contra la especie de Leishmania, pero es importante resaltar que esa efectividad
del medicamento no es selectiva contra el parasito. La pentamidina, tiene un efecto
compartido para promastigotes y amastigotes, lo cual favorece los protocolos
experimentales, a diferencia de las sales antimoniales como el antimoniato de
meglumina, que al ser un profármaco, sólo resulta efectivo sobre las formas
intracelulares del parásito [33, 103]. El isotianato de pentamidina, se ha convertido en el
medicamento de elección para el tratamiento de la LC en varios países donde la
enfermedad es endémica, presentando una eficacia muy similar a los antimoniales
pentavalentes pero con una incidencia menor de efectos adversos, lo cual se ha
56 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
evaluado también en Colombia [33, 75-77]. Esa incidencia menor de los efectos adversos
que presenta la pentamidina no es comparable con la posible incidencia del usó de
péptidos con acción biológica, ya que estos efectos adversos se ven disminuidos al
máximo [104]. Por eso, a pesar de que DM1 tiene una CE50 mayor comparado con la
CE50 de la pentamidina, esto no indica que la secuencia DM1 se pueda convertir en una
mejor alternativa para el tratamiento de la LC causada por promastigotes de L.
panamensis.
Tabla 9. Eficacia de los análogos de dermaseptina sobre promastigotes de L.
panamensis. La concentración media efectiva (EC50) es expresada en μg/mL.
La curva de viabilidad de L. panamensis vs la concentración empleada de DM1 se
presenta a continuación (figura 15). Se puede observar que la concentración efectiva
para llevar al 50% de supervivencia del parasito es cercana a 151,9μg/mL. La figura 15
muestra que no existe un efecto importante sobre la supervivencia del parasito a las
concentraciones bajas de DM1 en el estudio, pero cuando la concentración del péptido
aumenta, dicho efecto aumenta drásticamente, indicando que el péptido a
concentraciones superiores a 150μg/mL tiene un efecto alto sobre la supervivencia del
parasito.
Péptido
EC50
Leishmania
panamensis
(μg/mL)
DM1 151.9
DM5 >200
DM6 >200
DM9 >200
DM10 >200
DM11 >200
DM16 >200
DM17 >200
DM18 >200
DM19 >200
DM20 >200
Pentamidina < 1,25
Clip >200
Resultados y discusión 57
Figura 15. Efecto de la concentración de DM1 sobre la supervivencia de L. panamensis
La diferencia entre DM1, que corresponde al análogo de dermaseptina activo contra L.
panamensis y los demás análogos, se encuentra básicamente en la región inicial de la
secuencia, que corresponde al extremo amino de la secuencia. La DM1 al igual que la
secuencia dermaseptina S1 son activas contra la forma extracelular del parasito [81] y
poseen un residuo de triptófano (W) invariante en la posición 3, que básicamente es el
característico en la familia de dermaseptinas [105]. La única que posee ese residuo
invariante al inicio de su secuencia es el análogo DM1, y que se ve favorecido aún más
por la carga neta de la molécula. Al evaluar la hidrofobicidad de los análogos de
dermaseptina según la escala de Kyte y Doolittle [106], se puede apreciar la distribución
hidrofóbica e hidrofílica de cada análogo, los cuales se presentan como gráficos en la
figura 16. Al observar la distribución de hidrofobicidad para DM1, se puede observar
claramente que es diferente a los demás análogos evaluados, DM1 presenta al inicio de
la secuencia dos regiones de carácter hidrofílico totalmente definidas que son debidas a
los residuos iniciales W, K y T que no están presentes en ningún otro análogo en el
extremo N-terminal. La distribución de la hidrofobicidad de los demás análogos no es
totalmente definida como si lo es en DM1, lo que sumado a la presencia de una hélice
totalmente definida de carácter anfipático, hace que esta distribución de la hidrofobicidad
a lo largo de la secuencia, posiblemente genere un resultado global sobre la acción de
los análogos de dermaseptina al ser enfrentados con promastigotes de L. panamensis.
