LOGICA LABORATORULUI DE

MICROBIOLOGIE CLINICĂ

Microbiologia clinicăMicrobiologia clinică: : disciplină a medicindisciplină a medicineei de laborator, i de laborator, care trebuie să ofere cât mai rapid şi precis informaţiile necesare care trebuie să ofere cât mai rapid şi precis informaţiile necesare

pentru decizia clinică la un pacient cu boală infecţioasă.pentru decizia clinică la un pacient cu boală infecţioasă.

MICROBIOLOGIA CLINICĂ

Disciplină a microbiologiei aplicate

• Oferă semne paraclinice importante pentru diagnosticul etiologic al bolilor infecţioase

• Ţinteşte terapia antimicrobiană când este posibilă şi necesară

• Monitorizează eficient terapia antimicrobiană

“INSTRUMENT” DE LUCRU AL CLINICIANULUI

Pacientul întreabă:

• Mă vindec? Nu mor? Nu rămân “nenorocit”?

• Membrii familiei sunt la adăpost de această boală?

• Cât mă costă?

Organele decizionale întreabă: cât ne costă?

• Direct: diagnostic, terapie, spitalizare, combatere, profilaxie

• Indirect : zilele de muncă pierdute

Microbiologul face observaţii şi măsurători expuse variaţiilor şi erorilor:

- Biologice - Analitice - Pre-analitice- Post-analitice

Variaţii, erori în microbiologia clinicăVariaţii, erori în microbiologia clinică – Variaţii biologice

• Variaţii interindividuale - legate de vârstă– variaţia titrului semnificativ al ASLO de la copilul mic la adolescent şi adult;– variaţii ale microbiotei vaginale la diferite vârste;– colonizarea cu bacili gram-negativi a oro-faringelui la vârstnici ş.a.

• Variaţii intraindividuale legate de alterarea temporară sau definitivă a mecanismelor de eliminare microbiană – colonizări microbiene ale traheei la pacienţi cu disfuncţii ale filtrului

aerodinamic sau/şi ale transportului muco-ciliar etc.– Variaţii preanalitice

• fiziologice – diureza – terapia antimicrobiană

• prelevarea probelor (alegerea produsului, momentul recoltei, modul de recoltare), etichetarea, conservarea şi transportul lor la laborator, întocmirea cererii de analiză.

– Variaţii analitice • materialul utilizat (medii de cultură, reactivi, instrumente, aparate)• tehnica de lucru • performanţele individuale ale personalului implicat

– Variaţii post-analitice • între momentul obţinerii rezultatului de laborator şi însuşirea acestuia

de către medic• erori de transcriere a datelor.

Standardizarea şi controlul de calitate în microbiologia clinică

• Controlul variaţiilor preanalitice – norme pentru alegerea, recoltarea şi transportul

probelor– standarde de calitate a probelor acceptate pentru

examinare– atitudinea faţă de probele neadecvate

• Controlul variaţiilor analitice – controlul de calitate al reactivilor– controlul performanţelor aparaturii de laborator

• Controlul variaţiilor post-analitice – sistem de înregistrare şi comunicare a rezultatelor care

reduce la minimum numărul transcrierilor şi permite controlul lor în orice moment

Există diferenţe între metodele de diagnostic al bolilor infecţioase determinate de:

• Microorganisme patogene (clasice sau emergente)

• Microorganisme condiţionat patogene/oportuniste

• Sindroame polietiologice

• Emergenţa şi amplificarea rezistenţei la antibiotice

Exigenţele microbiologiei clinice (actuale/clasice)

• Metode performante: eficacitate vs. eficienţă, precizie

• Flux informaţional controlat între clinică şi laborator

• Norme şi standarde

Performanţele testelor de laborator Rezultatele testului

Prezenţa bolii Totaluri

Prezentă Absentă

Pozitiv (anormal) Real pozitiv (RP) Fals pozitiv (FP) RP + FP

Negativ (normal) Fals negativ (FN) Real negativ (RN) FN + RN

Totaluri RP + FN(total cu boală)

FP + RN(total fără boală)

RP + FP + RN + RN= N

(total observaţii)

Sn = RP/ RP + FN Sp = RN/ FP + RN

PP = RP/ RP + FP PN = RN/ FN + RN

Ef = RP + RN/ N Pr = RP + FN/ N

Examinări repetate şi asocieri de testeExaminări repetate şi asocieri de teste • Regula crede pozitivul

– suficient un singur rezultat pozitiv din serie ori din asociere

– creşte sensibilitatea investigaţiei– scade specificitatea

• Regula crede negativul – necesară pozitivitatea tuturor testelor din serie

sau din asociere– scade sensibilitatea – creşte specificitatea

Controlul Controlul erorierorilorlor în microbiologia în microbiologia clinicăclinică

• controlăm fluxul informaţional clinică-laborator;• alegem teste performante;• standardizăm şi controlăm calitatea activităţii;• utilizăm criterii obiective pentru interpretarea

rezultatelor;• supervizăm activitatea şi pregătirea continuă a

personalului;• asigurăm comunicarea clară a rezultatelor;• atragem clinicianul în programul controlului de

calitate al investigaţiei microbiologice.

Circuitul informaţional între medic şi laborator. Circuitul informaţional între medic şi laborator. SSubcircuite feed-back asigură o operaţie corectă.ubcircuite feed-back asigură o operaţie corectă.

HemoculturaHemocultura

DefiniţiiDefiniţii

• Hemocultura – punerea în condiţii de cultivare a unei probe de sânge – urmăreşte izolarea şi identificarea rapidă a bacteriilor

sau fungilor antrenaţi de curentul circulator în anumite condiţii patologice

• Bacteriemie – pasaj tranzitoriu prin sânge al bacteriilor, benign, fără expresie clinică sau doar cu o scurtă ascensiune termică

• Septicemie – pătrundere repetată sau continuă cu multiplicarea bacteriilor în sânge, acompaniată de sindrom infecţios grav

Consideraţii fiziopatologiceConsideraţii fiziopatologice • Curentul circulator se debarasează rapid de

microorganismele pătrunse ocazional în sânge. • În hemocultură pot creşte:

– Bacteriile de contaminare prin defect de prelevare– Microorganisme surprinse ocazional în circulaţie în

condiţii diverse: • efracţii cutaneo-mucoase (cateterizări, drenaje, extracţii

dentare, detartraj, chiuretajul pungilor parodontale), • obstrucţiile căilor biliare sau urinare, • supuraţii profunde etc. • În majoritatea cazurilor episoadele sunt trecătoare, fără

urmări. Dar la pacienţii cu leziuni endocardice (valvulopatii, ancorarea electrozilor stimulatorului cardiac etc.) sunt condiţii de risc pentru endocardite infecţioase.

