southern, northern y western blot
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Diapositiva 1
UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO ESCUELA DE POSTGRADO MAESTRIA EN MICROBIOLOGIASantos Evaristo Inon ChozoMAESTRANTESouthern, Northern y Western BlotINTRODUCCION
La tcnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografa, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de protenas o de cidos nucleicos:Si se trata de protenas, la tcnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cul es la banda que presenta la protena que me interesa localizar.
Si se trata de RNA, la tcnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (molculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qu bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda.
Si se trata de DNA, la tcnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (molculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qu bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda.
Western BlotWestern Blot, tambin llamado inmunoblot, es una tcnica analtica muy utilizada para identificar una protena diana en una mezcla de protenas complejas gracias a la especificidad de la interaccin anticuerpo-antgeno. El mtodo se basa en la construccin de un complejo anticuerpo: protena a travs de la unin especfica de anticuerpos a las protenas inmovilizadas sobre una membrana de nitrocelulosa o PVDF y en la deteccin del anticuerpo unido mediante uno de los dos diferentes mtodos de deteccin de western blot: el mtodo de deteccin directo y el indirecto.TECNICA DE WESTERN BLOT
SDS (sodium dodecyl sulfate), and BME (beta-mercaptoethanol)
Mtodo Indirecto
La Biomasa contienen mezclas complejas de carbohidratos, llamados celulosa, hemicelulosa y lignina.
Mtodo Directo Mtodo DIRECTOMtodo INDIRECTOPROSCONTRASPROSCONTRASRpido porque slo se usa un anticuerpo y se necesitan menos etapas.Unin especfica del anticuerpo secundario (no hay reactividad cruzada).Disminucin de la variabilidad del ensayo y mejora de la calidad de los datos.Falta de sensibilidad para detector bajos niveles de expresin del antgeno.Necesidad de marcar cada anticuerpo primario para cada antgeno de inters: consume tiempo y es costoso.La inmunoreactividad del anticuerpo primario puede verse afectada adversamente por el marcaje.No hay flexibilidad en la eleccin marcador del anticuerpo primario de un experimento a otro. Amplificacin de seal mnima. Altos conocimientos cientficos especializados requeridos.Mayor nivel de sensibilidad y genera una seal ms intensa.Una amplia variedad de anticuerpos secundarios marcados disponibles comercialmente.Mxima inmunoreactividad del anticuerpo primario se mantiene, ya que no est etiquetado.Mayor amplificacin de la seal debido a la unin de varios anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario.Unin no especfica del anticuerpo secundario y alto ruido de fondo.El uso de un anticuerpo secundario requiere pasos adicionales de bloqueo y de control.
VentajasDesventajasSe produce a partir defuentesrenovables.
Produce menos dixido decarbono que la gasolina, aunque el impacto total depende de losprocesosdedestilacin y laeficienciade los cultivos.
Genera menos monxidos de carbono al utilizarse como aditivos de la gasolina con el uso de 10% de etanol en la mezcla se puede lograr un reduccin de 25% a 30% en la emisiones de CO.
Es menos inflamable que la gasolina y el diesel.
Baja toxicidad.
No emite compuestos de azufre.
La combinacin de 90% de gasolina y 10% etanol puede ser usado en los vehculos sin ninguna modificacin.Presenta menorpoder calorfico que la gasolina, por lo que requiere un mayor consumo.
Contiene 2/3 de la energa contenida en el mismovolumen.
La elaboracin de etanol a partir de granos es ms caro que la gasolina. Aproximadamente 1.5 veces.
Presentaproblemas decorrosin en partes mecnicas y sellos.
En climas muy fros presenta dificultades para el encendido.
Genera emisiones de xidos de nitrgeno y aldehdos (contaminantes menores).
