splicing la celula
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7/25/2019 Splicing LA CELULA
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Seccin II Flujode lainformacingentica
292
Figura 7.47 Corte y em pal m e
in
vitro Seprocede a laclonacin de
un gen que contiene unintrn y
est
situado
corriente abajo
de un
promotor
(P),
el
cual
es
reconocido
por la ARN
polimerasa de un
bacterifago.
El
plsmido
es
digerido
con una enzima
de restriccin que
realiza
un corte en el
extremo3
del gen insertado
para
conseguiruna molcula de ADN
lineal. EsteADN se
transcribe
in
vitro
con
la
polimerasa
del
bacterifago,
obtenindose un pre-ARNm. Las
reacciones
de corte y empalme
pueden
serestudiadas aadiendo in vitro
este
pre-ARNm
a extractos
nucleares
de
clulas de
mamferos.
Intrn 1
Exn1 Ex n 2
Promotorpara
laARN polimerasa
del
bacterifago
Sitiod ecorte para
la
enzima
derestriccin
Digestin por la enzima de restriccin
ARNmprocesado
del
punto
de
adicin
de poli-A,
resultando
en la
terminacin
de la
t rans-
cripcin.
La
mayora de los A RN m eucariticos est poliadenilada, y se sabe que
las
colas
de
poli-A regulan
la
traduccin
y la
estabilidad
del
A RN m.
La po-
liadenilacin tiene tam bin un im portan te papel regulado r enfases iniciales
deldesarrollo, donde cambios en la longitud de las colas de poli-A contro-
lan la traduccin del ARN m. Por ejemplo, muc hos AR Nm estn almacena-
dos en vu los no fertiliza dos en una
forma
no tra duc ida con colas cortas de
poli-A (habitualmente de 30 a 50 nucletidos de longitud). La fertilizacin
estimula
el
alargamiento
de las
colas
de
poli-A
de los
ARNm almacenados,
lo cual a su vez activa su tra du cci n y la sntesis de las protenas necesarias
para el desarrollo em briona rio.
La mod ificacin
ms
llamativa
de los
pre-ARNm
es la
eliminacin
de in-
trones por el procedimiento de corte y empalme osplicing.Como fue ex-
puesto en el Cap tulo 5, las secuencias codificantes de la ma yora de los ge-
nes eucariticos estn interrumpidas por secuencias no codificantes
(intrones)
que son escindidas de
forma
precisa d el AR Nm maduro.En ma-
mferos,
la
may or parte
de los
genes contienen m ltiples intrones,
que
habi-
tualmente cuentan co n unas diez veces ms de secuencias de pre-ARNm .
que los exones. El desc ubrim iento in espe rado de los intrones en 1977 ge-
ner un activo esfuerzo investigador dirigido a la compresin de los meca-
nismosde corte y empalme, que se
supona deberan ser altamente es-
pecficos
p ara produc ir ARN m fun-
cionales.Estudio s posteriores de
los
fenmenos de corte y empalme n:
slo
han
ilustrado nuevos mecani-
mos de regulacin gnica, sino qi;-
tambin han revelado la
activida;
cataltica de ciertas molculas
c
A R N .
Mecanismosde
corte
y
empalme
o spli ing
La
clave para entend er
los mecanis-
mos de corte y empalme fue el
de-
sarrollo de sistemas
in vitro
que
lle-
varan a cabo de forma eficiente ~
reaccin (Fig.
7.47).
Los
pre-ARNi
fueron sintetizados in vitro
por
me-
dio de la
clonacin
d e
genes estruc-
turales (con
sus
intrones)
adya-
centes
a
promotores
de la ARN
polimerasa de un
bacterifago -
vectores plasmdicos, que
puede
ser obtenidos en grandes canrid*-
des. La transcripcin de estos pa
midosfue
utilizada para obtener _r
gran nmero
de
p re-ARNm
C JT
tras
ser
aadidos
a
extractos
nuclea-
res de clulas animales
fueron
c:
r-
tados
y
empalmados
de
forma
co-
rrecta.