– Bacterii antrenate constant în sânge în• endocarditele infecţioase, • febrele enterice, • infecţii cu serotipul b (invaziv) de Haemophilus influenzae, • bruceloză,• frecvent în pneumoniile lobare acute, meningite. • Pot evolua cu localizări metastatice septice

Microorganisme izolate de la pacienţi cu Microorganisme izolate de la pacienţi cu bacteriemie (Diekema et al, 1999)bacteriemie (Diekema et al, 1999)

• Enterobacteriaceae– Escherichia coli…………………..............................1751 cazuri– Klebsiella spp……………………………………..................765– Enterobacter spp………………….............................399– Serratia spp…………………………………………………………..136– Proteus mirabilis……………………………………………………122– Salmonella, toate serotipurile………………………………..93– Citrobacter spp……………………………………………………….76– complex Enterobacter agglomerans.…………………….44– Morganella morganii…………………………..................26

• Alte microorganisme– Staphylococcus aureus……………………………………….2151– Stafilococi coagulazo-negativi……………………………1256– Enterococcus spp………………………………………………….794– Streptococcus pneumoniae………………………………...475– Pseudomonas aeruginosa……………………………………451– Streptococi beta-hemolitici…………………………………307– Acinetobacter spp……………………………………………….206– Streptococi viridans……………………………………………154– Stenotrophomonas maltophilia……………………………69– Haemophilus spp………………………………………………….27– Corynebacterium spp…………………………………………..20

NecesarNecesar – Set de transfer steril– Medii de cultură condiţionate în flacoane cu

presiune negativă• Sisteme de prelucrare manuală şi citire vizuală• Sisteme automatizate• Sisteme de centrifugare liză pentru detectarea

micobacteriilor şi altor bacterii intracelulare– Bucată de muşama 40/40 cm– Soluţii decontaminante:

• săpun lichid, • un antiseptic din seria etanol sau propanol de 70°,

iodofori sau clorhexidină. ! ALCOOL IODAT 2% !• ETER (precauţii)

– îndepărtează iodul– lasă epiderma uscată

– Tampoane sterile din tifon– Garou

ProceduraProcedura• Momentul prelevării

– Neselectiv, când bacteriemia este continuă – În faza de frison sau ascensiune termică - descărcări bacteriene discontinui– Înaintea terapiei antimicrobiene

• Schimbul de informaţii între clinician şi microbiolog• Numărul probelor

– obligatoriu 2 hemoculturi, din vene periferice diferite– mai mult de 3 probe sunt cheltuială inutilă

• Cantitatea– La adult - cca 10 ml sânge – La copilul mic - 1-2 ml sânge

• Prelevarea– Utilizează medii de hemocultură preîncălzite la 37°C.– Lucrează la adăpost de curenţi de aer.– Plasează pacientul în decubitus dorsal cu bucata de muşama sub cot, în zona de puncţie– Decontaminează-ţi mâinile prin spălare de tip medical şi usucă-le cu hârtie de unică

folosinţă– Aplică garoul pentru a repera vizual şi prin palpare vena pentru puncţie– Dă drumul la garou– Antiseptizează-ţi degetele cu alcool iodat 2% sau alt antiseptic din gama betadină ori

clorhexidină– Decontaminează larg, concentric zona de puncţie, întâi prin spălare cu apă şi săpun lichid,

apoi prin badijonare cu unul din antisepticele precizate mai sus. După cca 1 minut, badijonează zona, tot concentric, cu tampon înmuiat în eter (precauţii), pentru a lăsa tegumentul uscat. O antiseptizare a tegumentului realizată superficial sau puncţia prin tegument umed cresc riscul contaminării hemoculturilor.

– Dezinfectează cu grijă dopul de cauciuc al flacoanelor cu medii de cultură ce urmează a fi însămânţate.

– Puncţionează vena– Agită blând flaconul pentru omogenizarea sângelui în masa mediului de cultură.– Asigură, în cel mai scurt timp, transportul flacoanelor fiecărei hemoculturi la laborator, fără

refrigerare.

Criterii de calitate a Criterii de calitate a hemoculturilorhemoculturilor

1. Prelevarea înaintea terapiei antimicrobiene sau, dacă nu este posibil, înaintea dozei subsecvente de antibiotic. Precizarea antibioticului utilizat.

2. Puncţionarea altei vene la fiecare hemocultură.3. Evitarea prelevărilor prin cateter intravascular.4. Expedierea imediată la laborator sau, dacă nu

este posibil, incubarea flacoanelor la 37C până în momentul expedierii.

5. Izolarea aceleiaşi bacterii în mai multe flacoane.

Specificaţii făcute în cererea de Specificaţii făcute în cererea de analizăanaliză

• diagnosticul clinic• ora recoltării• în caz de tratament antimicrobian,

antibioticul şi ora ultimei administrări înainte de prelevare

• dacă prelevarea a fost făcută în cursul frisonului sau puseului febril

Interpretarea rezultatelorInterpretarea rezultatelor

• Argumente de competenţa microbiologului:– Izolarea aceleiaşi bacterii (specie, antibiovar etc.) în mai multe

hemoculturi din vene diferite, are semnificaţie clinică.– Izolarea de bacterii diferite din flacoanele hemoculturilor de la acelaşi

pacient indică o contaminare.– Hemocultura cantitativă argumentează mai convingător semnificaţia

clinică a izolatelor condiţionat sau accidental patogene şi este indicată când decontaminarea tegumentului pentru puncţie este dificilă.

– Prezenţa unor structuri bacteriene implicate în patogenia bacteriemiilor de cateter: e.g., producerea de glicocalix (biofilm).

– Argumentarea bacteriemiei polimicrobiene se bazează pe izolarea a cel puţin două microorganisme din aceeaşi hemocultură, de cel puţin două ori în 24 ore.