Para el uso de una mezcla de 85% etanol y 15% gasolina (E85) se requiere de una adecuada modificacin en losmotores.Ventajas y Desventajas del Uso de Bioetanol como CombustibleA nivel mundial el etanol es usado principalmente como:
Combustibles: ya sea para mezclar o reemplazar el petrleo y derivados. El 65,4% de produccin mundial de etanol se usa como combustibles.
Insumo en laindustriaprocesadora: dado que el 21% de la produccin mundial se destina a lasindustriasde cosmticos, farmacutica,qumica, entre otras.
Insumo en la elaboracin de bebidas: que utiliza alrededor del 13% de la produccin mundial.
Cabe destacar que, la produccin mundial de alcohol destinada al uso de combustibles se encuentra mayormente subsidiada.
Bioetanol Principalmente Usado como CombustiblesEn el Per la produccin de etanol se destina principalmente a la elaboracin de bebidas, as como en la industria qumica y cosmticos.
Produccin de alcohol deresiduos lignocelulsicos cscaras de arroz (Oriza sativa)Roque Rojas Babilonia (1)Juan Cabanillas Aguilar (2)Bilogo. Ex-docente de la Universidad Nacionalde Piura-Per / Consultor Ambiental. [email protected]
Microbilogo. Ex-docente de la Universidad Nacional de Piura-Per/ Consultor Agroindustrial. [email protected] Virtual REDESMA Julio 2008ResumenExisten procesos qumico-biolgicos para obtener etanol de residuos celulsicos, con relativa rentabilidad para su aplicacin industrial. En nuestro pas (Per) y regin norte en especial, asi como otros pases existen residuos celulsicos abundantes, como la cscara de arroz y otros, rica en celulosa en un 70 %.Se plante investigar un mtodo rentable a nivel industrial de obtencin de etanol a partir de cscaras de arroz. El diseo de las experiencias se realiz teniendo como variables, presin y temperatura, y como constantes, la concentracin de cido y el tiempo.Como resultado se obtuvo un rendimiento de 25 litros de alcohol (etanol) de 96 G.L. a partir de 100.00 Kgrs. de cscaras de arroz, a un costo de produccin en el ao 1987 aproximado de cinco intis litro (I/5.00), competitiva a la materia prima tradicional melaza.El mtodo obtenido hace rentable la obtencin de alcohol etanol a nivel industrial a partir de cscaras de arroz y otros residuos agrcolas, forestales e industriales, pudiendo convertir al pas en exportador de alcohol y/o usar este alcohol, como alcohol combustible (Gasohol).Palabras clave: Alcohol, etanol, cscaras de arroz, Oriza sativa.
IntroduccinLa transformacin de los hidratos de carbono en bebidas alcohlicas (vinos, sidras, etc.) ha sido practicada por el hombre desde la antigedad, utilizando como materia prima: frutos, granos, tubrculos, etc.El desarrollo industrial est conduciendo cada vez ms al incremento del uso del alcohol, por la utilizacin de ste, directa o indirectamente para la elaboracin de una serie de productos, en medicina, perfumera, textiles, disolventes, bebidas alcohlicas, combustibles, etc.; por lo cual se viene investigando nuevas fuentes de materia prima para la obtencin de alcohol que sean rentables y competitivas frente a las tradicionales como la melaza, granos y derivados del petrleo.
Frente a la preocupacin mundial por el calentamiento global, nuestra dependencia a los combustibles fsiles no renovables con precios sobre los 100 USD/barril y en aumento, urge la bsqueda de nuevas alternativas energticas basadas en recursos renovables, como los deshechos agrcolas, forestales, domsticos e industriales.En este camino, para la obtencin de alcohol, planteamos el uso de residuos celulsicos (deshechos agrcolas, aserrn, virutas, etc.), que como sabemos, contienen del 35 al 70 % de residuos celulsicos. Ver Anexo N 3-4: Anlisis de la cscara de arroz.En nuestro pas (Per) y zona norte hay una relativa abundancia de cscaras de arroz y otros residuos celulsicos, que no se estn utilizando adecuadamente, siendo su utilizacin para la produccin de etanol, una importante alternativa; acorde con la actual poltica del gobierno nacional y regional, de impulsar la produccin de etanol, a partir del cultivo de la caa de azcar.