Para el caso de DM5, DM17 y DM20 que corresponden a las secuencias que arrojaron la
actividad hemolítica superior comparado con los demás péptidos, se puede observar en
la figura 16, que la distribución hidrofílica de estos péptidos esta favorecida hacia el
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150 200
% Su
perv
ivenc
ia
Concentración de DM1 / (μg/mL)
58 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
extremo C-terminal de la secuencia, y que además el carácter hidrofóbico de los residuos
no está totalmente definido si se compara con DM1. Esta posible distribución hidrofílica
desplazada hacia el extremo C-terminal, puede afectar de alguna manera la interacción
con el glóbulo rojo, y de alguna manera aumentar la lisis del eritrocito debido a su
interacción con el péptido.
Figura 16. Gráfico de la distribución de la hidrofobicidad por aminoácido para los
análogos de dermaseptina.
-4.5
-3.5
-2.5
-1.5
-0.5
0.5
1.5
2.5
3.5
4.5
A L W K T M L K K L G T M A L
Hid
rofo
bic
idad
DM1
-4.5
-3.5
-2.5
-1.5
-0.5
0.5
1.5
2.5
3.5
4.5
T M L K K L G T M A L H A G K
Hid
rofo
bic
idad
DM5
-4.5
-3.5
-2.5
-1.5
-0.5
0.5
1.5
2.5
3.5
4.5
M L K K L G T M A L H A G K A
Hid
rofo
bic
idad
DM6
-4.5
-3.5
-2.5
-1.5
-0.5
0.5
1.5
2.5
3.5
4.5
K L G T M A L H A G K A A L G
Hid
rofo
bic
idad
DM9
-4.5
-3.5
-2.5
-1.5
-0.5
0.5
1.5
2.5
3.5
4.5
L G T M A L H A G K A A L G A
Hid
rofo
bic
idad
DM10
-4.5
-3.5
-2.5
-1.5
-0.5
0.5
1.5
2.5
3.5
4.5
G T M A L H A G K A A L G A A
Hid
rofo
bic
idad
DM11
-4.5
-3.5
-2.5
-1.5
-0.5
0.5
1.5
2.5
3.5
4.5
H A G K A A L G A A A D T I S
Hid
rofo
bic
idad
DM16
-4.5
-3.5
-2.5
-1.5
-0.5
0.5
1.5
2.5
3.5
4.5
A G K A A L G A A A D T I S Q
Hid
rofo
bic
idad
DM17
-4.5
-3.5
-2.5
-1.5
-0.5
0.5
1.5
2.5
3.5
4.5
G K A A L G A A A D T I S Q G
Hid
rofo
bic
idad
DM18
-4.5
-3.5
-2.5
-1.5
-0.5
0.5
1.5
2.5
3.5
4.5
K A A L G A A A D T I S Q G T
Hid
rofo
bic
idad
DM19
-4.5
-3.5
-2.5
-1.5
-0.5
0.5
1.5
2.5
3.5
4.5
A A L G A A A D T I S Q G T Q
Hid
rofo
bic
idad
DM20
Resultados y discusión 59
Aunque estos resultados no establecen claramente un mecanismo de acción de los
péptidos sobre las formas del parasito, ni lo intentan establecer, dicho mecanismo puede
estar asociado con una actividad dual (sinérgica) de los péptidos, incluyendo la
distribución de los residuos a través de una estructura secundaria totalmente definida que
logre su acción sobre las células del huésped y/o en el parasito. Para poder potencializar
el uso de los péptidos con actividad antileishmanial en medicamentos que traten la
enfermedad, se requiere de estudios adicionales, incluyendo modificaciones químicas de
los péptidos sintéticos para aumentar su efecto contra la Leishmaniasis. En el caso del
presente proyecto, estas modificaciones deben estar enfocadas en el inicio de la
secuencia de dermaseptina (extremo N-terminal), logrando con la variación de algunos
residuos aumentar su acción leishmanicida selectiva contra promastigotes de L.