• Argumente de competenţa clinicianului:– Vârsta şi statusul imuno-reactiv ale pacientului.– Particularităţile focarului septic primar.– Sindrom inflamator: leucocitoză, formulă leucocitară, VSH, reactivi de

fază acută.

Absenţa creşteriiAbsenţa creşterii

• absenţa bacteriilor în proba examinată• sensibilitate insuficientă a metodei• probe prelevate sub antibioticoterapie

Eficienţa terapiei antimicrobieneEficienţa terapiei antimicrobiene • Antibioticoterapie eficientă

– Scăderea concentraţiei CRP cu o perioadă de înjumătăţire de 24 ore– Normalizarea concentraţiei serice a CRP semnifică vindecarea clinică

• Antibioticoterapie ineficientă– Creşterea persistentă a CRP la sfârşitul curei de antibiotice prevesteşte

recăderea sau recurenţa infecţiei– Evoluţia lineară (mai rar exponenţială) a CRP ridică problema:

- dozării medicamentului- rezistenţei microbului infectant- constituirii unui proces supurativ localizat- unei boli de fond neinfecţioase, sau în absenţa acesteia,- semn de prognostic grav

Practici greşitePractici greşite • la bolnavii cateterizaţi prelevarea hemoculturii

exclusiv prin cateter• efectuarea unei hemoculturi unice într-un singur

flacon• însămânţarea unei cantităţi de sânge din

prelevarea pentru hemocultură mai întâi în flacoane pentru alte testări (e.g., flacoane pentru VSH, aparate pentru analiza gazelor sanguine)

Examenul LCR Examenul LCR în în diagnosticul infecţiilor diagnosticul infecţiilor

SNCSNC

Infecţiile SNCInfecţiile SNCURGENŢEURGENŢE

• Meningite purulente cauzate cel mai frecvent de bacterii, ocazional de protozoare.

• Meningite cu lichid clar şi evoluţie acută sunt determinate mai frecvent de virusuri (meningite aseptice), uneori de leptospire. Când evoluează cronic, este posibilă etiologia tuberculoasă, sifilitică sau fungică. Probleme de diagnostic dificile pun meningitele bacteriene „decapitate” prin tratament antimicrobian incomplet, care pot evolua cu lichid clar.

• Encefalitele, inflamaţii ale creierului, sunt mai frecvent virale, dar pot să apară şi prin mecanism infecto-alergic. Uzual li se asociază meningita.

• Poliomielitele sunt inflamaţii ale ţesutului nervos, care evoluează cu distrugerea selectivă a neuronilor motori. Cel mai frecvent sunt virale.

• Supuraţiile (abcese cerebrale, subdurale sau epidurale) contraindică prelevarea LCR din cauza hipertensiunii intracraniene. Profilul modificărilor citologice şi biochimice din LCR este nespecific.

Infectarea SNC se poate produce:Infectarea SNC se poate produce:

• Hematogen, în cursul unor bacteriemii (mai ales când se depăşesc 104UFC/ml sânge) sau viremii cu variate porţi de intrare. La rândul său, meningele infectat devine focar bacteriemic.

• Din nazofaringe, prin tecile limfatice olfactive (meningococ, pneumococ, Haemophilus influenzae).

• Prin contiguitate, din focare infecţioase juxtameningiene (e.g., otomastoidită, sinuzită).

• Din exterior (conduct auditiv extern, tegumente, nazofaringe) după fracturi craniene (meningite traumatice, cu cel mai variat spectru etiologic), puncţii rahidiene sau intervenţii chirurgicale pe nevrax (meningite iatrogene, eventual cu tulpini bacteriene de spital) şi la pacienţi cu anomalii congenitale (meningocel ş.a.).

Prelevate patologicePrelevate patologice• LCR• sânge• prelevate de la poarta de intrare a

infecţiei

În LCR urmărim:În LCR urmărim:

• Microbul infectant (după caz, bacterie, fung, protozoar, virus).

• Antigene ale microbului infectant.• Consecinţe ale metabolismului microbian şi metaboliţi

microbieni: hipoglicorahie, hiperlactacidorahie, apariţia alcoolului etilic, a acizilor graşi volatili etc.

• Modificări care reflectă inflamaţia: pleiocitoză cu o anume formulă leucocitară, hiperproteinorahie.

• Apariţia unor anticorpi.• Modificări care reflectă perturbări hidroelectrolitice în

circulaţia sistemică pe fondul hiperproteinorahiei: hipoclorurorahia.

Meningite bacteriene şi fungiceMeningite bacteriene şi fungice Nou-născut şi sugarul până la 2 luni

Enterobacteriaceae Pneumococi(E. coli K1 ş.a.) Haemophilus influenzae tip bStreptococcus agalactiae Bacilul piocianicStaphylococcus aureus Listeria monocytogenes

Copil Neisseria meningitidis Mycobacterium tuberculosis2)

Pneumococi LeptospiraH. influenzae tip b1)

Adult Pneumococi L. monocytogenes4)

N. meningitidis LeptospiraS. aureus Cryptococcus neoformans4)

Bacili gram-negativi Candida albicans4)

Anaerobi nesporulaţi3) Stafilococi coagulazo-negativi5)

M. tuberculosis2) Streptococi viridans

1. Rară după vârsta de 5 ani.2. Frecvenţă în creştere.3. La pacienţi cu focare otice sau sinusale.4. La pacienţi imunodeprimaţi.5. Meningite iatrogene.

• Meningite virale– enterovirusuri (Coxsackie A7, A9, B2-5, ECHO, rar

poliovirus sau enterovirus 71) – virusul urlian– virusul rujeolic– virusul varicela-zoster– virusul gripal– paramixovirusuri– adenovirusuri– citomegalovirus – virus herpes-simplex– virusul coriomeningitei limfocitare– arbovirusuri

• Meningite amibiene– Naegleria fowleri – Acantamoeba-Hartmanella

Etiologia meningitelorEtiologia meningitelor bacteriene bacteriene Meningită acută (pleiocitoză cu PN)

Streptococcus pneumoniaeNeisseria meningitidisListeria monocytogenesStreptococcus agalactiaeHaemophilus influenzaeStaphylococcus aureusBacili gram-negativi (Enterobacteriaceae, P. aeruginosa şi alţi BGN nonfermentativi)Bacterii anaerobeBacillus anthracis

Meningită acută(corelată cu şunt LCR)

Stafilococi coagulazo-negativiStaphylococcus aureusPropionibacterium spp.BGN enterici (e.g., E.coli, Klebsiella spp.)BGN non-fermentativi (e.g., P. aeruginosa, Acinetobacter spp.)