En la Universidad Nacional de Piura-Per, en el ao l987, con el financiamiento de CONCYTEC (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa), se investig un mtodo rentable a nivel industrial de obtencin de etanol a partir de cscaras de arroz, logrando una biotecnologa de produccin de un rendimiento del 25 %, que proyectado al Anexo N 1:de proyeccin de produccin de arroz cscara, cscara de arroz, alcohol y valor agregado, enero a junio 2007, da un estimado de produccin nacional de 86 millones de litros de alcohol de 96 G.L y un valor agregado de 256908,750 nuevos soles, aproximadamente 80 millones de dlares.
Los resultados obtenidos han generado una gran expectativa, patentisado en consultas y pedidos de informacin, incluso del extranjero, conferencias, etc.; la posibilidad de convertir al pas en exportador de alcohol; y, la utilizacin de este como alcohol combustible (Gasohol).
II. Materiales y MtodosMaterialesA. Reactivos: H2 SO4: Acido sulfuricoCaO: Oxido de calcio SO4 (NH4)2: sulfato de amonio SO3HNa: El bisulfito de sodioAgar sabouraud y Probiticos.
B. Equipos: Aireador, autoclave, estufa y equipo de destilacin.
C. Otros: Placas petri, recipientes plsticos, frascos de vidrio, cocina elctrica, pintura, mangueras plsticas, cilindros, cinta de pH.
MtodosConsta de tres etapas: Procesamiento qumico basado en los mtodos de Duninng Lathrop y Scoller Tornesh.;Procesamiento biolgico, que comprende: obtencin y seleccin de la cepa de levadura, Preparacin de inculo e inoculacin y fermentacin; y,Destilacin, usando primero el equipo tradicional de laboratorio de vidrio, luego un equipo llamado pre-piloto y finalmente una pequea planta piloto; estos dos ltimos con nuestro propio diseo y asesoramiento de construccin, usando material nacional..
En trminos de la Ingeniera del proceso:La primera fase es la recoleccin de las cscaras de arroz.La segunda es el Pre-tratamiento y corresponde a un tratamiento fsico que es el de moler la cscara hasta una granulometra de malla 1mm. Para luego pasarlo a un bao con cido sulfrico diluido, aplicarle temperatura para conseguir la liberacin de la celulosa de la lignina y la liberacin de las hemicelulosas.Luego se ajustan las condiciones de trabajo (pH, tiempo, temperatura, relacin slido lquido) de la masa para ser hidrolizado por la accin de los preparados enzimticos de celulasas.Se separa el lquido con glucosa de la lignina y se acondiciona para ser fermentado por la levadura.El lquido fermentado se destila para obtener alcohol de 100 GL. (para su uso como combustible).
Al respeto, destacamos:
Se ha logrado completar el crculo de la tecnologa necesaria para convertir los residuos lignocelulsicos en etanol.
Anteriormente en el sigo XX se hacia completamente la sacarificacin de la celulosa por procesos qumicos, pero el costo de estos procesos demostr que si bien era viable tcnicamente mas no lo era econmicamente, pues el costo del petrleo era muy barato. Hace 15 aos atrs el barril del petrleo costaba 12 US, hoy supera los 130 USD con tendencia a seguir subiendo.