panamensis. La estructura secundaria de cada uno de los análogos de Dermaseptina
juega un papel importante en la actividad contra el parasito, en la cual un mayor
porcentaje de estructura de tipo helical no necesariamente proporciona una mayor acción
antileishmanial, pero la distribución de los residuos en la secuencia si logran de alguna
manera aumentar dicha acción. También se encontró que un mayor carácter catiónico
con distribución anfipática e hidrofóbica en la secuencia, favorece la interacción con
membrana celular y favorece la acción leishmanicida sobre L. panamensis.
Al evaluar los resultados obtenidos para los análogos de dermaseptina, se pueden
sugerir modificaciones de la secuencia activa contra el parasito DM1, e intentar predecir
por medio de herramientas bioinformáticas su estructura secundaria, carga total y
distribución de la hidrofobicidad a través de una posible estructura helical anfipática. En
la tabla 10 se presentan algunas modificaciones del análogo DM1, las cuales cumplen las
características encontradas para un posible péptido activo contra Leishmania. Todos
conservan un porcentaje de helicidad superior al 53%, una carga total positiva superior a
+3 y presentan un valor de carácter antimicrobial comparable con el calculado para DM1.
Se muestran en rojo los residuos modificados en la secuencia original del análogo DM1.
Es importante resaltar que todos los análogos modificados conservan una distribución
hidrofóbica favorable en la totalidad de la secuencia, e intentan mejorar de alguna
manera la distribución de los residuos en la hélice anfipática.
60 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
Tabla 10. Secuencias de análogos modificados de DM1
Secuencia Porcentaje Helice Carga Total Score Antimicrobial
GLWKTMLKKLGTMAL 60.0 3 1.940
KLWKTMLKKLGTMAL 60.0 4 1.110
LWKTMLKKLGTMALH 53.3 4 0.402
ALWKTMLKKLGTWAL 60.0 3 1.286
ALWKTWLKKLGTMAL 60.0 3 1.354
GLWKTWLKKLGTWAL 60.0 3 1.853
7. Conclusiones
Se logró estandarizar las condiciones necesarias para sintetizar análogos de
Dermaseptina S1 por SPPS mediante metodología Fmoc.
Se logró determinar la estructura secundaria de los análogos sintetizados y
compararla con datos obtenidos por predicción bioinformática, encontrando alta
correlación entre los valores experimentales y los obtenidos por medio
bioinformático.
Los análogos de Dermaseptina evaluados muestran baja actividad hemolítica y
citotóxica sobre eritrocitos humanos de donantes sanos grupo O Rh positivo y
monocitos de sangre periférica respectivamente.
De los péptidos evaluados, el único péptido que presentó actividad selectiva
contra promastigotes de L. panamensis fue DM1, lo cual es un indicio de su
potencial actividad antimicrobiana contra esta especie del parásito Leishmania.
Se encontró que la que la concentración efectiva media para DM1 contra L.
panamensis es de 151,9μg/mL, a partir de la cual existe un efecto elevado sobre
la supervivencia del parasito bajo la acción del péptido.
Se logró establecer una relación directa entre la estructura secundaria de los
péptidos y la distribución hidrofóbica de ciertos residuos a lo largo de la cadena
con la acción leishmanicida de los análogos evaluados contra promastigotes de
L. panamensis.
Los resultados obtenidos en este proyecto son de gran utilidad para diseñar y
sintetizar péptidos cortos que sean usados como nuevos fármacos contra la
62 Síntesis y determinación estructural de péptidos derivados de Dermaseptina
con actividad antileishmanial
leishmaniasis y se conviertan en una alternativa para combatir los efectos
adversos que conllevan los tratamientos actuales
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