Meningită cronică(pleiocitoză cu Lf)

Nocardia asteroidesBrucella spp.Leptospira interrogansMycobacterium tuberculosisTreponema pallidumBorrelia burgdoferi

Prelevarea şi transportul probelorPrelevarea şi transportul probelor • specialişti infecţionişti, neurologi sau

neurochirurgi • rahicenteză (lombară) sau puncţie ventriculară • condiţii strict aseptice • 5-10 ml

– minim 1 mL pentru bacterii piogene– minim 5 mL pentru M. tuberculosis (centrifugare)

• 2 tuburi de centrifugă cu capac înşurubat • transport imediat (< 15 min) şi fără refrigerare, la

laborator

Criterii de calitateCriterii de calitate • Prelevarea înaintea terapiei antimicrobiene sau,

dacă nu este posibil, înaintea dozei subsecvente de antibiotic. Precizarea antibioticului utilizat.

• Evitarea prelevărilor prin cateter în meningita corelată cu şunt LCR.

• Niciodată tampon imersat în lichidul de puncţie.• Volum suficient.• Tuburi fără fisuri, cu dop înşurubat.• Decontaminarea tegumentului cu alcool iodat.• Expedierea imediată la laborator.• Transport în condiţii izoterme, la 37°C.

Examene rapideExamene rapide• Bacterioscopia• Depistarea antigenică

TestulTipul de meningită

Bacteriană Tuberculoasă Virală Fungică

Leucocite/mm3

Tipul predominant de leucocite

sute-mii1)

PMN segmentate25-100MononuclearePMN tinere

50-1000Mononucleare

100-500Mononucleare

Glucoza2) Foarte scăzută:5-20 mg/dl

Scăzută:20-40 mg/dl

Normală:65-70 mg/dl3)

Scăzută:20-40 mg/dl

Acid lactic Crescut: > 35 mg/dl Crescut: > 35 mg/dl Normal: 35 mg/dl

Alcool etilic - - - Prezent

Proteine Mult crescute: 100-500 mg/dl

Crescute: 100-200 mg/dl

Uşor crescute: 15-100 mg/dl

Crescute: ~ 100 mg/dl

1)Uneori < 100, alterori > 60000; la nou-născut şi sugar poate fi diagnosticată meningită bacteriană acută (chiar şi cu cultură sterilă) dacă sunt prezente peste 8 leucocite sau peste 1PMN/mm3 LCR.2)Raportul glicorahie/glicemie < 0,31 are sensibilitate mai bună în meningitele bacteriene acute şi evită rezultatele fals negative la pacienţi cu diabet zaharat.3)Poate fi redusă la cca ¼ din pacienţii infectaţi cu virus herpes simplex sau urlian.

Infecţii ale Infecţii ale tractusului respirator tractusului respirator

superiorsuperior

Sindroame clinice

• Barierele antimicrobiene ale tractusului respirator

Consideraţii etiopatogeneticeConsideraţii etiopatogenetice • Microbiota indigenă a tractusului respirator supraglotic:

– floră microbiană abundentă dominată de bacterii anaerobe– bacterii aerobe sau facultative (streptococi viridans, neisserii

nepretenţioase, stafilococi coagulazo-negativi, ocazional S. aureus, bacili difterimorfi, streptococi β-hemolitici, pneumococi, Haemophilus spp., Actinomyces spp.) şi levuri din genul Candida

• Bacili gram-negativi - vârstnici şi pacienţii spitalizaţi pentru boli grave

• Terapia antibacteriană - disbioze orofaringiene - Staphylococcus aureus, bacili gram-negativi şi levuri

• Predicţia semnelor clinice pentru etiologia bacteriană a faringitelor este mediocră

Etiologia faringitelorEtiologia faringitelor • virusuri (70% din cazuri): rhinovirusuri, adenovirusuri, virusul Herpes

simplex1, virusurile Coxsackie A, virusurile gripale, paragripale;• bacterii: Streptococcus pyogenes (grup A) - determină majoritatea faringitelor

bacteriene alţi streptococi ß- hemolitici (grup B, C sau G) Chlamydophila pneumoniae Corynebacterium diphtheriae Mycoplasma pneumoniae Arcanobacterium haemolyticum gonococii asociaţii fusospirochetozice (la pacienţi cu igienă bucală

deficitară şi deficite locale sau sistemice ale apărării antiinfecţioase)• levuri: Candida albicans (în condiţii de disbioză la prematuri, nou-

născuţi, pacienţi debilitaţi).

Prelevarea exsudatului faringianPrelevarea exsudatului faringian • Necesar: tampoane sterile de uz general,

apăsător de limbă, sursă de lumină, mască.• Procedura:

– înainte sau după 3-4 ore de la toaleta gurii sau ingestia de alimente

– iluminare adecvată– şterge cu tamponul ferm amigdalele şi peretele

posterior al faringelui, – evită atingerea cu baza limbii sau cu palatul moale

• Transport şi conservare: maximum 3 ore după prelevare

Criterii de calitateCriterii de calitate • Prelevare înainte de tratamentul cu antibiotice.• Prelevare sub controlul vizual al faringelui

asigurat prin bună iluminare.• Absenţa creşterii în aria însămânţată cu

tamponul indică, cel mai frecvent, o gravă eroare de prelevare/conservare. La orice persoană, pe tamponul prelevat din faringe trebuie să crească şi bacterii din microbiota indigenă orală.

Simptomatologia faringitelor streptococice Simptomatologia faringitelor streptococice persistăpersistă sub penicilinoterapiesub penicilinoterapie

• suprainfecţia streptococică a faringitelor virale (continuă simptomatologia bolii virale neinfluenţate de antibiotic);

• infecţie la pacient purtător faringian de bacterii producătoare de β-lactamaze;

• reinfecţie cu S. pyogenes în mediul familial sau în colectivităţi închise cu condiţii de promiscuitate;

• tratament exclusiv cu penicilină V la copii.