Desde mediados de la dcada del 95 se iniciaron los primeros avances en las pruebas de produccin y extraccin de celulasas para su aplicacin industrial y a partir del 2002 se consigui la metodologa que reduce sus costos hasta en 30 veces de lo que era antes de esta poca. Siendo importante la suma de la experiencia de hidrlisis qumica y enzimtica, el conocimiento de las celulasas, las caractersticas de la celulosa y el perfeccionamiento de los materiales de los equipos de proceso.El uso de los residuos lignocelulsicos como biomasa-materia prima para la produccin de alcohol, tiene las siguientes ventajas:
La celulosa es un recurso abundante y fcilmente disponible que se encuentra en todo tipo de material vegetal incluidos los productos de desecho, como los tallos y las mazorcas de maz, la pasta de madera, virutas de madera, caa de azcar y hojas de paja y cascarilla de arroz.
Es muy barato su costo y ms bien solventa un problema de eliminacin de residuos.
El uso de residuos lignocelulsicos reducira la utilizacin de almidones y azucares (Maz, yuca, papa, remolacha, melaza, etc.), que tendran una mejor aplicacin en la alimentacin humana.La disponibilidad de los residuos lignocelulsicos garantiza una industria del alcohol y es sostenible por que es un recurso renovable a diferencia de los fsiles.
Una gran ventaja de la conversin de biomasa a etanol es la compatibilidad con la proteccin del medio ambiente, as como los beneficios econmicos que ofrece al mundo, tanto en el presente y el futuro; en este sentido, esta industria es un gran ejemplo de la filosofa de la tecnologa y el cambio que el mundo necesita para ser un lugar mejor para vivir.
Una de las caractersticas de la utilizacin de la biomasa es que, al contrario de lo que ocurre con los productos derivados de las materias primas fsiles (no renovables), presenta un balance de CO2 neutro desde el punto de vista medio ambiental; es decir, que la cantidad de CO2 que se libera a la atmsfera al final del ciclo de vida de los productos es idntica a la cantidad de CO2 previamente captada durante la formacin de biomasa.Otra ventaja es el uso de capacidad productiva no utilizada en agricultura e industria forestal.
La revitalizacin de las economas rurales mediante la produccin y el procesado local de fuentes de materias primas renovables, y el consiguiente desarrollo ms equilibrado entre reas urbanas y rurales.
Mayor facilidad para lograr un desarrollo econmico ambientalmente sostenible mediante el uso de materias primas renovables y la disminucin de las emisiones netas de CO2 a la atmsfera.
La seguridad nacional: por menor dependencia exterior, tanto energtica como de fuentes de materias primas.1. Cien Kgrs. de cscaras de arroz producen 50 Kgrs. de glucosa y este 25 litros de alcohol de 96 G.L.
2. La cepa de levadura obtenida y seleccionada es Saccahromyces cerevisiae, realiza la fermentacin en 48 horas y es resistente al bisulfito de sodio.
3. El costo de produccin estimado a nivel de planta piloto en el ao l987 fue de I/5.00 el litro.IV. Resultados4. Los anlisis qumicos del alcohol etlico obtenido demuestran su buena calidad y garantizan su uso, incluso como bebida alcohlica (Ver Anexo N2: Certificado de Anlisis del Alcohol obtenido).
5. El diseo de las experiencias se realiz teniendo como variables, presin y temperatura, y como constantes la concentracin de cido sulfrico y el tiempo.
6. A nivel de planta piloto se ha obtenido rendimientos del 25%, es decir por cada tonelada de materia prima (cscaras de arroz) se han obtenido 250 litros de alcohol etanol de 96 G.L. a un costo de produccin prometedor.1.No cabe duda que la obtencin de energa y biocombustibles a partir de biomasa, por su abundancia y sostenibilidad, es una alternativa viable y un hecho comercial actual.
2. Al haberse demostrado la viabilidad econmica, en la actualidad pases como Brasil, China, EEUU, India y la UE, estn avanzando aceleradamente en este proceso.
3. Pases con caractersticas similares al Per y otros relativamente pobres en recursos fsiles, deben apoyar iniciativas e investigaciones como la presente.