El uso de dichos sistemas
m
vitro ha permitido, como en el e-
cficas
de los exones y actan reclutando al snRNP Ul al punto de corte
i
empalme5 (Fig. 7.52).
Las
protenas
SR
tambin interaccionan
con
otro
fac-
tor de corte y empalme (U2AF), que se une a las secuencias ricas en pimr_-
dina
en los
puntos
de
corte
y
empalme 3
y
recluta
la
snRNP
U2 al
punto Ji
ramificacin.Adems de reclutar a los componentes del espliceosom;
pre-ARNm , los factores de corte y em palm e acoplan el corte y empalme a
t ranscripcin
mediante
su
asociacin
con el CTD
fosforilado
de la ARX po
limerasa
II.
Este anclaje
de la
m aquinar ia
de
corte
y
empalme
a la
A_R>
polimerasase cree que es impo rtante para asegurar que los exones se
una
en el orden correcto a medida que se sintetiza el pre-AR Nm .
Corte
y empalme alternativo
El papel central de los mecanismos de corte y empalme en la maduraa,T
del pre-ARN m abre la posibilidad de regu lar la expresin gnica por
mean
del control de la maqu inaria celular que los lleva a cabo. Dad o que m uero
pre-ARNm contienen mltiples intrones, pueden producirse distirrc
ARNm
partiendo del mismo gen combinando los sitios de corte 5 y 3
posibilidad de combinar los exones aporta un nuevo modo de controlar 1
expresin gnica generando mltiples ARNm
(y por
tanto mltiples pr.:o
as)
a
partir
del
mismo pre-ARNm. Este proceso, denominado corte em
palme al ternat ivo (o splicing alternativo) ocurre de forma habitual er ..
genesde eucariotas superiores. Po r ejemplo, se estima que ms del
3 0 .
lo s
genes
humanos producen transcritos
q ue
sufren corte
y
empalme
nativo,que podra dar lugar a un aum ento notable de ladiversidad de :
tenas que pueden ser codificadas por los 20.000-25.000 genes
estimados
los genomas de mam feros. Puesto que los patrones de co rte y
empalrr.e
ternativos pueden variar entre los distintos tejidos y en respuesta a
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Sntesis ymaduracindelARN
Exn 1
5
SS
Exn
Punto de ram ificacin 3' SS
TI/
7.52
Papel
de los
factores
de
corte
y
empalme
en el
ensamblaje
del
Lo s
factores
de
corte
y
em palme (protenas
SR ) se unen a
secuencias
en los exones. Las protenas SR
recluan
la RNPsn Ul al sitio de corte 5
un factor de corte y empalme adicional (U2AF) al punto de corte 3 . A
:inuacinU2AF recluta a RNPsn U2 al punto de ramificacin.
desarrollo.
Un
ejemplo bien estudiado del procesamiento alternativo especfico de
lo
proporciona
la
determinacin
del
sexo
en
Drosophila, donde
el
cor-
y empalme alternativo del mismo pre-ARNm determina si la mosca es
hembra (Fig. 7.53). Elcorte y empalme alternativo del pre-ARNm
transformador est controlado por una protena
que slo se expresa en las moscas hembra. El pre-ARNm
transforma-
posee tres exones, pero un segundo exn distinto entre ambos sexos se
en el
ARNm
como resultado del uso de puntos de corte y empal-
alternativos en 3 . En los machos, el exn 1 se une al sitio de corte y em-
situado
ms
corriente arriba
de
estos sitios 3 ,
que es
seleccionado
la
unin
del
factor
de
corte
y
empalme
U2AF. En las
hembras,
la
SXL se une al sitio de corte y empalme
3 ,
bloqueando la
unin
de
Como consecuencia, el sitio de corte y empalme corriente arriba se
Machos
U2AF UAG
x~
SXL
Hembras
UA G
pre-ARNm
Corte y
empalme Corte
y
empalme
UAG
Traduccin
Terminacin prematura
Ninguna
protema
funcional
Traduccin
Protena
tra
funcional
7.53Corteyempalme alternativoen ladeterminacin sexual de
El corte y empalme alternativo del ARNm transformador (tra) est
por la protena SXL, que slo se expresa en las moscas hembra. En los
tra se une a un p unto de corte y empalme 3 que
alugar a un segundo exn q ue contiene un codn de term inacin para la
(UAG),
de
modo
que no se expresa ninguna protena tra. En las
SXL
bloquea la
unin
de U2A F a este punto de
y empalme
3 ,
resultando en el uso de un sitio alternativo ms adelante en el
2. Este punto de corte y empalme a lternativo en
3
se encuentra
despus
del
n de terminacin para la traduccin, de modo que el ARN m expresado en las
la sntesis de una protena ira funcional.