AntibiogramaAntibiograma

• streptococii β-hemolitici (grup A, C sau G) şi-au păstrat marea sensibilitate la penicilină, iar antibiograma nu este necesară

• poate fi făcută la cerere expresă pentru pacienţii sensibilizaţi la peniciline

Infecţiile Infecţiile bronho-pulmonarebronho-pulmonare

Consideraţii etiopatogeneticeConsideraţii etiopatogenetice

• Infecţii primare• Infecţii secundare deficienţelor locale şi generale

ale apărării antiinfecţioase– depresia eliminării microbiene din tractusul respirator

• infecţiile primare • alergii• bronşită cronică• bronşiectazii• corpi străini• tumori• traheostomie • intubaţie traheală

– colonizări abortive sau de durată– bacteriile mai virulente rup echilibrul instabil cu gazda şi

determină suprainfecţii

Consideraţii cliniceConsideraţii clinice • Bronşitele acute

– virusuri, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae– suprainfecţii bacteriene: Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae,

Klebsiella penumoniae, Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis. • Bronşitele cronice (induse de tabagism, poluare atmosferică)

– distrugerea celulelor ciliate, metaplazia scuamoasă a epiteliului respirator şi hipertrofia glandelor producătoare de mucus

– acutizări periodice ale bronşitelor cronice• Pneumoniile acute

– la gazde normoreactive: virusuri, M. pneumoniae, chlamidii, Coxiella burnetii (organisme greu cultivabile) - pneumonii primare zise atipice

– suprainfecţia bacteriană cu S. pneumoniae, H. influenzae, S. aureus pneumonii lobare sau bronhopneumonii.

– expunere la aerosoli (mai ales la vârstnici) - Legionella pneumophila• În condiţii de spitalizare sau imundepresie

– bacili gram-negativi (peste 50% din cazuri): Escherichia coli, K. pneumoniae, Enterobacter spp., Serratia spp., Acinetobacter spp., Pseudomonas aeruginosa

• Pneumoniile de aspiratie sunt infecţii mixte cu bacterii aerobe şi facultativ anaerobe din microbiota orofaringiană abcedare.

• Pneumoniile cronice - bacterii cu creştere lentă– bacilii tuberculozei– micobacterii atipice (Mycobacterium avium-intracellulare, M kansasii ş.a.) – Actinomyces spp.– Nocardia spp. – fungi (fungi dimorfi ş.a.)

PrelevăriPrelevări • Expectoraţii: Sputa

– matinal, sub supravegherea asistentei medicale– toaleta orală – tuşeşte profund; expectoraţia poate fi stimulată prin inhalare

de aerosoli calzi cu soluţie salină 10% glicerinată 15%.– recipient steril, cu gura largă şi capac– salivă repetă prelevarea– probă expediată imediat, fără refrigerare, pentru examinarea

citobacteriologică. Probele pentru depistarea micobacteriilor pot fi refrigerate.

• Aspiratul traheal. – Intubarea traheală, ca şi traheostomia şi canularea– colonizarea precoce traheobronşică cu microorganisme

aspirate din mediul extern– interpretarea examenului microbiologic dificilă şi expune la

erori mari• Tamponul sau aspiratul nasofaringian

– numai pentru diagnosticul infecţiilor tractusului respirator inferior cu patogeni primari (virusuri, Mycoplasma pneumoniae, Coxiella burneti, Chlamydophila pneumoniae etc.) care nu aparţin microbiotei orofaringiene.

Practici greşitePractici greşite • A lăsa pacientului, de cu seară, colectorul cu

indicaţia superficială „tuşeşte şi scuipă” fără a verifica dacă ştie ce înseamnă a expectora şi fără a-i preciza ora când trebuie să tenteze expectorarea.

• A solicita examinarea sputei în pneumoniile de aspiraţie care sunt infecţii mixte cu bacterii anaerobe şi facultativ anaerobe ale cavităţii orale.

Criterii de calitate şi interpretarea Criterii de calitate şi interpretarea rezultatelor sputoculturiirezultatelor sputoculturii

• Calitatea sputei este apreciată etapizat• Controlul macroscopic imediat după prelevare• Controlul citologic - microscopie cu mărire de 100 x în patru categorii:

– Leucocite < 25/ câmp microscopic şi celule epiteliale scuamoase > 25/ câmp - probă improprie

– Leucocite > 25/ câmp şi celule epiteliale scuamoase > 25/ câmp • proba este improprie sputoculturii pentru bacterii condiţionat patogene; poate fi

examinată doar dacă sunt căutaţi patogeni pentru care nu există portaj orofaringian (e.g., bacilii tuberculozei, fungi dimorfi), dar cu risc de rezultat fals negativ

• poate fi tentată sputograma - insule de celule inflamatorii• solicitată prelevarea corectă a unei noi probe• probe de la pacienţi cu bronşită cronică la care este frecventă metaplazia scuamoasă

a epiteliului respirator• suspectat un carcinom scuamo-celular - citolog

– Leucocite > 25/ câmp, fibrină şi eventual celule bronşice, dar cu celule epiteliale scuamoase între 10-25/ câmp

• asocierea cu celulele inflamatorii sau/ şi bronşice a > 10 bacterii din aceeaşi categorie microscopică / câmp examinat cu mărire de 1000 x este prezumtiv semnificativă clinic

– Leucocite > 25/ câmp, fibrină şi celule bronşice, cu celule epiteliale scuamoase < 10/ câmp

• proba adecvată şi pentru sputocultură• asocierea cu celulele inflamatorii sau/şi broşice şi cu fibrina a >10 bacterii/câmp

examinat cu mărire de 1000x este semnificativă clinic• Izolarea din asemenea probe a cel mult două bacterii predominante şi în

cantitate mare le indică semnificaţia clinică, dacă sunt patogeni uzuali ai tractusului respirator (e.g., pneumococi, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis).

Diagnosticul de Diagnosticul de laborator al infecţiilor laborator al infecţiilor

tractusului urinartractusului urinar

• Pot fi afectate individual sau asociat diferitele segmente ale tractusului urinar:– uretra, – prostata, – vezica urinară, – bazinetul şi calicele, – medulara renală

• Predicţia pozitivă pentru ITU a simptomatologiei clinice este în jur de 50%.

• Uneori evoluţie asimptomatică.

• La copii sub vârsta de 2 ani simptomatologia este nespecifică.