4. Cualquier esfuerzo que se haga en esta lnea es un esfuerzo a contribuir al desarrollo sostenible del pas, recurriendo a formas de energa que no compiten con el uso de tierras para la produccin de alimentos.V. Conclusiones generales sobre los proyectos de BioetanolLos materiales usados y el mtodo encontrado hacen factible obtener alcohol etlico a partir de cscaras de arroz.
2. La abundancia de cscaras de arroz y otros residuos lignocelulsicos en el pas y en el mundo, as como su escaso uso y bajo costo, los convierten en excelentes y prometedoras materias primas alternativas a la tradicional melaza. Mucho ms, hoy que se impulsan los BIOCOMBUSTIBLES como alternativa energtica, con todas las ventajas que significa aprovechar los deshechos lignocelulsicos.
3. La infraestructura a implementar para la produccin de alcohol etlico a partir de cscaras de arroz no es compleja y no necesita mucha inversin, pues los costos de produccin - incluso poniendo un precio a la materia prima (cscaras de arroz)- permiten mantener un buen margen de rentabilidad. Adems, los costos de produccin pueden reducirse aprovechando la gran cantidad de CO2 producido, factible de usarse en otra rama industrial conexa a la planta. Adicionalmente, esta produccin puede ser complementaria a la que se realiza en una planta de produccin de alcohol a partir de caa de azcar u otro.VI. Conclusiones de las experiencias realizadas en la Universidad Nacional de Piura- Per en el ao 1987Los costos estimados de produccin en el laboratorio y planta piloto, demuestran la rentabilidad de obtencin de alcohol etlico a partir de cscaras de arroz a nivel industrial lo que la hace altamente competitiva frente a la materia prima tradicional melaza.
Los costos de produccin de este alcohol y el mercado nacional e internacional, hacen de esta actividad a partir de las lignocelulosas, una actividad rentable, sobre todo si se tiene en cuenta que actualmente el mayor porcentaje de alcohol es obtenido por fermentacin y destilacin de materia prima tipo melaza u otros carbohidratos que por sus mltiples usos, estn elevando cada vez ms sus costos de produccin.
Considerando los costos de produccin de este alcohol etlico, tiene una gran proyeccin para su utilizacin en un futuro cercano como alcohol combustible (GASOHOL) que actualmente utilizan muchos vehculos motorizados en Brasil, y sabemos que en el pas se viene investigando este uso.
La aplicacin industrial de esta biotecnologa de produccin de alcohol, podra convertir a un pas, de importador en exportador de alcohol, con todos los beneficios que de ello se derivan.
8. Como propuestas de accin al respecto, planteamos:
La creacin del Programa Nacional de Biocombustibles y el Subprograma de Biomasa, lo cual permitira no slo visualizar explcitamente la importancia estratgica del tema, sino concentrar los esfuerzos dispersos que actualmente puedan estar realizndose en otras reas con respecto a este tema. En efecto, dentro del subprograma se incluiran todos los eslabones de la cadena del valor de la biomasa (cultivo, recoleccin, almacenamiento y transporte, fraccionamiento, conversin en energa y bioproductos diferentes de los de uso alimentario, lo que permitira la creacin de equipos multidisciplinares para abordar el tema en su integralidad.
Anlisis nacional y regional de biomasa, su uso y potencialidad para sustentar una economa basada en biomasa. El objetivo de un estudio de este tipo sera evaluar qu potencial tienen las tierras disponibles para suministrar biomasa y qu proporcin de consumo de petrleo podra desplazar.El consumo de alcohol es grande en nuestro pas y sabemos que hay dficit de produccin, lo que est haciendo que el pas importe alcohol. Con la produccin de alcohol etanol a partir de cscaras de arroz se presenta la posibilidad de abastecer a nuestro mercado nacional y exportar.