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SeccinII Flujode lainformacin
gentica
300
12
exones
alternativos
DN
48
exones
alternativos
33
exones
alternativos
2
exones
alternativos
Figura
7.54 Cortey empalme alternativo de
Dscam
El gen Dscam
contiene
cuatrojuegos de
exones
alternativos: 12 para el exn
4,48
para el exn 6,33
para
el
exn
9, y2
para
el exn 17.
Cualquier exn
de cualquiera de
estos juegos
puede ser
incorporadoen el
ARNm
madura, de
forma
que el
corte
y empalme alternativo
puedeproducir un
total
de
38.016
ARNm diferentes (12x 48 x 33 x2 = 38.016).
El odo
de
unmamfero
contiene clulas pilosas
que
estn
preparadaspara respondera
sonidosdediferentes frecuencias.
Secree queeste fenmeno est
mediado en
parte
por el
corte
y
empalme alternativode un gen que
codifica unaprotenacanal.
saltaen las
hembras,
y el exn 1 se une a un sitio de corte y empalme 3 al-
ternativo que se encuentra corriente
abajo.
Las secuencias del exn 2 inclui-
das en el
ARNm
transformador contienen uncodn determinacin de la
tra-
duccin, de
modo
que no se
produce ninguna protena. Este codn
de
terminacin
no est incluido en el AR Nm femenino, de m odo que las mos-
cas hembra expresan la protena
transformadora
funcional, que acta como
un regulador clave en la determinacin del sexo.
El
corte y empalme alternativo de
transformer
ilustra la accin de un
re-
presor
(la
protena SXL )
que
funciona bloqueando
la
unin
de un factor de
corte
y
empalme
(U2AF), y un
gran grupo
de
protenas regulan
de forma si-
milar
el corte y empalme mediante la unin a secuencias silenciadoras de
los
pre-ARNm .
E n
otros casos,
el
corte
y
empalme alternativo est controla-
do por ac tivadores que reclutan los
factores
de corte empalme para que ac-
ta sobre sitios que de otro modo no seran reconocidos. Los activadores de
corte y empalm e
mejor
estudiados son los miemb ros de la
familia
de
prote-
nas SR (vase Fig.
7.52),
que se unen a secuencias especficas potenciadora
de l
corte
y
empalme.
Por tanto, existen m ltiples mecanismos que regulan el corte y empalm e
alternativo,y variaciones en el corte y empalme alternativo constituyen una
importan te contribucin a la diversidad de las protenas expresadas duran-
te el desarrollo y la diferenciacin. Uno de los ejemplos msl lamativos es
corte
y
empalme alternativo
de una
protena
de la
su perficie celular
de Df-
sophila
(denominada Dscam) que est implicada en especificar conexiones
entre neuronas. El gen Dscam contiene cuatro juegos de exones
alternati-
vos, de forma que un solo exn de cada juego se incorpora en el
ARXrr
(Fig.
7.54). Estos exones
pueden
unirse en cualquier combinacin, de
forma
que el corte y empalme alternativo puede potencialmente generar 38.
ARNm y
protenas diferentes
a
partir
de
este nico gen:
ms del
doble
nmero total
de
genes
del genoma de
Drosophila.
En
algunos
trabajos
cientesse ha publicado que estas formas escindidas alternativas de
Ds