Examenul citobacteriologic al Examenul citobacteriologic al urinei este cea mai frecventă urinei este cea mai frecventă

solicitare adresată solicitare adresată laboratorului clinic.laboratorului clinic.

Infecţiile urinare ale adultului

Consideraţii etiopatogeniceConsideraţii etiopatogenice• Majoritatea ITU - pe cale ascendentă - bacterii condiţionat patogene din

microbiota fecală ori perineală (Escherichia coli - 50%)• Factori predispozanţi:

– uretra scurtă (femei)– corpi străini (catetere)– obstacole în calea fluxului urinar (litiază, adenom de prostată)– reflux vezico-ureteral etc.

• Agenţi etiologici – E. coli – Proteus mirabilis– Klebsiella pneumoniae– enterococi– Enterobacter aerogenes– Staphylococcus saprophyticus – S. aureus – Candida albicans – Corynebacterium urealyticum– Oligella uretralis, O. ureolytica

• ITU nosocomiale– Pseudomonas aeruginosa– Stenotrophomonas maltophilia– Acinetobacter spp.

• Disurie cauzată de uretrite – Neisseria gonorrhoeae– Chlamydia trachomatis– Ureaplasma urealyticum– Herpes simplex

Prelevarea urineiPrelevarea urinei

1. Prelevări uzuale1. probe curate prinse în zbor din jet

mijlociu 2. TI, bolnavi imobilizaţi - măcar un

minimum de precauţii necesar prevenirii contaminării

2. Prelevări speciale1. Prelevările prin cateter vezical - numai

la pacienţii deja cateterizaţi din serviciile de terapie intensivă

• Momentul prelevării– de preferat, prima urină matinală – după cca 3 ore de la micţiunea

anterioară• Volumul necesar

– cca 20 ml pentru depistarea cantitativă a microorganismelor condiţionat patogene

– cca 50 ml pentru depistarea unor patogeni specifici

Pe cererea de analiză trebuie Pe cererea de analiză trebuie precizatprecizat

• tipul probei: probă prinsă în zbor din jet mijlociu (curată sau fără decontaminare specială a organelor genitale); probă prelevată prin cateter

• tratamentul antimicrobian, eventual

Transportul şi conservarea urineiTransportul şi conservarea urinei

• Probele trebuie examinate în interval de maximum o oră de la prelevare.

• Dacă acest interval nu poate fi respectat, proba trebuie imediat refrigerată la 4°C şi menţinută ca atare până la examinare.

Practici greşitePractici greşite • prelevarea urinei în tub• transvazarea probei din oală de noapte în tub• prelevarea de probe de la paciente cu scurgeri

vaginale altfel decât pe masa ginecologică şi cu tampon introdus în orificiul vaginal după toaleta vulvei

• prelevarea probelor sub terapie antibacteriană fără semnalarea acesteia

• prelevarea de probe din punga de drenaj• trimiterea pentru cultivare a vârfului cateterului

urinar – colonizat cu bacterii din uretră, care nu sunt neapărat

implicate în infecţie – contaminat la retragerea cateterului

Fig. 1. The early stages in the formation of a Proteus mirabilis biofilm on a catheter.Catheters were removed for examination after incubation for various times in aninfected laboratory model of the catheterized bladder. The rough irregular surfaceof the eye-hole is shown in (a) and (b). After 2 h in the model, cells can be seenadhering to crevices in the surface (c). At 4 h, microcolonies have developed indepressions in the surface (d). After 6 h incubation, amorphous crystalline material(e) can be seen associated with the cells. At 20 h, extensive crystalline biofilm hasformed around the eye-hole (f).

Fig. 2. Cross-sections of an all-silicone catheter that had been removed froma patient after 6 weeks. The biofilm was composed of Pseudomonas aeruginosacells at a density of 5×109 viable cells (cm catheter surface)–2. (a) A freeze-driedpreparation of a freeze-fractured catheter section. (b) The biofilm on the cathetersurface in more detail revealing the sponge-like structure.

Criterii de calitate a probelor de urinăCriterii de calitate a probelor de urină

• Intervalul de timp şi temperatura la care au fost menţinute probele până la examinare.

• Absenţa substanţelor antibacteriene.• Absenţa celulelor epiteliale scuamoase.• Prezenţa unui singur morfotip microbian

la microscopia directă a frotiului colorat Gram.

• Bacteriurie semnificativă cu o singură specie bacteriană.

Interpretarea rezultatelorInterpretarea rezultatelor Citobacterioscopie

• Piuria este semn definitoriu al ITU, dar poate avea şi alte cauze:– „Piuria prezentă” = >10 leucocite/ml urină– „Piuria absentă” = < 3 leucocite/ml urină– „Piuria posibilă”: 3-10 leucocite/ ml urină determinarea

ratei orare a leucocituriei

• Cilindrurie cu precizarea tipului (leucocitari, epiteliali, granuloşi) – semn de pielonefrită.

• Celule epiteliale– Scuamoase: Semn de contaminare vaginală a probei;– Vezicale, renale: Semn de inflamaţie evolutivă la nivelele

respective.

Interpretarea rezultatelorInterpretarea rezultatelor Urocultura cantitativă• O singură specie de bacili gram-negativi este izolată în

concentraţie de 104-5 UFC/ml, de stafilococi ≥ 5x104 UFC/ml sau levuri ≥ 104 UFC/ml:– În prezenţa piuriei = ITU– În absenţa piuriei = colonizare abortivă a urinei ori probă examinată

tardiv fără refrigerare imediată.• Mai mult de două specii bacteriene, eventual şi levuri, sunt izolate

în concentraţii de 104-5 UFC/ml – probă contaminată iniţial sau examinată tardiv.

• O singură specie de bacil coliform este izolată în concentraţie de 104 UFC/ml:– La bărbat în prezenţa piuriei este semnificativă clinic;– La femei în prezenţa piuriei şi a sindromului uretral acut poate fi

semnificativă. Izolarea repetată a E. coli confirmă suspiciunea chiar când concentraţia este de 103-4 UFC/ml.