Por ejemplo, de acuerdo al Anexo N 1: Proyeccin de produccin por departamentos de arroz cscara, cscara de arroz, litros de alcohol y valor agregado, enero a junio 2007 Per:
Total produccin arroz cscara = 1712,726 TM
Total materia prima (cscaras de arroz)20% de 1712,726 TM = 342,545 TM de cscaras (teniendo en cuenta que aproximadamente el 20% del arroz cscara, es cscara).
Total produccin de alcohol aplicando nuestra biotecnologa que tiene un rendimiento del 25%, 25% de 342,545 TM= 85636,250 litros de alcohol etlico de 96 G.L. o ms.
Total de Valor agregado a la produccin de arroz cscara= 256908,750 nuevos soles, aproximadamente 85 de USD.VI. DiscusionesLos resultados obtenidos han generado una gran expectativa, patentisado en las consultas y pedidos de informacin, incluso del extranjero, conferencias, etc., todo lo cual vislumbra la concretizacin de llevar esta biotecnologa a produccin industrial.
El precio de los bioproductos, y por tanto su aceptacin generalizada, depender en gran medida de dos factores importantes:
El coste de las materias primas a partir de las cuales se fabrica el bioproducto.
El costo de procesado para convertir la materia prima en el producto deseado.DEPARTAMENTOSTOTAL HA ARROZ CASCARA Y PRODUCCION TM (1)TOTAL TM CASCARA DE ARROZ(2)TOTAL LITROS ALCOHOL (250 L/ TM)TOTAL EN SOLES ALCOHOL (S/3/L)Tumbes7027 = 52454104912622,7506868,250Piura32563 = 3021746043515108,75045326,250Lambayeque35234 = 3050526101015252,50045757,500La Libertad29298 = 2797235594513986,25041958,750Cajamarca15098 = 115517231035775,75017327,250Amazonas17240 = 125631250266256,50018769,500Ancash3067 = 2315546211155,2503465,750Lima5 = 2551,2503,750Ica0 = 0000Hunuco5702 = 174233485871,2502613,750Pasco1601 = 2404481120,250360,750Junn1499 = 4683938234,500703,500Huancavelica0 = 0000Arequipa16928 = 2162314324611243,90033731,700Moquegua0 = 0000Tacna0 = 0000Ayacucho465 = 82616541,250123,750Apurmac0 = 0000Cusco2495 = 3155631157,750473,250Puno374 = 53410726,75080,250San Martn33439 = 2192434384911962,25035886,750Loreto6183 = 195363907976,7502930,250Ucayali7630 = 177663553888,2502664,750Madre de Dios4,217 = 71951439359,7501079,250TOTAL NACIONAL220064 = 171272634254585636,250256908,750ANEXO N 01: PROYECCION DE PRODUCCION POR DEPARTAMENTOS DE ARROZ CASCARA, CASCARA DE ARROZ, LITROS DE ALCOHOL Y VALOR AGREGADO,Enero a Junio 2007 - Per
ANEXO N 2: CERTIFICADO DE ANALISIS N 3259/87 DEL ALCOHOL OBTENIDO
ANEXO N 3: CERTIFICADO DE ANALISIS N 3257/87 DE LA CASCARA DE ARROZ
ANEXO N 4: CERTIFICADO DE ANALISIS N 3258/87 DE LA CASCARA DE ARROZ HIDROLISADAPRODUCCION DE ETANOL EN FORMA BIOLOGICAA. EN EL PRE TRATAMIENTO.LA CASCAR DE ARROZ SE DEBERIA LICUAR CON UNA SOLUCION DE SALES.LUEGO A ESTE LICUADO sembrar Aspergillus niger. EVALUAR DIARIAMENTE, A LOS 07, 15, 30 DIAS
B. EN LA FERMENTACION SE UTILIZA LA Saccahromyces cerevisiae.
ENZIMAS CELULITICASTrichoderma sp, Aspergillus niger y Bacillus subtilis. ** Sanchez Riao y col. 2010. Produccin de etanol a partir de subproductos agroindustriales lignocelulosicos. colombia pag. 72.gracias