• Prezenţa < 103 UFC/ml:– În absenţa piuriei = ITU exclusă;– În prezenţa piuriei şi simptomatologiei clinice:

• eliminarea renală de substanţe antimicrobiene• tratament cu o β-lactamină care a indus cronicizarea infecţiei cu forme

bacteriene „L” (bacterii cu perete defectiv)• infecţie cu Ureaplasma urealyticum• tuberculoză renală

Diagnosticul de laborator al infecţiilor

tractusului genital

Tractusul genital:Tractusul genital:microbiota indigenă(MI), agenţi etiologicimicrobiota indigenă(MI), agenţi etiologici

Entităţi clinice

Uretrita – gonococică - nongonococică – C. trachomatis - Ureaplasma urealyticum - Mycoplasma genitalium - Trichomonas vaginalis - Herpes simplex tip2 - postgonococice – reinfecţie - eşec terapeutic - dublă infecţie ( C. trachomatis, U.urealyticum incubaţie mai lungă decât gonoreea) AŢ! Cryptococcus neoformans Vulvita – T. pallidum - Herpes simplex tip2 - Papillomavirus (6,11) - Sarcoptes scabiei

Vaginita – leucoree/pseudoleucoree - specifice – Candida albicans - T.vaginalis Vaginoze - Gardnerella vaginalis, Bacteroides,Peptococcus,

Mobiluncus, Mycoplasma hominis - la fetiţe – vulvovaginite – N. gonorrhoeae - C. trachomatis - S. pyogenes

Cervicite – T.vaginalis - Candida albicans - Treponema pallidum - Papillomavirus - N. gonorrhoeae - Herpes simplex virus tip2

Diagnosticul de laboratorPrelevarea şi transportul probelor

- Secreţia uretrală – cel puţin 2 ore după micţiune - spontană sau provocată prin”mulgerea blândă”a uretrei - frotiu (3) şi cultivare extemporanee – de preferat - dacă nu este posibil – prelevarea pe tampon (2) - secreţia vaginală – aspirată sau prelevată pe tampon ( 2)- În caz de endocervicite – exocolul şters cu 2-3 comprese sterile pentru a îndepărta secreţiile stagnante, apoi prelevate 3

tampoane – frotiu Gram, cultivare, Giemsa

- leziuni ulcerative, negi genitali- Ştergem ulceraţia cu o compresă sterilă uscată până la sângerarea leziunii- Tamponăm pentru oprirea sângerării- Presăm marginile leziunii între degete pentru a obţine serozitate – aspirăm

cu pipeta Pasteur – preparat umed Sifilis – examen microscopic pe fond întunecat - imunofluorescenţă directă Ulcer herpetic - evidenţierea celulelor gigante multinucleate – coloraţia Giemsa,Papanicolau - imunoflurescenţă – evidenţierea antigenelor virale în celulele epitelialeExamen serologic – confirmarea sifilis, C. trachomatis

Negi genitali – biopsie –evidenţierea ADN HPV

SSupuraţiiupuraţii

Tipuri de prelevateTipuri de prelevate • Aspirate din cavităţi normal sterile (ascită, exsudate

peritoneale, pleurale, pericardice, articulare);

• Aspirate din colecţii purulente apărute prin metastazare septică sau care evoluează în raport anatomic cu cavităţi normal colonizate (stomatologice, digestive, ginecologice);

• Puroiul din plăgi (muşcate, traumatice, chirurgicale ş.a.) sau abcese fistulizate prin învelişuri cu microbiotă indigenă. Aceste probe pot fi contaminate şi colonizate cu bacterii comensale sau saprofite ale ambientului;

• Supuraţii ale ţesuturilor denudate (arsuri, escare), totdeauna contaminate.

FRECVENT PRELEVAREA PROBELOR DIN SUPURAŢII ESTE IREPETABILĂ!

Consideraţii fiziopatologiceConsideraţii fiziopatologice • Supuraţiile pot fi monobacteriene sau polimicrobiene, cu

implicarea celor mai variate microorganisme. Orice supuraţie este etapă evolutivă a unui proces inflamator.

• Inflamaţia evoluează numai într-un ţesut viu (viabil), niciodată în ţesut necrotic.

• Problema esenţială la examinarea puroiului este diferenţierea dintre bacteria cu semnificaţie clinică şi cele de contaminare a probelor.

• Puncţionarea şi aspiraţia puroiului din colecţii închise nu exclud riscul contaminării probelor cu microbiota învelişurilor, mai ales dacă antiseptizarea zonei de puncţie este superficială şi lasă tegumentul umed. Şi mai mare este riscul contaminării la puncţionarea membranelor mucoase. Oricare dintre contaminanţi pot fi virtual cauză de supuraţie – rezultat fals pozitiv. De aceea semnificaţia clinică a izolatelor în aceste situaţii trebuie bazată pe contextul citobacterioscopic al probei.

• Exsudatul stagnant şi ţesutul necrotic din arsuri, escare, plăgi este constant contaminat şi colonizat cu bacterii neimplicate în etiologia inflamaţiei. De aceea prelevarea trebuie făcută din ţesutul inflamat după îndepărtarea exsudatului stagnant. După caz, putem prefera aspiraţia exsudatului prin puncţie direcţionată din tegument sănătos spre focarul inflamator.

NecesarNecesar

• Facilităţi pentru antiseptizarea suprafeţei puncţionate (≈ hemocultură);

• Facilităţi pentru îndepărtarea prin spălare a exsudatului stagnant de pe suprafeţele denudate (soluţie salină izotonă, tampoane de tifon, pensă sterile);

• Perforator dermic de 4 mm steril, dacă urmărim prelevarea unei probe biopsice;

• Tampoane sterile;• Medii de transport speciale puse la dispoziţie de către

laborator cu instrucţiunile pentru utilizare;• Lame de microscop pentru efectuare de frotiuri

extemporaneu.

Puncţia colecţiilor purulente Puncţia colecţiilor purulente închiseînchise

• Adaptează la seringă un ac suficient de gros pentru a evita puncţia oarbă în cazul puroiului vâscos. Antiseptizează cu grijă tegumentul în zone de puncţie încât să rămână uscat. Puncţionează şi aspiră. Transvazează imediat puroiul în recipient special care asigură supravieţuirea bacteriilor anaerobe. În lipsa acestor recipiente, îndepărtează urmele de aer din seringă şi înfige imediat acul într-un dop de cauciuc steril pentru obturarea seringii. Proba prelevată prin procedeul „seringă anaerobă” trebuie examinată în interval de 30 minute după prelevare.

Prelevări intraoperatoriiPrelevări intraoperatorii

• Când intervenţia chirurgicală este determinată de suspiciunea unui abces (pelvin, abdominal, toracic ş.a.) trebuie pregătite în prealabil recipiente sterile pentru colectarea şi expedierea puroiului. Dacă este excizată membrana piogenă, câteva fragmente trebuie expediate pentru examinare bacteriologică în interval de 30 minute.

Prelevări din fistulePrelevări din fistule

• Rar tamponul prelevat de la orificiul fistulizat depistează corect microorganismul cu semnificaţie clinică. Sunt indicate spălarea şi antiseptizarea îngrijită a tegumentului urmată de chiuretarea cât mai profundă a traiectului fistulos cu expedierea imediată a probei spre examinare.

• Denudările mari impun prelevări din mai multe puncte ale leziunii.• Abordarea focarului inflamator direct prin suprafaţa denudată

– Îndepărtează exsudatul stagnant sau eventualii agenţi topici antimicrobieni prin spălare cu soluţie salină izotonă şi tampoane din tifon manipulate aseptic cu pensă hemostatică.

– Umectează un tampon din dacron, poliester, vată sau alginat. Învârte tamponul pe patul lezional suficient de ferm pentru a determina o minimă sângerare din ţesutul subiacent.

– Expediază imediat tamponul spre examinare.• Intraoperator. Debridează, excizează plaga şi prelevă o probă

bioptică din ţesutul viabil de la baza plăgii.• Puncţia oblică şi aspiraţie prin tegument normal pentru abordarea

focarului inflamator este o alternativă cu bune rezultate în ulcerele cutanate cronice. Antiseptizează tegumentul sănătos de la periferia leziunii. Puncţionează oblic pentru a conduce acul sub suprafaţa denudată. Aspiră. Expediază seringa imediat la laboratorul deja prevenit.

Prelevări din arsuri, plăgi şi ulcere Prelevări din arsuri, plăgi şi ulcere cutanate cronicecutanate cronice

Practici greşitePractici greşite, care afectează , care afectează calitatea probelor:calitatea probelor:

• – Prelevarea pe tampon pentru izolarea bacteriilor anaerobe.

• – Prelevarea pe tampon a unei probe care poate fi recoltată cu seringa, prin biopsie sau chiuretaj.

• – Prelevarea de ţesut necrotic din leziuni expuse contaminării/colonizării cu microbiota indigenă ori corpi străini.

Interpretarea rezultatelorInterpretarea rezultatelor• Probele prelevate prin puncţie şi aspiraţie: au semnificaţie clinică

izolatele care au aceleaşi caractere microscopice cu bacteriile observate pe frotiul direct. Când pacientul are semne de infecţie sistemică, izolarea aceleiaşi bacterii în hemocultură este alt criteriu major de semnificaţie clinică a izolatelor din puroi.

• Probele prelevate cu seringa intraoperator sau biopsice: bacteriile observate la examenul direct şi/sau izolate au semnificaţie clinică.

• Probele prelevate prin chiuretarea leziunii (traiect fistulos): au semnificaţie clinică izolatele pe care le regăsim asociate polimorfonuclearelor în microscopia directă.

• Probele prelevate biopsic din plăgi şi arsuri: sunt semnificative clinic izolatele condiţionat patogene în cantităţi de ≥ 105 UFC/g de ţesut. Indiferent de cantitate, izolarea streptococilor β-hemolitici au semnificaţie clinică.

• Probele prelevate pe tampon de pe suprafaţa arsurilor, plăgilor, ulcerelor cutanate. Prezenţa celulelor epiteliale scuamoase la microscopia directă semnifică îndepărtarea ineficientă a exsudatului stagnant contaminat şi colonizat de microbiota tegumentului ori saprofiţi ai mediului extern. Semnificaţia clinică a izolatelor condiţionat patogene nu poate fi stabilită. În aceste condiţii semnificativă este numai izolarea de streptococi β-hemolitici. În cazul probelor corect prelevate izolarea a ≥ 106 UFC per tampon este semnificativă.

FecaleFecale

• Infecţiile gastrointestinale au etiologie variată (parazitară, bacteriană, virală), mecanisme patogenetice multiple (invaziv, toxigen) şi diareea ca semn comun.

• Uzual, în sindromul diareic, coprocultura vizează enterobacteriile patogene: Shigella, Salmonella, Yersinia.

• Boală diareică acută pot determina şi bacterii condiţionat patogene cu capacităţi toxigene şi/sau invazive (E coli, Klebsiella pneumoniae, vibrioni NAG), dar depistarea lor depăşeşte posibilităţile laboratorului clinic.

Prelevarea din scaunul emis Prelevarea din scaunul emis spontanspontan

• Necesar: – container de carton cerat cu utilizare unică– recipient recuperabil dezinfectat după utilizare prin tratare cu soluţie

de cloramină B 4% timp de 6 ore, spălat apoi cu apă şi săpun şi clătit abundent cu apă; înainte de utilizare va fi clătit cu apă clocotită;

– coprorecoltor cu mediu de transport pentru probele destinate coproculturii;

– coprorecoltor fără mediu de transport pentru probele destinate examenului coproparazitologic.

• Procedura: pacientul instruit să nu contamineze scaunul cu urină, defecă în container de carton cerat sau recipient recuperabil. Cu linguriţa coprorecoltorului prelevă fragmentele mucosanguinolente, porţiunile lichide, mucoase când acestea există, sau porţiuni din diferite puncte ale unui scaun omogen. Proba în cantitate de circa 1 g se suspensionează în mediul de transport.

Prelevarea pe tampon rectalPrelevarea pe tampon rectal

• Este utilă la pacienţii cu sindrom dizenteriform. • Trece tamponul de vată steril prin orificiul anal,

şterge cu grijă mucoasa rectală şi retrage. • Imediat după prelevare imersează tamponul în

mediul de transport, retează tija cu foarfecele şi adaptează capacul recoltorului.

TransportTransport

• Probele trebuie să ajungă în laborator în maxim 1 oră, dacă nu este posibilă respectarea acestui interval, probele pot fi conservate prin refrigerare la 4°C maxim 24 de ore.

• Cererea de analiză, care însoţeşte proba, trebuie să specifice circumstanţele clinico-epidemiologice (sindrom holeriform, călătorie în străinătate şi unde anume).